הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח מקיף של טסיות דם מקרישות המציגות מאפיינים של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68116

⸱

23 במאי 2025

 , 
1Department of Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Taussig Cancer Institute, Cleveland Clinic

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מספק מערך מקיף של נהלים הדרושים לניתוח טסיות דם פרו-קרישיות, המציגות תכונות חופפות של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם.

תקציר

טסיות הדם המסתובבות בזרם הדם שקטות יחסית אך "מופעלות" כאשר נתקלות בממריצים או "אגוניסטים" במקום הפגיעה בכלי הדם. טסיות פרו-אגרגטוריות ופרו-קרישיות מייצגות שתי אוכלוסיות נפרדות של טסיות מופעלות. בעוד שטסיות פרו-אגרגטוריות מקלות על הפסקת הדימום, או "המוסטזיס", על ידי יצירת פקק של טסיות דם המקובצות יחד דרך גשרי פיברינוגן, טסיות פרו-קרישה מאיצות באופן דרמטי את מפל הקרישה, ומגיעה לשיאה בהיווצרות קרישי פיברין. היבט מעניין של טסיות דם מקרישות הוא שהמורפולוגיה שלהן מציגה מאפיינים מסוימים של "נמק" ו"אפופטוזיס". לפיכך הם עשויים לייצג צורה של מוות תאי בטסיות דם, אם כי יש להם תפקיד חשוב בפקקת והמוסטזיס. מאמר זה מציג את הרעיון של טסיות דם פרו-קרישה, הרלוונטיות שלהן לבריאות ולמחלות, והשוואה בין השיטות הקיימות לניתוחן. לאחר מכן הוא מספק פרוטוקולים מקיפים לניתוח טסיות דם פרו-קרישה, חקירת מנגנוני היווצרותם והערכת תפקידם הפרוטרומבוטי בהקלת הקרישה. המאמר מסתיים בדיון בשלבים מרכזיים, מגבלות ועקרונות פתרון בעיות עבור השיטות המתוארות.

מבוא

ישנן לפחות שתי אוכלוסיות נפרדות של טסיות פעילות 1,2. טסיות פרו-אגרגטוריות מאופיינות בהפעלה גבוהה של אינטגרין וחשיפה נמוכה, אם בכלל, ל-PS. מצד שני, טסיות דם מקרישות מאופיינות בפעילות אינטגרין נמוכה וחשיפה גבוהה ל-PS 1,2, ומספקות משטח להרכבה של קומפלקסים טנאז ופרותרומבינאז3, שהוא פעיל פי 105-10 פי6 ופי 300000 מגורם פאזה מסיס בודד IXa ו-Xa, בהתאמה4. טסיות דם מעודדות קרישה מאיצות באופן דרמטי את הקרישה. היבט מעניין של טסיות דם פרו-קרישה הוא שהמורפולוגיה שלהן דומה למאפיינים מסוימים של "נמק" כגון מיקרו-שלפוחית, בלון של התא עם הפרעה בשלד הציטו ואובדן שלמות הממברנה, כמו גם אלה של "אפופטוזיס" כגון אובדן אסימטריה של פוספוליפידים בממברנה עם חשיפה של פוספטידילסרין בעלון החיצוני 5,6. במילים אחרות, היווצרות טסיות דם פרו-קרישה עשויה לייצג צורה של מוות תאים בטסיות דם, אם כי עם פונקציה פיזיולוגית חשובה בהמוסטזיס.

טסיות דם מקרישות קשורות באופן משמעותי להפרעות פקקתיות. בעוד שלרוב האנשים הבריאים אין טסיות דם מעודדות קרישה במחזור הדם, ~30% מהטסיות הרגילות מאמצות פנוטיפ פרוקו-קרישה ex vivo לאחר חשיפה לאגוניסטים חזקים כמו טרומבין וקולגן7. טסיות דם פרו-קרישה במחזור דווחו בטראומה, כאשר היווצרותן עשויה לשקף הפעלה על ידי היסטון H4 8,9. עם זאת, ברוב ההפרעות הפרוטרומבוטיות, רמות מוגברות של טסיות דם מקרישות מתגלות רק לאחר גירוי ex vivo 10. לדוגמה, לחולים עם שבץ מוחי חריף שאצלם >51.1% מהטסיות שלהם הומרו לטסיות דם מעודדות קרישה (הידועות גם בשם טסיות COATed) על ידי קולגן ותרומבין היה יחס סיכון של 10.72 לשבץ חוזר תוך 30 יום בהשוואה לחולים עםהיווצרות טסיות דם פרו-קרישה פחותה. תוצאות דומות דווחו בחולים עם התקפים איסכמיים חולפים וטרשת עורקים קרוטידית12. לעומת זאת, הפרעת הדימום תסמונת סקוט נובעת ממוטציה של ANO6, המקודדת את הסקרמבלאז הפוספוליפיד TMEM-16F, מה שמוביל לחשיפה חסרה של טסיות דםPS 13. הפרעות דימום אידיופטיות ודימום תוך גולגולתי עשויות להיות קשורות לירידה ביכולת לייצר טסיות דם פרו-קרישיות14.

לפיכך, הערכת טסיות דם מקרישות היא חלק מכל ניתוח של תפקוד טסיות הדם לא רק במהלך חקירות בסיסיות של מנגנוני הפעלת טסיות דם וכתוצאה מכך פקקת והמוסטזיס, אלא גם במהלך ניתוח קליני לסיכון לפקקת או דימום בחולים במצבים פתולוגיים שונים. פאנל של האגודה הבינלאומית לפקקת והמוסטזיס (ISTH) המליץ על שימוש בקשירת Annexin V וביטוי P-selectin על ידי זרימה ציטומטרית להבחנה בין פרוקו-קרישה מתת-אוכלוסיות טסיות אחרות15. המאמר דן גם בשיטות השונות שניתן להשתמש בהן כדי לנתח טסיות דם פרו-קרישה ואפופטוטיות, אך אינו מתאר את התהליכים בפירוט. שיטות אלה כוללות זיהוי של (1) הפעלת טסיות דם על ידי PAC1/JonA או קשירת פיברינוגן (ציטומטריית זרימה); (2) הפרשת גרגירי אלפא על ידי ביטוי P-selectin (ציטומטריית זרימה); (3) חשיפה ל-PS על ידי קשירת Annexin V/lactadherin (ציטומטריית זרימה); (4) אובדן שלמות הממברנה על ידי תיוג GSAO (ציטומטריית זרימה); (5) שינויים מורפולוגיים כמו בלון (מיקרוסקופיה); (6) זיהוי הפעלת קספאאז על ידי בדיקת קספאזה (אימונובלוטינג/לינומטריה/ציטומטריית זרימה) או פירוק של גלסולין מצע שלד ציטו (אימונובלוטינג); (7) אובדן פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית על ידי צבעים רגישים לפוטנציאל מיטוכונדריאלי כגון JC-1/Mitotracker (ציטומטריית זרימה); (8) סמנים אפופטוטיים פנימיים מיטוכונדריאלים שחרור Bax, Bak וציטוכרום c (אימונובלטינג); (9) תפקוד פרוקו-קרישה על ידי בדיקת יצירת תרומבין וקשירת גורם קרישה Xa/Va (ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה); (10) עליית סידן ציטוזולית ומיטוכונדריאלית על ידי צבעים רגישים לסידן פלואורסצנטיים (ציטומטריית זרימה, פלואורומטריה, מיקרוסקופיה).

המחקר הנוכחי מתעמק בפרוטוקולים מקיפים לניתוח טסיות דם פרו-קרישיות וכן מבדיל אותן מטסיות פרואגרגטוריות ואפופטוטיות. רוב ההליכים המתוארים מסתמכים על זרימה ציטומטרית שיש לה את היתרונות של (1) היותה זמינה וקלה לשימוש, (2) דורשת נפח דגימה נמוך, ו-(3) מאפשרת זיהוי בו זמנית של תת-אוכלוסיות מרובות של טסיות דם (פרואגרגטורי, פרוקו-קרישה ואפופטוטית)15. פרוטוקולים אלה המבוססים על ציטומטריית זרימה מתווספים למבחנים פונקציונליים של פעילות פרוקו-קרישה המבוססים על קשירת גורמי קרישה ומבחני יצירת תרומבין מבוססי קריש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

משתתפים אנושיים גויסו למחקר לדגימת דם ורידית היקפית לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, תוך הקפדה על ההמלצות והאישור של ועדת הביקורת המוסדית של מכון המחקר לרנר קליבלנד קליניק, כאשר כל מתודולוגיות המחקר תואמות את הסטנדרטים שנקבעו בהצהרת הלסינקי. משתתפים בוגרים בריאים מעל גיל 18 נכללו, בעוד שמשתתפים מתחת לגיל 18, אנשים עם היסטוריה עדכנית של אירועים טרומבוטיים בששת החודשים האחרונים, אלה עם היסטוריה של אלכוהוליזם או שימוש בסמים, ומשתתפים שהשתמשו בתרופות נוגדות טסיות או נוגדות קרישה בארבעת השבועות האחרונים לא נכללו. תיאור מפורט של חומרים וריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת טסיות דם

  1. לשאוב דגימות דם ורידיות היקפיות לנוגדי קרישה ACD (1:9 v/v) ממשתתפים אנושיים לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב, תוך הקפדה על ההמלצות שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית.
  2. צנטריפוגה הדם שנאסף ב-ACD ב-100 x גרם למשך 20 דקות ב-22 מעלות צלזיוס כדי לקבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) כסופרנטנט.
  3. צנטריפוגה את ה-PRP ב-800 x g למשך 7 דקות ב-22 מעלות צלזיוס לאחר הוספת 3 מיקרומטר של PGE1 ו-2 מ"מ של EDTA.
  4. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הטסיות במאגר A (ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטינג עדין.
  5. צנטריפוגה: טסיות הדם תלויות במאגר A ב-800 x גרם למשך 7 דקות ב-22 מעלות צלזיוס.
  6. השעו מחדש את כדור הטסיות במאגר B (ראה טבלת חומרים) על ידי פיפטינג עדין.
  7. התאם את ספירת הטסיות הסופית ל-1 ×10 7/מ"ל באמצעות מונה תאים אוטומטי.
    הערה: בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים ונקוט באמצעי זהירות כדי לשמור על טסיות הדם במצב מנוחה על ידי הימנעות מחשיפה לגזירה מוגזמת במהלך הפיפטינג.

2. אנליזה של טסיות דם פרו-קרישה על ידי זרימה ציטומטרית

  1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
  2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל, 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הגירוי, הוסף 1 מיקרוליטר כל אחד של PE-Annexin V, FITC-PAC1 ונוגדני CD62P אנטי-אנושיים APC ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים.
  4. דגרו את הטסיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה (1:1) של 2% פורמלין.
  6. נתח את הדגימות על ידי זרימה ציטומטרית כדי לכמת טסיות דם פרו-קרישה15,16.
  7. צייר שער אמורפי כדי להקיף טסיות דם, להפריד אותן מרעש וחלקיקים מרובי טסיות.
  8. אסוף את כל נתוני הקרינה באמצעות הגברה לוגריתמית של ארבעה רבעים עבור 10,000 אירועים בשער הטסיות מכל דגימה.
  9. הגדר אזורים לטסיות דם על סמך חיוביות פלואורסצנטית או שליליות לחשיפה לפוספטידילסרין (PS) (כריכת Annexin V), ביטוי P-selectin (CD62P) והפעלת אינטגרין αIIbβ3 (קשירת PAC1).
  10. קחו בחשבון טסיות חיוביות הן עבור חשיפה ל-PS (קשירת Annexin V) והן עבור ביטוי P-selectin (CD62P) אך שליליות עבור הפעלת אינטגרין αIIbβ3 (קשירת PAC1) כטסיות פרו-קרישה (איור 1) (טבלה 1).
  11. באופן דומה, קחו בחשבון טסיות חיוביות הן להפעלת אינטגרין αIIbβ3 (קשירת PAC1) והן לביטוי P-selectin (CD62P) אך שליליות לחשיפה ל-PS (קשירת Annexin V) כטסיות דם מצטברות.
    הערה: טסיות שליליות הן להפעלת אינטגרין αIIbβ3 (קשירת PAC1) והן לביטוי P-selectin (CD62P) אך חיוביות לחשיפה ל-PS (קשירת Annexin V) הן ככל הנראה טסיות אפופטוטיות15,16.

