Method Article

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומרים מבוססי שלד אקטין נחקרים באופן נרחב כחומרים תאיים מודל כדי להבהיר מנגנונים פיזיקליים של מכניקת התא, כגון ויסות צורה וייצור כוח, כמו גם חומרים פולימריים רכים מסקרנים. בשיטה זו, אנו מפרטים יצירת מכלולים מבוססי אקטין במבחנה באמצעות חלבון מטוהר למחקרי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אנו מפילמרים חוטי אקטין ארוכים בתא דגימה ומשתמשים בחומר פולימרי כדי לדחוס חוטים לרשת שזורה דו-ממדית (2D) כנגד משטח פסיבי עם שכבת פעילי שטח. הוספת חוטי מיוזין II של שרירי השלד בנוכחות אדנוזין טריפוספט (ATP) גורמת להתכווצות רשת האקטין. על ידי שילוב חוטי אקטין עם מקשר צולב, אנו מכוונים את התכווצות המכלול, ועוברים מחומר שמתכווץ לחומר שמחליק בקנה מידה מיקרו. על ידי הפחתת אורך חוטי האקטין באמצעות קו-פילמור אקטין בנוכחות חלבון מכסה, אנו מכוונים את החומר מרשת דו-ממדית לגביש נוזלי. קישור צולב של חוטי אקטין קצרים מפוזרים מביא להיווצרות טיפות גביש נוזלי תלת מימדיות (3D).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומרים ביולוגיים פעילים עומדים בבסיס תהליכים מכניים במגוון תהליכים פיזיולוגיים, כולל הובלה תוך-תאית, נדידת תאים, ויסות צורת התא ויצירת כוח ביולוגי 1,2,3. מכלולים במבחנה של מערכות שלד תאים, הבנויים מרכיבי חלבון מטוהרים ומהונדסים המורכבים בעצמם במאגר, הם כלי מבוסס לאפיון תהליכים ביופיזיקליים וביוכימיים בסיסיים 4,5,6,7. מערכות מודל פשוטות אלה מאפשרות לחקור חלבונים ללא המורכבות של סביבות תאיות, מה שמאפשר לזהות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: חלבונים ותיוג: למטרות פרוטוקול זה, ההנחה היא שהחוקר מתחיל עם מלאי של חלבונים מטוהרים, המסומנים באופן פלואורסצנטי כאשר מתאים לחקירת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתן לרכוש או לטהר חלבונים אלה ולתייג אותם באופן פלואורסצנטי במעבדה 31,32,33,34,35,36,37. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במלאי של חלבונים שהוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. בדרך כלל ניתן לתייג את החלבונים בשיטות דומות. ניתן לתיי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן ליצור מגוון רחב של מכלולי אקטין במערכות מודל המשתמשות בחלבונים מטוהרים על ידי ביצוע האסטרטגיה הכללית המתוארת בשיטות אלה, כאשר אקטין מפולימר לחוטים בנוכחות חלבונים נלווים המשנים את ארכיטקטורת ההרכבה (איור 1). כאשר אקטין מפולימר לחוטים ללא קישורים צולבים או חלבון מכסה, הוא יוצר רשתות חוטים שזורות (איור 1A). הוספת קישור צולב לרשתות השזורות מביאה להיווצרות רשתות מעין דו-ממדיות או רשתות של חבילות (איור 1B,C). היווצר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם שיקולים רבים לייצור מכלולי אקטין הניתנים לשחזור. אחד הקריטיים ביותר להפקת נתונים הניתנים לשחזור וניתנים לניתוח הוא משטח זכוכית הכיסוי של תא הדגימה. החלבונים בדגימות אקטין במבחנה, במיוחד מיוזין, הם דביקים מאוד וייצמדו למשטחי זכוכית לא מטופלים או מטופלים בצורה גרועה, מה שהופך דגימה לבלתי שמישה (איור 5A). דנו בדרך סטנדרטית להכין את פני השטח כדי להניב דגימות הניתנות לשחזור באמצעות פסיבציה של כיסוי סילאני עם שכבת פעילי שטח שמן. עם זאת, להכנה לדוגמה .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לטוד תורנסון, מייק מורל, ג'ניפר רוס, פטריק מק'קול וחברים אחרים במעבדות גרדל וקובאר (אוניברסיטת שיקגו) על דיונים מועילים בזמן פיתוח השיטות. M.A.C. ו-S.R. נתמכו באופן חלקי על ידי מענקי הזדמנויות מחקר לתואר ראשון של המכללה להנדסה, מחשוב ומדעים יישומיים של אוניברסיטת קלמסון, ו-V.J.A. נתמך על ידי Clemson Biophysics REU תחת פרס NSF #2349368 במימון תוכניות DBI ו-EPSCoR. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי תוכנית EPSCoR של הקרן הלאומית למדע במסגרת פרס NSF #OIA-1655740, בחלקה ובחלקה על ידי תוכנית Clemson Creative Inquiry + Bachelor Research.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהפישר סיינטיפיק05-408-123
008-פלואורו-פעילי שטחRAN Biotechnologies00115081361-6525תמיסה חלופית למעורבבת מראש
008-FluoroSurfactant ב-HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50Gתמיסה מעורבת
מראש 2-מרקפטואתנול (&בטא;-מרקפטואתנול)סיגמא אולדריץ'63689מספר CAS: 60-24-2
תמיסת מלאי: 25 מ"מ במי MilliQ, מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C
4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-אתאן-חומצה סולפונית (HEPES)סיגמא אולדריץ'H3375מספר CAS: 7365-45-9
5 דקות אפוקסיDevcon14250
אקטיןציטוסקלטון, בע"מ.AKL99-A>99% שריר שלד ארנב טהור
(חלופי לטיהור)
אקטין (תווית רודמין)Cytoskeleton, Inc.AR05-Aשריר שלד ארנב
(חלופי לטיהור)
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט (ATP)סיגמא אולדריץ'A6419מספר CAS: 34369-07-8
תמיסת מלאי: 25 מ"מ במי MilliQ, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
שמור קפוא כדי למנוע הידרוליזה
סידן כלורי (CaCl2)Sigma AldrichC5670CAS Number: 10043-52-4
מכסה חלבון (עכבר)מטוהר מביטוי יתר ב-E.coli עם HisTag
תמיסת מלאי: 20 מ"מ במכסה חלבון מאגר ב-80 & deg; C
קטלאז מכבד בקרסיגמא אולדריץ'C9322מספר CAS: 9001-05-2
תמיסת מלאי: 85 ku/mL, יש לאחסן עם גלוקוז אוקסידאז ב-20°
C Cover זכוכיתFisherbrand12544Cבורוסיליקט, #1.5, 24 מ"מ x 40 מ"מ
Fisherbrand לא Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270מספר CAS: 50-99-7
תמיסת מלאי: 225 מ"ג/מ"ל במי MilliQ, יש לאחסן ב-20 מעלות; C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPמספר CAS: 3483-12-3
פתרון מלאי: 1 M במי MilliQ, אחסן ב-20 מעלות;
C סרט דו צדדי3M3136
אתיל אלכוהולול 200 הוכחהPHARMCO111000200מספר CAS: 64-17-5
200 הוכחה
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N′-חומצה טטראצטית (EGTA)סיגמא אולדריץ'E3889מספר CAS: 67-42-5
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא אולדריץ'E9884מספר CAS: 60-00-4
גלוקוז אוקסידאזסיגמא אולדריץ'345386מספר CAS: 9001-37-0
תמיסת מלאי: 135 מ"ג/מ"ל במי MilliQ, יש לאחסן עם קטלאז בטמפרטורה של -20 מעלות; C
גליצרולסיגמא אולדריץ'356352Mמספר CAS: 56-81-5
אימידזולפישר ביוריאגנטים BP305-50מספר CAS: 288-32-4
מגנזיום כלוריד (MgCl2)פישר ביוריאגנטים BP214מספר CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
מתיל צלולוזסיגמא אולדריץ'M0512מספר CAS: 9004-67-5
15
שקופיות מיקרוסקופמיקרוסקופ אלקטרונים רגילים / חותם זהב63710-05  3"x1", עובי 1 מ"מ
מים MilliQMilliporeCUFBI001מים טהורים במיוחד
Novec-7500 נוזל מהונדס3M7100134816תמיסה חלופית למעורבבת מראש
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא אולדריץ'P3911מספר CAS: 7447-40-7
אשלגן פוספט (KPO4)Sigma AldrichP3786מספר CAS: 7758-11-4
אבקת אצטון שרירי שלד ארנבPel-Freez ביולוגיים41995-1משמש בעת טיהור אקטין (לסירוגין לרכישה)
אחסן כ-30 מ"מ במאגר אקטין G ב-80 מעלות; C
נתרן אזידסיגמא אולדריץ'71289מספר CAS: 26626-22-8
Tetramethylrhodamine-C6-maleimideAnaSpecAS-81445מספר CAS: 174568-68-4 משמש בעת טיהור אקטין (לסירוגין לרכישה)
אחסן כ-30 מ"מ במאגר אקטין G ב-80 מעלות צלזיוס. משמש בעת תיוג אקטין (חלופי לרכישה)
חומצה הידרוכלורית טריס (Tris HCl)Sigma Aldrich648317מספר CAS: 1185-53-1
אמבטיה אולטרסאונדאמרסון ברנסון 
סנטיפואז מדעי CPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles