מאמר שיטה

במבחנה חשיפות קנאביס של תאי אפיתל ריאה בממשק אוויר-נוזל

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68102

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

במאמר זה

סיכום

אנו מקימים מודל מבחנה סטנדרטי לחקר חשיפה לאדי קנאביס בממשק אוויר-נוזל. מודל זה מספק גישה שיטתית לבחינת ההשפעות של קנאביס מאודה, תוך התייחסות לעניין הגובר במכשירי אידוי קנאביס כחלופה לעישון.

תקציר

קנאביס נמצא בשימוש על ידי כ-192 מיליון אנשים ברחבי העולם. רוב האנשים משתמשים בקנאביס באמצעות שאיפת עשן קנאביס, המכיל תוצרי לוואי של בעירה שיכולים להשפיע לרעה על בריאות הריאות. הידע על הסיכונים הללו הוביל להתעניינות גוברת במכשירי אידוי קנאביס, המחממים את פרח הקנאביס היבש מבלי להישרף. אידוי קנאביס עדיין משחרר קנבינואידים לשאיפה אך מחמם את החומר הצמחי בטמפרטורה נמוכה יותר. כיום אין מודל מבחנה סטנדרטי להערכת ההשפעות של אדי קנאביס יבשים. לכן, הקמנו מודל לחשיפה של תרביות תאי ריאה בממשק אוויר-נוזל (ALI), לפיו תאים נחשפים אפיקלית לקנאביס מאודה, ובכך מדמים בצורה מדויקת יותר את הפיזיולוגיה של תאי האפיתל של הריאה. פרוטוקול זה מבטיח אספקה עקבית וניתנת לשחזור של אדי קנאביס אל פני התא, ומספק פלטפורמה אמינה לחקירת ההשפעות התאיות והמולקולריות של קנאביס מאודה. עבודה זו היא הראשונה לתקנן שיטת אספקת אדי קנאביס במבחנה , שיכולה לשמש אמת מידה למחקר קנאביס פרה-קליני עתידי.

מבוא

קנאביס משמש בדרך כלל על ידי שאיפת עשן משריפת פרח הצמח בצורה של ג'וינט, בין אם למטרות פנאי או למטרות רפואיות. הפעילות הביולוגית העיקרית של הקנאביס נובעת מקנבינואידים כגון Δ 9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) וקנבידיול (CBD), המשתחררים לגוף בשאיפה. עשן קנאביס מכיל גם תרכובות פירוגניות, כולל חומרים מסרטנים, מוטגנים וטרטוגנים, שיש להם פוטנציאל לגרום לתוצאות בריאותיות שליליות1. לאור חששות אלו, יש עניין לפנות למכשירי אידוי קנאביס המחממים את פרח הקנאביס ללא שריפה, בתקווה שהדבר יאפשר שחרור קנבינואידים לשאיפה לאחר מכן אך ללא מוצרי בעירה. נעשתה עבודה מסוימת כדי לאפיין את המרכיבים הכימיים של אדי קנאביס, המראה נוכחות של קנבינואידים אך גם רעלים נשימתיים שונים, מה שמאתגר את הרעיון שמכשירים אלה בטוחים 2,3. ישנם פערים משמעותיים בידע לגבי האופן שבו קנאביס מאודה משפיע על הריאות ואיברים אחרים.

מחקרי תרבית תאים חיוניים בטוקסיקולוגיה כדי לבודד ולהבין את ההשפעות הספציפיות של חומרים נשאפים ברמה התאית, ומאפשרים תובנות בתפוקה גבוהה, חסכוניות ומכניסטיות הרלוונטיות לביולוגיה האנושית. שיטת תרבית התאים היא גם גורם חשוב לתוצאות הכוללות המתקבלות מניסוי במבחנה . רוב מחקרי תרביות התאים מבוצעים באמצעות סביבה שקועה, שבה תאים גדלים על פלסטיק ונחשפים באופן אפיקלי למדיה מימית. תאי אפיתל של דרכי הנשימה, לעומת זאת, מהווים אתגר ייחודי בהקשר זה. בכל מערכת הנשימה, המשטח האפיקלי של תאי האפיתל נמצא במגע עם אוויר. בתוך הנאדיות, תאי אפיתל מייצרים פעילי שטח, בעוד שתאי אפיתל אחרים של דרכי הנשימה מייצרים ריר; באופן קולקטיבי, זה מגן ושומר על תפקוד הריאות. תרביות שקועות אינן מצליחות לשכפל את החשיפה לאוויר האפיקלי, מה שמגביל את יכולתן לדגמן את סביבת ה-in vivo במדויק. אלטרנטיבה למודלים של תרבית שקועה היא תרבית בממשק אוויר-נוזל (ALI), שבו מגדלים תאי אפיתל נשימתיים על קרום מצופה קולגן עם מדיה בצד הבסיסי תוך חשיפה אפיקלית לאוויר. תאי אפיתל שגודלו ב-ALI הם מודלים מדויקים יותר של אפיתל הנשימה בשל יכולתם לקטב, לייצר פעילי שטח או ריר וליצור צמתים בסביבה זו4.

שיקול נוסף העומד בפני שיטות תרבית תאים שקועות מסורתיות הוא שתרכובות הידרופוביות כמו קנבינואידים מסיסות בצורה גרועה במדיה מימית5. תמציות אתנוליות הן ממס נפוץ לחקר תרכובות הידרופוביות בתרביות שקועות 6,7,8,9,10,11,12. תמציות אלו מאפשרות להמיס תרכובות הידרופוביות והידרופיליות במדיה מימית. עם זאת, מגבלה היא הפוטנציאל לצבירת תרכובות כמו גם תרכובות המקיימות אינטראקציה עם המדיה, שניהם יכולים לשנות את הזמינות הביולוגית13,14. לאחרונה חלו פיתוחים המאפשרים העברת תרכובות פאזה אירוסול לתאים בהיעדר ממס או מדיה באמצעות מערכות חשיפה מתקדמות כגון expoCube15 (מערכת חשיפה ALI/Transwell in vitro/ex vivo), כמו גם אחרות. תצהיר ישיר של אירוסולים ותרחיפים חלקיקים באמצעות מערכת חשיפה מתקדמת מבטל את תהליך האיסוף-השעיה מחדש החיוני לחשיפות שקועות, הידוע כמשנה באופן מהותי את התכונות הפיזיקוכימיות של החלקיקים16. כאן, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי לחשיפה של קו תאי אפיתל מכתשית ב-ALI.

פרוטוקול

1. תרבית תאי אפיתל ריאה ב-ALI

הערה: כאן, מתואר פרוטוקול לתרבית תאי A549 ב-ALI. אנא עיין בספרות עבור סוג התא שישמש במחקר. קווי תאים שונים זקוקים לפרק זמן שונה ב-ALI כדי להתמיין, ליצור צמתים הדוקים ולייצר פעילי שטח/ריר.

  1. תרבית תאים
    1. הכן את המדיה על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 5 מ"ל של גלוטמקס, 5 מ"ל של אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית ו-500 מיקרוליטר של גנטמיצין לבקבוק של 500 מ"ל של DMEM.
    2. מניחים מדיה מוכנה באמבט מים למשך 10-15 דקות לחימום ל -37 מעלות צלזיוס.
    3. רססו את ארון הבטיחות הביולוגית ב-70% אתנול ונגבו אותו. לאחר חימום המדיום, הנח אותו מתחת לארון הבטיחות הביולוגית המעוקר.
    4. מתחת למכסה המנוע, צינור כ -10 מ"ל מדיה לצינור של 15 מ"ל.
    5. אחזר תאים מחנקן נוזלי והפשיר על ידי ערבוב עדין באמבט מים.
    6. מתחת למכסה המנוע, הכניסו את התאים המופשרים של הקריוביאל לתוך צינור 15 מ"ל.
    7. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב -300 גרם למשך 5 דקות.
    8. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.
    9. מערבבים את הגלולה עם מדיה ומעבירים אותה לבקבוק T75 .
    10. בדוק את בקבוק T75 תחת מיקרוסקופ.
    11. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עם לחות רוויה.
    12. רענן את מדיית תרבית התאים כל 2-3 ימים.
    13. מעבר וגידול תאים עד להגעה לספירת התאים הרצויה. כדי לזרוע צלחת אחת של 12 בארות, נדרשים 3 × 106 תאים.
  2. ציפוי קולגן של טרנסוולים
    1. הכנת תמיסת קולגן
      1. יש להמיס 10 מ"ג של קולגן מסוג IV ב-20 מ"ל של ddH2O עם 50 מיקרוליטר של חומצה אצטית קרחונית
      2. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, תוך ערבוב מדי פעם, עד להמסה מלאה.
      3. עקר את התמיסה על ידי סינון דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
      4. יש להוציא 1.5 מ"ל מהתמיסה לצינורות של 15 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. ציפוי מסנני טרנסוול עם קולגן מסוג IV
      1. יש להפשיר שפופרת אחת של קולגן מסוג IV (50 מיקרוגרם/מ"ל) מ-20 מעלות צלזיוס.
      2. הוסיפו 150 מיקרוליטר קולגן לכל מסנן Transwell.
        הערה: רק צלחות של 12 בארות תואמות למערכת החשיפה.
      3. השאירו צלחות עם מכסים פתוחים בארון הבטיחות הביולוגית (BSC) למשך 18 שעות לייבוש.
      4. יש לעקר על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
    3. יש לאחסן צלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עטופות בפרפילם, עד 30 יום.
    4. לפני ציפוי התאים, יש לשטוף את שני צידי המסננים במי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS).
  3. זריעת תאים בתוספות ומעבר ל-ALI
    1. הכנת מתלה צלחת ותא
      1. פיפטה 1.5 מ"ל של מדיה מוכנה מחוממת מראש לכל באר של צלחת 12 הבארות.
      2. הנח את הצלחת לתוך החממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      3. הכן תרחיף תאים בריכוז של 5 × 105 תאים/מ"ל במדיה מוכנה.
    2. זריעת תאים בתוספות
      1. הסר את צלחת תרבית התאים המוכנה מהחממה והנח אותה מתחת לארון בטיחות ביולוגית מעוקר.
      2. פיפטה 0.5 מ"ל של תרחיף התא (2.5 × 105 תאים/תוספת) על החלק העליון של הממברנה בתוספת.
      3. מכסים את הצלחת במכסה הצלחת שלה ומניחים אותה בחזרה לתוך החממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    3. הקמת ALI
      1. הסר את המדיה האפיקלית 24 שעות לאחר זריעת התאים.
      2. החלף את המדיה הבסיסית ב-0.6 מ"ל של מדיה מוכנה. בשלב זה, התאים נחשפים אפיקלית לאוויר, ויוצרים את ה-ALI.
      3. תרבית תאי A549 ב-ALI עד שבועיים, החלפת מדיה כל יומיים כדי לאפשר לתאים להתמיין כפי שאופיין בעבר4.

