הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תאים דמויי איים שמקורם בהשתלת תאי צינור בחולדות

468 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68066

⸱

1 באוגוסט 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

במאמר זה

סיכום

תאים דמויי אי שמקורם בתאי צינור מדגימים פוטנציאל לטיפול בסוכרת על ידי הורדת רמות הגלוקוז בדם והגברת ייצור האינסולין בחולדות סוכרתיות. עם זאת, נותרו אתגרים בהבטחת תפקוד תאים מספק, הגנה חיסונית ובטיחות. נדרשת חקירה נוספת כדי לשפר את היכולת הטיפולית של חומרים אלה.

תקציר

השימוש בתאים דמויי איים שמקורם בתאי צינור התגלה כגישה פוטנציאלית לטיפול בסוכרת מסוג 1. לחולי סוכרת אין מספיק סינתזת אינסולין בגופם עקב הרס אוטואימוני של תאי בטא בלבלב האחראים לייצור אינסולין. במסגרת זו, מטרת השתלת תאי האי היא להחזיר את יכולתם של החולים לייצר אינסולין. עם זאת, מכשולים כמו רכישה לא מספקת של תאי איים מהלבלב התורם ותגובות חיסוניות מעכבים את היישום הרחב של שיטת טיפול זו. בנסיבות ספציפיות, לתאי צינור הלבלב יש את היכולת להפוך לתאים המייצרים אינסולין. ניתן לגדל תאים אלה בסביבה מבוקרת ולהמיר אותם לתאים דמויי איים בעלי יכולת לשחרר אינסולין, מה שהופך אותם למתאימים להשתלה. אסטרטגיה חדשנית זו מציעה פוטנציאל לעצור את התקדמות הסוכרת מסוג 1 ולהפחית את התלות בזריקות אינסולין. במחקר זה, תאים דמויי איים שמקורם בתאי צינור הושתלו בכבד דרך וריד השער של הכבד בחולדות סוכרתיות המושרות על ידי סטרפטוזוטוצין. לאחר ההשתלה, הבחנו בירידה משמעותית ברמות הגלוקוז בדם של החולדות החל מהיום החמישי, שנמשכה 15 יום. בנוסף, בדיקת סבילות לגלוקוז תוך צפקי (IPGTT) הראתה כי חולדות סוכרתיות שקיבלו השתלת תאים דמויי אי ייצרו באופן משמעותי יותר אינסולין מקבוצת הביקורת. תוצאות אלה מצביעות על כך שתאים דמויי איים שמקורם בתאי צינור עשויים להיות גישה טיפולית מבטיחה לסוכרת. המכשולים העיקריים בתחום מחקר זה כוללים השגת יכולת תפקודית מספקת לתאים, הגנה עליהם מפני מערכת החיסון והבטחת בטיחותם ליישום טיפולי. למחקרים עתידיים יש פוטנציאל להניב תובנות חיוניות לאופטימיזציה של השימוש בתאים אלה במסגרות טיפוליות, תוך התמקדות בשיפור היעילות והבטיחות.

מבוא

סוכרת מסוג 1 היא הפרעה אוטואימונית מתמשכת המאופיינת בהרס של תאי בטא בלבלב המייצרים אינסולין. הטיפולים הנוכחיים כוללים בעיקר טיפול ארוך טווח באינסולין, שלמרות שהוא מצליח לשלוט ברמות הגלוקוז בדם, אינו מספק תרופה למצב או עוצר את התקדמותו1. חקירת טיפולים אלטרנטיביים לסוכרת מסוג 1 מונעת על ידי הצורך בחלופות יעילות יותר מהדגש הקיים על טיפול באינסולין. מחקר מתמשך הונע על ידי כך, תוך התמקדות בטיפולים חלופיים כגון השתלת תאי אי, המבקשת להחזיר את היכולת הטבועה של הגוף לייצר אינסולין. ובכל זאת, העובדה שקשה להשיג תאי איים תורמים ויש סיכוי לדחייה חיסונית הקשתה על שימוש נרחב בטיפול זה. כתוצאה מכך, הקהילה המדעית החלה להתעניין יותר ויותר במציאת מקורות חלופיים לתאים המייצרים אינסולין 1,2,3.

שיטה זו מבקשת למנף את פוטנציאל ההתחדשות של תאים אלה כדי לבסס אספקה בת קיימא של תאים מפרישי אינסולין4. מחקרים במבחנה הראו את יכולתם של תאי צינור אלה להפוך לתאים דמויי בטא פונקציונליים המסוגלים להפרשת אינסולין בתגובה לגירוי גלוקוז5. קו חקירה זה חיוני במיוחד, בהתחשב בתוצאות השליליות הקשורות להשתלת איים קונבנציונלית בשל התגובות החיסוניות המורכבות הכרוכות בכך. מחקרים רבים מצביעים על כך שלתאים שמקורם בצינור יש לא רק את היכולת הפנימית לייצר אינסולין, אלא גם עשויים להפגין מאפיינים שיכולים לקדם סבילות חיסונית, ובכך להקל על כמה אתגרים הקשורים לטכניקות השתלה מסורתיות 5,6,7,8. ניתן לגדל תאים אלה מחוץ לגוף, להמיר אותם לתאים הדומים לאיים שיכולים לשחרר אינסולין, ולאחר מכן להשתיל אותם באנשים עם סוכרת. חקירות פרה-קליניות, שכללו ניסויים בחולדות סוכרתיות המושרות על ידי סטרפטוזוטוצין, הראו כי השתלת תאים אלה יכולה להפחית ביעילות את רמות הגלוקוז בדם ולהגביר את הפרשת האינסולין9.

הגישה שלנו התמקדה בהאצת תהליך ההתמיינות ושיפור הפונקציונליות של תאים מייצרי אינסולין על ידי הגדלת מדיום תרבית התאים הסטנדרטי עם אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)10,11,12, איזוקסזול 9 (ISX-9)13,14 ו-GLP-115. גורמים אלה מדווחים כחיוניים להקלה על התמיינות הלבלב והגברת הפרשת האינסולין. השילוב של רכיבים אלה נועד להשיג תאים דמויי איים פונקציונליים בצורה יעילה יותר, ולהבטיח את יכולתם לייצר ולשחרר אינסולין בתגובה לגירוי גלוקוז 9,10,11,12,13,14.

בהשתלת איים, דחייה חיסונית מהווה מכשול משמעותי להשגת תוצאות מוצלחות. איים מושתלים אלוגניים פגיעים להתקפה חיסונית, ודורשים טיפולים מדכאי חיסון כדי למנוע דחייה16,17. מעורבותם של תאי צינור הלבלב בדחייה חיסונית במהלך השתלת איים מייצגת תחום מחקר מתפתח. נהוג לחשוב כי לתאי צינור עשויות להיות תכונות שיכולות להפחית את הדחייה החיסונית, מה שיגדיל את הסיכוי שהאיים המושתלים ישרדו ויתפקדו כראוי. אילייבה ועמיתיו הראו כי איים שגודלו יחד עם תאים דוקטליים הראו ירידה בנמק מרכזי ואפופטוזיס, מה שמעיד על אפקט מגן מפני נזק בתיווך חיסוני. השפעה זו עשויה להיות מתווכת על ידי גורמים כמו גורם גדילה דמוי אינסולין 2 (IGF-2) המופרש על ידי תאי צינור, כפי שצוין על ידי Marín-Cañas et al. (2019)18. האפקט המגן הוא חיוני, שכן דחייה חיסונית מהווה אתגר ניכר להצלחת השתלת איים, במיוחד בסוכרת מסוג 1. תאי צינור בשתלי איים נקשרו לתפקוד השתל והישרדות משופרים, ככל הנראה מיוחסים ליכולתם להפריש גורמים אימונומודולטוריים המפחיתים את התגובה החיסונית19.

למרות ההתקדמות המבטיחה, יש לפתור כמה מכשולים כדי להבטיח את היעילות והבטיחות התפעולית של טיפולים מבוססי תאים אלה לשימוש קליני. חיוני לוודא שהתאים המושרים מציגים תכונות פונקציונליות הדומות לתאי בטא מקומיים ולבסס טכניקות יעילות להגנה על תאים אלה מפני התקפות מערכת החיסון כדי להבטיח את הישרדותם הממושכת ותפקודם20,21. ככל שתחום מחקר זה מתקדם, ידע מקיף ופתרון של מכשולים אלה יהיו חיוניים למינוף ההבטחה של תאים מייצרי אינסולין שמקורם בתאי צינור בטיפול בסוכרת מסוג 1 22,23,24.

מחקר זה נועד להעריך את היעילות in vivo של תאים דמויי איים שמקורם בתאי צינור, שפותחו בתנאים אופטימליים, לשיקום הבקרה הגליקמית במודל חולדות סוכרתיות המושרה על ידי סטרפטוזוטוצין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה דבק בהמלצות ARRIVE, והבטיח כי התכנון, הביצוע והדיווח של המחקר עומדים בסטנדרטים גבוהים לרווחת בעלי חיים ושלמות ניסויים (https://arriveguidelines.org). אוניברסיטת מדיפול באנקרה קיבלה אישור מוועדת האתיקה (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) ואישור מוסדי. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות החלות. כל האמצעים נחקקו כדי למזער את סבלם של בעלי חיים ולהעסיק את המספר המינימלי הדרוש להשגת מטרות מדעיות.

1. הכנת פתרונות

  1. תמיסת אנזים: הכינו תמיסת קולגנאז עם 50 מ"ג אבקת קלוסטרידיום היסטוליטיקום קולגנאז מסוג V. הכינו תמיסה של 50 מ"ל על ידי שילוב קולגנאז עם HBSS (המכיל Ca-Mg) להשגת ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. השתמש ב-7 מ"ל מהתמיסה לכל דגימה והכניס את השאר למקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: הריכוז המומלץ של קולגנאז הוא 1 מ"ג/1 מ"ל. לפני השאיבה למזרקים, יש לערבב את הקולגנאז עם תמיסת HBSS שהוכנה מראש לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
  2. פתרון כביסה 1: משוך 62.5 מ"ל מ-500 מ"ל של פנול HBSS ללא אדום. הוסף 50 מ"ל של FBS ל-HBSS הנותר בזהירות רבה. הוסיפו 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 5 מ"ל L-גלוטמין (L-Gln) ו-2.5 מ"ל של 1 M HEPES. הביאו את הנפח ל-500 מ"ל.
    הערה: בתוספת אדום פנול, הנפח הסופי מורכב מ-88% HBSS, 10% FBS, 1% P/S ו-1% l-Gln. כדי למנוע קצף ולהבטיח דיוק, שלבו בזהירות את סרום הבקר העוברי צעד אחר צעד.
  3. מדיום תרבית לתאים ותמיסת כביסה 2: משוך 62.5 מ"ל מ-500 מ"ל של מדיום מכון הזיכרון של רוזוול פארק (RPMI w/L-Gln). היזהר כדי למנוע מה-FBS להקציף במהלך התוספת ההדרגתית של 50 מ"ל ל-RPMI הנותר. הוסף 2.5 מ"ל של 1 M HEPES, 5 מ"ל של P/S ו-5 מ"ל של L-Gln. ודא שהנפח הכולל הוא 500 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. פתרונות שיפוע צפיפות: הכן את תמיסות הצפיפות הסופיות על ידי דילול תמיסת הצפיפות של 1100 מ"ג/מ"ל בתמיסת HBSS כדי לקבל טווח צפיפות ביניים של 1062-1096 מ"ג/מ"ל. כדי להבטיח דיוק, ודא בעזרת מד צפיפות את הצפיפות של כל תמיסה מוכנה. השתמש בתמיסת ריכוז 1077 כהפניה. לאחר קבלת הריכוזים הרצויים (1062-1096 מ"ג/מ"ל) יש להעביר את התמיסות למיכלים אטומים ולאחסן במקום חשוך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על יציבותן.
  5. הכינו תמיסה כחולה של 0.4%. התפתחות התאים מקודמת על ידי תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), בעלת pH של 7.4.
  6. מדיום גידול תרבית תאים: שלב 43.4 מ"ל כל אחד ממדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) ומדיום הנשר המותאם של דולבקו (גלוקוז נמוך DMEM). הוסף 10% סרום עגל עוברי (FCS), 1% אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 1% L-גלוטמין (L-Gln), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) ו-0.2 מ"ל של 1 M HEPES. הרכיבו את הנפח הסופי ל -100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  7. מדיום התמיינות תרבית תאים: הוסף 43.4 מ"ל של RPMI עם 43.4 מ"ל של גלוקוז נמוך ב-DMEM. הוסף לתערובת 10% FCS, 1% אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 1% L-Gln, 1% P/S ו-0.2 מ"ל של 1 M HEPES. יתר על כן, הוסף 1 מיקרוליטר של איזוקסזול 9 (ISX-9) מדולל ב-4 מ"ל אתנול לאמצעי ההתמיינות. לבסוף, הוסף 24 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד דמוי גלוקגון 1 (GLP-1) בריכוז של 50 ננומטר למדיום תרבית התא.
    הערה: ISX-9 ו-GLP-1 מתווספים טריים רק במהלך שינויי תרבית; הם מוכנים מראש. נדרשת הכנה טרייה לכל חומר תרבותי.
  8. תמיסת דיתזון (DTZ): ממיסים 100 מ"ג דיתזון ב-20 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ומערבבים היטב. מוסיפים לתמיסה המתקבלת 30 מ"ל HBSS ומערבבים עד לקבלת תערובת הומוגנית. סנן את התמיסה מסנני 0.2 או 0.4 מיקרומטר. הוסף 50 מ"ל של HBSS לתמיסה המסוננת. סמן את התמיסה עם תאריך ההכנה. לאחר פירוק מלא של המוצקים, העבירו את התמיסה דרך מכשיר סינון של 0.4 מיקרומטר. הכניסו את התמיסה המסוננת לצינורות של 2 מ"ל והשתמשו בהם מיד, לאחר הפשרתם. שמור את התמיסה שנעשתה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  9. תמיסת קרבס: במיכל של 250 מ"ל מוסיפים 1.68 גרם נתרן כלורי (עבור 115 מ"מ), 0.50 גרם נתרן ביקרבונט (עבור 24 מ"מ), 0.09 גרם אשלגן כלורי (כדי להפוך אותו ל -5 מ"מ), 0.05 גרם מגנזיום כלוריד (עבור 1 מ"מ), 0.09 גרם סידן כלורי (עבור 2.5 מ"מ) ו -0.25 גרם אלבומין בסרום בקר (עבור 0.1%). הוסף 6.25 מ"ל של 1 מ 'HEPES. כוונו את הנפח ל-250 מ"ל על ידי הוספת מים נטולי יונים וערבבו עד שהכל יתאחד. התאם את ה-pH לטווח של 7.3 עד 7.5, באמצעות 1 M NaOH או 1 M HCl. סנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. אחסן את התמיסות בטמפרטורת החדר. באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסיפו את התמיסות כשהן מוכנות לשימוש.
  10. תמיסה בריכוז גלוקוז גבוה: יש למדוד ולהוסיף 149.1 מ"ג של D-(+)-גלוקוז לשפופרת. הוסף 50 מ"ל תמיסת קרבס לצינור וערבב היטב על ידי ניעור. סנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
  11. תמיסה בריכוז גלוקוז נמוך: שלב 1 מ"ל של תמיסה בריכוז גלוקוז גבוה של 16.7 מ"מ עם 9 מ"ל תמיסת קרבס.

2. בידוד הלבלב מחולדות

  1. התחל עם קבוצה של שלוש חולדות מעבדה לבקנים של Wistar (בני 3 חודשים/זכר) במשקל של בין 220 גרם ל-280 גרם. הרדמו את בעלי החיים באמצעות שילוב של קטמין (35-50 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג). בדוק את עומק ההרדמה על ידי היעדר תגובת נסיגת הדוושה. מרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש.
  2. התחל את התהליך הכירורגי עם חתך בטן בקו האמצע של 3-4 ס"מ לאורך הלינאה אלבה עם מספריים. (איור 1A). בצע מניפולציה עדינה של הכבד על ידי הפעלת לחץ פיזי עדין עם האצבעות לכלוב הצלעות כדי להרים את הסרעפת. הוצא את הכבד והניח אותו על גזה סטרילית ליציבות.
  3. הכינו תמיסת קולגנאז סטנדרטית במינון של 28 מ"ג/גרם משקל גוף ושאבו 7 מ"ל (כ-7 גרם) למזרק לחולדות במשקל שבין 250 ל-300 גרם. שנה את נפח התמיסה על סמך משקל הגוף של כל בעל חיים.
  4. חותכים את צינור הלבלב. בעזרת מספריים עדינים לכלי דם חותכים את הצינור ליד הכבד. השתמש במיקומים אנטומיים ביחס ללבלב ולכלי הדם שמסביב כדי לזהות את הצינור. השתמש ברמזי מיקום כמו כלי דם סמוכים ותכונות רקמות כדי להבטיח דיוק. בצע חתך אחד מושלם במקום זה לחסימה.
    הערה: החתך היה מינימלי - קטן מכדי להימדד במדויק - אך רחב מספיק כדי לאפשר החדרת קטטר. החתך מאפשר מיקום חלק ויעיל של הצנתר, ומבטיח טראומה מינימלית לרקמה שמסביב.
  5. הכנס קטטר עם מסילה משולבת בתוך פתח הצינור שנוצר (איור 1B). לאחר מיקום נכון, הדק את הקטטר באמצעות מהדק כירורגי (למשל, מיקרו מלקחיים) כדי למנוע תזוזה.
  6. מתן התמיסה האנזימטית של הקולגנאז על ידי עירוי מבוקר באמצעות דיכאון בוכנה הדרגתי ומכוון.
  7. לאחר הניפוח, השתמש במכשירים כירורגיים עדינים כדי להפריד בזהירות את רקמת הלבלב מהמבנים שמסביב. בצע את הכריתה במהירות ובתמרונים מדויקים ועדינים כדי למזער נזק לרקמות. מיד לאחר ההסרה, יש להניח את הלבלב בשפופרת של 50 מ"ל על קרח כדי לעצור כל פעילות אנזימטית.
  8. כל התהליך אמור להימשך בסביבות 60 שניות עבור לבלב אחד25. בנוסף, עד שכל הלבלבלים גודשים, שומרים את הקולגנאז ואת הלבלב שהוסר על קרח.

figure-protocol-1
איור 1: עיבוד הלבלב. (A) הידוק של פתח צינור הלבלב לתוך התריסריון ו-(B) ניפוח קולגנאז מסוג 5 מביא לתמונה של הלבלב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3 בידוד תאי צינור מרקמת הלבלב

  1. לאחר עקירה כירורגית, יש לדגור על הלבלב באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
  2. הוסף 25 מ"ל של תמיסת כביסה 1 לצינור כדי לנטרל את פעילות הקולגנאז. נער ידנית את הצינור כדי לקדם את פירוק רקמת הלבלב. בצע את כל ההליכים הבאים תחת שדה סטרילי עם זרימה למינרית.
  3. שמור את כל המדיה על הקרח. דגימות צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, ב-100 x גרם למשך דקה אחת, והגדר את הבלם להגדרה המקסימלית. השליכו את הסופרנטנט. לגלולת התא, הוסף 25 מ"ל של תמיסת כביסה 1 והשהה מחדש את התערובת.
  4. בצע שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט. לגלולה, הוסף 25 מ"ל של תמיסת כביסה 1 והשהה מחדש. מסננים את רקמת הלבלב המעובדת דרך רשת פלדה של 425 מיקרומטר כדי לחסל שאריות כלי דם או שברי רקמות לא מעוכלות.
  5. לאחר הסינון, הפוך את הנפח ל -25 מ"ל עם תמיסת כביסה 1. בצע צנטריפוגה 1x ב-100 x g למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant.
  6. העבירו את הגלולה לצינור חדש באמצעות פיפטת פלסטיק סטרילית לאחר הוספת 50 מ"ל של מדיום RPMI. צנטריפוגה את הדגימה שוב ב-100 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ואחסנו את הגלולה להמשך ניתוח.
    הערה: כל השלבים הנותרים בוצעו בתוך ארונות זרימה למינאריים בתנאים סטריליים המתאימים לניסויים בתרבית תאים.
  7. הוסף 10 מ"ל של תמיסת צפיפות 1.077 לגלולה שנרכשה לאחר האחרונה, ואחריה שיבוש עדין והומוגניזציה של הגלולה על ידי הקשה על קצה הצינור באצבע.
    הערה: טווח הצפיפות לבידוד תאי איים מרקמת הלבלב שמסביב הוא כ-1.077, בניגוד לצפיפות המדיום, שהיא כ-1.00126. כתוצאה מכך, השתמשנו בפתרון צפיפות 1.077 למטרה זו.
  8. הוסף 10 מ"ל RPMI וצנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 12 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם בלמים כבויים. הליך זה יצר חלוקה מבוססת צפיפות בתוך הצינורות, וכתוצאה מכך הצטברות של תאי איים בשכבה ממש מתחת לשכבת ה-RPMI, הממוקמת ישירות מתחת לשכבת ה-RPMI.
  9. הסר גם את תאי האי וגם RPMI חוסלו. מטרת שלב זה הייתה לטהר תאי איים כדי לשפר את הסרתם מרקמות הלבלב, וכתוצאה מכך תהליך בידוד תאי צינור טהור יותר.
  10. הסר כל רקמת לבלב נוספת לתוך צינור חדש של 50 מ"ל באמצעות פיפטה. הוסף 10 מ"ל של תמיסה בצפיפות 1.096 לגלולת הרקמות.
  11. לאחר מכן, הוסף לאט לאט 10 מ"ל של שיפוע תמיסה בצפיפות 1.062 עם מזרק. שימו לב לשמירה על התפלגות הומוגנית של רכיבים. צור שיפוע על ידי ערימת פתרונות לפי הסדר מצפוף ביותר לפחות צפוף.
  12. הוסף 10 מ"ל RPMI מעל. צינורות צנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 12 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ללא הבלמים. לאחר הסיבוב נראות שכבות שונות של צפיפות. תאי הצינור נמצאים בשכבה האמצעית, מתחת לשכבת ה-RPMI.
  13. הסר בזהירות את תאי הצינור באמצעות פיפטה פסטר זרוקה והכניס אותם לצינור נפרד של 50 מ"ל. הוסף 25 מ"ל תמיסת כביסה 2 וערבב את המתלה בעדינות על ידי הקשה על הצינור באצבע.
  14. סובב את הצינור ב -100 x גרם למשך דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. בצע שני סבבים נוספים של צנטריפוגה עם הגלולה. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 2 מ"ל תמיסת כביסה 2 לגלולה27.

