Method Article

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול צעד-אחר-צעד המדגים כיצד ניתן להתאים שיבוט מודולרי (MoClo) לשיבוט של אופרון פוליציסטרוני.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ערכות כלים של שיבוט מודולרי (MoClo) מאפשרות הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים. הם מבוססים על שיבוט שער הזהב, המשתמש באנזימי הגבלה מסוג IIS החותכים מחוץ לאתר הזיהוי שלהם. מכיוון שרצף הזיהוי והחיתוך מנותקים, ניתן לבחור בכוונה תלויים שנוצרו על ידי אנזימי הגבלה מסוג IIS, ואסטרטגיות שיבוט מונעות בדרך כלל חיתוך של מקטעי DNA שחוברו כהלכה. זה מאפשר הרכבות יעילות ביותר של מקטעי DNA מרובים בתגובה אחת. ב-MoClo, חלקי DNA פונקציונליים בודדים כגון מקדמים, אתרי קשירה ריבוזומליים, רצפי קידוד וסיומים, כמו גם מכלולים מסדר גבוה יותר, מוקצים מתלים סטנדרטיים, כך שניתן ליצור ספריות חלקים לשימוש חוזר. רוב ערכות הכלים של MoClo החיידקים מיועדות לשיבוט יחידות שעתוק חד-ציסטרוניות ואינן מספקות נתיב מובנה להרכבה של אופרון פוליציסטרוני. פרוטוקול זה מדגים את ההרכבה של יחידות שעתוק פוליציסטרוניות עם ערכת הכלים In- & Out-Cloning . אותה גישה ניתנת להעברה לערכות כלים אחרות של MoClo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוט מולקולרי, החדרת DNA רקומביננטי לרפליקון כגון פלסמיד, היא מתודולוגיה בסיסית בביולוגיה מולקולרית. שיטות הבנייה וההרכבה של DNA הפכו מתוחכמות יותר ויותר בעשורים האחרונים. עד כה, חוקרים יכולים לבנות כרומוזומים סינתטיים שלמים ואפילו גנומים מ-DNAמסונתז 1. שיבוט מולקולרי מסורתי מסתמך לעתים קרובות על אסטרטגיות שיבוט אד הוק, ויכול להיות מייגע ויקר עבור מבנים מרובי גנים גדולים2. בשנים האחרונות, שיבוט שער הזהב (GG) וערכות כלים היררכיות של שיבוט מודולרי (MoClo) 2,3 הפכו לפתרונות פופולריים כדי לאפשר הרכבת DNA חסכונית בזמן ובעלות.

אנזימי הגבלה מסוג IIS הם אנדונוקלאזות המזהים רצף כיווני (לא פלינדרומי) ונבקעים מחוץ לרצף זיהוי זה4. כתוצאה מכך, רצפי תלייה שנוצרו על ידי מחשוף אינם תלויים באתר הזיהוי, אך ניתן לבחור אותם4. יתר על כן, ניתן לעצב מקטעי DNA פונקציונליים, הנקראים כאן 'חלקים', כך שהמחשוף מסיר את אתר הזיהוי מהקצוות של חלקים2 שיש לחבר. אסטרטגיות שיבוט GG ממנפות זאת כדי לאפשר מכלולי DNA יעילים מרובי חלקים בתגובות סיר אחד5. ערכות הכלים של MoClo מבוססות על שיבוט GG, ומטרתן לספק דרך מודולרית והיררכית להרכבה של מבנים מרובי גנים. תלויים המשמשים להרכבת חלקים הם סטנדרטיים, ומאפשרים יצירת ספריות חלקים לשימוש חוזר ולהחלפה. ערכות הכלים של MoClo מסתמכות על פלסמידים מקבלים, אשר מתוכננים לקבל רצפי DNA מרובים ולשחרר את המוצר המורכב. כל פלסמיד מקבל מכיל שני אתרי זיהוי של שני אנזימים שונים מסוג IIS, כאשר האחד משמש לקבלת מטען DNA והשני לשחרור DNA מורכב 3,6. המחשה של עיקרון זה מוצגת באיור 1 עבור שיבוט של חלק בודד, טרמינטור, לפלסמיד מקבל MoClo (רמה 0). גם הפלסמיד המקבל וגם התוספת נחתכים על ידי אנזים ההגבלה BbsI, באופן שמשאיר תלויים תואמים ומסיר את אתרי הזיהוי של BbsI. פלסמידים קשורים כהלכה, לפיכך, אינם נחתכים יותר על ידי BbsI. חיתוך הפלסמיד המתקבל עם האנזים מסוג IIS SapI משחרר את השבר שהוכנס בעבר בשלב ההרכבה הבא (רמה 1).

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בארגז הכלים של MoClo In- and Out-Cloning 7. כאן, פלסמידים ברמה 0 מכילים חלקים גנטיים בסיסיים מוגדרים כגון מקדמים עם 5' אזורים לא מתורגמים (UTRs), רצפי קידוד וטרמינטורים עם 3'UTRs, איור 1 מציג סקירה סכמטית של רמה 0. ברמה 1, חלקים מרובים מורכבים ליחידת שעתוק (TU), איור 2 מציג סקירה סכמטית של חלקי רמה 1 ושיבוט. שיבוט פנימה והחוצה MoClo תוכנן להרכבה ללא צלקות של יחידות שעתוק ברמה 1 על ידי שימוש באנזים מסוג IIS היוצר תלויות של 3 נוקלאוטידים. זה מאפשר לתלויים להיות במלואם בתוך רסטר הקודון של רצף הקידוד, תוך שימוש בקודוני ההתחלה ATG ו-TGA stop עבור ההרכבה. רמות M ו-P משמשות להרכבה של יחידות שעתוק מרובות המשתחררות מפלסמידים ברמה1 3,8. איור 3 מציג סקירה סכמטית של החלקים לשיבוט לרמה M ו-P, והרכבה של אופרון ביסיסטרוני ברמה M (אופרון ביסיסטרוני הוא יחידת שעתוק המבטאת רצפי קידוד מרובים (CDS)). רמה P ו-M תוכננו כדי לאפשר רכיבה איטרטיבית מאחד לשני, כך שאין מגבלה תיאורטית על מספר החלקים שניתן להרכיב, אולם זה לא מתואר בפרוטוקול זה, שכן המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא להראות הרכבה של אופרון ביסיסטרוני. למרות שאין הגבלה על מספר החלקים שניתן להרכיב, יש גבול לגודל המבנה שניתן להרכיב; עד 100,000 bp הורכבו באמצעות ערכת MoClo9. יתר על כן, מבנים גדולים או מבנים המכילים גנים רעילים עלולים לגרום לעומס על התא; במקרים אלה, פרוטוקולים מותאמים פורסמו10.

In- and Out-Cloning בתחילה לא תיאר תוכנית להרכבה של יחידות שעתוק פוליציסטרוניות. אופרון פוליציסטרוני הוא מצב ארגון גנים נפוץ מאוד בחיידקים 11,12,13, ולכן יש עניין בולט בהרכבתם מלמטה למעלה בצורה מודולרית 14. כאן, מתוארת סכמה מובנית להרכבה של אופרון פוליציסטרוני באמצעות שיבוט פנימה והחוצה. התוכנית המוצגת מאפשרת החלפה קלה של מיקום רצפי הקידוד בתוך יחידות שעתוק פוליציסטרוניות, כמו גם מכלולים המורכבים משעתוק מונו-ופוליציסטרוני כאחד.

הפרוטוקול הבא שלב אחר שלב מציג את העיצוב והשיבוט של אופרון פוליציסטרוני באמצעות שיבוט פנימה והחוצה. ניתן להתאים בקלות את האסטרטגיה המוצגת לשיבוט יחידות שעתוק פוליציסטרוניות לערכות כלים אחרות של MoClo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מתאר את התכנון וההרכבה של אופרון פוליציסטרוני באמצעות שלוש רמות של תקן In-Cloning (0, 1 ו-M). האופרון הפוליציסטרוני המורכב כאן מתחיל עם מקדם, ואחריו אתר קשירה ריבוזומלי (RBS), רצף קידוד (CDS), RBS שני, CDS שני ולבסוף טרמינטור (איור S1). מומלץ מאוד להשתמש בתוכנת שיבוט מולקולרית כדי לדמות את השיבוט בסיליקו, כדי להבטיח שאסטרטגיית השיבוט המתוכננת נכונה. דוגמה להרכבת מקדם כחלק ברמה 0, הרכבת RBS עם רצף קידוד וסיום ליחידת שעתוק ברמה 1, והרכבה של אופרון ביסיסטרוני ברמה M מתוארת כאן, וסקירה סכמטית של המכלול כולו מוצגת באיור S1.

