הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ותרבית של תאי מולר רשתית ראשוניים מחולדות Sprague-Dawley (SD)

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68129

⸱

17 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים ברשתית מחולדות Sprague-Dawley (SD) יילודים. ההליך כולל הוצאת גלגלי העין, דיסקציה של רקמת הרשתית, מיצוי וזיהוי תאים, ושיקולים מרכזיים לתרבית תאים לאחר מכן.

תקציר

תאי מולר ברשתית (RMCs) ממלאים תפקיד מכריע במתן תמיכה מבנית ובוויסות תפקודים שונים בתוך הרשתית. כמרכיב ליבה של מיקרו-סביבת הרשתית, RMCs מבצעים מספר פונקציות חיוניות. באמצעות תעלות היונים השופעות, הליגנדים, הקולטנים, המובילים הטרנסממברניים ומערכות האנזימים שלהם, תאים אלה תורמים להפרשת נוירוטרנסמיטר וגורמים טרופיים, מווסתים את חילוף החומרים ברשתית ושומרים על הומאוסטזיס של יוני מים. יש לציין כי RMCs זוהו לאחרונה כמקור משמעותי לתאי גזע רגנרטיביים אנדוגניים ברשתית, המציעים מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות ניווניות של הרשתית. לכן, חקר RMCs חיוני להבנת המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס הפרעות ברשתית. מחקר זה קובע באופן שיטתי פרוטוקול ניסוי סטנדרטי הכולל עיכול טריפסין וטיהור של RMCs ראשוניים, תצפית מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופיה אופטית הפוכה וצביעה של המטוקסילין ואאוזין (HE), זיהוי חלבון ספציפי באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח טוהר תאים באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה משמש כהתייחסות חשובה הן למחקר בסיסי והן ליישומים קליניים הקשורים ל-RMCs, תומך בחקר המנגנונים שלהם במחלות רשתית ומקדם פיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

מבוא

תאי גליה של מולר ברשתית (RMCs), המקרוליה הדומיננטית ברשתית, מהווים את הליבה של היחידה הנוירו-וסקולרית ברשתית 1,2. משתרעים כמעט על כל עובי הרשתית, RMCs חובקים כמעט את כל תאי העצב והמיקרו-כלי דם ברשתית. התהליכים שלהם משתרעים כלפי מעלה אל הממברנה המגבילה הפנימית (ILM), ויוצרים כפות רגליים אפיקליות, ומטה אל הממברנה המגבילה החיצונית (OLM), שם הם מפתחים מיקרוווילי3 מיוחדים. ארכיטקטורה ייחודית זו מאפשרת ל-RMC לתפקד כפיגום המבני העיקרי לארגון הרשתית 4,5.

RMCs מועשרים בתעלות יונים, ליגנדים, קולטנים, טרנספורמטורים טרנסממברניים ואנזימים6, והם משתתפים במטבוליזם של גלוקוז ברשתית באמצעות גליקוליזה7. תעלות יוני אשלגן (Kir2.1, Kir4.1) וחלבוני תעלות מים (AQP4, AQP9, AQP11) מווסתים בשיתוף פעולה הומאוסטזיס יונים ומים על פני קרום התא, ושומרים על איזון פיזיולוגי ברשתית7. בנוסף, RMCs סופגים ומנקים נוירוטרנסמיטורים המשתחררים על ידי נוירונים, כולל גלוטמט, חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA) וגליצין 7,8.

מצבים פתולוגיים כגון רטינופתיה סוכרתית7, גלאוקומה9 ורטיניטיס פיגמנטוזה10 עלולים לפגוע ב-RMC, לשבש את מחסום הדם-רשתית, לעורר דלקת, להגביר את חדירות כלי הדם ולפגוע בתפקוד הרשתית. RMCs מוכרים גם כמקורות פנימיים סמויים של תאים מתחדשים ברשתית11,12. בדגים ובדו-חיים מסוימים, RMCs יכולים להתמיין לתאי אב ברשתית המחליפים נוירונים שאבדו בפציעה13. ברשתית של יונקים בוגרים, RMCs מבטאים חלבוני סמן הקשורים לתאי גזע14,15, מה שמעניק להם את הפוטנציאל להתמיין לתאי עצב ברשתית ולהחליף תאים פגומים במחלות ניווניות כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, גלאוקומה ורטינופתיה סוכרתית16. RMCs ראשוניים מחקים מקרוב את מצבם in vivo והם בעלי ערך רב במחקר וטיפול במחלות ניווניות ברשתית. עם זאת, הספרות מכילה מעט שיטות מבוססות לבידוד וטיפוח RMCs ראשוניים, במיוחד מחולדות Sprague-Dawley (SD) יילודים.