3. אנליזה של סידן מיטוכונדריאלי על ידי זרימה ציטומטרית

  1. יש לדלל טסיות דם אנושיות שטופות ל-1 ×10 6/מ"ל ולהשלים עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי בתרחיף טסיות של 100 מיקרוליטר).
  2. סמן את הטסיות עם 5 מיקרומטר רוד-2 AM (לסידן מיטוכונדריאלי) למשך 30 דקות בחושך.
  3. טסיות שער כראוי, כמתואר בשלב 2.
  4. נתח אירועים בשער הטסיות עבור שינויים תלויי זמן בקרינה הממוצעת של אירועים נרכשים במשך 5 דקות באמצעות תרשים פיזור צפיפות של פלואורסצנציה PE (עבור Rhod-2 AM) לעומת זמן.
  5. רשום את רמות הסידן הבסיסיות במשך הדקה הראשונה.
  6. הוסיפו תרומבין (0.1 ננוגרם/מ"ל, 0.25 ננוגרם/מ"ל, או 0.5 ננוגרם/מ"ל), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם, והמשיכו לאסוף נתונים עוד 4 דקות17.

4. ניתוח פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית על ידי ציטומטריית זרימה

  1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
  2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הגירוי, הוסף צבע תיוג מיטוכונדריה (ראה טבלת חומרים) בריכוז סופי של 500 ננומטר לתרחיפים המגורים של טסיות הדם.
  4. דגרו על הטסיות למשך 30 דקות בחושך.
  5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
  6. לנתח דגימות לפי זרימה ציטומטרית17.
  7. טסיות שער כמתואר בשלב 2.
  8. נתח אירועים בשער הטסיות לאיתור ירידה בקרינה בתעלת PE (עבור צבע תיוג המיטוכונדריה) של ציטומטר הזרימה.

5. ניתוח פעילות קספאז 3 וקספאז 8 על ידי זרימה ציטומטרית

  1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
  2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר הגירוי, הוסף מגיב לזיהוי אפופטוזיס 1:1000 (v/v) (ראה טבלת חומרים) (עבור מסלולי אפופטוזיס פנימיים וחיצוניים כאחד) או 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (עבור קספאז 8 של מסלול האפופטוזיס החיצוני) לתרחיפי הטסיות המגורים.
  4. דגרו על הטסיות למשך 30 דקות בחושך.
  5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
  6. לנתח דגימות לפי זרימה ציטומטרית17.
  7. טסיות שער כראוי, כמתואר בשלב 2.
  8. נתח אירועים בשער הטסיות לפלואורסצנטיות בתעלת FITC (עבור קספאז 3/7 או קספאז 8) של ציטומטר הזרימה.

6. אנליזה של קשירת פרותרומבין על ידי זרימה ציטומטרית

  1. צימוד פרותרומבין בקר עם צבע Alexa Fluor 488 באמצעות ערכת תיוג חלבון (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
  2. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי בתרחיף טסיות של 100 מיקרוליטר).
  3. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לאחר הגירוי, הוסף פרותרומבין בקר מצומד AF488 (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן CD62P אנטי-אנושי PE-Annexin V ו-APC ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים.
  5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
  6. לנתח דגימות על ידי זרימה ציטומטרית17 לכימות קשירת פרותרומבין לטסיות דם.
  7. צייר שער אמורפי כדי להקיף טסיות נפרדות מרעש וחלקיקים מרובי טסיות.
  8. אסוף את כל נתוני הקרינה באמצעות הגברה לוגריתמית של ארבעה רבעים עבור 10,000 אירועים בשער הטסיות מכל דגימה.
  9. צייר אזורים עבור טסיות דם עם פלואורסצנטיות חיוביות או שליליות לחשיפה ל-PS (כריכת Annexin V), ביטוי P-selectin (CD62P) ו-AF488-prothrombin (קשירת פרותרומבין).
  10. קבע את החלק היחסי של כל אירועי טסיות הדם, כמו גם את שיעור הטסיות החיוביות הן לחשיפה ל-PS (כריכת Annexin V) והן לביטוי P-selectin (CD62P) (טסיות דם פרוקו-קרישה), החיוביות לקשירת פרותרומבין.