1. רמה 0: ביות חלקים

הערה: המונח "ביות" משמש כדי לציין שחלק מולקולרי שולב בספריית חלקי MoClo וניתן להרכיב אותו בכל הרמות של ערכת MoClo. בדרך כלל, כל אתרי הזיהוי של אנזימי הגבלה מסוג IIS המשמשים בערכה מוסרים מהחלק המיועד לביות, למשל, על ידי קידוד נרדף מחדש.

  1. עיצוב התוספת
    1. בחר את החלקים המולקולריים, כגון מקדם, CDS וטרמינטור, שיורכבו יחד באופרון.
      הערה: בפרוטוקול זה האופרון מתחיל עם המקדם PLuxB, אותו ניתן להפעיל על ידי החלבון LuxR בנוכחות התרכובת המשרה N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserine lactone (OC6)17. GFP הוא התקליטור הראשון של האופרון; ה-RBS שלה הוא iGEM BBa_B0064. אחרי GFP מגיע מקשר שאינו מסוף, 'גשר הטרמינטור'. ה-CDS השני הוא mTurquoise. ה-RBS שלו תוכנן על ידי מחשבון RBS18. לבסוף, האופרון מסתיים עם הטרמינטור L3S2P2119.
    2. בחר את המיקום בו יש להרכיב את החלק, מעלview מוצג באיור 1. בהתבסס על המיקום, בחר את הפלסמיד המקבל שישמש ב- GG.
      הערה: ניתן לביית חלקים לשימוש מאוחר יותר במיקומים שונים. לדוגמה, ניתן להרכיב מקדם כחלק יחיד מאוחר יותר בחיבור עם חלק 5'UTR (pSL252), או שניתן לביית אותו עם 5'UTR שכבר כלול (pSL099). ניתן להרכיב CDS בארבעה פלסמידים מקבלים, להרכבה ללא תג (pSL102), להרכבה עם תג מסוף N (pSL104), להרכבה עם תג מסוף C (pSL101), או להרכבה עם תג מסוף N ותג מסוף C (pSL103). בדוגמה הנתונה, המקדם מבוית ל-pSL252, ה-RBS הראשון מבוית ל-pSL253, ה-CDS הראשון מבוית ל-pSL102, גשר הטרמינטור מבוית ל-pSL106, ה-RBS השני מבוית ל-pSL099, ה-CDS השני מבוית ל-pSL102, והסיומת מבויתת ל-pSL106.
    3. הוסף הרחבות לתוספת המעוצבת על סמך הפלסמיד המקבל שנבחר. טבלה 1 מספקת סקירה כללית של ההרחבה הנדרשת להרכבת GG לכל פלסמיד מקבל. יש להוסיף הרחבות אלו במהלך תכנון הפריימרים ל-PCR, עיצוב האוליגו במקרה של חישול שני אוליגואים לבניית חלק, או במהלך סינתזת גנים.
      הערה: על מנת שחלק יהיה מבוית, יש לוודא שהחלק עצמו אינו מכיל אתרי זיהוי של אנזימים מסוג IIS המשמשים בערכה, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') ו-BsaI (5'-GGTCTC-3'). נוכחותם של אתרי זיהוי בחלקים מפחיתה באופן דרסטי את היעילות של הרכבה נכונה מכיוון שניתן לחתוך את המוצר הסופי על ידי האנזים המשומש מסוג IIS (ראה איור 1).
  2. תגובת GG