פרוטוקול זה משתמש בחולדות SD יילודים בנות 3-5 ימים, ללא העדפה מגדרית. בתנאים סטריליים, גלגלי העיניים מנוטרלים, ורקמת הרשתית מתעכלת באמצעות טריפסין. לאחר מכן מבודדים RMCs ראשוניים באמצעות צנטריפוגה וטיהור לצורך תרבית ומעבר לאחר מכן. ניתוח מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופיה אופטית הפוכה בשילוב צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) גילה כי התאים המבודדים הפגינו תכונות RMC אופייניות. צביעה אימונופלואורסצנטית אישרה את הביטוי של סמני חלבון ספציפיים ל-RMC, כולל גלוטמין סינתטאז (GS), חלבון קושר רטינלדהיד תאי (CRALBP), וימנטין, אקוופורין-4 (AQP4) ותעלת אשלגן מיישר פנימה 4.1 (Kir4.1). ניתוח ציטומטרי זרימה לאחר תיוג עם נוגדנים GS ו-CRALBP הראה טוהר תאים של ≥90%, העומד בקריטריונים שנקבעו לניסויים ביולוגיים מבוססי RMC ומבטיח התאמה למחקרים פונקציונליים הבאים. במהלך תהליך הניסוי, תאים במעבר הרביעי הראו היצמדות מופחתת לבקבוק התרבית, שינויים מורפולוגיים וסימני הזדקנות, מה שהוביל בסופו של דבר למוות של תאים. לכן, רק תאים משלושת המעברים הראשונים שימשו בניסויים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר אתיקה: 2024069). במחקר נעשה שימוש בחמישים חולדות ספציפיות ללא פתוגן (SPF) (בנות 3-5 ימים, מין לא מוגדר, משקל גוף 7-10 גרם). בעלי החיים הושגו באופן מסחרי ושוכנו במרכז חיות הניסוי של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר רישיון שימוש במתקן SYXK [סצ'ואן] 2024-049) בתנאי מעבדה סטנדרטיים. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. בידוד ותרבות של RMCs ראשוניים