2. הערכת דוזימטריה של חשיפה לאדי קנאביס באמצעות LC/MS

הערה: בחלק זה של הפרוטוקול, נעשה שימוש בשיטות נטולות תאים כדי לאפיין את מינון אדי הקנאביס המופקדים בתוך כל באר על ידי ניתוח ריכוזי Δ 9-THC. Δ9-THC נצמד לחומרים פלסטיים, ולכן יש להשתמש רק בבקבוקוני זכוכית לאיסוף דגימות. שיטה זו דורשת שזן הקנאביס שנבחר יכיל Δ9-THC.

  1. הכנה והתקנה של מערכת החשיפה
    1. הגדר את הצינור למערכת החשיפה בהתאם לנתיב הזרימה שצוין (איור 1A, B): יחידת ENDS > מעבה > משאבת נשיפה > מכלול דגימה איזומטרית עם משאבת Aeroneb > expoCube > חיישן לחות עם מסנן > יציאת זרימת חשיפה של ExpoCube.
    2. הפעל את בקרות הטמפרטורה כדי לחמם את המערכת ל-35 מעלות צלזיוס ו-50 מעלות צלזיוס.
    3. בצע בדיקות זרימה כדי לוודא שהמערכת נטולת דליפות והלחצים מוגדרים כהלכה (עיין ב-SCIREQ Technote A Guide to Troubleshooting Uneven Flows in the expoCube).
    4. הפעל את משאבות Aeroneb כדי להשיג לחות יחסית של יותר מ-75%.
  2. בדיקת דוזימטריה והכנת וופורייזר
    1. הכנת וופורייזר קנאביס
      1. טוחנים את פרח הקנאביס בעזרת מטחנת עשבי תיבול.
      2. שקלו 0.25 גרם אליקוטים, השתמשו במפריד גלולות כדי לארגן כל מנה.
      3. הנח תוספות נירוסטה בשורת החשיפה של צלחת הטרנסוול בעלת 12 הבארות בתוך מערכת החשיפה.
  3. חשיפת תוספות נירוסטה לאדי קנאביס
    1. התחל חשיפה
      1. אורזים את תנור האידוי עם 0.25 גרם קנאביס.
      2. חבר את וופורייזר הקנאביס ליחידת ה-ENDS של מערכת החשיפה עם אטם מאובטח והתחל במשטר הנשיפה הרצוי. הגדר את הוופורייזר להגדרת הטמפרטורה של Smart Path Level 2 .
        הערה: למערכת החשיפה המשמשת במחקר זה יש ארבע רמות נתיב חכם לבחירה, כולל רמה 1 (176-188 מעלות צלזיוס), רמה 2 (188-199 מעלות צלזיוס), רמה 3 (199-210 מעלות צלזיוס) ורמה 4 (210-221 מעלות צלזיוס).
      3. צור פרופיל נשיפה בתוכנת flexiWare (תוכנת רכישת נתונים; עיין ב-SCIREQ Technote: מדריך ליצירת פרופילים עבור flexiWare 8). עבור פרוטוקול זה, השתמש בנפח נשיפה של 70 מ"ל בתדירות של 4 שאיפות לדקה.
      4. הפעל את וופורייזר העשבים היבש למשך 5 דקות לפני החלפת הקנאביס על ידי הוצאת פרח הקנאביס מתנור האידוי והוספת 0.25 גרם קנאביס טרי לוופורייזר. החלף בין שני מכשירי אידוי לחשיפה מתמשכת.
      5. המשך בשלבים 2.3.1.1-2.3.1.4 עד להגעה לזמן החשיפה הרצוי.
    2. לאחר כל חשיפה, הסר בזהירות את התוספות ממערכת החשיפה באמצעות פינצטה והכן אותן לאיסוף דגימות כמתואר להלן.
  4. איסוף והכנת דגימות לניתוח LC/MS
    1. בעזרת פינצטה, הנח מסננים המתאימים לכל חשיפה לתוך בקבוקון זכוכית מסומן המכיל 10 מ"ל מתנול בדרגת LC/MS (למשל, חשיפה 1, חשיפה 2, חשיפה 3).
    2. שוטפים את התוספת.