4. בידוד ותרבית של תאי צינור

  1. יש לחסן את התאים שנקטפו לתוך בקבוק T25 ולהוסיף 5 מ"ל של נוזלי תרבית תאים שחוממו מראש. שמור על החממה ב-5% CO2ו-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: שמירה על טמפרטורות פיזיולוגיות יציבות חשובה לתרבית תאים, ולכן כל התמיסות חוממו לכ-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בהן.
  2. לאחר 24 שעות, שאפו את המדיום בזהירות. שוטפים את התאים פעמיים בתמיסת כביסה 2. הוסף מדיום תרבית תאים טרי והחזיר את הבקבוק לחממה. התאים שנדבקו למשטח הבקבוק נקראו תאי צינור.
  3. החלף את מצע הגידול כל 3 ימים. אם צבע המדיום משתנה מהר מאוד, המשמעות היא שהוא מאבד חומרים מזינים והופך לחומצי יותר, מה שמצביע על כך שיש להחליף את המדיום בתדירות גבוהה יותר.
  4. תאי מעבר ברגע שהתאים בצלוחיות מגיעים למפגש של 80%. שטפו עם 1-2 מ"ל PBS פי 2 והיפטרו מכל מדיה מיותרת.
  5. הוסף 2 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית (ללא פנול אדום) כדי להתחיל את תהליך הפירוק האנזימטי ולהפריד את התאים ממשטח הבקבוק.
  6. דגירה למשך 2-3 דקות והערכת ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ פי 10. אם התאים נשארים מחוברים חלקית, יש לדגור מחדש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות נוספות.
  7. לאחר שהתאים נותקו לחלוטין משטח הבקבוק, עצור את עיכול האנזים על ידי הוספת כ-8 מ"ל של מדיום גידול תאים, שהוא פי 4 מנפח תמיסת הדיסוציאציה האנזימטית. הקש בעדינות על קירות הבקבוק.
    הערה: הקשה, שיכולה לעזור לתאים להיפרד, מקצרת את זמן הדגירה הכולל ועוצרת את האנזימים מלפגוע בקרום התא, ומבטיחה שזה יקרה לאחר מגע ארוך טווח עם תמיסת הדיסוציאציה האנזימטית.
  8. לאחר הוספת אמצעי תרבית תאים, העבירו את תרחיף התאים לצינורות של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 x גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס עם הגדרת האטה קלה (מהירות 9 הפסקה) כדי לגלול את התאים.
  9. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא בתמיסת כביסה של 6-8 מ"ל 2. חזור על הצנטריפוגה כאמור לעיל. השליכו את הסופרנטנט. ההליך חזר על עצמו כדי להבטיח חיסול יסודי של תמיסת הדיסוציאציה האנזימטית.
  10. בעזרת פיפטינג עדין, השעו מחדש את הגלולה במדיום תרבית תאים טריים של 5 מ"ל כדי ליצור תרחיף תאים אחיד. בשלב זה, בצע ספירת תאים.
  11. מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים עם 10 מיקרוליטר טריפן כחול וסופרים תאים באמצעות המוציטומטר.
  12. זרע 1 × 106 תאים לבקבוק T25 באמצעות התרחיף שנספר.
    הערה: בשלב זה, רוב התאים זוהו כתאי צינור. מספר לא מבוטל של תאים נזרעו בכל צלחת בהתבסס על ספירת התאים שנעשתה. בהתבסס על מה שראינו בניסויים, תאים פוזרו לשתי צלוחיות T25 שונות ברגע שהגיעו לרמת המפגש הטובה ביותר בבקבוק אחד. זה נעשה כדי לשמור על יעילות ההפצה גבוהה. הצלחנו להפריד בהצלחה תאי צינור מרקמת לבלב של חולדה בשיטה זו. לאחר שהופרדו בהצלחה, התאים הוכנו לניסויים נוספים בהתאם לתוכנית המחקר.
  13. ממשיכים בתרבות עד למעבר 4. תאי מעבר בעת הצורך לשמירה על תנאי גידול אופטימליים.
    הערה: ממעבר 4 ואילך, חלה עלייה ניכרת במספר התאים בין הימים 3 ל-9. מאחר שתאים נוטים להיות פחות מסוגלים להתחלק אחרי יותר מחזורים, השיטה הזו דאגה שיהיו מספיק תאים ברי קיימא. ברגע שתאי הצינור גדלו מספיק, הם החלו להשתנות לתאים דמויי אי. בהתבסס על מה שמצאנו, לתאים בין שלבים 3 ו-6 יש את שיעורי ההתפשטות המהירים ביותר. מעבר 4 מראה עלייה בולטת במיוחד במספר תאי הצינור. עם זאת, לאחר מעבר 6, חלה ירידה ביכולת ההתרבות. הפרוטוקול עבר שינויים על סמך תוצאות אלה כדי לקבל את המספר הנכון של תאים תוך שמירה על כדאיותם ושימושיותם28.

5. התמיינות של תאי צינור לאשכולות דמויי איים

  1. קצור מעבר 4 תאי צינור באמצעות הליך המעבר הסטנדרטי. שטפו פעמיים עם 1-2 מ"ל PBS כדי להסיר שאריות בינוניות ותאים לא מחוברים.
  2. הוסף תמיסת דיסוציאציה אנזימטית של 2 מ"ל (ללא פנול אדום) לבקבוק. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות וניטור תחת מיקרוסקופ פי 10.
  3. אם התאים נשארים מחוברים, יש לדגור למשך 2 דקות נוספות. עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת מצע גידול תאים של 8 מ"ל.
  4. העבירו את המתלה לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, הגדירו 9 להאצה והאטה.
  5. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה בתמיסת כביסה של 6-8 מ"ל 2. צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.
  6. השעו מחדש את הגלולה הסופית במדיום טרי של 5 מ"ל. ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן.
  7. זרע 1 × 105 תאים לבאר בצלחת של שש בארות, ומוסיף 3 מ"ל בינוני לבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  8. החלף את המדיום כל 3 ימים במהלך 7 הימים הראשונים. התאם את התדירות אם הצבע הבינוני משתנה במהירות.
  9. עוברים בהדרגה למדיום התמיינות לאחר 7 ימים. המשך בתרבות במשך 15 ימים בסך הכל (7 ימי גידול + 8 ימי בידול). החלף את המדיום כל יומיים במהלך הבידול.
  10. ביום 8, התחל את שלב ההתמיינות. לאחר 4 ימים יש לשטוף תאים פעמיים עם PBS ולהוסיף תמיסת דיסוציאציה אנזימטית של 500 מיקרוליטר.
  11. דגירה 2-3 דקות, ועצירת התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של מצע גידול. צנטריפוגה ב-150 x גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. השעו מחדש וזרעו מחדש 1 x 105 תאים לבאר בצלחות של שש בארות.
  12. ביום ה-15, בצע ניתוח מיקרוסקופי מלא כדי לאפיין ולאשר בבירור את היווצרותם של אגרגטים תאיים דמויי איים24.

6. כימות ריכוז האבץ בתאי צינור ממוינים על ידי Dithizone

  1. להפשיר ולאזן את תמיסת ה-DTZ מאחסון של -20 מעלות צלזיוס. הוסף 3-4 טיפות תמיסת DTZ לכל באר של התאים הממוינים של 15 יום. התבוננו במיקרוסקופ. זיהוי תאים מייצרי אינסולין על ידי צביעה אדומה28 (איור 2).

figure-protocol-2
איור 2: תמונות מיקרוסקופ של תאי צינור דמויי אי. תמונות ב-(A) היום ה-11 של התרבות (פי 20), (B) היום ה-13 של התרבות (פי 20), (C, D) היום ה-15 של התרבות (פי 20). התאים הודגמו לאחר צביעה בדיתזון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

7. בדיקת גירוי גלוקוז

  1. זרע 1 x 104 אשכולות דמויי איים לבאר בצלחת של 24 בארות עם 1 מ"ל של מדיום התמיינות לבאר.
  2. ביום 15, לעורר תאים עם גלוקוז. הסר את המדיום הקיים והוסף 1 מ"ל של תמיסה דלת גלוקוז (1.67 מ"מ). יש לדגור שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. אוספים בינוני ומעבירים לצינורות של 2 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת גלוקוז גבוהה (16.7 מ"מ). דגירה 1 שעה. אסוף מדיום לניתוח. אסוף את מדיום תרבית התאים בכל מרווח של שעה בין הוספת תמיסות גלוקוז שונות.
  4. בצע אינסולין ELISA בהתאם להוראות היצרן. לאחר הוצאתו מכיס נייר הכסף, אפשר למיקרופלייט להתייצב לטמפרטורת החדר לפני תחילת הליך ELISA.
  5. הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב לדגימה, לבקרה ולבארות הסטנדרטיות. הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסה מצומדת עובדת. סלה את הצלחת ודגרה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור (700-900 סל"ד).
  6. שטפו בארות 6x עם 350 מיקרוליטר של מאגר כביסה. הוסף 100 מיקרוליטר של מצע 3,3′,5,5,5,5-Tetramethylbenzidine (TMB) לכל באר. אוטמים את הצלחות ודוגרים 15 דקות בחושך עם טלטול (700-900 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
  7. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לבאר ומערבבים על ידי ערבוב עדין של הצלחת כדי לעצור את התהליך. הסר בועות וקרא את הספיגה ב -450 ננומטר. מדוד במשך 30 דקות לאחר הוספת תמיסת העצירה27.