  1. הכנת פריטי ניסוי
    1. עקר את הפריטים הבאים באור אולטרה סגול למשך 30 דקות לפחות על הספסל הנקי לפני השימוש: צלוחיות תרבית T25, צינורות ומתלים צנטריפוגה, פיפטות ומעמדים, מיכלים לפסולת נוזלית, מציתים, מנורות אלכוהול אלכוהול וסמנים.
    2. עקר את הפריטים הבאים על ידי חיטוי לפני השימוש: קצות פיפטה של 1 מ"ל, צלחת כיפוף, צלחות פטרי מזכוכית עם מכסים, פינצטה מעוקלת, רשת ניילון 45 מיקרומטר (300 רשת), פינצטה עם שיניים, פינצטה ללא שיניים ומספריים מיקרו קרנית.
  2. הכנה סביבתית: חיטוי הסביבה ושולחן הניתוחים לדיסקציה של גלגל העין באור אולטרה סגול למשך יותר מ-30 דקות. רססו אלכוהול על ידיו של הנסיין בכל פעם לפני הכניסה ואחרי היציאה מהספסל הנקי. הגדר את החממה ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. רססו את ידיו של הנסיין באלכוהול לפני ואחרי פתיחת האינקובטור.
  3. הכנת תמיסה: הכינו את התמיסה של D-Hank, תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (גלוקוז גבוה DMEM), סרום בקר עוברי (FBS, מושבת בחום), תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (פי 100), ותמיסת טריפסין-EDTA של 0.25%.
    הערה: יש לחמם DMEM ו-FBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    1. הכן את התמיסות של D-Hank ו-PBS המכילות 1% פניצילין/סטרפטומיצין על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין ל-10 מ"ל של תמיסת D-Hank או PBS, בהתאמה.
    2. הכן את מדיום התרבית השלם על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין ו-2 מ"ל של FBS ל-10 מ"ל של DMEM עתיר גלוקוז.
      הערה: הכן פתרונות על ספסל נקי במעבדה והשתמש בהם מיד במידת האפשר. אחסן את מדיום התרבות השלם ב-4 מעלות צלזיוס וחמם ל-37 מעלות צלזיוס לפני כל שימוש. יש להשליך אם הוא מאוחסן במשך יותר משבוע.
  4. הסרת עיניים
    1. המתת חסד של חולדות SD בילודים על ידי פריקת צוואר הרחם (ללא חנק CO2) על שולחן עבודה מעוקר בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד. טבלו את הגופות ב-75% אלכוהול למשך 5 דקות לחיטוי, ואז העבירו לכלי מעוקל סטרילי.
    2. יוצקים את התמיסה של D-Hank לשתי צלחות תרבית זכוכית בגודל 10 ס"מ.
    3. השתמש בפינצטה משוננת כדי לקרוע את העפעף לאורך הסדק הפלפברלי כדי לחשוף את גלגל העין.
    4. השתמש בפינצטה ללא שיניים המוחזקות פתוחות ומקבילות לסדק הפלפברלי כדי ללחוץ כלפי מטה על האורביטל. לאחר שמגיעים לעצב הראייה וגלגל העין נחשף, סגור את הפינצטה כדי להרים ולחלץ את גלגל העין.
    5. מניחים את גלגל העין בכלי תרבית זכוכית עם התמיסה של D-Hank, שוטפים אותו ומעבירים אותו לכלי אחר עם התמיסה הטרייה של D-Hank.
      הערה: ודא שגלגל העין נשאר שלם. באופן אידיאלי, חלק מעצב הראייה צריך להישאר מחובר כדי להקל על הפרדת רקמת הרשתית.
  5. דיסקציה של הרשתית
    1. הכינו צלחת תרבית ריקה מעוקרת ומכסה והתאימו את המיקרוסקופ.
    2. הניחו את צלחת תרבית הזכוכית משלב 1.4.5 מתחת למיקרוסקופ. השתמש במלקחיים מיקרו עיניים מעוקלים כדי לקבע בעדינות את האזור שבין הקרנית לעצב הראייה כדי לחשוף את הקרנית.
    3. חודרים את הצומת הקרניאוסקלרי בעזרת מספריים מיקרו קרנית. חותכים לאורך הלימבוס בצורה מעגלית, ואז מבצעים חתכים סקלרליים סימטריים באורך של כ -2 מ"מ. שחרר את המלקחיים והדק מחדש בצומת עצב הראייה והסקלרה.
    4. השתמש במלקחיים שניים כדי ללחוץ בעדינות ליד שורש עצב הראייה, לכוון את הלחץ לכיוון ממשק עצב הקרנית-אופטי. כאשר רקמת העדשה מופיעה, הסר אותה בזהירות והמשך ללחוץ עד להופעת רקמת הרשתית.
      הערה: הסר את העדשה בזהירות כדי למנוע חילוץ בטעות של רקמת הרשתית.
    5. העבירו את רקמת הרשתית המופרדת לצלחת תרבית סטרילית אחרת באמצעות מלקחיים. מכסים את התבשיל, מרססים אותו באלכוהול ומניחים אותו על הספסל הנקי.
  6. חילוץ RMCs ראשוניים
    1. הפעל את מתג אוורור הספסל הנקי.
    2. פתח את מכסה צלחת התרבות. השתמש בפיפטה עם קצה של 1 מ"ל כדי לזרוק את רקמת הרשתית למעלה ולמטה כ-15 פעמים כדי לשבור אותה לחתיכות קטנות. מוסיפים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. מוציאים את צלחת התרבות מהחממה ומניחים אותה על הספסל הנקי. הוסף 2 מ"ל של מדיום שלם ופיפטה בעדינות כדי לעצור את העיכול.
      הערה: השתמש בנפח כפול של טריפסין כדי להפסיק את העיכול. לדוגמה, אם נעשה שימוש ב-1 מ"ל של טריפסין, סיים עם 2 מ"ל של מדיום שלם.
    4. סנן את מתלה התא דרך מסך ניילון 300 רשת לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שוטפים את המנה עם PBS מוכן ואוספים את המתלה שנותר.
    5. צנטריפוגה את הצינור ב-878 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שאפו והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיום שלם וצנטריפוגה שוב ב-878 x גרם למשך 5 דקות כדי לטהר את התאים.
    6. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב -2 מ"ל של מדיום שלם. הוסף 3 מ"ל של מדיום שלם לכל בקבוק T25 לפני כן, ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל של מתלה התאים. נענע את הבקבוק בתבנית צלב והניח אותו בחממה.
    7. בצע את השינוי הבינוני הראשון לאחר 48 שעות של דגירה. מוציאים את הבקבוק מהחממה ומניחים אותו על הספסל הנקי. השליכו את המדיום המושקע ושטפו את המשטח הדבק לתאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS.
      1. מוסיפים 5 מ"ל של מדיום שלם טרי. המשך לשנות את המדיום כל יומיים עד שמפגש התאים עולה על 90%, ואז המשך בתת-תרבית.