    1. לתגובת ה-GG, הוסף 50 fmol מהתוספת הרצויה, 50 fmol של הפלסמיד המקבל, 1 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 1 μL של T4 ligase ו-1 μL של BbsI. הוסף מים נטולי נוקלאז לנפח כולל של 10 מיקרוליטר. בנוסף, כלול בקרה שלילית עם אותה תגובה ללא התוספת הרצויה.
    2. הפעל את התוכנית הבאה במחזור תרמי: 25 מחזורים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (37 מעלות צלזיוס היא הטמפרטורה האופטימלית של אנזים ההגבלה) ו-16 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות (16 מעלות צלזיוס היא הטמפרטורה האופטימלית של T4 ליגאז), ולאחר מכן עיכול סופי ב-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (ב-50 מעלות צלזיוס, T4 ליגאז מראה מעט מאוד פעילות עד ללא פעילות, בעוד שאנזים ההגבלה עדיין מסוגל לתפקד, ובכך מגביל את כמות הפלסמיד המקבל הלא חתוך בתוצר הסופי) והשבתת חום של האנזימים ב-80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (ב-80 מעלות צלזיוס, כל האנזימים מושבתים בחום והתגובה מסתיימת)6.
    3. לשנות את תגובת ה-GG על ידי הוספת 5 מיקרוליטר של תגובת GG ב-50 מיקרוליטר של תאי E. coli בעלי יכולת כימית ולבצע טרנספורמציה של הלם חום עם שלב התאוששות כמתואר בפרוטוקול15 שפורסם בעבר.
    4. מורחים 100 מיקרוליטר של צמיחת הטרנספורמציה על צלחת אגר לוריא-ברטאני (LB) עם 100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    5. השווה את יעילות הטרנספורמציה של הבקרה השלילית לזו של המכלול השלם על ידי ספירת מספר המושבות הלבנות בשתי הלוחות. המשך לשלב הבא אם במכלול יש בערך פי 10 (או יותר) מושבות לבנות מאשר הבקרה השלילית.
      הערה: רוב המושבות המתקבלות צריכות להיות לבנות, עם רק חלק קטן מהמושבות האדומות. לפלסמידים מקבלים בערכת הכלים In-Cloning יש קלטת בחירה כפולה, המכילה mCherry (רמה 0 ורמה 1) או LacZα (רמה M ורמה P), וגן ccdB, המקודד מעכב ג'יראז. טרנספורמציה של תגובת ה-GG מתבצעת בתאי E. coli רגישים ל-ccdB, לפיכך, רק תאים שיש להם את הפלסמיד המורכב יכולים לגדול, בעוד שלא ניתן להפיץ את הפלסמיד המקבל המקורי. דוגמאות לזנים רגישים ל-ccdB כוללות DH5α ו-TOP10. ה-mCherry/LacZα מאפשר זיהוי חזותי של תאים הנמלטים ממנגנון ccdB 16.
    6. עבור כל מכלול, טפחו שתי מושבות לבנות על ידי איסוף חומר כלשהו של המושבה עם קצה פיפטה והשעייתו מחדש ל-5 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין כל אחת ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-250 סל"ד. בצע מיצוי פלסמיד מבוסס עמודות בהתאם להוראות היצרן. ודא שלפלסמיד המופק יש את הרצף הצפוי על ידי ריצוף Sanger.