8. השתלת תאי צינור דמויי איים ואיים

  1. להרדים חולדות באמצעות קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). לחטא ולעטוף את אתר הניתוח. בצע חתך בקו האמצע של 2-3 ס"מ.
  2. עקור את המעיים וחשוף את וריד הפורטל באמצעות מחזירים. בצע ונוטומיה והכנס קטטר מלא מראש במי מלח (איור 3A).
  3. החדירו 100-500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לווריד הפורטל. הסר את הקטטר וסגור את הווריד בעזרת תפרים או דבק. סגור את הבטן ועקוב אחר ההתאוששות, תוך מתן משככי כאבים לפי הצורך (איור 3B).

figure-protocol-3
איור 3: השתלת איים ותאים דמויי אי . (A) צנתור תוך-ורידי סטרילי המשמש להשתלת איים ותאים דמויי אי. (B) השתלת איים ותאים דמויי איים לתוך מזרק סטרילי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

9. חולדות סוכרתיות המושרות על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ)

  1. חולדות מהירות 12 שעות. יש לתת 45 מ"ג/ק"ג STZ תוך צפק, מומס במאגר ציטראט קר (pH 4.5).
    הערה: צום במשך 12 שעות לפני הזרקת STZ משפר את ביטוי GLUT2, מה שמקל על הובלת גלוקוז בתאי בטא בלבלב. תהליך זה מגביר את ספיגת STZ לתאים, וכתוצאה מכך נזק גדול יותר לתאי בטא. מנגנון זה מקל על התקדמות היפרגליקמיה משמעותית יותר ומשפר את היעילות של מודל הסוכרת.
  2. יש לאשר סוכרת 48-72 שעות לאחר ההזרקה עם גלוקוז בדם >250 מ"ג/ד"ל. סווג חולדות שהגיעו בדרך כלל לערכי גלוקוז בדם מעל 250 מ"ג/ד"ל כסוכרתיים ושלבו אותן בניסוי29.

10. הכנת איים ותאים דמויי איים להשתלה

  1. קצור תאים לאחר טיפול בתמיסת הדיסוציאציה האנזימטית למשך דקה אחת. מגרדים תאים הנצמדים למשטח. החלף במדיום טרי ואסוף תאים.
  2. צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב 100-150 מיקרוליטר מי מלח. בצע ספירת תאים והתאם את ספירת התאים ל-1000 IEQ או 800 איים לכל חולדה או 1 x 105 תאים דמויי איים לכל חולדה.

11. השתלת וריד פורטל

  1. להרדים בעלי חיים על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
  2. יש לחטא את אזור הבטן של החיה בתמיסה סטרילית (בטדין או 70% אתנול). עטפו את אזור הניתוח בווילון סטרילי.
  3. בצע חתך בקו האמצע, באורך של כ-2-3 ס"מ, כדי לקבל גישה לחלל הבטן.
  4. עקור את המעיים כדי לחשוף את הכבד. אבטח את האונות השמאלית והימנית של הכבד בעזרת מחזירים סטריליים. חשוף את פני הגחון של הכבד כדי לאתר את וריד הפורטל.
  5. יש לשטוף מראש את קטטר הפוליאתילן (PE-10 או PE-50) בתמיסת מלח ולמלא אותו לחלוטין. השתמש במלקחיים מיקרו-כירורגיים כדי להחזיק ענף של וריד הפורטל - בדרך כלל הענף הצדדי השמאלי או הימני.
  6. בצע וריד קל (כ-1-2 מ"מ). הכנס בזהירות את הקטטר לאתר הוורידים. כדי למנוע תזוזה, השתמש בחומר תפר או במלקחיים כדי לעגן את הקטטר, בדרך כלל באמצעות חוט תפר 6-0.
  7. ודא את המיקום המדויק של הצנתר על ידי מתן הדרגתי של תמיסות מלח סטריליות. הצנתר העביר בהדרגה את תא האי המוכן ואת תרחיף התאים דמויי האי לווריד הפורטל. הנפח הכולל הוא 100-500 מיקרוליטר.
  8. עם סיום העירוי, הסר את הקטטר והשתמש בדבק רקמות סטרילי או בתפרים נספגים כדי לאטום את אתר הוורידים.
  9. בצע ניהול דימום. מקם מחדש את כל הרקמות המקיפות את הכבד ותפור את שרירי הבטן באמצעות חוט נספג. אבטח את העור בעזרת תפרים או קליפסים.
  10. שמור על החיה תחת מעקב בסביבה חמה. לספק משככי כאבים מתאימים לטיפול בכאב במהלך היציאה מההרדמה (למשל, בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג). התבוננו בבעלי חיים במשך 48 שעות. בדוק אם יש אינדיקציות לזיהום, בצקת באתר הניתוח או דימום30.

12. ניטור גלוקוז בדם

  1. העריכו את רמות הגלוקוז הראשוניות בדם. החזיקו בזהירות את החולדה והשתמשו ברומח כדי ליצור חתך קטן בקצה הזנב. הסר בעדינות את טיפת הדם הראשונית באמצעות צמר גפן סטרילי.
  2. מרחו את טיפת הדם השנייה על רצועת בדיקת הגלוקוז ותעדו את רמת הגלוקוז הבסיסית31.

13. בדיקת סובלנות לגלוקוז תוך צפקי

הערה: חולדות עוברות בדיקת סבילות לגלוקוז תוך צפקי (IPGTT) כדי להעריך את יעילות פינוי הגלוקוז בזרם הדם שלהן. בדיקה זו מציעה תובנות לגבי חילוף החומרים של גלוקוז, רגישות לאינסולין ומצבי סוכרת אפשריים. בדיקת הסבילות לגלוקוז תוך צפקי בוצעה ביום ה-15 ביום ה-15 לאחר ההשתלה. הרציונל העיקרי ליישום משך צום ייעודי לפני ה-IPGTT הוא לייצב את רמות הגלוקוז הבסיסיות ולהבטיח מצב מטבולי עקבי. תקופת הצום מקלה על דלדול מאגרי הגליקוגן בכבד, ומאפשרת הערכה אמינה יותר של תגובת הסבילות לגלוקוז. צום של 6 שעות מפחית את ההשפעות שלאחר הארוחה, בעוד שלצום לילה (כ-12-16 שעות) עשויות להיות השלכות ברורות, שעלולות להשפיע על הרגישות לאינסולין ועל חילוף החומרים של הגלוקוז.