7. ניתוח קשירת פרותרומבין במיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. צימוד פרותרומבין בקר עם צבע Alexa Fluor 488 באמצעות ערכת תיוג חלבון (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
  2. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי בתרחיף טסיות של 100 מיקרוליטר).
  3. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לאחר הגירוי, הוסף פרותרומבין בקר מצומד AF488 (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן CD62P אנטי-אנושי PE-Annexin V ו-APC ל-100 מיקרוליטר של תרחיפי טסיות מגורים.
  5. תקן את הטסיות על ידי הוספת נפח שווה של 2% פורמלין.
  6. גלולה את הטסיות הקבועות על כיסויים מצופים פולי-D-ליזין.
  7. הרכיבו כיסויים על שקופיות מיקרוסקופיה באמצעות תמיסה נגד דהייה.
  8. לחלופין, כיסויי מעיל עם קולגן (100 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת בתא לח.
  9. חסום את הכיסויים המצופים עם 0.5% BSA ב-PBS למשך שעה.
  10. סמן את הטסיות עם פרותרומבין בקר מצומד AF488 (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר כל אחד של נוגדן CD62P אנטי-אנושי PE-Annexin V ו-APC.
  11. אפשר לטסיות המסומנות להיצמד למשך 20 דקות על כיסויים מצופים קולגן.
  12. שטפו את הכיסויים עם טסיות דביקות שלוש פעמים עם PBS.
  13. תקן כיסויים עם 2% פרפורמלדהיד למשך שעה.
  14. הרכיבו כיסויים על שקופיות מיקרוסקופיה באמצעות תמיסה נגד דהייה.
  15. התבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה אובייקטיבית של 63×.
  16. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת פיג'י לכימות פלואורסצנטי.

8. בדיקת יצירת תרומבין תלויה בפוספוליפידים על בסיס טסיות דם

  1. תוסף טסיות דם אנושיות שטופות עם 2.5 מ"מ סידן (0.5 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 0.5 M במלאי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות דם).
  2. שמרו על חלק אחד של טסיות דם ללא גירוי ועוררו את השברים הנותרים עם טרומבין (0.1 U/mL, 0.25 U/mL, או 0.5 U/mL), קונוולקסין (20 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל או 100 ננוגרם/מ"ל), או השילוב שלהם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של טסיות דם מטופלות לתערובת של 50 מיקרוליטר של פלזמה רגילה מאוגדת ו-50 מיקרוליטר של תמיסת קאולין בעלת עכירות נמוכה (20 מ"ג/מ"ל), שהודגרה מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. מוסיפים לתערובת 5 מ"מ של CaCl2 .
  5. עקוב אחר היווצרות הקריש על ידי עכירות בקורא מיקרו-פלטות, ומדוד ספיגה ב-660 ננומטר כל 60 שניות למשך שעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חלק מהטסיות המופעלות הופכות ל"פרו-קרישות" עם עלייה אופיינית בביטוי פני השטח של פוספטידילסרין (PS) ו-P-סלקטין, מה שמבדיל אותן מטסיות "אפופטוטיות" שהן חיוביות רק לחשיפה ל-PS כמו גם טסיות "פרו-אגרגטוריות" שהן חיוביות לביטוי P-selectin. מצאנו כי תרומבין גורם לעלייה תלוית מינון בשיעור טסיות הדם החיוביות הן לביטוי P-selectin והן לביטוי PS כפי שזוהה על ידי קשירה של נוגדן FITC-anti-CD62P ו-PE-Annexin V, בהתאמה (איור 2). יצירת טסיות דם פרו-קרישה תלויה בזרם הסידן המיטוכונדריאלי18,19<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טסיות דם מעודדות קרישה מדגימות עלייה ניכרת ומתמשכת בסידן התוך תאי עם גירוי26, אך ניתן להפיק אותן באמצעות מנגנונים שונים. הם נוצרים על ידי גירוי אגוניסטי חזק עם קולגן ותרומבין באמצעות מתווכים נפרדים, כולל זרם הסידן המיטוכונדריאליהבולט ביותר 18,19 לאורך השיפוע האלקטרוכימי על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית עם עליות סידן ציטוזוליות הנגרמות על ידי אגוניסטים. ברגע שהסידן המיטוכונדריאלי מגיע לסף מסוים, הוא מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

תודות

פארש פ. קולקרני וקית' ר. מקריי, בהתאמה, מכירים בפרסי מענק עמית ופיילוט הממומנים על ידי VeloSano, קרן קליבלנד קליניק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) (עבור 1000 מ"ל)טרי-סודיום ציטראט-                    22 גרם
חומצת לימון-                                                    8 גרם
דקסטרוז-                                                          24.5 גרם<> מים-                                                                    נפח איפור עד 1000 מ"ל 
ערכת תיוג חלבון Alexa Fluor 488InvitrogenA10235
APC עכבר אנטי אנושי CD62PBD Pharmingen550888
בקר ProthrombinProlytixBCP-1010
Buffer A (הכנת טסיות דם)                                      מ.ו                Conc. in 1X          עבור תמיסת 100 מ"ל 10X
HEPES              238.30                20 מ"מ                                      4.766 גרם
NaCl                          58.44            134 מ"מ                                    7.83 גרם
KCl                              74.55              2.9 מ"מ                            216.19 מ"ג
MgCl2                  203.30                    1 מ"מ                          203.30 מ"ג
NaH2PO4      156.01              0.34 מילימטר                              53.04 מ"ג
NaHCO3              84 01                    12 מ"מ                     1.01 גרם
מים ל-100 מ"ל לאחר התאמת ה-pH ל-6.2

לדלל תמיסת 10X 1:10 (v/v) במי Milli Q ממש לפני הכנת טסיות הדם כדי לקבל את תמיסת ה-1X שיש להשלים עם הדברים הבאים
                                Conc. in 1X          עבור תמיסה 1X של 1 מ"ל
EGTA                   1 מ"מ           הוסף 10 μ L (1:100 v/v) 100 מ"מ EGTA 
גלוקוז               5 מ"מ         הוסף 5 μ L (1:200 v/v) 1 M גלוקוז
PGE1                     3 μ M         הוסף 3 μ L (1:333 v/v) תמיסת PGE1 1 מ
"מ מאגר B (הכנת טסיות דם)                                      מ.ו                Conc. in 1X          עבור תמיסת 100 מ"ל 10X
HEPES              238.30                20 מ"מ                                      4.766 גרם
NaCl                          58.44            134 מ"מ                                    7.83 גרם
KCl                              74.55              2.9 מ"מ                            216.19 מ"ג
MgCl2                  203.30                    1 מ"מ                          203.30 מ"ג
NaH2PO4      156.01              0.34 מילימטר                              53.04 מ"ג
NaHCO3              84 01                    12 מ"מ                     1.01 גרם
מים ל-100 מ"ל לאחר התאמת pH ל-7.4

לדלל תמיסת 10X 1:10 (v/v) במי Milli Q ממש לפני הכנת טסיות הדם כדי לקבל את תמיסת ה-1X שיש להשלים עם הדברים הבאים
                                Conc. in 1X          עבור 1 מ"ל תמיסה 1X
גלוקוז               5 מ"מ         הוסף 5 μ L (1:200 v/v) 1 M גלוקוז 
CaCl2 (0.5 מ') (עבור 50 מ"ל)משקל מולקולרי של CaCl2.2H2O = 147.02
ממיסים 3.675 גרם של CaCl2.2H2O ב-50 מ"ל מילי-Q מים
CellEvent Caspase-3/7 ריאגנטים לזיהוי ירוקInvitrogenC10423מגיב לזיהוי אפופטוזיס
ConvulxinEnzo Life SciencesALX-350-100
EDTA (0.5 מ'; pH 8) (עבור 100 מ"ל)משקל מולקולרי של EDTA Na2.2H2 O: 372.24g
שוקל 18.612 גרם ומשהה ב-50 מ"ל מים Milli Q ובדוק את ה-pH (pH~4)
הוסף לאט 10N NaOH תוך ערבוב ופקח על ה-pH.
EDTA מתחיל להתסיס בסביבות pH 7 והוא מסיס לחלוטין ב-pH 8.
הרכיב את הנפח ל-100 מ"ל עם מי Milli Q.
EGTA (100 מ"מ; pH 7.4) (עבור 100 מ"ל)משקל מולקולרי: 380.4
הוסף 3.804 גרם EGTA ב-50 מ"ל מים Milli Q ובדוק את ה-pH (pH~3)
הוסף 10 N NaOH טיפה תוך כדי ערבוב ועקוב אחר ה-pH
EGTA הופך מסיס ב-pH 7.0 (בערך)
התאם את ה-pH ל-7.4
הרכיב את הנפח ל-100 מ"ל עם מי
Milli QFITC עכבר אנטי אנושי PAC-1BD340507
FITC-IETD-FMK Caspase 8 (פעיל) ערכת צביעהAbcamab65614
Mitotracker Red CMXRos (צבע תיוג מיטוכונדריה)InvitrogenM7512מלאי = 1 מ"מ (50 ומיקרו; G מומס ב-90 ומיקרו; l DMSO)
תת-מלאי = 100 ומיקרו; M (10 ומיקרו; l מלאי + 90 ומיקרו; l DMSO)
ריכוז עבודה = 500 ננומטר (0.5 ומיקרו; l ב-100 ומיקרו; l)
PE Annexin VBD Pharmingen560930
פרוסטגלנדין E1SigmaP5515מלאי = 20 מ"מ (1 מ"ג מומס ב-141 ומיקרו; L DMSO)
תת-מלאי = 1 מ"מ (10 ומיקרו; l מלאי + 190 ומיקרו; L DMSO)
ריכוז עבודה = 3 ומיקרו; M (3 ומיקרו; L ב-1 מ"ל)
Rhod-2 AMInvitrogenR1244מלאי = 5 מ"מ (1 מ"ג מומס ב-178 ומיקרו; L DMSO)
תת-מלאי = 100 ומיקרו; M (10 ומיקרו; L מלאי + 90 ומיקרו; L DMSO)
ריכוז עבודה = 500 ננומטר (0.5 ומיקרו; L ב-100 ומיקרו; L)
תרומבין מפלזמה אנושיתSigmaT7572

מקורות

  1. Munnix, I., Cosemans, J., Auger, J., Heemskerk, J. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb Haemost. 102 (12), 1149-1156 (2009).
  2. Heemskerk, J. W. M., Mattheij, N. J. A., Cosemans, J. M. E. M. Platelet-based coagulation: Different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  3. Podoplelova, N. A., et al. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting. Blood. 128 (13), 1745-1755 (2016).
  4. Mann, K. G., Butenas, S., Brummel, K. The dynamics of thrombin formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (1), 17-25 (2003).
  5. Jackson, S. P., Schoenwaelder, S. M. Procoagulant platelets: Are they necrotic. Blood. 116 (12), 2011-2018 (2010).
  6. Hua Vivien Mun Yee, V. M. C. Procoagulant platelets and the pathways leading to cell death. Semin Thromb Hemost. 41 (04), 405-412 (2015).
  7. Dale, G. L. Coated-platelets: An emerging component of the procoagulant response. J Thromb Haemost. 3 (10), 2185-2192 (2005).
  8. Vulliamy, P., Armstrong, P. C. Platelets in hemostasis, thrombosis, and inflammation after major trauma. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 545-557 (2024).
  9. Vulliamy, P., et al. Histone H4 induces platelet ballooning and microparticle release during trauma hemorrhage. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (35), 17444-17449 (2019).
  10. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Zermatten, M. G., Marchetti, M., Alberio, L. Thrombocytopathies: Not just aggregation defects-the clinical relevance of procoagulant platelets. J Clin Med. 10 (5), 894(2021).
  11. Kirkpatrick, A. C., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. Coated platelets predict stroke at 30 days following TIA. Neurology. 89 (2), 125-128 (2017).
  12. Kirkpatrick, A. C., Tafur, A. J., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. Coated platelets improve prediction of stroke and transient ischemic attack in asymptomatic internal carotid artery stenosis. Stroke. 45 (10), 2995-3001 (2014).
  13. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  14. Prodan, C. I., Vincent, A. S., Dale, G. L. Coated platelet levels correlate with bleed volume in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Stroke. 41 (6), 1301-1303 (2010).
  15. Josefsson, E. C., et al. Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: Communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  16. Kulkarni, P. P., Sonkar, V. K., Gautam, D., Dash, D. AMPK inhibition protects against arterial thrombosis while sparing hemostasis through differential modulation of platelet responses. Thromb Res. 196, 175-185 (2020).
  17. Ekhlak, M., et al. Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order. Cell Death Differ. 30 (8), 1886-1899 (2023).
  18. Kholmukhamedov, A., Janecke, R., Choo, H. -J., Jobe, S. M. The mitochondrial calcium uniporter regulates procoagulant platelet formation. J Thromb Haemost. 16 (11), 2315-2321 (2018).
  19. Choo, H. -J., Saafir, T. B., Mkumba, L., Wagner, M. B., Jobe, S. M. Mitochondrial calcium and reactive oxygen species regulate agonist-initiated platelet phosphatidylserine exposure. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (12), 2946-2955 (2012).
  20. Jobe, S. M., et al. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis. Blood. 111 (3), 1257-1265 (2008).
  21. Leytin, V., Allen, D. J., Mykhaylov, S., Lyubimov, E., Freedman, J. Thrombin-triggered platelet apoptosis. J Thromb Haemost. 4 (12), 2656-2663 (2006).
  22. Lopez, J. J., Salido, G. M., Pariente, J. A., Rosado, J. A. Thrombin induces activation and translocation of Bid, Bax and Bak to the mitochondria in human platelets. J Thromb Haemost. 6 (10), 1780-1788 (2008).
  23. Wolf, B. B., et al. Calpain functions in a caspase-independent manner to promote apoptosis-like events during platelet activation. Blood. 94 (5), 1683-1692 (1999).
  24. Kim, O. V., et al. Fatal dysfunction and disintegration of thrombin-stimulated platelets. Haematologica. 104 (9), 1866-1878 (2019).
  25. Schoenwaelder, S. M., et al. Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function. Blood. 114 (3), 663-666 (2009).
  26. Abbasian, N., Millington-Burgess, S. L., Chabra, S., Malcor, J. -D., Harper, M. T. Supramaximal calcium signaling triggers procoagulant platelet formation. Blood Adv. 4 (1), 154-164 (2020).
  27. Le, T., et al. An inner activation gate controls TMEM16F phospholipid scrambling. Nat Commun. 10 (1), 1846(2019).
  28. Yang, H., et al. TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation. Cell. 151 (1), 111-122 (2012).
  29. Mattheij, N. J. A., et al. Dual mechanism of integrin closure in procoagulant platelets. J Biol Chem. 288 (19), 13325-13336 (2013).
  30. Liu, F., et al. Mitochondrially mediated integrin αiIbβ3 protein inactivation limits thrombus growth. J Biol Chem. 288 (42), 30672-30681 (2013).
  31. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  32. Goelz, N., et al. Platelets express adaptor proteins of the extrinsic apoptosis pathway and can activate caspase-8. PLOS ONE. 16 (1), e0244848(2021).
  33. Shlomovitz, I., Speir, M., Gerlic, M. Flipping the dogma - phosphatidylserine in non-apoptotic cell death. Cell Commun Signal. 17 (1), 139(2019).
  34. Nadine, J. A. M., et al. Coated platelets function in platelet-dependent fibrin formation via integrin αIIbβ3 and transglutaminase factor XIII. Haematologica. 101 (4), 427-436 (2016).
  35. Michelson, A. D. Platelet activation by thrombin can be directly measured in whole blood through the use of the peptide GPRP and flow cytometry: Methods and clinical applications. Blood Coagul Fibrinolysis. 5 (1), 121-131 (1994).
  36. Taylor, M. R., Couto, J. R., Scallan, C. D., Ceriani, R. L., Peterson, J. A. Lactadherin (formerly BA46), a membrane-associated glycoprotein expressed in human milk and breast carcinomas, promotes Arg-Gly-Asp (RGD)-dependent cell adhesion. DNA Cell Biol. 16 (7), 861-869 (1997).
  37. Andersen, M. H., Graversen, H., Fedosov, S. N., Petersen, T. E., Rasmussen, J. T. Functional analyses of two cellular binding domains of bovine lactadherin. Biochemistry. 39 (20), 6200-6206 (2000).
  38. Tan, C. W., Bourcy, M., Pasalic, L., Chen, V. M. Flow cytometry assessment of procoagulant platelets using a dithiol-reactive probe functional disulfide bonds: Methods and protocols. Methods Mol Biol. 1967, 305-321 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נמק של טסיותאפופטוזיס של טסיותציטומטריה זרימהמטבוליזם של טסיותגירוי באמצעות תרומביןסידן מיטוכונדריאליהפעלת קספזביטוי פוספטידילסרין
ניתוח מקיף של טסיות דם מקרישות המציגות מאפיינים של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.