הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה מודל השפעה ליצירת פגיעה תת-קטלנית של כונדרוציטים בצמחי סחוס בקר

950 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68061

⸱

27 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 3School of Mechanical Engineering, Purdue University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כדי להבין טוב יותר את תגובת פגיעת הכונדרוציטים לעומס יתר מכני של סחוס, הפרוטוקול מתאר פיתוח של מודל פגיעת סחוס ex vivo שהיה תת-קטלני במשך 24 שעות.

תקציר

דלקת מפרקים ניוונית פוסט-טראומטית (PTOA) היא מחלת מפרקים מתקדמת נפוצה, ניוונית וכואבת המתעוררת בדרך כלל לאחר טראומה משמעותית במפרקים, המשפיעה על למעלה מ-6 מיליון אמריקאים. טראומת סחוס הנגרמת על ידי פגיעה גורמת לתגובת פגיעה כונדרוציטים שמגיעה לשיאה ב-PTOA. הבנת האירועים המולקולריים הקשורים לפגיעה בכונדרוציטים נחוצה כדי לפתח טיפולים למניעת PTOA או להאטת התקדמותו. כדי להקל על כך, פותח מודל פגיעת סחוס ex vivo שהיה תת-קטלני למשך 24 שעות. צמחים אוסטאוכונדרליים נקטפו ממפרקי מטקרפופלנגאליים של בקר, ומגדל טיפה שימש להעברת עומסי פגיעה לצמחים. כדי להבטיח שהלחץ והפגיעה יופעלו באופן אחיד יחסית על הסחוס המפרקי, הוצבו צמחים כשפני העצם פונים כלפי מעלה, והעצם נפגעה מלמעלה. עומסים שונים הופעלו על האקספלנטים מגבהים של 4.0 ס"מ, 4.5 ס"מ ו-5.0 ס"מ, וכתוצאה מכך עומסי שיא ממוצעים של 10.87 ±-1.84 מגה פיקסל, 11.69 ±-0.67 מגה פיקסל ו-12.98 ±-0.75 מגה פיקסל, בהתאמה. המחקר ניתח את תפקיד נוכחות העצם התת-כונדרלית בסחוס במהלך תרבית לאחר הפגיעה ואת ההשפעה של שימוש במחזיק מותאם או רופף במהלך הפגיעה, הערכת כדאיות התאים ואפופטוזיס. סחוס מפרקי שנפגע מ-4.5 ס"מ, בשילוב עם מחזיק מותאם והסרת עצם מיידית, סיפקו את המודל האופטימלי לגרימת פגיעה בסחוס עם מוות תאים מינימלי ב-24 שעות לאחר הפגיעה.

מבוא

דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA) היא מחלה מתישה המשפיעה על למעלה מ-5 מיליון מבוגרים בארצות הברית1. פגיעה טראומטית בודדת בסחוס יכולה לעורר תגובה לפגיעה בכונדרוציטים, מה שמוביל לתסמינים מוקדמים ולמאבק לכל החיים עם כאבי מפרקים ותפקוד לקוי2. לסחוס יש יכולת תיקון פנימית מועטה עד אפסית, ולכן קיים צורך לא מסופק בפיתוח טיפולים לשינוי התקדמות המחלה3. מכיוון ש-PTOA נמצא בקורלציה עם אירוע טראומטי יחיד ומוגדר בבירור, יש הזדמנות להתערב לפני שהמחלה מתקדמת. עם זאת, פיתוח טיפולים אלה מעוכב על ידי פער הידע על האיתות המולקולרי המווסת את תגובת הפגיעה הכונדרוציטים ומוביל לדלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית 2,3,4. הבנה טובה יותר של האירועים המולקולריים בעקבות פגיעה בכונדרוציטים יכולה לסייע בתכנון טיפולים טיפוליים חדשים שמצילים את תגובת הפגיעה בכונדרוציטים ומונעים או מעכבים את התפתחות PTOA 2,5,6.

כדי להבין טוב יותר את האיתות המולקולרי של פגיעה בכונדרוציטים, מחקר קודם השתמש במגדלי נפילה או במכשירים דומים המשפיעים מכנית על צמחי הסחוס כך שתתחיל תגובת פציעה. מחקרים אלה ביקשו לאפיין היבטים רבים של תגובה זו, כולל שינויים בתכונות המכניות ובמבנה 7,8, נזק למטריצות וסינתזה 6,9,10,11, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 12,13,14,15, מסלולי הובלת יונים 16,17,18,19, וביטוי גנים 9,11,20,21,22,23. עם זאת, ברבים מהמחקרים הללו, כדאיות התאים לא דווחה או נפגעה, עם 50% או פחות כדאיות תאים בחלק מהמחקרים 24,25,26. השפעות מבלבלות של כדאיות תאים נמוכה עלולות להקשות על חקר תגובת הפציעה. מוות כונדרוציטים מיד לאחר טראומה במפרקים הוא בלתי הפיך, אך טיפולים המטפלים בפגיעה בכונדרוציטים מפחיתים את ה-PTOA27 שלאחר מכן. על מנת לזהות שינויים מולקולריים הקשורים לפגיעה בכונדרוציטים ולא לאובדן תאים ברי קיימא, יש צורך במודל השפעת סחוס השומר על כדאיות הכונדרוציטים לתקופה מסוימת. בנוסף, פגיעת סחוס היוצרת תגובת פגיעה כונדרוציטים אחידה יחסית בכל רקמת הסחוס תספק את התוצאות העקביות ביותר בניתוח התנהגות התאים.

מטרת המחקר הייתה לפתח ולאפיין מודל חסכוני של פגיעת פגיעה ex vivo עבור סחוס מפרקי המשמר את היכולת לחקור מסלולי איתות הטבועים בתגובת פגיעה חריפה בסחוס. בנוסף, מודל כזה יכול לשמש להערכת טיפולים פוטנציאליים להצלת תגובת הפציעה. כדי להשיג זאת, פיתחנו תחילה טכניקה סטרילית לקצירת צמחי סחוס ממפרקים מטה-קרפופלנגאליים של בקר מבעלי חיים בוגרים מבחינה שלדית באמצעות מקדח ליבה עם קצה יהלום המותקן על מקדחה. מפרקי Metacarpophalangeal מושלכים על ידי בית המטבחיים כאשר בעלי החיים מעובדים לצריכת מזון, מה שהופך את המפרק הזה למקור רקמות נגיש וזול. לאחר מכן, הקמנו מודל פגיעת פגיעה שבו הדגימה האוסטאוכונדרלית הונחה במחזיק מתחת למכשיר מגדל נפילה. במודל זה, הדגימות האוסטאוכונדרליות הונחו כשהמשטח המפרקי פונה כלפי מטה על משטח נירוסטה מלוטש במראה #8, והעצם הייתה נתונה לפגיעה מלמעלה, והעבירה עומס אחיד יחסית לרקמת הסחוס. נקבעו פרמטרי השפעה השומרים על כדאיות כונדרוציטים למשך 24 שעות לאחר הפגיעה תוך הפעלת תגובת פגיעה מולקולרית אפופטוטית. מחזיקים שאפשרו כמויות שונות של תנועה רוחבית של הדגימה במהלך הפגיעה הוערכו על השפעתם על כדאיות התא ואפופטוזיס; לבסוף, הוערכה ההשפעה של הסרת סחוס מהעצם התת-כונדרלית לאחר הפגיעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בגפיים של בקר שהושגו מבית מטבחיים מקומי לא דרש אישור אתי, שכן הרקמות נאספו לאחר המוות מבעלי חיים שעובדו לצריכת מזון.