  1. הכניסו את החולדות לתקופת צום של 6 שעות, עם גישה למים בלבד למשך הלילה, מה שמבטיח שמשך הצום לא יעלה על 12 שעות. הקפידו על תקופת צום אחידה לכל הנבדקים כדי להפחית את השונות במדידות הגלוקוז.
  2. לפני מתן גלוקוז, שקלו את החולדות. להכנת תמיסה סטרילית, ממיסים 20 גרם גלוקוז ב 100 מ"ל מי מלח סטריליים.
    הערה: המינון המקובל הוא בדרך כלל 2 גר' גלוקוז/ק"ג משקל גוף (2 גרם/ק"ג). הנפח הכולל שניתן נקבע על פי משקל הגוף של החיה.
  3. העריכו את רמות הגלוקוז בדם הבסיסיות. החזק את החולדה והשתמש ברומח כדי לבצע חתך קטן בקצה הזנב. הסר בעדינות את טיפת הדם הראשונה באמצעות צמר גפן סטרילי.
  4. מרחו את טיפת הדם השנייה על רצועת בדיקת הגלוקוז ורשמו את רמת הגלוקוז הבסיסית.
  5. בהתבסס על משקל הגוף של החולדה, יש לתת את הכמות המתאימה של תמיסת גלוקוז בקצב של 2 גרם/ק"ג.
  6. לפני מתן תוך-צפקי (IP) של תמיסת הגלוקוז, טפל בעדינות בחולדה. יש להזריק גלוקוז לחלל הצפק, לא לרקמה התת עורית או לאיבר כלשהו, ולוודא שהוא מתבצע כהלכה.
  7. לאחר הזרקת הגלוקוז, אסוף דגימות דם במרווחי זמן מוגדרים כדי לנטר את רמות הגלוקוז. מרווחי זמן אופייניים הם 15, 30, 60, 90 ו-120 דקות לאחר ההזרקה.
  8. בכל נקודה, אסוף דם על ידי חיתוך וריד הזנב. לפני כל איסוף דם, ודא שהזנב ניגב בעזרת ספוגית אלכוהול.
  9. בכל נקודת זמן ייעודית, מדדו את רמות הסוכר ותעדו באמצעות מד סוכר.
  10. במהלך הבדיקה, עקוב אחר החולדות לאיתור סימני אי נוחות או תגובות שליליות. כדי למזער את הלחץ עבור בעלי החיים בין המדידות, שמרו על סביבה חמה ושקטה.
  11. לאחר מדידת הגלוקוז האחרונה בדם, נקה פצעי זנב וניחם את בעלי החיים29.

14. ניתוח אינסולין באמצעות ELISA לאחר איסוף דם

הערה: השלבים בפרוטוקול זה מיועדים ללקיחת דם מאבי העורקים הבטני של חולדה ולאחר מכן שימוש בשיטת בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA) לבדיקת אינסולין.

  1. להרדים את החולדה לפני איסוף הדם כפי שתואר קודם לכן. הנח את החולדה המורדמת במצב שכיבה על משטח כירורגי סטרילי.
  2. לגלח את אזור הבטן ולחטא את האזור באמצעות תמיסת אתנול או יוד 70% כדי להבטיח סטריליות.
  3. בצע חתך בקו האמצע בעזרת אזמל כדי לחדור לשכבות העור והשרירים ולחשוף את חלל הבטן.
  4. החזר את המעיים כדי לגשת לאבי העורקים הבטני הממוקם בסמוך לעמוד השדרה. השתמש במזרק הפריני כדי להכניס את המחט לאבי העורקים הבטני בזווית קלה.
  5. אוספים דם (בדרך כלל 1-3 מ"ל, תלוי בגודל החולדה) לתוך המזרק. הפעל יניקה הדרגתית ועקבית כדי למנוע קריסת כלי דם או המוליזה של הדם.
  6. מניחים את הדם שנאסף בצינור צנטריפוגה ושומרים אותו על קרח.
  7. אם יש להמית את בעל החיים לאחר ההליך, בצע המתת חסד בהתאם להנחיות האתיות המוסדיות.
  8. צנטריפוגה את הדם שנאסף ב-300 x g למשך 10-15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח הפרדה של פלזמה או סרום. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח אינסולין לאחר מכן.
    הערה: חשוב להימנע מהמוליזה במהלך איסוף הדם מכיוון שהדבר יכול להשפיע על הדיוק של תוצאות ELISA (איור 4)29.

figure-protocol-4
איור 4: דגימות דם נלקחו מווריד הזנב של חולדות לתוך צינורות דם לניתוח אינסולין בסיום הניסוי ביום ה-15 לאחר ההשתלה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

15. מדידת אינסולין על ידי ELISA

  1. הכן את ערכת האינסולין ELISA בהתאם להוראות היצרן. אפשר לכל הריאגנטים, התקנים והדגימות להגיע לטמפרטורת החדר לפני תחילת הבדיקה.
  2. קבע את המספר הנדרש של בארות על לוחית ELISA עבור תקנים, בקרות ודגימות סרום חולדות.
  3. הכן את דגימות הסרום של החולדות לניתוח על ידי דילולן כפי שמצוין בפרוטוקול ערכת ELISA, למשל, דילול של 1:10 ב-PBS.
  4. הכן תקני אינסולין על ידי דילול סדרתי ליצירת עקומה סטנדרטית, למשל, הנעה בין 0 ל-10 ננוגרם/מ"ל.
  5. החלק תקנים, בקרות ודגימות סרום חולדות מדוללות (בדרך כלל 50-100 מיקרוליטר לבאר) לבארות המצוינות של לוחית ELISA. הוצא את תמיסת נוגדני הזיהוי המסופקת עם הערכה לכל באר כדי להבטיח פיזור אחיד.
  6. דגרו את הצלחת למשך הזמן שצוין (בדרך כלל 1-2 שעות) בטמפרטורת החדר או על פי ההוראות שסופקו.
  7. לאחר הדגירה, ודא שהבארות נשטפות עם מאגר השטיפה המיועד, בדרך כלל PBS המכיל 0.05% Tween-20, כדי להסיר חומרים לא קשורים. בצע את שלב הכביסה פי 3 עד פי 5 בהתאם להוראות הערכה, וודא שכל הנוזל שנותר מוסר לחלוטין לאחר כל כביסה.
  8. מניחים את תמיסת המצע בכל באר. המצע יתקשר עם הנוגדן הקשור לאנזים, ויגרום לשינוי צבע; עוצמת הצבע קשורה לכמות האינסולין הקיימת בדגימה. דגרו את הצלחת בחושך למשך הזמן המצוין על ידי הערכה, בדרך כלל נע בין 15 ל -30 דקות.
  9. הוסף את תמיסת העצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה הקולורימטרית. שינוי הצבע יתייצב לאחר הוספת תמיסת העצירה, שהיא בדרך כלל צהובה.
  10. מדוד מיד את הצפיפות האופטית (OD) של כל באר באמצעות קורא צלחות המוגדר ל-450 ננומטר (או כפי שצוין בערכה).
  11. צור עקומה סטנדרטית על ידי התוויית הריכוזים הידועים של תקני אינסולין מול ערכי הצפיפות האופטית (OD) המתאימים.
  12. חשב את ריכוז האינסולין בדגימות סרום של חולדות באמצעות העקומה הסטנדרטית וערכי OD המתאימים. יש לדווח על רמות אינסולין ב-ng/mL או ביחידות מתאימות אחרות29.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח מיקרוסקופ אור

במהלך בדיקות היוםה-14 של תאי צינור, ניתוח מיקרוסקופ אור גילה כי התאים התקבצו ויצרו מבנה דמוי אי. שינוי מבני זה מצביע על כך שלאחר תקופה מסוימת, תאי צינור משנים את המאפיינים המורפולוגיים שלהם על ידי כניסה לסדר ארגוני וקבלת מראה דמוי אי. הנטייה של התאים להתקבץ נובעת ככל הנראה מההשפעות של תקשורת בין-תאית ומיקרו-סביבה, והיא מספקת ממצא חשוב שעשוי לשפוך אור על תהליכי המעבר האפשריים בין תאי איים לתאי צינור (איור 2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חקר היכולת התפקודית של תאים דמויי איים ממקורות שונים משך עניין רב בחקר הסוכרת. מחקר ראשוני מראה כי תאים אלה יכולים לשחרר אינסולין כאשר רמות הגלוקוז עולות, מה שמצביע על כך שהם עשויים להיות מסוגלים לחקות את התפקודים של איי הלבלב הטבעיים. חוקרים השתמשו בצביעת דיתזון כדי לאמת את הדמיון הפנוטיפי של תאים דמויי איים לאיי הלבלב, כפי שמעיד הצביעה האדומה האופיינית הקיימת בתאים אלה32. שימוש בחולדות סוכרתיות כמודלים להשתלה הראה שתאים דמויי איים יכולים לשלוט ברמות הסוכר בדם בדיוק כמו תאי איים רגילים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא דווח על ניגוד עניינים פוטנציאלי על ידי המחבר/ים.

תודות

המחברים רוצים להודות לצוות המעבדה על תרומתם למחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% נתרן כלוריסהר פארמהלהסרת לבלב והשתלת תאים
10 מ"ל פיפטה סרולוגית סטריליתקורנינג4488לבידוד
353047קורנינג24 בארל-GSIS 
פיפטה סרולוגית 25 מ"ל -סטרילית קורנינג4489לבידוד
70% אתנול ISOLAB64-17-5לחיטוי חולדות
betadine בטיקונול  1186לחיטוי חולדות
ביוקול 1077סיגמאL6715-BCלטיהור הלבלב
ביוקול, צפיפות 1.10 גרם/מ"לסיגמאL6155-BCלטיהור הלבלב
מדי סוכר בדם ורצועות לבדיקת גלוקוזOn Call Plusלמדידת גלוקוז בדם
BSASigmaA9418להכנת קרבס
CaCl2סיגמא57647902להכנה של
הרכב קטטר קרבס: קטטר פוליאתילן (תוך ורידי תוך ורידי)  ביקקילר24G  ו-14Gללבלב ולכבד 
צנטריפוגהתרמוST1R פלוסלבידוד 
קולגנאז סוג V, ≥ 1 יחידות FALGPA/מ"ג מוצק,
>125 CDU/מ"ג מוצק 		סיגמאC9263- 1Gלעיכול הלבלב
D-(+)-גלוקוז Sigma50-99-7עבור GSIS ו-IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130לקביעת איים
DMSOSigmaD8779לפתרון DTZ
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM— גלוקוז נמוך) Gibco11885084לתרבית תאים
צינור אפנדורףISOLABלשטיפת תאים
שפופרת בז (50 מ"ל)ISOLABLB. IS.078.02.009לבידוד
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaN4637לבידוד ותרבית לבלב
עדינה וחומר תפר (גודל 6-0 או 7-0)כחול פרולן 18 אינץ' מחט P-1 | 8697Gלהסרת לבלב והשתלת תאים
פפטיד דמוי גלוקגון 1 (GLP-1) אלאדיןrp174144לתרבית תאים
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS עם Ca-Mg) מזל גדיHBSS-1Aלהכנה לאנזים
HBSS ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםBIOCHROM  L2015לבידוד לבלב
HEPESLonzaלתרבית תאים
אינסולין אליסהאלפקו80-INSRT-E01לאינסולין אליזה
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)GibcoITS -Gלתרבית תאים
איזוקסזול 9 (ISX-9) אלאדיןI304735-10 מ"גלתרבית תאים
KClSigma329820207להכנה של קרבס
קטמין HCl 200 מ"ג/מ"לNexGenלחולדות הרדמה
למינרית ארונות זרימהעבודה IldamBSC-1100IIA2-Xלתקופת בידוד ותרבות
LancetsAyset28 Gלמדידת גלוקוז
בדםל-גלוטמין Sigma59202cלבידוד ותרבית לבלב
MgCl2Sigma329759772להכנה של
קורא מיקרו-פלטותBioTek SynergyH1 Multimode Readerלאינסולין אליסה
שייקר מיקרו-פלטותVWR  444-0270לאינסולין אליסה
מיקרוסקופ מיקרוכירורגיEMZ-200TR 3.9X להסרת לבלב והשתלת תאים
מספריים ומלקחיים מיקרו-כירורגייםAesculapלהסרת לבלב והשתלת תאים
הכנסת תרבית תאים תלויים מילי-תאים, פוליאתילן טרפתלט 8.0 ומיקרו; מ מיליפורPIEP30R48 עבור GSIS 
NaClSigma7647-14-5להכנת קרבס
NaHCO3Sigma144-55-8להכנת פיפטת קרבס
פסטר 3 מ"לBIOSIGMAלבידוד
פניצילין/סטרפטומיצין סיגמאלבידוד ותרבית הלבלב
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ביוכרום  L1815למעבר תאים
מפסק (לייצוב הכבד ורקמות החיבור)Aesculapלהסרת לבלב והשתלת תאים
מדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI w/L-Gln)מזל גדיRPMI-Aלבידוד ותרבית לבלב
כותנה עם קצהDynarexלהסרת לבלב והשתלת תאים
מזרק סטרילי (10 מ"ל)Ayset32MM 22Gלתגובת Collegenase
שעון עצרKenkoKK613Dעבור IPGTT
Streptozotocin (STZ) סיגמא18883-66-4עבור חולדות סוכרתיות
יחידת מסנן נהג מזרק (GP-0.22 ומיקרו; m-3 מ"מ)MillexSLGP033RSלעיקור אמצעי תרבית תאים
בקבוק T25תרמו130189לתרבית
ריאגנטים TrypLE ExpressGibcoלמעבר תאים
אמבט מים Labor IldamALB128לתגובת קולג'נאז
קסילזין 2% w/v תמיסה להזרקהרומפוןלהרדמת חולדות
מחט קרבס סטריל

מקורות

  1. Nichols, G. A., Kimes, T. M., Harp, J. B., Kou, T. D., Brodovicz, K. G. Glycemic Response and Attainment of A1C Goals Following Newly Initiated Insulin Therapy for Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 35 (3), 495-497 (2012).
  2. Shapiro, A. M. J., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  3. Barton, F. B., et al. Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
  4. Jacobson, A., et al. Biomedical Risk Factors for Decreased Cognitive Functioning in Type 1 Diabetes: An 18-year Follow-Up of the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) Cohort. Diabetologia. 54 (2), 245-255 (2010).
  5. Rovner, A. J., et al. Development and Validation of the Type 1 Diabetes Nutrition Knowledge Survey. Diabetes Care. 35 (8), 1643-1647 (2012).
  6. Knopp, B., Perumareddi, P. An Atypical Presentation of Type 1 Diabetes. Arch Clin Cases. 8 (3), 46-49 (2021).
  7. Low, J. C., et al. Do Obese Children With Diabetic Ketoacidosis Have Type 1 or Type 2 Diabetes. Primary Care Diabetes. 6 (1), 61-65 (2012).
  8. Xu, X., et al. β cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132 (2), 197-207 (2008).
  9. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832(2011).
  10. Kim, B., et al. Differentiation of human labia minora dermis-derived fibroblasts into insulin-producing cells. Exp Mol Med. 44 (1), 26(2012).
  11. Campbell, S. C., et al. Selenium stimulates pancreatic beta-cell gene expression and enhances islet function. FEBS Lett. 582 (15), 2333-2337 (2008).
  12. Shaer, A., Azarpira, N., Vahdati, A., Karimi, M. H., Shariati, S. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Into Insulin-Producing Clusters. Exp Clin Transplantat. 13 (1), 68-75 (2015).
  13. Koh, S. H., et al. Differential Effects of Isoxazole-9 on Neural Stem/Progenitor Cells, Oligodendrocyte Precursor Cells, and Endothelial Progenitor Cells . PLoS One. 10 (9), e0138724(2015).
  14. Tsakmaki, A., Fonseca Pedro, P., Pavlidis, P., Hayee, B., Bewick, G. A. ISX-9 manipulates endocrine progenitor fate revealing conserved intestinal lineages in mouse and human organoids. Mol Metabol. 34, 157-173 (2020).
  15. Khan, S., Sur, S., Newcomb, C. J., Appelt, E. A., Stupp, S. I. Self-assembling glucagon-like peptide 1-mimetic peptide amphiphiles for enhanced activity and proliferation of insulin-secreting cells. Acta Biomaterialia. 8 (5), 1685-1692 (2012).
  16. White, A. M., et al. Engineering Strategies to Improve Islet Transplantation for Type 1 Diabetes Therapy. ACS Biomater Sci Eng. 6 (5), 2543-2562 (2020).
  17. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The Fate of Allogeneic Pancreatic Islets following Intraportal Transplantation: Challenges and Solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  18. Marín-Cañas, S., et al. Pancreatic ductal cells may have a negative effect on human islet transplantation. PLoS One. 14 (7), e0220064(2019).
  19. Webb, M. A., et al. The Impact of Potential Islet Precursor Cells on Islet Autotransplantation Outcomes. Cell Transplant. 22 (6), 1041-1051 (2013).
  20. Vendrame, F., et al. Recurrence of Type 1 Diabetes After Simultaneous Pancreas-Kidney Transplantation, Despite Immunosuppression, Is Associated With Autoantibodies and Pathogenic Autoreactive CD4 T-Cells. Diabetes. 59 (4), 947-957 (2010).
  21. Barron, E., et al. Associations of Type 1 and Type 2 Diabetes With COVID-19-related Mortality in England: A Whole-Population Study. Lancet Diabetes Endocrinol. 8 (10), 813-822 (2020).
  22. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  23. Blum, B., et al. Functional β-cells maturation is marked by an increase in the glucose threshold for insulin secretion and by expression of urocortin3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  24. Karimi, N., Ozcan, G. B. Rat Ductal Cell-Derived Differentiation into Islet-Like Cells. Methods Mol Biol. , 1-15 (2024).
  25. Dagli Gul, A. S., Fadillioglu, E., Karabulut, I., Yesilyurt, A., Delibasi, T. The effects of oral carvacrol treatment against H2O2-induced injury on isolated pancreas islet cells of rats. Islets. 5 (4), 149-155 (2013).
  26. Noguchi, H., et al. Evaluation of Osmolality of Density Gradient for Human Islet Purification. Cell Transplant. 21 (2-3), 493-500 (2012).
  27. Boyuk, G., Yigit, A. A., Aydogan, I. Co-culture of rat luteal cells with islet cells enhances islet viability and revascularization. In Vitro Cell Dev Biol Animal. 54, 640-647 (2018).
  28. Karimi, N., Boyuk Ozcan, G. Isolation Procedure for Rat Pancreatic Ductal Cells. Methods Mol Biol. , (2024).
  29. Karakose, M., et al. Comparison of the Ovary and Kidney as Sites for Islet Transplantation in Diabetic Rats. Transplant Proc. 48, 2216-2220 (2016).
  30. Gou, W., Cui, W., Cui, Y., Wang, H. Minimizing post-infusion portal vein bleeding during intrahepatic islet transplantation in mice. J Vis Exp. (171), e62530(2021).
  31. Geiger, M. C., et al. Evaluation of Metabolic Control Using a Continuous Subcutaneous Glucose Monitoring System in Patients with Type 1 Diabetes Mellitus who Achieved Insulin Independence after Islet Cell Transplantation. Cell Transplant. 14 (2-3), 77-84 (2005).
  32. Farina, M., et al. 3D Printed Vascularized Device for Subcutaneous Transplantation of Human Islets. Biotechnol J. 12 (9), 1700169(2017).
  33. Biancone, L., et al. Platelet-Activating Factor Synthesis and Response on Pancreatic Islet Endothelial Cells: Relevance for Islet Transplantation. Transplantation. 81 (4), 511-518 (2006).
  34. Lee, Y. S., Lee, C., Choung, J. S., Jung, H. S. Glucagon-Like Peptide 1 Increases Β-Cell Regeneration by Promoting Α- To Β-Cell Transdifferentiation. Diabetes. 67 (12), 2601-2614 (2018).
  35. Akinci, E., Banga, A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta (β) cell character using Pdx1, Ngn3 and MafA. Biochem J. 442 (3), 539-550 (2012).
  36. Kalwat, M. A., et al. Isoxazole Alters Metabolites and Gene Expression, Decreasing Proliferation and Promoting a Neuroendocrine Phenotype in Β-Cells. Acs Chem Biol. 11 (4), 1128-1136 (2016).
  37. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  38. García-Ocaña, A., et al. Transgenic Overexpression of Hepatocyte Growth Factor in the β-Cell Markedly Improves Islet Function and Islet Transplant Outcomes in Mice. Diabetes. 50 (12), 2752-2762 (2001).
  39. Vegas, A. J., et al. Long-term glycemic control using polymer-encapsulated human stem cell-derived beta cells in immune-competent mice. Nat Med. 22 (3), 306-311 (2016).
  40. Zhang, W. J., et al. Evaluation of islets derived from human fetal pancreatic progenitor cells in diabetes treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 141(2013).
  41. El-Kersh, A. O. F. O., El-Akabawy, G., Al-Serwi, R. H. Transplantation of human dental pulp stem cells in streptozotocin-induced diabetic rats. Anat Sci Int. 95 (4), 523-539 (2020).
  42. Lee, D. Y., Park, S. J., Nam, J. H., Byun, Y. Optimal aggregation of dissociated islet cells for functional islet-like cluster. J Biomater Sci Pol Ed. 19 (4), 441-452 (2008).
  43. Brissova, M., et al. Intraislet Endothelial Cells Contribute to Revascularization of Transplanted Pancreatic Islets. Diabetes. 53 (5), 1318-1325 (2004).
  44. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  45. Brissova, M., et al. Pancreatic Islet Production of Vascular Endothelial Growth Factor-A Is Essential for Islet Vascularization, Revascularization, and Function. Diabetes. 55 (11), 2974-2985 (2006).
  46. Chow, L. W., Wang, L., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Self-assembling Nanostructures to Deliver Angiogenic Factors to Pancreatic Islets. Biomaterials. 31 (24), 6154-6161 (2010).
  47. Assady, S., et al. Insulin Production by Human Embryonic Stem Cells. Diabetes. 50 (8), 1691-1697 (2001).
  48. Homma, J., Sekine, H., Shimizu, T. Tricultured Cell Sheets Develop into Functional Pancreatic Islet Tissue with a Vascular Network. Tissue Engineering Part A. 29 (7-8), 211-224 (2023).
  49. Loganathan, G., et al. Culture of Impure Human Islet Fractions in the Presence of Alpha-1 Antitrypsin Prevents Insulin Cleavage and Improves Islet Recovery. Transplaxt Proc. 42 (6), 2055-2057 (2010).
  50. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. J Cell Mol Med. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  51. Choi, H., Shinohara, M., Ibuki, M., Nishikawa, M., Sakai, Y. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endocrine Progenitors to Islet-like Cells Using a Dialysis Suspension Culture System. Cells. 10 (8), 2017(2021).
  52. Ding, Y., Xia, S., Zhang, H., Chen, Q., Niu, B. Loureirin B Activates GLP-1R and Promotes Insulin Secretion in Ins-1 Cells. J Cell Mol Med. 25 (2), 855-866 (2020).
  53. O'Mara, B. A., Liehuaa, L., Ahrén, B. Stromal Derived Factor 1 Alpha (SDF-1a) in a Dual Therapy With the DPP-4 Inhibitor 1 Vildagliptin Does Not Enhance Beta Cell Function but Improves Glucose Clearance After Oral Glucose in Streptozotocin Diabetic Mice. J Chem Biol Ther. 1, 110(2016).
  54. Caporarello, N., Parrino, C., Trischitta, V., Frittitta, L. Insulin Receptor Signaling and Glucagon-Like Peptide 1 Effects on Pancreatic Beta Cells. Plos One. 12 (8), e0181190(2017).
  55. Schwenk, R. W., et al. GLP-1-oestrogen Attenuates Hyperphagia and Protects From Beta Cell Failure in Diabetes-Prone New Zealand Obese (NZO) Mice. Diabetologia. 58 (3), 604-614 (2014).
  56. He, Y., et al. Reversal of Early Diabetic Nephropathy by Islet Transplantation under the Kidney Capsule in a Rat Model. J Diabetes Res. 2016, 1-12 (2016).
  57. Yun, F., Zhaorigen, B., Han, X., Li, X., Yun, S. Islet-Like Cells Induced from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells with Neonatal Bovine Pancreatic Mesenchymal Exosomes for Treatment of Diabetes Mellitus. Hormone Metabolic Res. 56 (06), 463-470 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סוכרת מסוג 1ייצור אינסוליןתאי בטא בלבלבהשתלת תאי אייםהפחתת גלוקוז בדםסבילות לגלוקוז תוך-peritonealחולדות סוכרתיות שעובדו בסטריפטוזוטוציןהגנה חיסונית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.