      1. הנח כל תוספת נירוסטה חשופה לתוך בקבוקון זכוכית מסומן המכיל 10 מ"ל מתנול בדרגת LC/MS.
      2. סמן בקבוקונים לפי חשיפה (למשל, חשיפה 1 באר 1-4).
    3. תמצית Δ9-THC
      1. השתמש באמבט סוניקטור כדי לסוניקציה של הבקבוקונים עם תוספות למשך 10 דקות כדי לחלץ Δ9-THC.
      2. העבירו את התוספות לסט שני של בקבוקוני זכוכית עם 10 מ"ל מתנול טרי וסוניקט למשך 10 דקות נוספות.
    4. הגש את כל הדגימות המוכנות (בארות, שטיפה ומסנן) לניתוח LC/MS כדי לכמת את רמות Δ 9-THC.
  5. חישובי דוזימטריה
    1. באמצעות תוצאות ניתוח LC/MS, חשב את כמות ה-Δ9-THC המופקדת כדי לקבוע את המינון של זרימת החשיפה (הכמות המופקדת במסנן) ואת המינון בבאר.
    2. חשב את היחס בין מסנן זרימת החשיפה לתצהיר הבאר עבור Δ9-THC.
    3. השתמש ביחס זה כדי לקבוע את המינון שיועבר לתאים במהלך החשיפה.

3. הערכת דוזימטריה של חשיפה לאדי קנאביס באמצעות מיקרו-איזון גביש קוורץ

הערה: שיטה זו מפרטת את ההגדרה והכיול של מיקרו-איזון קריסטל קוורץ (QCM) כדי להעריך את מסת חלקיקי אדי הקנאביס המופקדים במהלך החשיפה. כל QCM מספק מדידות בזמן אמת, המאפשרות מינון מדויק של החשיפה לאדי קנאביס.

  1. הכנה והתקנה של ה-QCM במערכת החשיפה
    1. הגדר את מערכת החשיפה כמתואר קודם לכן.
    2. חבר כל QCM למודול האלקטרוניקה שלו באמצעות מחבר הקליפ, וחבר את המודול לכניסות יחידת inExpose (פלטפורמת חשיפה לשאיפה) עם מחבר 7 פינים.
    3. הנח תוספות QCM לתוך צלחת באר בצד החשיפה של מערכת החשיפה, וודא שה-QCM מיושר היטב.
    4. מחממים את מערכת החשיפה עם QCMs מחוברים עד שהמערכת מתייצבת בטמפרטורות היעד של 35 מעלות צלזיוס ו-50 מעלות צלזיוס.
    5. הפעל מיקרו-זרימות וזרימות חשיפה בהתאם להגדרות הניסוי.
  2. כיול ה-QCM
    1. השתמש באשף כיול תוכנת רכישת הנתונים כדי לכייל את ה-QCM לפני כל ריצת חשיפה.
    2. המתן עד שסרגל הכיול הכחול יתייצב, ולאחר מכן בחר הבא כדי להקליט את תדר התהודה QCM לחישובי מסה מדויקים.
      הערה: טווח הכיול הצפוי הוא -15% עד 15%. סטיות עשויות להצביע על בעיות כמו QCM מלוכלך או מחבר LEMO מנותק.
  3. ניטור בזמן אמת של אותות QCM
    1. עקוב אחר יציאות QCM; המערכת מוציאה את המסה המצטברת שהופקדה. הערך מוצג בתוכנת רכישת נתונים הן כחלק מגרף והן כערך הנוכחי בפועל.
      הערה: עבור כל ריצה ניסיונית, התצהיר המקסימלי והמינימלי מדווחים גם בתוכנה.
  4. ניקוי ה-QCM
    1. כדי לשמור על דיוק, נקה את ה-QCM לאחר כל ניסוי.
    2. הוסף 1 מ"ל של 70% אלכוהול איזופרופיל בתוך כל תוספת QCM.
    3. פיפטו את תמיסת האלכוהול למעלה ולמטה 2-3 פעמים כדי להמיס שאריות.
    4. הסר את תמיסת האלכוהול ואפשר ל-QCM להתייבש לחלוטין באוויר בסביבה נטולת אבק לפני השימוש הבא.

4. תוצאות של חשיפת תאים לאדי קנאביס

הערה: פרוטוקול זה נועד להעריך את ההשפעות של אדי קנאביס על תאי נשימה שגודלו ב-ALI באמצעות מערכת expoCube. בדיקות לאחר החשיפה, כולל 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ולקטט דהידרוגנאז (LDH), מספקות תובנות לגבי ציטוטוקסיות תלוית מינון ופעילות מטבולית.

  1. אספקת אדי קנאביס
    1. הגדר את מערכת החשיפה כמתואר לעיל: ודא שהמערכת הגיעה לרמות טמפרטורה ולחות יחסית של 35 מעלות צלזיוס ו-50 מעלות צלזיוס מעל 75%.
    2. אם אתה משתמש ב-QCM, חבר את המכשיר למודול האלקטרוניקה שלו באמצעות מחבר הקליפ, וחבר את המודול לכניסות יחידת החשיפה לשאיפה באמצעות מחבר בעל 7 פינים. הנח את תוספת ה-QCM היחידה לתוך צלחת באר בצד החשיפה של ה-expoCube, וודא שה-QCM מיושר היטב.
    3. פתח את מערכת החשיפה והנח את צלחת תרבית התאים בפנים.
    4. התחל את משטר הפחזניות למשך הזמן הרצוי בהתבסס על סעיף 2. השימוש ב-QCM יאפשר מעקב בזמן אמת אחר סך האדים שהושקעו.
    5. לאחר החשיפה, החזר תאים לחממה עד לנקודת הזמן הרצויה לבדיקה.
    6. אסוף דגימות לפי הצורך מתאים שונים, כולל התא הבסיסי, שטיפת התא האפיקלי (עבור פעילי שטח או ריר) וליזאט התא.
    7. מבחני בחירת מינון: השתמש במבחני LDH ו-MTT כדי לסייע בקביעת מינון אופטימלי וציטוטוקסיות פוטנציאלית.
  2. בדיקת LDH לתאים ב-ALI
    1. איסוף מדיה: בנקודת הזמן הרצויה לאחר החשיפה, אסוף מדיה מהתא הבסיסי.
    2. העבר 100 מיקרוליטר של מדיה שנאספה למיקרו-פלטה שקופה של 96 בארות.
    3. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תערובת תגובת LDH טרייה שהוכנה לכל באר.
    4. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות, והגנו עליה מפני אור.
    5. מדוד ספיגה ב-490-492 ננומטר, באמצעות אורך גל ייחוס מעל 600 ננומטר.
    6. חשב ציטוטוקסיות באמצעות הנוסחה הבאה:
      ציטוטוקסיות (%) = (ערך ניסוי-בקרה שלילית)/(בקרה חיובית-בקרה שלילית) x 100
  3. בדיקת MTT לתאים ב-ALI
    1. תרבית תאי A549 ב-ALI כפי שנקבע בעבר.
    2. לאחר מסירת החשיפה במערכת החשיפה, החזר תאים לחממה עד לנקודת הזמן הרצויה לבדיקה.
    3. ממיסים 1 מ"ג MTT ב-1 מ"ל של PBS כדי ליצור את תמיסת ה-MTT.
    4. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת MTT לצד האפיקלי של התאים ו-500 מיקרוליטר של תמיסת MTT לתא הבסיסי.
    5. החזר תאים לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    6. הסר בזהירות את כל המדיה.
    7. הוסף 500 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לצד האפיקלי ו -1,000 מיקרוליטר של DMSO לצד הבסיסי.
    8. יש לדגור למשך שעה אחת כדי להמיס גבישי פורמזן.
    9. אוספים ומשלבים את התמיסה הן מהצד האפיקלי והן מהצד הבסיסי.
    10. מדוד ספיגה ב-540 ננומטר (OD540) עם ייחוס ב-690 ננומטר (OD690).
    11. חשב את כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה:
      כדאיות התא (%) = 100 × (ממוצע OD_exposure/ממוצע OD_negative בקרה)

