כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

Summary

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

Abstract

חומרים מבוססי שלד אקטין נחקרים באופן נרחב כחומרים תאיים מודל כדי להבהיר מנגנונים פיזיקליים של מכניקת התא, כגון ויסות צורה וייצור כוח, כמו גם חומרים פולימריים רכים מסקרנים. בשיטה זו, אנו מפרטים יצירת מכלולים מבוססי אקטין במבחנה באמצעות חלבון מטוהר למחקרי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אנו מפילמרים חוטי אקטין ארוכים בתא דגימה ומשתמשים בחומר פולימרי כדי לדחוס חוטים לרשת שזורה דו-ממדית (2D) כנגד משטח פסיבי עם שכבת פעילי שטח. הוספת חוטי מיוזין II של שרירי השלד בנוכחות אדנוזין טריפוספט (ATP) גורמת להתכווצות רשת האקטין. על ידי שילוב חוטי אקטין עם מקשר צולב, אנו מכוונים את התכווצות המכלול, ועוברים מחומר שמתכווץ לחומר שמחליק בקנה מידה מיקרו. על ידי הפחתת אורך חוטי האקטין באמצעות קו-פילמור אקטין בנוכחות חלבון מכסה, אנו מכוונים את החומר מרשת דו-ממדית לגביש נוזלי. קישור צולב של חוטי אקטין קצרים מפוזרים מביא להיווצרות טיפות גביש נוזלי תלת מימדיות (3D).

Introduction

חומרים ביולוגיים פעילים עומדים בבסיס תהליכים מכניים במגוון תהליכים פיזיולוגיים, כולל הובלה תוך-תאית, נדידת תאים, ויסות צורת התא ויצירת כוח ביולוגי ^1,2,3. מכלולים במבחנה של מערכות שלד תאים, הבנויים מרכיבי חלבון מטוהרים ומהונדסים המורכבים בעצמם במאגר, הם כלי מבוסס לאפיון תהליכים ביופיזיקליים וביוכימיים בסיסיים 4,5,6,7. מערכות מודל פשוטות אלה מאפשרות לחקור חלבונים ללא המורכבות של סביבות תאיות, מה שמאפשר לזהות את התפקידים של רכיבים בודדים. בנוסף לתמיכה במחקרים ביולוגיים בסיסיים, מכלולי שלד תאים במבחנה מפותחים גם כמערכות ניסיוניות לחקירת חומרים גבישיים נוזליים ופעילים או מחוץ לשיווי משקל 8,9,10,11,12,13,14,15.

אקטין הוא ביופולימר מרכזי במכלולי שלד תאים המווסתים את המכניקה והדינמיקה של התא באמצעות כוחות מונעי מנוע ופימור ^3,16. ניסויי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרים הדמיה של שינויים מבניים ברשת האקטין במהלך תהליכים כגון התכווצות מונעת מנוע וחבילת אקטין על ידי חלבונים צולבים. הדמיה של רשתות אקטין תלת מימדיות כפי שהן מעוצבות מחדש על ידי חלבונים מוטוריים משובצים האירה את תפקידם של קישורים צולבים של אקטין להתכווצות רשת ויצירת דפוסים 12,17,18,19. עם זאת, רשתות אקטין דו-ממדיות מתגברות על אתגרים בהדמיה עם רזולוציה מרחבית-זמנית מספקת כדי ללכוד שינויים מבניים ברשת. בנוסף, מבני אקטין דו-ממדיים בצפיפות גבוהה הם חיקוי קרוב יותר של מכלולים תאיים כמו קליפת המוח הצפופה של תא²⁰. אסטרטגיות לייצור מבני אקטין דו-ממדיים כללו הצמדה של חלבוני גרעין אקטין לכיסוי^21,22, צימוד של אקטין למשטח באמצעות מולקולות קישור 10,23,24, היווצרות צרורות אקטין צפופים המחוברים לחרוזים במשטח כיסוי ^25,26, וריכוז חוטי אקטין במשטח כיסוי עם חומרי צפיפות מולקולרית^10,27.

כאן, אנו מפרטים שיטה ליצירת מכלולים מבוססי אקטין הניתנים לשחזור וכיצד לשנות אותה כדי להכין וריאציות מרשתות פעילות לגבישים נוזליים כמו-דו-ממדיים וטיפות נמטיות. השתמשנו בעבר בשיטות דומות כדי לחקור את היווצרותן של טיפות גבישיות נוזליות מופרדות פאזה של חוטי אקטין קצרים עם תוספת צולבת¹¹, שינויים במצבי עיוות רשת אקטין שנוצרו על ידי מיוזין II (למשל, כיפוף נימה או החלקה יחסית) עם קישור צולב נימה וקישוריות²⁸, הבדלים בכוחות הנוצרים על ידי מיוזין II על צרורות אקטין עם מרווח ותאימות משתנים²⁹, ומיוזין II הובלה³⁰. השימוש בחלבונים צולבים וחלבוני מכסת אקטין מאפשר וריאציה שיטתית של אורך חוט האקטין וארכיטקטורת ההרכבה.