1. קציר אקספלנט אוסטאוכונדרלי

  1. עקר את החומרים הבאים באמצעות חיטוי לפני קציר השתילה: תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS; כ-1 ליטר למפרק), מקדח ליבה, מתאם מסתובב מים, בקבוק כביסה אחד הניתן לחיטוי, ידית אזמל אחת, שני מלקחיים ולהב מסור נתיחה שלאחר המוות.
  2. הגדר מכסה מנוע לתרבית רקמות עם מקדחה ומלחצים בתוך אגן כדי להכיל PBS. הרכיבו מקדח ליבה ומתאם מסתובב במכבש המקדחה וחברו את פיית המתאם המסתובב עם צינור לקרבוי מלא ב-PBS מעוקר. הרכיבו את מסור הנתיחה והניחו בתוך מכסה המנוע (איור 1A-B).
  3. מורחים תחתונים חד פעמיים בערימה במכסה המנוע של תרבית הרקמה, אחת לכל מפרק.
    הערה: רפידות תחתונות סופגות PBS ונוזל סינוביאלי שעלול לטפטף בזמן פתיחת המפרק. ערימה של מספר רפידות תחתונות מאפשרת הסרה קלה של השכבה העליונה כאשר היא הופכת רטובה מדי, ומספקת סביבת עבודה נקייה ויבשה לאורך כל ההליך.
  4. הכינו מבחנה אחת של 50 מ"ל המכילה 70% אתנול ועוד 50 מ"ל המכילה 0.13% v/v betadine ב-PBS, והניחו אותם במכסה המנוע. הנח מלקחיים וידית אזמל לתוך מבחנת האתנול כדי לשמור על סטריליות במהלך הטיפול ברקמות והנח צלחת תרבית תאים סטרילית בעלת 6 בארות בחלק האחורי של מכסה המנוע.
  5. הכן 3 מ"ל של אמצעי תרבית תאים לכל דגימה צפויה. מצע התרבית מורכב ממדיום נשר מותאם (DMEM) עם 0.9 מ"מ נתרן פירובט, אינסולין, טרנספרין וסלניום (ITS), 50 מ"ג/מ"ל חומצה L-אסקורבית, חומצות אמינו לא חיוניות של מדיום חיוני מינימלי (MEM), פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין B. הוסף חומצה L-אסקורבית ו-ITS ביום השימוש28.
  6. השג רגליים קדמיות של בקר מבעלי חיים בוגרים מבית מטבחיים מקומי תוך 6 שעות מההקרבה. שמור טישו על קרח במהלך ההובלה.
  7. בודד את המפרק המטקרפופלנגאלי על ידי הסרת הפרסה באמצעות מסור רצועת בשר מבלי לפתוח את קפסולת המפרק. יש להסיר את העור באמצעות להבי אזמל #22 מבלי לנקב את קפסולת המפרק.
  8. שטפו כל רגל ביסודיות מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית במים קרים כדי להסיר לכלוך ומצפים בבטדין לחיטוי.
  9. בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות, פתח את קפסולת המפרק באמצעות להב אזמל חדש #22. בודדו את המפרק הדיסטלי ושמרו על לחות הסחוס המפרקי עם PBS מבקבוק שטיפה (איור 1C). מכסים את הסחוס המפרקי בגזה סטרילית ספוגה ב-PBS לשמירה על לחות.
  10. לבודד עוד יותר את המפרק המטא-קרפופלנגאלי הדיסטלי על ידי חיתוך דרך המטטרסוס עם מסור הנתיחה שלאחר המוות (איור 1D). הנח את המפרק הדיסטלי לתוך המברג כשהסחוס המכוסה פונה כלפי מעלה והדק עד שהוא מאובטח. במהלך כל התהליך יש להרטיב את הגזה על הסחוס באופן קבוע בעזרת PBS.
  11. קפלו גזה הרחק מקונדיל אחד והתאימו את מיקום המברג כך שסיבית הליבה תהיה מעל האזור השטוח ביותר של המשטח המפרקי (איור 1E).
  12. פתח את שסתום הקרבוי כדי לאפשר ל-PBS לזרום דרך סיבית הליבה. השתמש בבקבוק כביסה כדי להרטיב את הרקמה ללא הרף עם PBS ולקרר את הדגימות במהלך הקידוח.
    הערה: ל-PBS מהקרבוי ולבקבוק הכביסה יש אפקט קירור במהלך תהליך הליבה.
  13. ליבה לתוך הקונדיל לאט, על ידי לחיצה על המקדח לתוך פני הקונדיל. שחרר את הלחץ לעתים קרובות ואפשר לחום להתפזר. המשך עד שעומק הליבה הוא כ -2 מ"מ לתוך העצם התת-כונדרלית. חזור על הפעולה עבור כל צד (איור 1E).
    הערה: סימני התחממות יתר כוללים אידוי מהיר של נוזלים או ריח בוער.
  14. השתמש במסור הנתיחה כדי לשחרר ליבות אוסטאוכונדרליות על ידי חיתוך העצם במקביל למשטח הסחוס המפרקי, המשך סחיטת PBS מבקבוק הכביסה לממשק של מסור הנתיחה והעצם האוסטאוכונדרלית בזמן החיתוך. במהלך שלב זה, שמור על הגזה הלחה על פני הסחוס המפרקי כדי למנוע התייבשות.
  15. אחסן ליבות אוסטאוכונדרליות (איור 1F) בתמיסת בטדין מדוללת (ראה שלב 1.3) עד שכל המפרקים מעובדים.
  16. שטפו ליבות אוסטאוכונדרליות ב-PBS והעבירו את הדגימות לבארות בודדות של צלחת סטרילית של 6 בארות המכילה 3 מ"ל של מצע תרבית מחומם מראש (DMEM עם 0.9 מ"מ נתרן פירובט, אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 50 מ"ג/מ"ל חומצה L-אסקורבית, חומצות אמינו לא חיוניות, פניצילין, סטרפטומיצין ואמפוטריצין B)28. שמור דגימות בחממה לחה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד להליך ההשפעה למחרת.