תוצאות

במהלך ניסויים עם מערכת expoCube, ארבע בארות מקבלות את החשיפה לאדי קנאביס, ארבע בארות חשופות לאוויר ממוזג כבקרות רכב, וארבע הבארות הנותרות סגורות לחלוטין כבקרות שליליות (איור 1C)17. הגדרה זו מאפשרת השוואה מדויקת בין מצבים מטופלים, רכבים ושליליים. המערכת עוברת לחות כדי ליצור סביבה המתאימה לתרביות תאים (איור 2), וויסות הטמפרטורה בתוך המערכת משפר את שקיעת החלקיקים באמצעות תרמופורזה, ומאפשר אספקה יעילה של תרכובות מאודות לתאים18. כדי לכמת את החשיפה, אנו מודדים את כמות Δ9-THC כסמן לשקיעת אדי קנאביס באתר החשיפה לתא. כימות זה חיוני לאופטימיזציה של זמני החשיפה והמינונים, ומאפשר לחוקרים להתאים את תקופות החשיפה הפעילה כדי להשיג מינונים רצויים בניסויים בתרבית תאים (איור 3). על ידי חישוב היחס בין Δ9-THC שנאסף במסנן זרימת החשיפה לכמות המופקדת בבארות בודדות, אנו יכולים להעריך את המינון בפועל המועבר לתאים (טבלה 1). מינון מחושב זה מודיע על טווח החשיפה הרצוי, ומסייע בקביעת פרמטרים אופטימליים לחקר תגובות תאיות לאדי קנאביס באופן עקבי ומדיד. ניתן לבצע זאת עבור קנבינואידים אחרים, בהתאם לפרופיל הקנבינואידים של זן הקנאביס שנבחר. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח QCM למדידת שקיעת אדי קנאביס בזמן אמת. איור 4 מציג את שקיעת אדי הקנאביס על פני מהלך זמן של 30 דקות שבו הוחלפו הוופורייזר וחומר הקנאביס כל 5 דקות. כל באר הציגה עלייה עקבית במסה לאורך זמן, מה שמעיד על שקיעה יעילה ומתמשכת של חלקיקי אדי קנאביס שלמים.

figure-results-1
איור 1: סכימה של מערכת החשיפה ALI/Transwell in vitro/ex vivo לחשיפה לאדי קנאביס ב-ALI. (A) הוופורייזר DaVinci MIQRO שימש לייצור אדי קנאביס. דגימה זו מרטיבה ומועברת דרך הדגימה האיזוקינטית אל אתר החשיפה. יחידת הבקרה מאפשרת התאמות ליציאות זרימת האוויר ושיפועי הטמפרטורה. (ב) תצלומים של מערך מערכת החשיפה. (C) החלק הפנימי של ה-expoCube מחולק לשלוש שורות: שורת בדיקה לחשיפה לאדי קנאביס, שורת בקרת רכב של אוויר ממוזג, ושורת הבקרה השלילית הסגורה שנשארת ללא מגע על ידי זרימת אוויר כלשהי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פרופיל לחות יחסית (%) שנרשם לאורך זמן. נתונים אלה מציגים את רמות הלחות היחסית כאשר האירונבים מופעלים, ומגיעים ושומרים על לחות ממוצעת של 75%. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: כימות שקיעת Δ 9-THC באמצעות ניתוח LC/MS לאחר חשיפה של 30 דקות לאדי קנאביס. (א-C) שקיעת Δ9-THC נמדדה בכל באר לאחר שלוש חשיפות אדים עצמאיות של 30 דקות, כל אחת באמצעות 1.5 גרם של זן קנאביס עתיר THC. רמות Δ9-THC כומתו על ידי LC/MS. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4
איור 4: מדידות QCM של שקיעת אדי קנאביס במערכת החשיפה ALI/Transwell in vitro/ex vivo על פני משטר חשיפה של 30 דקות. (A-D)כל גרף מייצג את התצהיר המצטבר של חלקיקי אדי קנאביס בבארות 1-4, עם מסה שנמדדת במיקרוגרם (μg) לאורך זמן. קצב התצהיר מדגים הצטברות קבועה בכל הבארות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תצהיר מסנן זרימה ראשוני (μg)משקעי באר (μg)אחוז הזרימה הראשונית שהושקעה בבאר (%)
חשיפה 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
חשיפה 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
חשיפה 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
ממוצע2422.94.30.18
סטיית תקן292.80.40.03

טבלה 1. השוואה של שקיעת Δ9-THC במערכת החשיפה ALI/Transwell in vitro/ex vivo בין מסנן זרימת החשיפה לאתר החשיפה לתא.