Protocol

הערה: חלבונים ותיוג: למטרות פרוטוקול זה, ההנחה היא שהחוקר מתחיל עם מלאי של חלבונים מטוהרים, המסומנים באופן פלואורסצנטי כאשר מתאים לחקירת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתן לרכוש או לטהר חלבונים אלה ולתייג אותם באופן פלואורסצנטי במעבדה 31,32,33,34,35,36,37. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במלאי של חלבונים שהוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. בדרך כלל ניתן לתייג את החלבונים בשיטות דומות. ניתן לתייג את החלבון כשלב טיהור או מציר קפוא. הפשירו מלאי חלבון קפוא על קרח לפני שתמשיכו בתיוג. להלן שיטה לתיוג פלואורסצנטי של שרירי השלד מיוזין II (מיוזין) עם פלואורופור פונקציונלי מלימיד (מותאם^מ-38).

1. הכן מיוזין עם תווית פלואורסצנטית

1. התחל עם ~2 מ"ל מיוזין בריכוז של 5-10 מ"ג/מ"ל.
   הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיוזין שרירי השלד II מטוהר משריר עוף בשיטות שפורסמו³⁵ . המיוזין מאוחסן במאגר אחסון מיוזין (25 מ"מ KPO₄, 0.6 M KCl, 10 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 1 מ"מ דיתיותרייטול (DTT), pH 6.6), ישירות לאחר הטיהור או ממלאי קפוא. חשוב לשמור על המיוזין קר בכל עת כדי למנוע אובדן פעילות מוטורית.
2. הוסף DTT לתמיסת המיוזין המופשרת לריכוז סופי של 10 מ"מ. השתמש בפתרון מלאי של 1 M DTT כדי להגביל את הנפח.
   הערה: ה-DTT מפחית את קבוצת התיול על ציסטאין בחלבון המיוזין, ומכין אותם להגיב עם המלימיד לתיוג.
3. כדי למנוע הפרעה לתגובת התיוג, הסר את ה-DTT על ידי דיאליזה למשך הלילה ב-50 מ"מ HEPES, 500 מ"מ KCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.6, ב-4 מעלות צלזיוס.
4. לאחר הדיאליזה, צנטריפוגה את תמיסת המיוזין ב-100,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לגלול כל אגרגטים. אסוף את הסופרנטנט.
5. קבע את ריכוז המיוזין בסופרנטנט באמצעות ספקטרופוטומטר. העריכו את ריכוז המיוזין באמצעות מקדם הכחדה ב-280 ננומטר של ~148,000 ^{M-1 cm-1} עבור מיוזין שרירי השלד³⁸. מקדם הכחדה זה מניח ש"מונומר" מורכב משרשרת כבדה אחת, שרשרת קלה חיונית אחת ושרשרת קלה רגולטורית אחת.
6. הכן פלואורופור לתגובת תיוג על ידי השעיית פלואורופור אבקתי בדימתיל סולפוקסיד יבש (DMSO) לריכוז של 5 מ"מ פלואורופור.
   הערה: כל פלואורופור עם קבוצה תגובתית מלימיד אמור לעבוד. נעשה שימוש באלקסה 647 מלימיד. DMSO הוא היגרוסקופי וצובר מים. DMSO "יבש" מתייחס ל-DMSO שאוחסן בסביבה כדי למנוע הצטברות מים. כדי להבטיח שהממס יבש DMSO, נעשה שימוש באמפולה טרייה של DMSO שנפתחה לשלב זה. אל תשים פתרונות DMSO על הקרח. ל-DMSO יש נקודת התכה של 19 מעלות צלזיוס, ולכן היא חייבת להיות בטמפרטורת החדר (או מעט חמה יותר) כדי לפיפטה³⁹.
   זהירות: DMSO יכול לחדור לכפפות, לכן מומלץ ללבוש כפפות ניטריל כפולות ולדאוג למניעת שפיכה.
7. כדי להכין את המיוזין להוספת פלואורופור, הסירו לזמן קצר את תמיסת המיוזין מהקרח ותנו לה להתחמם לטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: אל תשאיר את המיוזין ב-RT למשך זמן רב מהנדרש. בצע שלב זה לאחר שהפלואורופור מושעה ב-DMSO.
8. ברגע שתמיסת המיוזין קרובה ל-RT, הוסיפו את תמיסת הפלואורופור למיוזין וערבבו במהירות כך שיהיה יחס מולארי של 5:1 של פלואורופור: מיוזין. הניחו תמיסת מיוזין על קרח ברגע שהוא מעורבב עם הפלואורופור.
9. דגירה על קרח למשך שעה, מוגנת מאור, ואז עצור את התגובה על ידי הוספת DTT לריכוז של 1 מ"מ. השתמש במלאי DTT של 1 M כדי למזער את הנפח הנוסף.
10. הסר פלואורופורים שלא הגיבו. השתמש באחת משתי השיטות המתוארות להלן:
    1. אפשרות 1:
       1. פילמרו את המיוזין על ידי דילול איטי שלו למאגר F (10 מ"מ אימידזול, 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl₂, 2 מ"מ EGTA, 4 מ"מ ATP, pH 7.5). זהו דילול פי 10 בקירוב, בהתאם לנפח הצבע שנוסף בשלב 1.8.
       2. דגירה על קרח למשך 20 דקות. סובב ב-8,000 x גרם בצנטריפוגה מקוררת ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לגלולה.
       3. יש להשליך את הסופרנטנט המכיל צבע חופשי ולהשעות/לבטל את הפולימריזציה של המיוזין עם מאגר אחסון מיוזין (משלב 1). כדי להסיר את כל הצבע שנותר, יש לבצע דיאליזה לתוך 5 מ"מ 2-[4-(2-sulfoethyl)piperazin-1-yl] חומצה אתנסולפונית (PIPES), 0.45 M KCl, pH 7.0 (עודף נפח >פי 100) שלוש פעמים למשך 15 דקות כל אחת באמצעות דיאליזה חתוכה של 10 kD.
    2. אפשרות 2:
       1. השתמש בעמודת התפלה להחלפת חיץ לצינורות של 5 מ"מ, 0.45 מ"מ KCl, pH 7.0, עם הפרוטוקול הסטנדרטי של יצרן העמודה.
11. הערך את יחס הפלואורופור לחלבון על ידי מדידת ריכוז המיוזין והפלואורופור באמצעות ספקטרופוטומטר, באמצעות מקדמי הכחדה עבור מיוזין ב-280 ננומטר ועבור הפלואורופור כפי שדווח על ידי היצרן. יחס של 2-4 הוא אופייני.
    הערה: המיוזין המסומן מוכן כעת להקפאה מהירה של חנקן נוזלי. Aliquots מאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.

2. אופציונלי: הליך להסרת מיוזין לא פעיל

הערה: ניתן להשתמש במיוזין ישירות מאליקוט מופשר בניסויים, אך חלק מהמיוזין לא יהיה פעיל. ההליך הבא מתאר כיצד להסיר מיוזין לא פעיל. זהו שלב אופציונלי, אך הוא יכול להיות חיוני לשחזור. מינוטים של מיוזין משמשים כ-3 ימים לאחר ההפשרה, מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח.

1. פילמור אקטין ללא תווית מיוצב פלואידין:
   1. מערבבים 10 מיקרוליטר של 10x F-buffer, 1 μL של 100 mM ATP ו-ddH₂O כך שהנפח הסופי (כולל אקטין בשלב 2.1.2) יהיה 100 מיקרוליטר בצינור מיקרו-צנטריפוגה.
   2. הוסף מונומר אקטין לריכוז סופי של 20 מיקרומטר ומערבב פיפטה.
   3. כדי לייצב חוטי אקטין, הוסף פלואידין לריכוז סופי של 6.7 מיקרומטר באמצעות מלאי של 100 מיקרומטר פלואידין בתערובת מתנול ופיפט.
      זהירות: פלואידין הוא רעלן⁴⁰. הימנע מנוזלים וזיהום.
   4. דגירה על קרח למשך 20 דקות כדי לאפשר לאקטין להתפלמר. לאחר פילמור, אחסן את האקטין ב-4 מעלות צלזיוס לספין-דאונים עתידיים.
2. Pipet מערבבים 10 μL אקטין מיוצב פלואידין, 3 μL של 10x F-buffer, 0.3 μL של 100 mM ATP, 6 μL של 2 M KCl ו-ddH₂O לנפח סופי של 30 μL (כולל נפח הקשור להוספת מיוזין בשלב הבא) בצינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח.
3. הוסף מיוזין עם תווית דימרית מהמלאי המוכן לריכוז הרצוי, תוך שמירה על יחס מולארי של מיוזין לאקטין של ≤ 1:6.
4. צנטריפוגה את התמיסה המתקבלת קרה (4 מעלות צלזיוס) ב-100,000 x גרם למשך 30 דקות. מיוזין לא פעיל ייקשר לחוטי אקטין ויישאר קשור. חוטי המיוזין והאקטין הלא פעילים יהוו כדור במהלך הצנטריפוגה.
5. הסירו את הסופרנטנט (המכיל מיוזין פעיל) ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש בניסויים.
6. הערך את ריכוז המיוזין באותה שיטה ספקטרופוטומטרית למדידת ריכוז המיוזין לאחר התיוג.
   הערה: בריכוזי החלבון וה-ATP שנשארים בסופרנטנט, שיא הספיגה של 280 ננומטר מוסתר על ידי שיא ספיגת ה-ATP של 260 ננומטר, כך שמדידת הריכוז באמצעות הספיגה הקשורה לפלואורופור או מדידת פלואורסצנטיות יחסית היא מדויקת יותר.