2. רמה 1: קביעת עמדות

הערה: רמה 1 היא הרמה שבין ביות חלקים להרכבת אופרון פוליציסטרוני (איור 2). כאן נקבעים מיקומם של מכלולי ביניים במבנה הסופי. ניתן לשנות את המיקום של מכלול רמה 1 בתוך האופרון על ידי שימוש בפלסמיד מקבל אחר ברמה 1. הדוגמה הנתונה מתארת הרכבה של יחידה ביסיסטרונית, אך ניתן להתאים את התוכנית הנתונה בקלות להרכבה של עד שישה רצפי קידוד (עם RBS כל אחד). הרכבה של רצפי קידוד נוספים דורשת בנוסף רכיבה על אופניים בין רמה P ל-M. עם מחזוריות איטרטיבית בין רמה P ו-M, אין גבול עליון קבוע למספר רצפי הקידוד שניתן להרכיב לאופרון יחיד.

  1. בחירת חלקים ופלסמידים מקבלים
    1. בחר את החלקים ברמה 0 שיורכבו ליחידת תמלול. לכל הפחות, אלה צריכים לכלול מקדם, CDS וטרמינטור.
    2. בחר את המיקום בו יש להרכיב את יחידת התמלול באופרון. בהתבסס על עמדה זו, בחר את הפלסמיד המקבל המתאים. סקירה כללית מוצגת באיור 2.
      הערה: 7 שברי ה-DNA לבניית האופרון הביסיסטרוני המוצגים כדוגמה מורכבים לשני מבנים ברמה 1. המקדם, ה-RBS הראשון, ה-CDS הראשון וגשר הטרמינטור מורכבים ל-pSL68; ה-RBS השני, ה-CDS השני והטרמינטור מורכבים ל-pSL69.
  2. תגובת GG
    1. לתגובת ה-GG, הוסף 50 fmol מכל אחת מהתוספות הרצויות, 50 fmol של הפלסמיד המקבל, 1 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 1 μL של T4 ligase ו-1 μL של SapI. הוסף מים נטולי נוקלאז לנפח כולל של 10 מיקרוליטר.
    2. הפעל את התוכנית הבאה במחזור תרמי: 25 מחזורים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו-16 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ולאחר מכן עיכול סופי ב-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, והשבתת חום של האנזימים ב-80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות6.
    3. אופציונלי: הוסף 0.5 מיקרוליטר SapI לתגובת GG ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
      הערה: SapI אינו יציב כמו אנזימי הגבלה אחרים מסוג IIS. נמצא כי שלב עיכול עם SapI לאחר תגובת ה-GG מפחית את כמות המושבות הנושאות את הפלסמיד המקבל הקשור מחדש. ל-SapI יש איזוסכיזומר, BspQI, שאולי לא יזדקק לשלב העיכול הסופי הזה.
    4. התמיר 5 מיקרוליטר של תגובת GG ב-50 מיקרוליטר של תאי E. coli בעלי יכולת כימית ובצע טרנספורמציה של הלם חום, רצוי עם שלב התאוששות כפי שבוצע בשלב 1.2.3.
    5. לוח 100 מיקרוליטר של צמיחת הטרנספורמציה על צלחת אגר LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    6. עבור כל אחת, טפחו שתי מושבות לבנות על ידי איסוף חומר כלשהו מהמושבה עם קצה פיפטה והשעייתו מחדש ב-5 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין כל אחת. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-250 סל"ד. בצע מיצוי פלסמיד מבוסס עמודות בהתאם להוראות היצרן.
    7. אשר את ההרכבה הנכונה באמצעות תקציר הגבלה עם BbsI, ובדוק שגודל הגזרה תואם את הגודל הצפוי של התוספת. עכל 1000 ננוגרם של DNA פלסמיד על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של מאגר העיכול המתאים פי 10 ו-1 מיקרוליטר של BbsI. הוסף מים נטולי נוקלאז לנפח כולל של 10 מיקרוליטר. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    8. בצע אלקטרופורזה של ג'ל על ידי העמסת הפלסמיד המעוכל על ג'ל אגרוז 1%, הפעל את הג'ל ב-100 וולט למשך 35 דקות.
      הערה: ניתן לבצע עיכול בסיליקו של הפלסמיד הצפוי כדי לדמות ג'ל אגרוז כדי לחזות את התוצאה.

3. רמה M: הרכבה של אופרון פוליציסטרוני

הערה: בשלב זה, האופרון הפוליציסטרוני מורכב. במקרה המוצג של אופרון ביסיסטרוני, שני תוספות ברמה 1 מורכבות במיקומים 1 ו-2. בהתאם לכך, נבחר הפלסמיד המקבל pMA60. יתר על כן, נדרש מקשר קצה. לכל הפלסמידים המקבלים ברמה M ו-P יש את ה-GGGA התלייה כמתלה השני. מקשרי קצה מגשרים בין הפלסמיד המכניס למקבל ומאפשרים הרכבה של מבנה רמה P לרמה M ולהיפך. עבור מכלול רמה P של שני תוספות רמה 1, נעשה שימוש במקשר הקצה pMA668 והוא יתפוס את המיקום השלישי והאחרון. סקירה כללית של רמה M ו-P והדמיה של שלב השיבוט מוצגות באיור 3. עם הרכבה אך ורק ברמה M (או P), ניתן לשכפל אופרופונים של עד 6 רצפי קידוד (מיקומים 1-6). עמדה 7 תופסת על ידי מקשר הקצה. הרכבה של מספר גבוה יותר של רצפי קידוד באופרון אפשרית, אך דורשת רכיבה על אופניים לרמה M (או P), שאינה מתוארת בפרוטוקול זה.