דיון

תרבית תאים ב-ALI היא שיטה חשובה במחקר נשימתי בשל יכולתה לייצג בצורה מדויקת יותר את תנאי דרכי הנשימה in vivo בהשוואה לתרביות שקועות מסורתיות19. תרבית ב-ALI מאפשרת לתאי אפיתל ריאה להיחשף ישירות לאוויר על פני השטח הקודקודיים שלהם תוך שמירה על חומרים מזינים חיוניים ממדיום התרבות בצד הבסיסי. מערך זה מאפשר לתאים לייצר פעילי שטח או ריר, מרכיבי מפתח במנגנון ההגנה הנשימתי שהם קריטיים ללכידה והסרה של חלקיקים ופתוגנים נשאפים 20,21,22. תאי A549 משמשים בדרך כלל למחקרי מבחנה, אך הם רק אחת מתרביות תאי אפיתל נשימה רבות שניתן להשתמש בהן עבור ALI. סילבה ועמיתיו סקרו קווי תאים ותרביות ראשוניות של אפיתל הנשימה עבור ALI מחלל האף לנאדיות22. הגמישות של מערכת החשיפה ל-ALI המוצגת מאפשרת להתאים אותה לקווי תאים שונים ולתאים ראשוניים.

תרביות ALI נחשבות יותר ויותר ל"תקן הזהב" למחקרי שאיפה במבחנה , במיוחד למחקר על מזהמי אוויר, חלקיקים וחומרים אחרים הניתנים לשאיפה23. יתרון עיקרי של מודלים של ALI טמון ביכולתם לספק תובנות הניתנות לתרגום טוב יותר להשפעות אנושיות in vivo . עם זאת, חסרון בולט הוא היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים לחשיפה ל-ALI, מה שמשפיע על יכולת השחזור וההשוואה בין מחקרים. אחד הפערים הוא זרימת עבודה סטנדרטית של חשיפה. על ידי חשיפת תאים לאדי קנאביס ב-ALI, ניתן להעריך את השפעות הקנאביס על תפקוד התא, הכדאיות והציטוטוקסיות. חשיפות אלו מאפשרות הערכה מפורטת של תוצאות ביולוגיות, כולל סמנים של ציטוטוקסיות, דלקת ומתח חמצוני. הכימות המדויק של קנבינואידים שהופקדו מאפשר מחקרים הניתנים לשחזור על ההשפעות התאיות של אדי קנאביס (וצורות אחרות של מוצרי קנאביס), ומקדם את ההבנה שלנו לגבי ההשפעות הבריאותיות הפוטנציאליות שלהם בסביבת מעבדה מבוקרת.

מערכות חשיפה מתקדמות נותנות מענה למגבלות בתרביות שקועות מסורתיות על ידי מתן אפשרות לשקיעה ישירה של חלקיקים על פני התא, ובכך מספקות חשיפות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית. זה גם מפחית את ההשפעות הפוטנציאליות של הממיסים או הנשאים. על ידי מתן אפשרות לשקיעת חלקיקים ישירה ללא צורך בממיסים אלה, מערכות חשיפה עוזרות למזער את ההשפעות הקשורות לרכב. עם זאת, נותרו כמה שיקולים הקשורים לרכב. לדוגמה, רמות לחות בלתי מבוקרות עלולות לגרום ללחץ תאים לא רצוי24, מה שעלול להשפיע על תוצאות הניסוי. הקפדה על ויסות הלחות בקפידה כדי להגיע לרמות אופטימליות חיונית לשמירה על יציבות התאים ודיוק בתוצאות. בנוסף, לכל חלקיק, תרסיס או תערובת גז יש תכונות פיזיקוכימיות ייחודיות משלו, שעלולות לשנות את התצהיר על פני התא25. לכן, חשוב לאפיין משטר חשיפה לכל מוצר ייחודי. הגורמים שיכולים להשפיע על שקיעת החלקיקים כוללים תרמופורזה, תנועת חלקיקים מאזור של טמפרטורה גבוהה לנמוכה יותר26. תרמופורזיס מסייע בהפניית חלקיקים לעבר התאים ומשפר את יעילות התצהיר.

עקביות מינון ודיוק הם אתגרים נוספים בעבודה עם מערכות חשיפה ב-ALI, במיוחד כאשר מעורבים אירוסולים או חלקיקים. שקיעת חלקיקים בריאה in vivo היא תהליך מורכב המושפע מגודל החלקיקים, צורתם, צפיפותו ומסיסותם, כמו גם מהאזור הספציפי של הריאה שנחשף27. גורמים אלה מביאים לשיעורי שקיעה מגוונים שיכולים להיות קשים לשכפול במבחנה. מודלים מתמטיים, כגון דוזימטריית חלקיקים מרובת נתיבים (MPPD), הם כלים שימושיים להערכת שיעורי שקיעה in vivo והנחיית תרגום מינון במבחנה 28. עם זאת, התאמת מינון במבחנה לתרחישי חשיפה in vivo נותרה אתגר, במיוחד עבור אירוסולים מורכבים עם הרכבים הטרוגניים.

לאפיון מינון נטול תאים, חשוב לציין ששטיפות תוספת נירוסטה נוטות להעריך יתר על המידה את התצהיר, מכיוון שתרכובות יכולות להיצמד הן לדפנות התוספת והן לבסיס שבו נמצאים התאים בדרך כלל. ה-QCM מציע כאן יתרון על ידי מדידת המסה המופקדת ישירות במיקום תרבית התאים, ומספק הערכה מדויקת יותר של התצהיר הרלוונטי במיוחד לחשיפה לתאים.

ככל שהטוקסיקולוגיה מתקדמת לעבר מודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, אימוץ פרוטוקולי חשיפה מאוחדים ל-ALI יהיה בסיסי בגישור על הפער בין ממצאים במבחנה לתגובות אנושיות in vivo , ובסופו של דבר יתמוך בהערכות אמינות יותר של רעלים נשימתיים והשפעותיהם על הבריאות.

גילויים

PG ו-BU מועסקים ב-SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW השלימה התמחות ב-SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. באמצעות תוכנית Mitacs Accelerate. למחברים האחרים אין קונפליקטים לחשוף

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) 162273. CJB נתמך על ידי Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS). מחקר זה נתמך גם על ידי מענק Mitacs #IT34076 ל-ETW.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, מתלה (מתלה פוליסטירן), סטרילימונטריאול ביוטק בע"מ
בקבוקוני זכוכית 30 מ"לתומאס סיינטיפיק1755F32
A549 תאיםATCCCCL-185
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100x)Wisent450-115-EL
מטחנת עשבי קנאביס Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL
ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
מילות מפתח=herb%2Bgrinder& qid=1736346511&
קידומת = עשב%2Bgrinder%2Caps%
2C168& sr=8-10& th=1
קולגן משליה אנושית, סוג IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 מ"מ transwell, 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליאסטר ממברנה מוסיףStemcell Technologies38023
ערכת זיהוי ציטוטוקסיות (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C וופורייזר עשבי תיבול יבשDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'34869
DMEM בינוניWisent319-005-CL
פרח קנאביס מיובשSocié té qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
ערך&fv1=		תכולת קנבינואידים THC: 17– 23% THC < 0.1% CBD 
סרום בקר עובריWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/גרסה 8.4.1
GentamycinWisent450-134-XL
חומצה אצטית קרחוניתSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
ב-ExpoCube חבילת חשיפה חוץ גופית   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
מתנול בדרגת LC/MSסיגמא-אולדריץ'106035
מי מלח חוצץ פוספטThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, משטח TC, מכסה מסנןThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, משטח TC, מכסה מסנןThermoFisher Scientific
תיאזוליל כחול טטרזוליום ברומידסיגמא-אולדריץ'M 2128MTT
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'108603
אמבט מנקה אולטרסאונדVWR18303סוניקטור אמבטיה
ארגונית גלולות שבועיתHealthSmart640-8223-0000
MBI601051C156499

מקורות

  1. Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
  2. Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
  3. Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
  4. Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
  5. Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
  6. Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
  7. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
  8. Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
  9. Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
  10. Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
  11. Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
  12. Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
  13. Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
  14. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
  15. Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  16. Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
  17. Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  18. Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
  19. Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  20. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  21. Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
  22. Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  23. Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
  24. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
  25. Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
  26. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  27. Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
  28. Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חשיפה לאדי קנאביסרעילות שאיפהמערכת חשיפה למכשיר אידוימיקרו-מאזן של קריסטל קוורץתרבית תאי נשימהדוסימטריה בזמן אמתמדידת שיקוע אדיםמודל ריאה פרה-קליני
במבחנה חשיפות קנאביס של תאי אפיתל ריאה בממשק אוויר-נוזל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.