2. העברת RMC

הערה: מעבר התאים כאשר המפגש עולה על 90%. בפרוטוקול זה, תרביות ראשוניות דורשות בדרך כלל מעבר 5-6 ימים לאחר הבידוד. העיתוי של המעבר הראשון עשוי להשתנות בהתאם לצפיפות הציפוי. התאם את צפיפות התאים ל-4 x 103 תאים/מ"ל וזרע את התאים לתוך צלוחיות תרבית T25. כאשר המפגש מגיע ל->90% לאחר 3-4 ימים, המשך במעבר.

  1. הסר את בקבוק התרבות T25 מהחממה. השליכו את מדיום התרבית ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של תמיסת PBS המכילה 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% לבקבוק ודגירה למשך דקה ו -30 שניות.
  3. התבונן בבקבוק תחת מיקרוסקופ הפוך. כאשר התאים נראים עגולים, מנותקים ומתחילים לצוף, הסר את הבקבוק מהחממה. העבירו אותו לספסל הנקי והוסיפו 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם כדי לסיים את העיכול.
  4. השתמש בפיפטה כדי לשאוב את מתלה התא. פיפטה בעדינות על דופן הבקבוק כדי לעקור את כל התאים הדבקים שנותרו.
  5. העבירו את כל מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שטפו את דופן הבקבוק עם 2 מ"ל PBS המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין והוסיפו אותו לאותו צינור. צנטריפוגה את הצינור ב-878 x גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  6. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא בנפח מתאים של מדיום שלם. העבר את התאים ביחס של 1:2 או 1:3 כנדרש.
    הערה: השתמש בתאים במעבר 2 (P2) עבור ניסויים במורד הזרם (איור 1).

3. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)

  1. מעבר זרעים 2 (P2) תאים בצלחת בת 6 בארות המכילה כיסויים סטריליים שהונחו מראש בצפיפות של 2 x 105 תאים לבאר. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות שלם לכל באר. כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, השליכו את מדיום התרבות ושטפו בעדינות כל באר פעמיים עם 1 מ"ל PBS.
  2. הוסף 1 מ"ל של 4% קיבוע פרפורמלדהיד לכל באר ודגר למשך 30 דקות כדי לתקן את התאים. השליכו את הקיבוע ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל PBS.
  3. מוסיפים 1 מ"ל כתם המטוקסילין לכל באר ודוגרים למשך 15 דקות. השליכו את תמיסת הצביעה ושטפו את הבארות 2-3 פעמים עם 1 מ"ל PBS.
  4. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ. אם כתם ההמטוקסילין נראה כהה מדי, השתמש באלכוהול חומצה הידרוכלורית 1% כדי להבדיל ולהסיר עודף כתם ציטופלזמי. שוטפים 2-3 פעמים עם 1 מ"ל PBS.
  5. הוסף 1 מ"ל תמיסת מכתים של אאוזין לכל באר. התבונן בצביעה מתחת למיקרוסקופ למשך כ-30 שניות או עד להשגת עוצמת הצבע הרצויה. שוטפים את הבארות 2-3 פעמים עם 1 מ"ל PBS. הרכיבו את הכיסויים על שקופיות באמצעות שרף ניטרלי.

4. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. תאי זרע P2 בצלחת של 6 בארות המכילה כיסויים סטריליים שהונחו מראש בצפיפות של 2 x 105 תאים לבאר. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות שלם לכל באר.
    1. כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, השליכו את מדיום התרבית. הסר את הכיסוי והניח אותו בצנצנת מכתים. שטפו את הכיסוי שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS, 5 דקות בכל פעם.
  2. הוסף כ -50 מיקרוליטר של תמיסת חדירות (Triton X-100: PBS = 1: 200) כדי לכסות את התאים. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ואז לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS, 5 דקות בכל פעם. מוסיפים כ-50 מיקרוליטר של תמיסת חסימת BSA 3% ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  3. השלך בעדינות את תמיסת החסימה. הוסף כ-200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית שהוכנה ב-PBS כדי לכסות את השקופית: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) או Vimentin (1:200). הנח את הכיסוי בתא לח ודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את הכיסוי שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS, 5 דקות בכל פעם.
  5. הוסף כ-200 מיקרוליטר של נוגדן משני IgG נגד ארנב עזים עם תווית FITC17. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 50 דקות. שטפו את הכיסוי שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS, 5 דקות בכל פעם.
  6. מכתים את הגרעינים ב- DAPI למשך 10 דקות. שטפו שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS, 5 דקות בכל פעם.
  7. הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה נגד דהייה לשקופית. התקן את תא הכיסוי כלפי מטה. אטום והתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. ציטומטריית זרימה

  1. התאם את ריכוז התאים ל-1.0 x 107 תאים/מ"ל באמצעות מאגר צביעת ציטומטריית זרימה.
  2. יש לשים 100 מיקרוליטר של המתלה החד-תאי לשני צינורות דגימה נפרדים לכל מצב. ייעד צינור אחד כבקרה השלילית (הלא מוכתמת).
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום חדירות A (מהערכה שהושגה מסחרית, ראה טבלת חומרים) לכל צינור. מערבבים בעדינות ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. הוסף 3 מ"ל של מאגר צביעת זרימה ציטומטרית מקורר מראש לכל צינור. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT והשליכו את הסופרנטנט.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום חדירות B (מהערכה המתקבלת מסחרית) לכל צינור ומערבולת לערבוב. הוסף 0.1 מיקרוליטר של נוגדן CRALBP לצינורות הדגימה המיועדים, ו-0.8 מיקרוליטר של נוגדן GS לצינורות המתאימים. אל תוסיף נוגדן לצינור הבקרה השלילי. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30-60 דקות.
  6. הוסף 3 מ"ל של מאגר צביעת זרימה ציטומטריה לכל צינור. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT והשליכו את הסופרנטנט.
  7. השעו מחדש כל צינור ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעת ציטומטריית זרימה. הוסף 1 מיקרוליטר של IgG (H&L) נגד ארנב עזים מצומד FITC לכל צינור מוכתם ב-CRALBP, ו-1 מיקרוליטר של IgG נגד ארנב (H&L) מצומד PE לכל צינור מוכתם GS. אל תוסיף נוגדן לצינור הבקרה השלילי. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30-60 דקות.
  8. הוסף 3 מ"ל של מאגר צביעת זרימה ציטומטריה לכל צינור. צנטריפוגה בחום של 300 x גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
  9. השעו מחדש כל צינור ב-300 מיקרוליטר של מאגר צביעת זרימה ציטומטרית. המשך מיד בניתוח ציטומטריית זרימה; לחלופין, יש להשהות מחדש ב-500 מיקרוליטר של 1%-4% פרפורמלדהיד, לאחסן ב-2-8 מעלות צלזיוס בחושך ולנתח תוך 24 שעות.
  10. ניתוח דגימות שליליות וחיוביות באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר שתאים ראשוניים נזרעים לתוך בקבוק התרבית, שינויים ומעבר במדיום עוזרים לחסל RMCs דבוקים בצורה גרועה ולהסיר פסולת תאית שנוצרה במהלך המעבר, ובכך להעשיר את אוכלוסיית ה-RMC בתרבית. RMCs זוהו על סמך המורפולוגיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך (איור 1) וצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) (איור 2). צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה באמצעות נוגדנים ספציפיים כנגד GS, Vimentin, CRALBP, AQP4 ו-Kir4.1 כדי לצפות בביטוי חלבון (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבידוד RMCs ראשוניים מחולדות SD יילודים. הפרוטוקול מכסה את כל השלבים, כולל הכנות טרום ניסוי, כריתת גלגל העין, בידוד רקמת הרשתית ונהלים שלב אחר שלב לחילוץ, תרבית, מעבר וזיהוי RMC. הוא גם מדגיש שיקולים מרכזיים שיש להקפיד עליהם לאורך כל תהליך תרבית התאים, ומציע הדרכה טכנית סטנדרטית למחקר קשור.

למיצוי RMC, נבחרו חולדות SD יילודים בגילאי 3-5 ימים. בשל גודלם הקטן של גלגלי העיניים בחולדות בגיל זה, ההליכים לבידוד גלגל העין וחילוץ רקמת הרשתי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים הקשור לתוכן מאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קרן הטבע המחוזית של סצ'ואן (2023NSFSC0690).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1% טריטון X-100SolarbioT8200
0.25% טריפסין-EDTAהיקלון SH30042.01B
1% חומצה הידרוכלורית אלכוהולBIOSYSTEMS3803651E
4% ParaformaldehydeSolarbioP1110
45μ m רשת ניילון (300 רשת)SolarbioYA0926
צלחת 6 בארותServicebioIMC202302001
6 ס"מ צלחת פטרי זכוכיתNormax5058541
75% אלכוהולKESHIGEA004
Aquaporin-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
חממת תרבית תאיםתרמוFORMA311
חלבון קושר רטינלדהיד תאי (CRALBP)HUABOIHA721330
צנטריפוגהHunan XiangyiTDZ5-WS
ספסל נקיZHICHENGZHJH-C12
מספריים לקרניתJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
תמיסת D-HankSolarbioH1045
DMEM  גלוקוז גבוה בינוניGibcoC11995500BT
סרום בקר עוברי (FBS)Sbjbio מדעי החייםBC-SE-FBS01
FIX& PERM בינוני AMultiSciencesGAS006/2
FIX& PERM בינוני BMultiSciencesGAS006/2
מאגר צביעת ציטומטריה זרימהMultiSciencesS1001
Fluoromount-G מדיה הרכבה פלואורסצנטיתSourthernBiotech0100-01
גלוטמין סינתטאז נוגדן פוליקלונליProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50ul
עז 324 אנטי ארנב IgG H& L PEBiossbs-0295G-PE
עז אנטי- 323 ארנב IgG H& L FITCBiossbs-0295G-FITC
Hematoxylin-eosin (HE) ערכת צביעהSolarbioG1120
מכונת חיטוי בלחץ גבוהZealway (xiamen) מכשיר IncGI80DS
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךNikon 
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכהLeica DMIL
מיישר פנימה תעלת אשלגן 4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
שרף ניטרליSolarbioG8590-100
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100&)HycloneSV30010
Phosphate Buffer Salt (PBS) (pH7.2- 7.4)SolarbioP1020-500ml
נוגדן משני (נגד ארנב עזים עם תווית FITC)ServicebioGB22303
חולדות Sprague-Dawley צ'נגדו דאשו בעלי חיים ניסיוניים ושות', בע"ממספר רישיון הפקה: SCXK [סצ'ואן] 2020-0030
בקבוק תרבות T25קורנינג 
430639 צינורות טורנדו: 15 מ"לWHB טורנדו WHB-15-1
50 מ"לWHB WHB-50-1
מעקר חיטוי אולטרה סגולGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
SMZ1500צינורות :

מקורות

  1. Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  2. Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
  3. Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
  4. Subirada, P. V., Paz, M. C., Ridano, M. E., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. Eur J Neurosci. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  5. Wang, J., O'Sullivan, M. L., Mukherjee, D., et al. Anatomy and spatial organization of Müller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  6. Beverley, K. M., Pattnaik, B. A. Inward rectifier potassium (Kir) channels in the retina: Living our vision. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (3), C772-C782 (2022).
  7. Lai, D., Wu, Y., Shao, C., et al. The role of Müller cells in diabetic macular edema. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (10), 8(2023).
  8. Coughlin, B., Schnabolk, G., Joseph, K., et al. Systemic complement inhibition reduces intraocular inflammation and retinal cell death in murine models of glaucoma. J Neuroinflammation. 16, 212(2019).
  9. Alarcon-Martinez, L., Shiga, Y., Villafranca-Baughman, D., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  10. Strong, S., Liew, G., Michaelides, M. Retinitis pigmentosa-associated cystoid macular oedema: Pathogenesis and avenues of intervention. Br J Ophthalmol. 101 (1), 31-37 (2017).
  11. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  12. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. J. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  13. Norrie, J. L., et al. Latent epigenetic programs in Müller glia contribute to stress and disease response in the retina. Dev Cell. 60 (8), 1199-1216.e7 (2025).
  14. Too, L. K., Gracie, G., Hasic, E. Adult human retinal Müller glia display distinct peripheral and macular expression of CD117 and CD44 stem cell-associated proteins. Acta Histochem. 119 (2), 142-149 (2017).
  15. Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res. 93 (6), 852-861 (2011).
  16. Grigoryan, E. N. Cell sources for retinal regeneration: Implication for data translation in biomedicine of the eye. Cells. 11 (23), 3755(2022).
  17. Dong, S., Li, X., Chen, Z. MMP28 recruits M2-type tumor-associated macrophages through MAPK/JNK signaling pathway-dependent cytokine secretion to promote the malignant progression of pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 60(2025).
  18. Vardimon, L., Ben-Dror, I., Havazelet, N. Molecular control of glutamine synthetase expression in the developing retina tissue. Dev Dyn. 196 (4), 276-282 (1993).
  19. Xu, Q. A., Boerkoel, P., Hirsch-Reinshagen, V. Müller cell degeneration and microglial dysfunction in the Alzheimer's retina. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 145(2022).
  20. Bunt-Milam, A. H., Saari, J. C. Immunocytochemical localization of two retinoid-binding proteins in vertebrate retina. J Cell Biol. 97 (3), 703-712 (1983).
  21. Masri, R. A., et al. Immunohistochemistry and spatial density of Müller cells in the human fovea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 46(2025).
  22. Kolesnikov, A. V., Kiser, P. D., Palczewski, K. Function of mammalian M-cones depends on the level of CRALBP in Müller cells. J Gen Physiol. 153 (1), e202012675(2021).
  23. Xue, Y., Shen, S. Q., Jui, J. CRALBP supports the mammalian retinal visual cycle and cone vision. J Clin Invest. 125 (2), 727-738 (2015).
  24. Pereiro, X., Beriain, S., Rodriguez, L. Characteristics of whale Müller glia in primary and immortalized cultures. Front Neurosci. 16, 854278(2022).
  25. Tran, T. L., Bek, T., Holm, L. Aquaporins 6-12 in the human eye. Acta Ophthalmol. 91 (6), 557-563 (2013).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (2), 42-47 (2015).
  27. Zeng, Q., Xia, X. B. Study on the differentiation of retinal ganglion cells from rat Müller cells in vitro. Yan Ke Za Zhi. 46 (7), 615-620 (2010).
  28. Backstrom, J. R., et al. Phenotypes of primary retinal macroglia: Implications for purification and culture conditions. Exp Eye Res. 182, 85-92 (2019).
  29. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  30. Pereiro, X., et al. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice Müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14 (7), (2020).
  31. Wang, M., Ma, W., Zhao, L. Adaptive Müller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. J Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  32. Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P. Isolation of primary mouse retinal glial Müller cells. J Vis Exp. (210), e66237(2024).
  33. Li, Q., Cheng, Y., Zhang, S. TRPV4-induced Müller cell gliosis and TNF-α elevation-mediated retinal ganglion cell apoptosis in glaucomatous rats via JAK2/STAT3/NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 18 (1), 271(2021).
  34. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  35. Reichenbach, A., Wolburg, H., Richter, W. Membrane ultrastructure preservation and membrane potentials after isolation of rabbit retinal glial (Müller) cells by papain. J Neurosci Methods. 32 (3), 227-233 (1990).
  36. Harstad, H. K., Ringvold, A. Scanning and transmission electron microscopy of Müller cells isolated from rabbit retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 223 (1), 29-34 (1985).
  37. Guidry, C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (5), 740-752 (1996).
  38. Qiu, A. W., Wang, N. Y., Yin, W. J. Retinal Müller cell-released exosomal miR-92a-3p delivers interleukin-17A signal by targeting Notch-1 to promote diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 1(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית תאי ראשונייםדיסקציה של הרשתיתעיכול בטריפסיןחולדות Sprague-Dawleyצביעה אימונופלורסצנטיתציטומטריה של זרימהצביעת המטוקסילין-אוסיןגלוטמין סינתטאזתאי גזע של הרשתית
בידוד ותרבית של תאי מולר רשתית ראשוניים מחולדות Sprague-Dawley (SD)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.