3. הכן תמיסת פעילי שטח

הערה: ניתן לרכוש את תמיסת פעילי השטח גם מעורבבת מראש ומוכנה לשימוש.

1. התחל עם בקבוקון זכוכית נקי. שטפו את הבקבוקון במים ואתנול כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים בשמן, המהווה ממס לחומר פעילי השטח. השתמש בבקבוקוני זכוכית בורוסיליקט עם מכסה מרופד בפוליטטרפלואורואתילן (PTFE).
2. הרם 5-20 מ"ג של חומר פעילי שטח פלואורו-פעילי שטח באמצעות קצה פיפט והפקיד ליד תחתית בקבוקון זכוכית. מדוד את כמות פעילי השטח לפי משקל באמצעות איזון עם דיוק תת-מיליגרם.
3. יש לזרוק את הנפח המתאים של שמן מופלר כדי ליצור תמיסה של 2% משקל ולסגור את הבקבוקון.
   הערה: השמן נדיף, לכן סגור את הבקבוקון מיד לאחר המדידה.
4. מערבולת במהירות נמוכה לערבוב.
   הערה: כעת ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. גיל ואיכות פעילי שטח יכולים להשפיע הן על הצפיפות והן על המראה של האקטין. אקטין שנראה מנומר, דבוק לפני השטח או שאינו מצטופף לפני השטח עשוי להצביע על כך שיש צורך בתמיסת פעילי שטח טרייה. אחסון תחת גז חנקן יכול לשפר את חיי המדף.

4. הכן תא מדגם (שלוש אפשרויות)

הערה: סעיף זה מספק נוהל לבניית שלושה תאי דגימה סטנדרטיים המשמשים להכנת דגימות למיקרוסקופיה. שני הסעיפים הבאים מכסים את הכנת הדגימה בפועל ופסיביזציה של תא הדגימה לטעינת דגימה.

1. אפשרות 1: תא זרימה
   הערה: תא זרימה פשוט הוא דרך סטנדרטית לייצור דגימות מיקרוסקופ במעבדות רבות. עבור פרוטוקול זה, הוא מתאים במיוחד לדגימות העטופות בטיפות אמולסיה. זה יכול להיות קשה להשיג שדות ראייה גדולים ושטוחים עם ציפוי פני השטח פעילי השטח המתואר בפרוטוקול זה, כך שעבור דגימות דו-ממדיות, אפשרויות 2 ו-3 ניתנות לשחזור לרוב. גיאומטריית הערוץ עלולה גם לגרום לערבוב לא אחיד של רכיבים שנוספו בזמנים מאוחרים יותר, כגון מיוזין.
   1. הנח 2 חתיכות סרט דו צדדי במקביל זו לזו לרוחב שקופית המיקרוסקופ כדי ליצור את גבולות תעלת תא הזרימה. התעלה שנוצרה בין שתי חתיכות הקלטת צריכה להיות ברוחב של כ -2 מ"מ.
      הערה: תעלות קטנות יותר עוזרות למנוע תחליבים להיתקע בחלק ההתחלתי של הערוץ. כדי ליצור אטימה טובה, השתמש בחתיכות סרט ארוכות יותר מרוחב מגלשת הזכוכית וחתוך לאחר בניית תא הזרימה.
   2. הנח את הכיסוי מעל תעלת הקלטת. ודא שהחלקת הכיסוי מאונכת לשקופית המיקרוסקופ. השתמש בכיסוי בגודל 30 מ"מ על 40 מ"מ למטרה זו מכיוון שהוא מספק תלייה קטנה כאשר הוא מונח על מגלשה.
   3. כדי ליצור אטימה טובה ולחסל כיסי אוויר בין הסרט לכיסוי, לחץ כלפי מטה על אזור הכיסוי שנמצא במגע עם סרט דו צדדי.
      הערה: היזהר לא לשבור את הכיסוי בזמן לחיצה סביב הקצוות. שפשוף האזור עם חפץ מעוגל, כמו קצה של טוש מכוסה, עובד היטב כדי ללחוץ על הסרט.
   4. בעזרת סכין גילוח, חתוך כל סרט עודף משקופית המיקרוסקופ והכיסוי, כך שהסרט הגלוי היחיד נמצא בתוך תעלת הדגימה.
      הערה: היזהר בהשלמת שלב זה, מכיוון שקל לשבור בטעות את הכיסוי בזמן ניסיון להסיר את הסרט.
2. אפשרות 2: צילינדר על כיסוי לא מטופל
   הערה: אפשרות זו מתאימה לדגימות מישוריות דו-ממדיות. זה נוח להוספת רכיבים בזמנים שונים במהלך ניסויי מיקרוסקופיה. אין להשתמש בתא דגימה זה עבור תחליבים, אשר מקרמים ולא משקעים, מה שמקשה על ההדמיה.
   1. שטפו את הכיסוי ואת גליל שיבוט הזכוכית במים, אתנול ומים. יבש באוויר.
   2. בעזרת שכבה דקה של אפוקסי של 5 דקות, הדביקו את גליל שיבוט הזכוכית לכיסוי.
      הערה: כדאי להפעיל כוח על הצילינדר בזמן שהאפוקסי מתייבש על ידי הנחת חפץ נקי על גבי הצילינדר. מכסה קטן של צלחת פטרי או קופסת הכיסוי יכולים לעבוד היטב.
3. אפשרות 3: צילינדר על כיסוי מצופה סילאן
   הערה: אפשרות זו מביאה באופן שחזורי לאזור מישורי גדול במרכז החדר ומפחיתה את זרימת התפזורת של הדגימה. כדי להשיג זאת, נוצר אזור הידרופובי המוקף באזור הידרופילי על החלקת הכיסוי, מה שמביא לדגימה סופית שיש לה רשת אקטין באזור פסיבי ומוגבל שבו האקטין מעוגן לאזורים ההידרופיליים בקצה החדר. אין להשתמש בתא דגימה זה עבור תחליבים, אשר מקרמים ולא משקעים במאגר, מה שמקשה על ההדמיה.
   1. הכן כיסויים עם ציפוי סילאן כדי להפוך אותם להידרופוביים.
      1. טען כיסויי זכוכית נקיים לתוך מתלה נירוסטה. נקה מראש זכוכית על ידי סוניקציה בחומר ניקוי או אתנול אם תרצה.
      2. בכלי צביעה מזכוכית יש לדלל טרימתוקסי (אוקטיל) סילאן לתמיסה של 2% באיזופרופנול.
      3. טבלו את הכיסויים בתמיסה למשך 10 דקות.
      4. לשטיפה, החלף את התמיסה במים. הרם וטבל מחדש את מדפי הכיסוי שש פעמים. חזור על התהליך ארבע פעמים נוספות עם חילופי מים בין לבין.
      5. מכסים את המדפים בנייר אלומיניום כדי להגן על החלקות הכיסויים מפני אבק ומייבשים אותם בטמפרטורה של 25-30 מעלות צלזיוס.
   2. הנח כיסוי שטופל באוקטיל סילאן בתחתית צלחת פטרי מזכוכית או כל מיכל זכוכית פתוח אחר שיתאים למנקה האוזון האולטרה סגול (UV).
   3. בעזרת מלקחיים, הנח ריבוע PTFE בגודל 2 מ"מ על 2 מ"מ (חתוך מסדין) על הכיסוי שישמש כמסכה לטיפול הבא באוזון UV.
   4. טפל בכיסוי עם אוזון UV למשך 10 דקות. תהליך זה הופך את הזכוכית להידרופילית באזורים החשופים שאינם מכוסים על ידי מסכת PTFE.
   5. הסר בזהירות את המנה מבלי להפריע לכיסוי או לריבוע PTFE. הדביקו גליל שיבוט זכוכית לכיסוי באמצעות אפוקסי של 5 דקות. ודא שהגליל מקיף את ריבוע ה-PTFE, אותו ניתן להסיר בעזרת מלקחיים לאחר שהאפוקסי מתייבש.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בריבוע PTFE בניסויים עתידיים.

5. הרכבת רשת האקטין

הערה: להלן להכנת דגימה של 50 מיקרוליטר. עבור דגימות צילינדר, נפח גדול יותר יכול להפחית את השפעות המניסקוס ולהגביר את יציבות הדגימה.

1. לצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף 5 מיקרוליטר של מאגר 10x F, ddH₂O הכרחי כדי להביא את הנפח הסופי ל-50 מיקרוליטר, 1 מיקרוליטר של 25% נפח בטא-מרקפטואתנול, 1 מיקרוליטר של 225 מ"ג/מ"ל גלוקוז, 1 מיקרוליטר של תערובת של גלוקוז אוקסידאז (135 מ"ג/מ"ל) וקטלאז (85,000 יחידות/מ"ל), 1 מיקרוליטר של 25 מ"מ ATP, ו-10 מיקרוליטר של 2% משקל 15 סנטיפואז מתיל צלולוז. פיפט מערבבים היטב.
   הערה: בטא מרקפטואתנול הוא רעלן. הימנע מנוזלים וזיהום. הריאגנטים גלוקוז אוקסידאז, קטלאז, גלוקוז ובטא-מרקפטואתנול נמצאים בדגימה כדי ליצור מערכת ניקוי חמצן. תמיסת מלאי המתיל צלולוז מוכנה על ידי ערבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. מתיל צלולוז יכול לזרז מחוץ לתמיסה ויש להכין אותו מחדש אם יש משקעים גלויים או אם צפיפות האקטין גרועה.
2. אופציונלי: הוסף חלבון צולב (0.1-1 חלבון צולב לכל מונומר אקטין אחד). תערובת פיפט.
   הערה: ניתן להוסיף חלבונים צולבים גם לאחר פילמור אקטין ולאפשר להם להיקשר למשך 10-20 דקות לפני הוספת מיוזין. זה עדיף עבור ריכוזי Crosslinker גבוהים מספיק כדי לאגד חוטי אקטין - הצרורות מפוזרים בצורה שווה יותר וניתנת לשחזור בממשק פעילי שטח-מים. תא דגימת הצילינדר ניתן להוספת קישור צולב לאחר שהאקטין מתפלמר.
3. הוסף פלואידין (1 פלואידין לכל 1-3 מונומרים אקטין), אם רוצים. תערובת פיפט.
4. בשפופרת נפרדת, מערבבים אקטין ללא תווית ומסומן כך שכאשר תערובת האקטין מתווספת לדגימה של 50 מיקרוליטר, הריכוז הכולל יהיה 2.64 מיקרומטר. השתמש ביחס של מונומר אקטין מסומן אחד לכל 9 מונומרים אקטין לא מסומנים. תערובת פיפט.
   הערה: מונומרים האקטין יתחילו להתפלמר עם הוספה לתמיסת הדגימה. הוספת האקטין המסומן וללא תווית בנפרד עלולה לגרום לאקטין שנראה מנומר באזורים כהים ופלואורסצנטיים לאורך קווי המתאר של חוט בודד. מלאי מונומר האקטין מעורבב כדי להבטיח חוטי אקטין בעלי תווית אחידה. טיהור ותיוג אקטין מתוארים ב³¹.
5. אופציונלי: להכנת גבישים נוזליים או ניסויים אחרים באמצעות חוטי אקטין קצרים, הוסף חלבון מכסה לתערובת האקטין משלב 5.4. הכמות המדויקת של חלבון המכסה תלויה בחלק הפעיל של החלבון ובאורך חוטי האקטין הממוקדים, אך בדרך כלל, בסביבות 1-10 מול% חלבון מכסה (ביחס לאקטין) מספיקים כדי ליצור חוטים קצרים לניסויי גביש נוזלי. טיהור חלבון מכסה מתואר ב³⁶.
6. כדי להתחיל בפילמור אקטין, הוסף את תערובת האקטין לתמיסת F-buffer ולתערובת הפיפט.
7. השאירו את האקטין להתפלמר בצינור המיקרו-צנטריפוגה ב-RT, ולאחר מכן הוסיפו אותו לתא הדגימה לאחר 10-30 דקות.
8. אופציונלי: אם מכינים דגימת צילינדר, משוך את כל התמיסה לקצה פיפט כך שיהיה מוכן לצינור בשלב 7.4 של טעינת תא דגימת הצילינדר.

6. אופציונלי: הכן תחליבים

הערה: לפעמים נוח להכין דגימות אלה באמולסיות, המספקות תא דגימה סגור. האמולסיות מוכנות באמצעות ריאגנטים דומים לאלה של Chowdhury et al., מה שמביא לשלב רציף של שמן שיש בו טיפות תחליב מימי בתיווך פעילי שטח⁴¹. בנוכחות חומר דלדול, כגון מתיל צלולוז, המשמש בפרוטוקול זה, דגימות האקטין יצטופפו לממשק המימי של תחליב זה. עבור דגימות שפרוטוקול זה מבוסס עליהן, לא נראה הבדל בין פילמור האקטין לפני או אחרי הוספתו לאמולסיות; עם זאת, דווח כי חשוב לקחת בחשבון את שלב הפילמור בכמה ניסויי אנקפסולציה⁴².

1. הוסף 3.5 מיקרוליטר של חומר פעילי שטח שמן לצינור מיקרו-צנטריפוגה. השתמש בצינור מיקרו-צנטריפוגה שקוף, בהיר או שקוף לשלב זה.
2. מבלי לערבב, הוסיפו 5 מיקרוליטר מתמיסת האקטין לחלק העליון של שכבת פעילי השטח של השמן. סגור את צינור המיקרו-צנטריפוגה.
3. תוך כדי החזקת החלק העליון של צינור המיקרו-צנטריפוגה, החלק את הקצה התחתון של הצינור כדי ליצור קצף עם תחליבים גלויים בתחילה. המשך להזיז את הצינור עד שהקצף לא יציג מאפיינים בולטים בתאורה אחורית, מה שמעיד על מיקרו-אמולסיות.
   הערה: בעת הכנת דגימה באמולסיות, תא זרימה או תא דגימה אחר צריכים להיות מוכנים לפני הכנת דגימת האקטין. תא הדגימה של גליל הזכוכית אינו עובד היטב עבור תחליבים מכיוון שהם יקרמו לממשק האוויר ולא משקעים למשטח זכוכית הכיסוי.

7. טען את תא הדגימה (תאי צילינדר)

1. מכניסים 5 מיקרוליטר של תמיסת פעילי שטח שמן לתחתית תא גליל הזכוכית
   הערה: לחלופין, ניתן לבצע דגימות על ידי פסיבציה של פני השטח עם שכבת שומן דו-שכבתית נתמכת 11,29,30.
2. הטה את הכיסוי וסובב לאט כך שמשטח הכיסוי והצילינדר התחתון מצופים בתמיסת פעילי שטח.
3. הסר עודפי תמיסת פעילי שטח עם פיפט כדי לקבל שכבת שמן דקה ככל האפשר מבלי לאפשר לשמן, שהוא נדיף, להתאדות לחלוטין.
4. הוסף מיד את תמיסת המדגם משלב 5.7 לתא.
5. מכסים את החדר בחתיכה קטנה של סרט PTFE כדי למנוע אידוי וזרימה.

8. חלופי: טען את תא הדגימה (תא זרימה)

1. כדי להתכונן להעמסת תא הזרימה, מערבבים כמות קטנה של 5 דקות אפוקסי. טיפה בשטח של פחות מ-0.5 ס"מ^מספיקה בדרך כלל.
2. כדי למקם את הדגימה בתא הזרימה, תחילה פיפטה 1-3 מיקרוליטר של תמיסת פעילי שטח שמן לתוך תעלת הדגימה של תא הזרימה כדי ליצור פקק קטן של תמיסה שמרטיב את התעלה.
3. פיפטה מיד נפח של תמיסת דגימה או תרחיף תחליב לאט לתוך הכניסה של תא הזרימה כדי למלא את התעלה. בדרך כלל, עבור תעלה שגודלה כ-2 מ"מ, הנפח הוא בסביבות 8 מיקרוליטר. הכניסה היא הצד שאליו נוספה תמיסת פעילי השטח בנפט.
   1. אם נפח הדגימה עולה על נפח תא הזרימה, נדף את הדגימה דרך תא הזרימה על ידי הנחת מגבון או נייר סינון נטול מוך בקצה השני של התעלה.
   2. אם המניסקוס של תמיסת פעילי השטח בשמן נסוג, וכתוצאה מכך נוצר פער אוויר, הטה תחילה את תא הזרימה כדי להסיר את מרווח האוויר בכניסה לפני הוספת הדגימה.
4. במידת הצורך, הוסף תמיסת שמן פעילי שטח נוספת עד שהאוויר כבר לא נראה בתעלה או כדי לדחוף את הדגימה (במיוחד עבור תחליבים) הלאה לתוך התעלה.
5. אוטמים כל צד של התעלה באפוקסי של 5 דקות (מעורבב ממש לפני טעינת תא הזרימה).

9. תמונה והוסף מיוזין

1. הרכיב את הדגימה על המיקרוסקופ והתחל הדמיית זמן-lapse של אקטין באמצעות מטרה של 20x, 40x, 60x או 100x עם טבילה בשמן או במים כדי לספק צמצם מספרי גדול מספיק להדמיה ברזולוציה גבוהה. אם פילמור בתא הדגימה, אפשר פילמור למשך ~30 דקות או עד שכבר אין התארכות נימה או תנועה נראית לעין.
2. אופציונלי: הוסף קישור צולב.
3. הוסף מיוזין דרך אפשרויות 1 או 2 להלן.
   1. הוסף מיוזין כדימר המועבר לחלק העליון של הדגימה (אין צורך בערבוב מכיוון שדימר המיוזין יתפזר).
   2. הוסף מיוזין כחוטים מפולימרים מראש. פיפט מערבבים כמחצית מהנפח הכולל לאט מאוד כדי למנוע הפרעה לאקטין הצפוף.
      הערה: השיטה האידיאלית עבור מיוזין בנוסף כדי לקבל את צפיפות הנימה או הגודל הרצויים על משטח הכיסוי עשויה להשתנות עבור ארכיטקטורות אקטין שונות ויש לקבוע אותה בניסוי.
4. התחל הדמיה דולג זמן.

Results

ניתן ליצור מגוון רחב של מכלולי אקטין במערכות מודל המשתמשות בחלבונים מטוהרים על ידי ביצוע האסטרטגיה הכללית המתוארת בשיטות אלה, כאשר אקטין מפולימר לחוטים בנוכחות חלבונים נלווים המשנים את ארכיטקטורת ההרכבה (איור 1). כאשר אקטין מפולימר לחוטים ללא קישורים צולבים או חלבון מכסה, הוא יוצר רשתות חוטים שזורות (איור 1A). הוספת קישור צולב לרשתות השזורות מביאה להיווצרות רשתות מעין דו-ממדיות או רשתות של חבילות (איור 1B,C). היווצר...

Discussion

ישנם שיקולים רבים לייצור מכלולי אקטין הניתנים לשחזור. אחד הקריטיים ביותר להפקת נתונים הניתנים לשחזור וניתנים לניתוח הוא משטח זכוכית הכיסוי של תא הדגימה. החלבונים בדגימות אקטין במבחנה, במיוחד מיוזין, הם דביקים מאוד וייצמדו למשטחי זכוכית לא מטופלים או מטופלים בצורה גרועה, מה שהופך דגימה לבלתי שמישה (איור 5A). דנו בדרך סטנדרטית להכין את פני השטח כדי להניב דגימות הניתנות לשחזור באמצעות פסיבציה של כיסוי סילאני עם שכבת פעילי שטח שמן. עם זאת, להכנה לדוגמה ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-123
008-פלואורו-פעילי שטח	RAN Biotechnologies	00115081361-6525	תמיסה חלופית למעורבבת מראש
008-FluoroSurfactant ב-HFE7500	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G	תמיסה מעורבת
מראש 2-מרקפטואתנול (&בטא;-מרקפטואתנול)	סיגמא אולדריץ'	63689	מספר CAS: 60-24-2 תמיסת מלאי: 25 מ"מ במי MilliQ, מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C
4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-אתאן-חומצה סולפונית (HEPES)	סיגמא אולדריץ'	H3375	מספר CAS: 7365-45-9
5 דקות אפוקסי	Devcon	14250
אקטין	ציטוסקלטון, בע"מ.	AKL99-A	>99% שריר שלד ארנב טהור (חלופי לטיהור)
אקטין (תווית רודמין)	Cytoskeleton, Inc.	AR05-A	שריר שלד ארנב (חלופי לטיהור)
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט (ATP)	סיגמא אולדריץ'	A6419	מספר CAS: 34369-07-8 תמיסת מלאי: 25 מ"מ במי MilliQ, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C שמור קפוא כדי למנוע הידרוליזה
סידן כלורי (CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	CAS Number: 10043-52-4
מכסה חלבון (עכבר)			מטוהר מביטוי יתר ב-E.coli עם HisTag תמיסת מלאי: 20 מ"מ במכסה חלבון מאגר ב-80 & deg; C
קטלאז מכבד בקר	סיגמא אולדריץ'	C9322	מספר CAS: 9001-05-2 תמיסת מלאי: 85 ku/mL, יש לאחסן עם גלוקוז אוקסידאז ב-20°
C Cover זכוכית	Fisherbrand	12544C	בורוסיליקט, #1.5, 24 מ"מ x 40 מ"מ Fisherbrand לא Fisher Finest
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G8270	מספר CAS: 50-99-7 תמיסת מלאי: 225 מ"ג/מ"ל במי MilliQ, יש לאחסן ב-20 מעלות; C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	3860-OP	מספר CAS: 3483-12-3 פתרון מלאי: 1 M במי MilliQ, אחסן ב-20 מעלות;
C סרט דו צדדי	3M	3136
אתיל אלכוהולול 200 הוכחה	PHARMCO	111000200	מספר CAS: 64-17-5 200 הוכחה
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N′-חומצה טטראצטית (EGTA)	סיגמא אולדריץ'	E3889	מספר CAS: 67-42-5
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)	סיגמא אולדריץ'	E9884	מספר CAS: 60-00-4
גלוקוז אוקסידאז	סיגמא אולדריץ'	345386	מספר CAS: 9001-37-0 תמיסת מלאי: 135 מ"ג/מ"ל במי MilliQ, יש לאחסן עם קטלאז בטמפרטורה של -20 מעלות; C
גליצרול	סיגמא אולדריץ'	356352M	מספר CAS: 56-81-5
אימידזול	פישר ביוריאגנטים	BP305-50	מספר CAS: 288-32-4
מגנזיום כלוריד (MgCl2)	פישר ביוריאגנטים	BP214	מספר CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
מתיל צלולוז	סיגמא אולדריץ'	M0512	מספר CAS: 9004-67-5 15
שקופיות מיקרוסקופ	מיקרוסקופ אלקטרונים רגילים / חותם זהב	63710-05	3"x1", עובי 1 מ"מ
מים MilliQ	Millipore	CUFBI001	מים טהורים במיוחד
Novec-7500 נוזל מהונדס	3M	7100134816	תמיסה חלופית למעורבבת מראש
אשלגן כלורי (KCl)	סיגמא אולדריץ'	P3911	מספר CAS: 7447-40-7
אשלגן פוספט (KPO4)	Sigma Aldrich	P3786	מספר CAS: 7758-11-4
אבקת אצטון שרירי שלד ארנב	Pel-Freez ביולוגיים	41995-1	משמש בעת טיהור אקטין (לסירוגין לרכישה) אחסן כ-30 מ"מ במאגר אקטין G ב-80 מעלות; C
נתרן אזיד	סיגמא אולדריץ'	71289	מספר CAS: 26626-22-8
Tetramethylrhodamine-C6-maleimide	AnaSpec	AS-81445	מספר CAS: 174568-68-4 משמש בעת טיהור אקטין (לסירוגין לרכישה) אחסן כ-30 מ"מ במאגר אקטין G ב-80 מעלות צלזיוס. משמש בעת תיוג אקטין (חלופי לרכישה)
חומצה הידרוכלורית טריס (Tris HCl)	Sigma Aldrich	648317	מספר CAS: 1185-53-1
אמבטיה אולטרסאונד	אמרסון ברנסון