2. השפעת צמח אוסטאוכונדרלי

  1. בנה מחזיק פגיעה מנירוסטה עם משטח פגיעה מלוטש במראה (איור משלים 1 ואיור משלים 2) וקדח חורים מתאימים בלוחית הבסיס של מגדל הנפילה (איור משלים 3).
  2. עקר את החומרים הבאים באמצעות חיטוי לפני הליך הפגיעה: ראש אימפקטור כדורי מנירוסטה בקוטר 15 מ"מ, מחזיק נירוסטה עם משטח פגיעה מלוטש במראה, 4 ברגים 6/32, 4 דסקיות, מלקחיים.
  3. מקם מגדל נפילה שתוכנן ויוצר בעבר29 בארון בטיחות ביולוגית. השתמש במגדל נפילה עם ראש פגיעה כדורי בקוטר 15 מ"מ המותקן על כרכרה המצוידת בתא עומס ומד תאוצה (איור 2A), עם מסת עגלה כוללת של 358.4 גרם למחקר זה.
  4. קבע את המחזיק ללוחית הבסיס של מגדל הנפילה עם ארבעה ברגים אוטומטיים (איור 2B). במחקר זה נבדקו מחזיקים עם פתחים עגולים בקוטר 8.7 מ"מ ו-9.1 מ"מ.
  5. הנח ליבה אוסטאוכונדרלית לתוך המחזיק (איור משלים 1, איור משלים 2, איור משלים 3) מתחת לראש הפגיעה של מגדל הנפילה כשהעצם פונה כלפי מעלה.
    הערה: הצבת הליבה האוסטאוכונדרלית כשהעצם פונה כלפי מעלה והמשטח המפרקי פונה כלפי מטה30 נבחרה להעמסה הומוגנית יותר.
  6. כוונן את גררת מגדל הנפילה לגובה הרצוי ביחס לחלק העליון של העצם. קבע את הגובה המשוער של מגדל הנפילה ממחקרי פיילוט. במחקר זה הוערכו גבהים של 4.0, 4.5 ו-5.0 ס"מ.
  7. לחץ על כפתור התחל בתוכנת רכישת הנתונים (קובץ קידוד משלים 1) רגע לפני שחרור גררת מגדל הנפילה על ידי שחרור מעצור הציר (איור 2A) ומתן אפשרות לראש הפגיעה ליפול תחת משקל הכבידה על הדגימה. הרם מיד את הכרכרה והנח אותה על מעצור הציר.
    הערה: במהלך הפגיעה, ייאספו נתונים ב-100 קילו-הרץ באמצעות תוכנת איסוף נתונים המחוברת למודול רכישת נתונים, המתעד אותות מתא עומס הממוקם בין ראש הפגיעה לכרכרה, כמו גם ממד תאוצה. בעוד שאנו מרימים את הכרכרה בהקדם האפשרי לאחר הפגיעה, אין לה תכונה למניעת ריבאונד או מנגנון אחר למניעת פגיעה שנייה.
  8. מקם את קובץ .txt שנוצר על ידי תוכנת רכישת הנתונים באותה תיקיה כמו קוד ניתוח הנתונים של Matlab (קובץ קידוד משלים 2, זמין גם בכתובת https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) והפעל את קוד ניתוח הנתונים כדי לסנן נתונים גולמיים ולחשב פרמטרי השפעה.
    הערה: קוד ניתוח הנתונים משתמש בעובי סחוס של 0.563 מ"מ כדי לחשב את אנרגיית הפגיעה. זה נקבע כעובי הסחוס הממוצע שנלקח מ->-50 מיקומים בכל אחת מחמש הדגימות במחקר נפרד באמצעות שיטת המחט31 ובודק מכני Biomomentum Mach-1. פרמטרי ההשפעה מחושבים כפי שתואר קודם לכן32.
  9. יש להסיר סחוס מהעצם בעזרת להב אזמל #11, לפי הצורך. החזר את הדגימה למדיה ולאינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד להדמיה למחרת.
    הערה: במחקר זה הוערכה ההשפעה של הסרת סחוס מהעצם מיד לאחר הפגיעה או 24 שעות לאחר הפגיעה.

3. אפיון כדאיות התאים בדגימות סחוס

  1. הסר סחוס מהעצם במידת הצורך. חותכים את דגימת הסחוס לשניים בעזרת אזמל חד. הימנע מביצוע חתכים מרובים; כוון לחתך בודד כדי להבטיח קצה חלק.
  2. טבלו כל חצי דגימה מעניינת בתמיסה המורכבת מ-5 מיקרומטר אתידיום הומודימר ו-2.5 מיקרומטר סידן AM ב-PBS. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להשלים את הכתמת המתים החיים.
  3. שטפו דגימות עם PBS 2x ושמרו דגימות ב-PBS עד להדמיה. תמונה בהקדם האפשרי לאחר השלמת הצביעה.
  4. העמידו דגימת סחוס זקופה על כמה טיפות PBS בצלחת מיקרוסקופיה כך שחצי העיגול המלא נראה מהחלק הקדמי של המיקרוסקופ. צלם תמונות עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. כופפו מעט את הסחוס בעזרת מלקחיים אם הוא לא מצליח לעמוד זקוף בכוחות עצמו.
  5. באמצעות FIJI, הפצה של ImageJ עם תוספים מצורפים33, המירו תחילה את התמונה ל-8 סיביות על ידי לחיצה על Image > Type >- 8 סיביות. לאחר מכן, הגדר את הסף תחת תמונה > התאם סף > ולחץ על החל. לאחר מכן, בצע את פונקציית פרשת המים תחת תהליך > בינארי, והפעל ניתוח חלקיקים... תחת נתח עבור הערוץ הירוק והאדום. נתח תמונות שצולמו בגובה z עקבי עבור כל דגימה להשוואות מדויקות בין קבוצות.
  6. חשב את כדאיות התא על ידי חלוקת מספר התאים החיים במספר הכולל של התאים בדגימה.

4. אפיון אפופטוזיס בדגימות סחוס

  1. טבלו כל חצי דגימה מעניינת ב-8 מיקרומטר Caspase-3/7 מגיב זיהוי ירוק ב-PBS. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. שטפו דגימות עם PBS 3x. תקן את הדגימות המוכתמות על ידי דגירה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות. יש לשטוף שוב עם PBS ולאחסן ב-PBS עד להדמיה. תמונה תוך 24 שעות מרגע הצביעה.
  3. תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה שלב 3.4 למעלה). להשוואות תקפות של עוצמת הקרינה בין קבוצות, שמור על פרמטרי הדמיה עקביים עבור כל הדגימות, כולל עדשה אובייקטיבית, עוצמת לייזר עירור, רווח גלאי צינור מכפיל פוטו, גודל חור, עובי פרוסה אופטית, מהירות סריקה, ממוצע קו ורזולוציית תמונה.
  4. באמצעות סיומת FIJI של ImageJ, בחר ערך אפור ממוצע תחת התפריט Analyze > Set Measurements... .
  5. השתמש בכלי מקטע מצולע כדי לתאר את כל שטח הדגימה המוצג בתמונה. בצע את הפונקציה מדידה בתפריט ניתוח ורשום את הערך האפור הממוצע, תוך שימוש באותם פרמטרי עיבוד בין קבוצות.
  6. השתמש בכלי מקטע מצולע כדי לבחור אזור בתמונה שאינו מכיל את הדגימה ובצע שוב את הפונקציה מדידה. רשום זאת כערך האפור הממוצע של הרקע.
  7. חשב את עוצמת הקרינה על ידי הפחתת ערך האפור הממוצע ברקע מערך האפור הממוצע של המדגם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עומס הפגיעה המכני על אקספלנטים אוסטאוכונדרליים הופעל באמצעות מגדל נפילה עם גבהי כרכרה של 4.0 ס"מ, 4.5 ס"מ ו-5.0 ס"מ מעל הרקמה (n = 3 או 4). הגדלת גובה הכרכרה לפני שחרורה הביאה לכוחות פגיעה גבוהים יותר, מתחי שיא ממוצעים, שיעורי העמסה ואנרגיות פגיעה (טבלה 1).

ביקשנו לפתח מודל פגיעת סחוס ex vivo שהיה תת-קטלני במשך 24 שעות לאחר הפגיעה. אפיון של כתם חי/מת 24 שעות לאחר הפגיעה עם גבהים שונים של עגלת מגדל הנפילה הצביע על כך שהליך הקציר יצר צמחי סחוס עם כדאיות תאים גבוהה של 98...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מטרת מחקר זה הייתה לאפיין ולייעל מודל השפעת סחוס שאינו פוגע בכדאיות התאים לחקר אירועים מולקולריים לאחר פגיעה בכונדרוציטים, כאשר המטרה הסופית היא לפתח טיפול שמציל את התאים הפגועים כדי למנוע התקדמות PTOA. במרדף אחר מטרה זו, הועבר עומס מכני לחלק העצם של ליבות אוסטאוכונדרליות, והעביר את העומס לרקמת הסחוס. יתר על כן, בחנו גבהי פגיעה שונים, את ההשפעות של לוחות מחזיק שונים במהלך הפגיעה, ואת ההשפעות של נוכחות עצם בתרבית רקמת סחוס לאחר הפגיעה. פרמטרים אלה בשילוב מספקים תובנה משמעותית לגבי המודל, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי NIH NIAMS Grant R21 AR080255. המחברים רוצים להודות לקווין קאר על שסיפק את המומחיות שלו בעיבוד שבבי וייצור לפרויקט זה. המחברים מודים לאטליז מורסוויל (מורסוויל, אינדיאנה) על אספקת רקמות למחקר זה. המחברים מודים לצוות במרכז אינדיאנה למיקרוסקופיה ביולוגית על עזרתם במיקרוסקופיה קונפוקלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#11 להב אזמל סטריליThermo Fisher Scientific10-001-823הסר סחוס מהעצם
#22 להב אזמל סטריליThermo Fisher Scientific10-001-833הסר עור מרקמות בקר ופתח את המפרק על ידי חיתוך הרצועות
10-1000 ul קצות פיפטהThermo Fisher Scientific02-707-411מדידה והעברה  PBS, מדיה תרבותית ופתרונות אחרים 
200 הוכחה אתנולתרמו פישר סיינטיפיק03-007-647משמש להכנת 70% אתנול כחומר עיקור לחיטוי כלים כירורגיים ושמירה על סביבה סטרילית במהלך הכנת ועיבוד רקמות.
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל (סטרילי)Thermo Fisher Scientific339652משמש לאחסון מדיה ודגימות
קרבוי 5 ליטרThermo Fisher Scientific04-355-233מיכל PBS סטרילי המחובר למתאם מסתובב באמצעות צינור.
צלחת 6 בארות (סטרילית)Thermo Fisher Scientific140685משמש לאחסון זמני של ליבות אוסטאוכונדרליות בסביבה סטרילית עם מדיה מחוממת מראש במהלך איסוף, דגירה לפני מחקרי פגיעה והדמיה
מד תאוצהKistler8743A5משמש למדידת התאוצה הנוצרת במהלך
ערכת צביעת אפופטוזיס פגיעה (CellEvent)Thermo Fisher ScientificC10423משמש לאיתור והדמיה של תאים אפופטוטיים
בקבוקי כביסה הניתנים לחיטויNalgene2405-0500מלאו ב-PBS סטרילי כדי להרטיב את הסחוס במהלך קצירת רקמות.
מסור נתיחה שלאחר המוותMopecBD 810הסר את כל העצם העודפת לאחר פתיחת המפרק או חילוץ הליבה האוסטאוכונדרלית
להב מסור נתיחה לאחר המוות MopecBD 101משמש לחיתוך עצם לבידוד ושחרור צמחים אוסטאוכונדרליים.
בטדיןאבריו בריאות L.P.n/aמשמש לחיטוי החלק החיצוני של דגימות בקר לפני העברתן למכסה המנוע ומדולל לחיטוי הדגימות האוסטאוכונדרליות הסופיות.
צינור שקוף של 4 רגלn/an/a משמשלחיבור הקרבוי בנפח 5 ליטר המכיל PBS למתאם המסתובב של מכבש המקדחה  להובלת PBS.
מקדח ליבה UKAM Industrial Superhard Tools3EDCD7160משמש לחילוץ צמחים אוסטאוכונדרליים מהעצם על ידי קידוח לתוך הסחוס המפרקי והעצם התת-כונדרלית.-  קוטר המקדחה: 7/16 אינץ' (מקדחות ליבת יהלום מצופות אלקטרו)
מפתח סהרMcMaster Carr5362A1משמש להידוק מהדק (המחזיק את המפרק במקומו) והידוק מקדח הליבה   
צנרת סרולוגית חד פעמיתThermo Fisher Scientific13-678-11מדידה והעברה של PBS ואמצעי תרבית
תחתון חד פעמיThermo Fisher Scientific23-666-062משמש לכיסוי שטח הדלפק לספיגת מים ונוזלים במהלך הקטיף לנוחות והיגיינה רבה יותר
יחידות מסנן ואקום חד פעמיותThermo Fisher ScientificSCGP00525Filter PBS ופתרונות אחרים
מכבש מקדחה   WEN433TV 3.25 אינץ'הפעל כוח לקידוח דגימות אוסטאוכונדרליות- WEN 433TV 3.25 אינץ' חוזק תעשייתי
לחיצת מקדחה שולחנית זווית הטיהWENTV434מאבטח דגימות אוסטאוכונדרליות במיקום קבוע בזווית הרצויה במהלך תהליך הליבה.
מגדל נפילהבהתאמה אישיתn/aמשמש להשפעה על הדגימות
FIJI (ImageJ Extension)n/an/aתוכנה המשמשת לעיבוד וניתוח תמונות מיקרוסקופיה, כולל כדאיות תאים וכימות אפופטוזיס
מלקחייםפישרברנד12-000-163משמש לחיתוך רקמות במכסה המנוע, פתיחת המפרק והעברת הדגימות
גזה (סטרילית)דוקאל6412משמש להרטבת הסחוס המפרקי לאחר פתיחת קפסולת המפרק
בקבוק מדיה מזכוכית 1 ליטרסיגמא אולדריץ'CLS13951LHTCמשמש לאחסון PBS סטרילי 
כפפותתרמו פישר סיינטיפיק19-130-1597Dמשמש להגנה על צוות האיסוף
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)Gibco41400-045תוסף מדיה
LabVIEW תוכנת רכישת נתוניםNational Instrumentsn/aלוכד נתונים מתא העומס וממד התאוצה במהלך בדיקת ההשפעה לניתוח עוקב.
חומצה L-אסקורביתMerckA4403תוסף מדיה
מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי לייזראולימפוסFV1000D משמש לצילום תמונות תלת מימדיות ברזולוציה גבוהה של דגימות רקמה מוכתמות.
ערכת צביעת בדיקה חיה ומתהThermo Fisher ScientificL3224משמשת להבדיל בין תאים חיים ומתים בדגימות רקמה כדי להעריך את כדאיות התאים
תא עומסKistler9712B5000משמש למדידת הכוח המופעל במהלך פגיעה.
מטלב מאת'וורקס בע"מn/a
רצועת בשר מסורSkymsenMSKLEהסר פרסה קרפלית מדגימות בקר
Micropipette 10-100 uLThermo Fisher ScientificFBE00100מדידה והעברה  PBS ומדיה תרבית
חיוני מינימלי (MEM) תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותGibco11140-050תוסף מדיה
נשר שונה s בינוני (DMEM)Gibco10566-016תרבית אקספלנט אוסטאוכונדרלית.
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15-140-148תוסף מדיה
פוספט חוצץ מלחThermo Fischer ScientificBP399-20משמש לשטיפה, לחות וקירור רקמות לשמירה על תנאים פיזיולוגיים, מניעת התייבשות והכנת תמיסות צביעה
מחזיק מדגם על מגדל טיפהבהתאמה אישיתn/aמאבטח את הליבה האוסטאוכונדרלית במהלך הפגיעה.
ידית אזמל תרמו פישר סיינטיפיק16-100-107משמש לחיתוך מדויק, דיסקציה של רקמות ופתיחת המפרק.
ברגים (הוסף ל-cad)6-32 חוט גודל-18-8 ברגי ראש שקע נירוסטה
נתרן פירובטGibco11360-070תוסף מדיה
ראש אימפקטור כדורימקמאסטר קאר9292K52חיטוי לפני הליך פגיעה
מסכות כירורגיותמסכת מסנן375101משמש להגנה על צוות האיסוף
מתאם מסתובב מים UKAM Industrial Superhard Tools7035812מתחבר למקדח הליבה כדי לספק זרימה רציפה של PBS לקירור במהלך תהליך הקידוח.
מדיום

מקורות

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
  2. Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
  3. Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
  4. Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
  5. Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
  6. Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
  7. Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
  8. Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
  9. Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
  10. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  11. Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
  12. Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
  13. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
  14. Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
  15. Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
  16. Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
  17. Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
  18. Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  19. Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
  20. Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
  21. Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
  22. Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
  23. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
  24. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  25. Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
  26. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
  27. Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
  28. Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
  29. Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
  30. Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
  31. Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
  32. Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל פגיעת סחוסאוסטאוארטריטיס פוסט-טראומטיתיישום עומס מכנינדגי סחוס ועצם (Osteochondral Explants)מבחן חיוניות תאיםסיגנל אפופטוטיטכניקת מגדל הפלהעצם סוב-כונדראלית
במבחנה מודל השפעה ליצירת פגיעה תת-קטלנית של כונדרוציטים בצמחי סחוס בקר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.