  1. לתגובת GG, הוסף 50 fmol מכל תוספת רצויה, 50 fmol של הפלסמיד המקבל, 1 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 1 μL של T4 ligase ו-1 μL של BbsI. הוסף מים נטולי נוקלאז לנפח כולל של 10 מיקרוליטר.
  2. הפעל את התוכנית הבאה ב-thermocycler: 50 מחזורים של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו-16 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ולאחר מכן עיכול סופי ב-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות והשבתת חום של האנזימים ב-80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות6.
  3. התמיר 5 מיקרוליטר של תגובת GG ב-50 מיקרוליטר של תאי E. coli בעלי יכולת כימית ובצע טרנספורמציה של הלם חום עם שלב התאוששות כפי שבוצע בשלב 1.2.3.
  4. מורחים 100 מיקרוליטר של צמיחת הטרנספורמציה על צלחת אגר LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין. דגרו את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, או ב-30 מעלות צלזיוס אם מצפים לעומס מטבולי או רעילות של המכלול.
  5. עבור כל אסיפה, הכינו תרבות משתי מושבות לבנות. לשם כך, טבלו קצה פיפטה במושבה והשתמשו בו כדי לחסן 5 מ"ל של LB ב-100 מיקרוגרם/מ"ל ספקטינומיצין. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס או 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-250 סל"ד. בצע מיצוי פלסמיד מבוסס עמודות בהתאם להוראות היצרן.
  6. אשר הרכבה נכונה באמצעות תקציר הגבלה עם BsaI, ובדוק שגודל הגזרה תואם את הגודל הצפוי של התוספת, כפי שבוצע בשלב 2.2.7.
    הערה: המבנה עשוי להיות ארוך מדי מכדי להיות מכוסה על ידי רצף סנגר לאישור. לאחר מכן ניתן לאשר זאת על ידי ריצוף פלסמיד שלם, הזמין כשירות מסחרי ממספר ספקי שירותי ריצוף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מוצגות התוצאות של הרכבה מלמטה למעלה של אופרון פוליציסטרוני מרמה 0 עד רמה M (איור S1). האופרון מתחיל עם המקדם PLuxB, שיכול להיות מופעל על ידי החלבון LuxR בנוכחות התרכובת המשרה N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserine lactone (OC6)17. GFP הוא ה-CDS הראשון של האופרון, ה-RBS שלו הוא iGEM BBa_B0064. אחרי GFP מגיע מקשר שאינו מסוף, 'גשר הטרמינטור'. ה-RBS השני תוכנן על ידי מחשבון RBS18, ה-CDS השני הוא mTurquoise. לבסוף, האופר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוט מולקולרי יכול להיות גוזל זמן ומסורבל, במיוחד עם אסטרטגיות שיבוט אד הוק. ערכות כלים של MoClo יכולות לשפר את השיבוט המולקולרי על ידי המודולריות שלהן, ההרכבה ההיררכית ותגובות חד-פעמיות יעילות ביותר. הם מסתמכים על הרכבת DNA באמצעות תגובות שער הזהב. הודות לתלויות סטנדרטיות, ניתן לעשות שימוש חוזר בספריות של חלקים מולקולריים ולשתף אותן עם אחרים 3,6. השימוש החוזר בחלקים מאפשר יצירת ספריות קומבינטוריות מאוגדות או מסודרות של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV ו-DS נתמכו על ידי אגודת מקס פלאנק במסגרת פרויקט MaxGENESYS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אמפיציליןמרק לייף סיינסA9518
אגר חיידקיפישר סיינטיפיק  P0011B
BbsI-HFניו אינגלנד ביולאבסR3539
BsaI-HF V2ניו אינגלנד ביולאבסR3733
E. coli DH5α תאים מיומנים
אפנדורף  Mastercycler  Nexus Thermal Cyclersאפנדורף6333000014
ספקטרופוטומטר EzDrop 1000 מיקרו-נפחבלו-ריי ביוטקBRED-1000
ערכת מיני-פרפ של פלסמיד GeneJETתרמו-סיינטיפיקK0503
in- & Out- ערכת כלים לשיבוט
בופר ליגזהניו אינגלנד ביולאבסB0216
NaClפישר סיינטיפיק  BP358
ניו ברונסוויק אינובה ורג;   42/42R - מנער אינקובטור ניתן לערימהאפנדורףM1335-0080
PhenoBooth+Singer InstrumentsPHB-007
SapIניו אינגלנד ביולאבסR0569
ספקטינומיציןמרק לייף סיינסS4014
מעבדה סטנדרטית
ליגאז DNA של T4ניו אינגלנד ביולאבסM0202
תרמומיקס MMב. בראון ביוטכנולוגיה אינטרנשיונל
טריפטוןפישר סיינטיפיק  LP0042B
תמצית שמריםפישר סיינטיפיק  LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles