פרוטוקולי סינון ניסיוניים, אימונוציטוכימיה וטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה עבור Penium margaritaceum

Summary

דוח זה מתאר את השיטות הבסיסיות המשמשות לתרבית ולמניפולציה ניסויית של אצת הסטרפטופיטים החד-תאית, Penium margaritaceum. הוא גם מספק פרוטוקולים בסיסיים של הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה, כולל תיוג תאים חיים עם נוגדנים חד-שבטיים ובדיקות פלואורסצנטיות אחרות ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

Abstract

דופן התא היא המרכיב הראשון של קליטה/התמרת אותות עבור תא צמח במהלך ההתפתחות וכאשר הוא מגיב לגורמי לחץ סביבתיים אביוטיים וביוטיים. התא עוקב כל הזמן אחר שלמות דופן התא שלו ומווסת אותה בתגובה ללחץ. הבהרת המודולציות המבניות והביוכימיות הספציפיות המתרחשות בדופן התא היא משימה קשה במיוחד כאשר משתמשים בצמחים רב-תאיים ואיברים/רקמות שלהם. זאת בשל מגבלות לגבי מה שניתן לפתור בתא בודד שהוא חלק מרשת רב-תאית מורכבת. אצת הסטרפטופיט החד-תאית, Penium margaritaceum, שימשה לאחרונה בחקירות של דינמיקת פקטין, פלסטיות פנוטיפית מבוססת דופן תא והיבטים מרובים של ביולוגיה של תאי אצות. הפנוטיפ הפשוט שלו, דופן התא הייחודית שיש לו מרכיבים רבים הדומים במיוחד לדפנות התא של צמחי היבשה, והקלות במחקרים אימונוציטוכימיים וניסויים הופכים אותו לאורגניזם מודל רב עוצמה בביולוגיה של דופן תא הצמח. מטרת מחקר זה היא לספק את הטכניקות הבסיסיות לתרבית, מניפולציה ניסויית וסינון של גורמי לחץ יישומיים. פרוטוקולי סינון לאימונוציטוכימיה, הדמיית מיקרוסקופיה סורקת לייזר קונפוקלית והדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של מבנה דופן התא. כמו כן, רבות מהטכניקות המתוארות עשויות להשתנות עבור מגוון רחב של מחקרים תאיים ומולקולריים אחרים.

Introduction

דופן התא של צמח היא רשת פולימרית מורכבת שיש לה תפקידים מרובים בחייו של תא צמח¹. שלמות דופן התא מנוטרת כל הזמן על ידי התא במהלך ההתפתחות ובתגובה ללחץ סביבתי ומווסתת בכימיה ובמבנה בהתאם. Penium margaritaceum היא אצה ירוקה חד-תאית ששימשה לאחרונה במחקרים על אצות סטרפטופיטים (Streptophyta, קבוצת האצות הירוקות הקרובות ביותר לצמחי יבשה²).

במהלך שני העשורים האחרונים, P. margaritaceum היה אורגניזם חשוב בחקר דופן התא ודינמיקה של מטריצה חוץ-תאית, פעילויות מערכת אנדומברנה, ביטוי צורת התא ואבולוציה של צמחים 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . מטרת עבודה זו היא לספק לחוקרי דופן תא הצמח את השיטות הבסיסיות לתרבית P. margaritaceum, מניפולציה ניסויית שלו באמצעות טכניקות מבוססות מיקרו-פלטות, וניטור מבנה דופן התא שלו באמצעות תיוג אימונוציטוכימי של תאים חיים והדמיה בטכניקות מיקרוסקופ אור ואלקטרונים. ל-P. margaritaceum יש קווי דמיון רבים בביוכימיה של דופן התא לדפנות התא הראשוניות של צמחי יבשה. פיתחנו מספר פרוטוקולים המנצלים את הפנוטיפ החד-תאי הייחודי של אצה זו ומספקים אמצעי מהיר לחקר דינמיקת דופן התא שלעתים קרובות קשה לנטר בצמחים רב-תאיים. טכניקות אלה יעזרו לביולוגים של דופן התא של הצמח שרוצים להבהיר דינמיקה מפורטת של דופן התא, במיוחד אלה העוסקים בפקטין, וישמשו נקודת מוצא למחקרים העוסקים בביולוגיה של תאי אצות צמחים וסטרפטופיטים.

Protocol

הערה: Penium margaritaceum מושג ב- Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - אוסף תרבות האצות באוניברסיטת גטינגן, SAG; זן #2640.

1. שמירה על תרבויות

1. שמור את האצה במדיום נוזלי של Woods Hole (WH¹²) שניתן להשלים גם עם תמצית מי אדמה (כלומר, 40 מ"ל לליטר מדיום). שמור על תרביות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 16 שעות:8 שעות: חושך עם 3.5 קלוקס (74 מיקרומול פוטונים/מ"^{ר לשנייה}) של אור פלואורסצנטי לבן קריר.
2. הכינו תת-תרביות מדי שבוע והשתמשו בתרביות תאים כשהן בנות 10-14 יום. תרביות פניום יהיו ברות קיימא למשך 6 חודשים וניתן להשתמש בהן כדי להתחיל תת-תרבויות במהלך תקופה זו. האצה תגדל גם על 1%-2% אגר WHM מוצק.
3. לסנכרון מחזור תאים שגרתי, הניחו תאים מתרבויות בנות 10-14 יום בחושך למשך 2-6 שבועות בטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס. לאחר זמן זה, יש לשטוף את התאים ב- WHM טרי (ראה להלן) ותרבות כמתואר לעיל.

2. תיוג דופן התא עם נוגדנים חד שבטיים

הערה: P. margaritaceum מכוסה בדופן תא ראשונית שיש בה רבים מאותם מרכיבים שנמצאים בדפנות התאים הראשוניים של צמחי היבשה¹¹. רבים מהנוגדנים החד-שבטיים (mAbs) המועלים כנגד אפיטופים של דופן תא צמחי יבשה מזהים רכיבים של דופן התא P. margaritaceum . מקורות הנוגדנים הללו כוללים את המרכז לחקר פחמימות מורכבות של אוניברסיטת ג'ורג'יה (ccrc@uga.edu) או Kerafast (kerafast.com). לאחר תיוג דופן התא של תאים חיים עם mAbs ראשוניים ספציפיים לאפיטופים של דופן התא ונוגדנים משניים מצומדים פלואורופור (למשל, FITC, TRITC), ניתן להחזיר את התאים לתרבית מבלי להשפיע על בריאות התא או שקיעת דופן התא. התיוג הפלואורסצנטי של דופן התא נשאר ללא הגבלת זמן, ודופן התא המופרשת החדשה מוצגת כאזורים חשוכים (כלומר, לא מסומנים) שניתן למדוד כדי לקבוע את קצב התפשטות התא ו/או לתייג שוב עם mAbs או בדיקות אחרות.

1. הסר 5 מ"ל של תרבית תאים נוזלית הגדלה באופן פעיל (בת 10-14 יום) והנח אותה בצינור צנטריפוגה מפלסטיק של 15 מ"ל. צנטריפוגה על צנטריפוגה שולחנית ב -1,000 x גרם למשך דקה.
2. יוצקים וזורקים את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב -5 מ"ל של WHM טרי. הנח את המכסה בחוזקה ונער את הצינור למשך 10 שניות כדי להשעות מחדש את הגלולה ולהסיר כל חומר פולימרי חוץ-תאי או EPS ממשטח דופן התא.
3. צנטריפוגה ב -1,000 x גרם למשך דקה. חזור על שלב 2.2 וצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של WHM טרי והעבירו 200 מיקרוליטר של מתלה התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
4. מכסים את הצינורות והצנטריפוגה במיקרו-צנטריפוגה ב-1,000 x גרם. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -400 מיקרוליטר של WHM טרי.
5. לתרחיף, הוסף 20 מיקרוליטר של mAb (למשל, JIM5, mAb של חולדה עם ספציפיות להומוגלקטורנן מתיל אסטרי נמוך; הדילול הסופי הוא 1/20 עם WHM). מערבל את הצינור, עטוף אותו בנייר אלומיניום והניח אותו על מסובב מעבדה למשך 90 דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מערבב את הצינור פעמיים במהלך שלב הדגירה של 90 דקות.
6. צנטריפוגה את מתלה התא ב-1,000 x גרם למשך דקה אחת. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של WHM טרי. מכסה את הצינור ומערבל את תרחיף התאים למשך 10 שניות.
7. חזור על שלב 2.6 2x. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב -400 מיקרוליטר של WHM ו -8 מיקרוליטר של עזים נגד חולדות TRITC או FITC (מדולל 1/75 עם WHM). מערבולת, עטפו את הצינור בנייר אלומיניום והניחו אותו על מסובב מעבדה למשך 90 דקות.
8. חזור על שלבים 2.6 ו-2.7. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול, כסו את הצינור ועטפו אותו בנייר אלומיניום עד שהוא מוכן לתמונה.
   הערה: ניתן להשתמש גם בדגירת התאים ב-WHM המכילים חומר חוסם כמו חלב אינסטנט ללא שומן ציפורן (1%) או אלבומין בסרום בקר (1%) לפני הדגירה ב-mAbs, אך מניסיוננו לא עושה דבר לתיוג האיכות או העוצמה. פניום אינו מרחיב את דופן התא שלו או מייצר כמויות גדולות של EPS בחושך. הנוגדן המסומן נשאר שלם לפחות 3-4 ימים. לכן, אין צורך לבצע הדמיה באופן מיידי. ניתן ליישם כאן mAbs אחרים, אך יהיה צורך לבדוק את הריכוזים. עבור מחקרי סינון כימיים ופיזיקליים, ניתן לסמן מספר מ"ל של תרחיף תאים, שנשמר בחושך במשך מספר ימים ומשמש במחקרי מיקרו-פלטות. ניתן גם לסמן תאים עם הנוגדן הראשוני רק לפני הטיפול, ואחריו הנוגדן המשני מאוחר יותר.

3. מדידת דופן התא ושיעורי התרחבות התאים לאורך זמן

1. קח 1 מ"ל של תאים המסומנים ב- JIM5-TRITC והנח 1 מ"ל של WHM בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב -1,000 x גרם למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב -250 מיקרוליטר של WHM ומערבולת כדי לערבב את התאים.
2. לכל באר של צלחת פטרי עם 12 בארות מוסיפים 1 מ"ל WHM. בשלב זה, ניתן להוסיף מעכבים ומווסתי גדילה ספציפיים לכל באר. במאמר זה, אנו מדגימים את ההשפעות של עלייה ברמות הסידן במהלך הדגירה.
3. קח 30 מיקרוליטר של תרחיף תאים מסומן (שלב 1) והוסף לכל באר של המיקרופלייט. סובבו בעדינות את הצלחת לערבוב. חותמים עם סרט שקוף.
4. תרבית כאמור לעיל (שלב 1.1) למשך 24 שעות, 48 שעות או 72 שעות. בזמנים מוגדרים, הסר 250 מ"ל של תרחיף תאים מכל באר והנח אותו בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר.
5. צנטריפוגה ב -1,000 x גרם למשך דקה. הסר את ה-supernatant. השעו מחדש את הגלולה ב -50 מיקרוליטר של מדיום גידול ומערבולת.
6. הנח טיפה של 15 מיקרוליטר של מתלה התא על מגלשת זכוכית וכסה בכיסוי 22 x 22 (עובי 1.5). התבונן בתאים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן TRITC ב-10x -20x.
7. צלם תמונות של לפחות 50-100 תאים. עבור כל תא, מדדו ורשמו את אורך התא הכולל ואת אורך האזור הכהה (כלומר, הדופן החדשה שנוצרה במהלך הדגירה לאחר התיוג).
8. קבע את האחוז הממוצע של דפנות תאים חדשים בתרבית. חזור על הפעולה עבור תאים שנאספו לאחר 48 שעות ו-72 שעות כדי לקבל מידע על התרחבות דופן התא לאורך זמן.
   הערה: שלבים 3.5-3.8 מניבים תרחיף תאים צפוף המאפשר הדמיה של תאים רבים בשדה ראייה אחד. זה הופך את המדידה הידנית להרבה יותר נוחה. תוכנות מצלמה רבות מספקות מדידה נוחה ו/או אוטומטית של מידות התאים שניתן להשתמש בהן עם אצה זו. אפשר גם לאסוף את התאים ולתייג אותם כאמור ב-JIM5 אך להחליף את FITC נגד חולדות כנוגדן המשני. באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), ניתן לצלם תאים עם מסנני FITC ו-TRITC. לאחר מכן ניתן להקצות את האותות הפלואורסצנטיים לפסאודו-צבעים שונים. זה גם מאפשר ממוצע להבחין במבנה דופן התא החדש המיוצר במהלך טיפולים שונים (מסומן ב-JIM5-FITC) בהשוואה לדפנות תא תיוג מראש (מסומן ב-JIM5-TRITC).

4. הדמיית Timelapse של התרחבות דופן התא

1. סמן את דופן התא עם JIM5-TRITC כמתואר לעיל (שלבים 2.1-2.8). מדללים תאים פי 10 ב- WHM ומוסיפים טיפה של 50 מיקרוליטר תאים על צלחת פטרי תחתית או תחתית זכוכית.
2. אפשר לתאים להיצמד לזכוכית למשך 2 דקות בחושך. יש לשטוף בעדינות תאים שלא נדבקו לזכוכית עם 1 מ"ל WHM. השתמש במיקרופיפטה והוסף בזהירות WHM טיפתית לכוס.
3. הוסף 30 מיקרוליטר של WHM על גבי התאים המחוברים לזכוכית. הוסף 30 מיקרוליטר של 4% אגרוז/WHM חמים על גבי טיפת WHM/תאים. מניחים לאגרוז להתקרר לטמפרטורת החדר ולהתמצק.
4. לדגימות בצלחת פטרי, הוסף מספיק WHM כדי לכסות לחלוטין את התאים המוטבעים באגרוז. עבור תאים על כיסוי, הפוך את הכיסוי והנח אותו בעדינות מעל שקופית שקע מלאה ב- WHM.
5. הרכיב תאים על מיקרוסקופ פלורסנט. ניתן להגדיר תאורה חיצונית (מנורה), או להשתמש באור מהמיקרוסקופ עצמו כדי לספק אנרגיה לצמיחה ותנועה של תאים. במיקרוסקופ אולימפוס Ix83 או Ix63, הספק של 5-6 וולט למנורת הטרנס עובד היטב. זה עשוי לדרוש ניסוי וטעייה עבור המערכת שלך.
6. צלם כל 10-30 דקות באמצעות ערכת המסננים TRITC למעקב אחר התרחבות דופן התא. הוסף כימיקלים/אנזימים ל-WHM המשמשים בשלב 3.8, אם בכלל.

5. התבוננות בייצור חומר פולימרי חוץ-תאי (EPS)

1. הכנת תאים: השג 5 מ"ל תאים מתרבויות בנות 10-14 יום ושטוף אותם כמו בשלבים 1-4 לעיל.
2. הכנת חרוזי פלורסנט: לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף טיפה אחת (כ-100 מיקרוליטר) של חרוזי פלורסנט של 0.75 מיקרומטר (פוליספרה). הוסף 1 מ"ל של WHM לצינור ונער במרץ כדי להשעות את החרוזים. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 3 דקות. הסר את ה-supernatant. הוסף 1 מ"ל של WHM לגלולה ונער. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 3 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של WHM.
3. הכנת בארות: הוסף 1 מ"ל של מדיום WHM לבארות של צלחת של 12 בארות. הוסף מעכבים או מווסתי גדילה לריכוז הרצוי וערבב בעדינות. מוסיפים 10 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים ומערבבים בעדינות את הצלחת כדי לערבב את החרוזים. מוסיפים 10 מיקרוליטר תאים שטופים לכל באר ומערבבים את הצלחת בעדינות.
4. תרבית צלחת התאים כאמור לעיל (1.1). לאחר 24 שעות, הנח בעדינות את הצלחת (היזהר לא לערבב) על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במסנן FITC. החרוזים נצמדים ל-EPS וחושפים את דפוסי שחרור ה-EPS. צלם את התאים ב- 4x, 10x או 20x.

6. הדמיית Timelapse של היווצרות שובל EPS

1. בצע הדמיית זמן-lapse בצלחת של 12 בארות (שלב 3.2), כפי שהוכן לעיל, או בצלחת פטרי בודדת. בצע את שלבים 1-4. במקום לתרבית את התאים תחת תאורה פלואורסצנטית, ניתן לגדל את התאים כשהם מותקנים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
2. תאי תמונה כל 5-10 דקות כדי ללכוד בצורה הטובה ביותר את תנועת התאים. חרוזים פלואורסצנטיים נראים באמצעות סט מסנני FITC, אך עבור חרוזים מרוכזים השתמש בערוץ השדה הבהיר. ניתן להגדיר תאורה חיצונית (מנורה), או להשתמש באור מהמיקרוסקופ עצמו כדי לספק אנרגיה לצמיחה ותנועה של תאים. במיקרוסקופ אולימפוס Ix83, הספק של 5-6 וולט למנורת הטרנס עובד היטב. זה עשוי לדרוש ניסוי וטעייה עבור המערכת שלך.

7. ניתוח מבני קורלטיבי של דופן התא עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)

הערה: ניתן לדמות תכונות משתנות של דופן התא שנצפו בתאים חיים המסומנים בנוגדנים ספציפיים לתא לקבלת תכונות מפורטות באמצעות SEM. גישה מתאמת זו מאפשרת להשיג נתונים אולטרה-מבניים שניתן להשוות לנתוני הקרינה.

1. השג 1 מ"ל של תרחיף תאים (בקרה או מטופל בניסוי) בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב -4,000 x גרם למשך דקה אחת.
2. השליכו את הסופרנטנט. צללו את הצינור המכיל את הגלולה בחנקן נוזלי, או אם אינו זמין, הניחו אותו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן תאים קפואים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
3. בזמן עיבוד דופן התא, הוציאו את הצינור מהמקפיא והניחו לו להפשיר למשך 15 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר של WHM והניחו טיפה של מתלה תאים צפוף על כיסוי של 45 מ"מ x 50 מ"מ.
4. מניחים כיסוי שני על גבי הטיפה ליצירת כריך. מניחים על שולחן מעבדה ולוחצים ברציפות על הכריך כדי לקרוע את התאים (למשל 30 שניות).
5. הפרד בזהירות את כיסויי הזכוכית ושטוף את התאים הקרועים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 500 x גרם למשך דקה.
6. יוצקים את הסופרנטנט. הגלולה צריכה להיות לבנה או מעט ירוקה. אם ההדמיה הבאה מראה שמספר מספיק של תאים לא נקרע, חזור על שלב 3 עם הגלולה כאן.
7. השעו מחדש את הגלולה המכילה את דפנות התא ב-D-H₂O וחזרו על שלבים 7.4 ו-7.5. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של D-H₂O והניחו אותה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
8. השג בדל קיימברידג' (רדיוס 6 מ"מ או 8 מ"מ) והדבק סרט פחמן (EMS) על פני השטח שלו. לאחר מכן, הנח 5 טיפות מיקרוליטר של מתלה דופן התא התלוי (שלב 7) על סרט הפחמן. התבונן במספר דפנות התא באמצעות מיקרוסקופ מנתח. אם המתלים צפופים מדי, יש לדלל אותם עם D-H2O.
9. מניחים את הבדל בכלי מכוסה ומניחים לו להתייבש (שעתיים עד לילה). מקרטע מצפים את הבדל למשך 50 שניות באמצעות יעד פלדיום (ניתן להשתמש גם במטרות אחרות). התבונן בתאים ב-5 קילו וולט, גודל נקודתי, במרחק של 10 ס"מ מגלאי האלקטרונים המשני.
   הערה: דילול מתלה דופן התא לפני הפקדת טיפות על סרט הפחמן יגביל את השקעת דפנות התאים זה על זה.

Results

התיוג של דופן התא של P. margaritaceum עם mAbs אנטי-פקטין (למשל, JIM5) חושף רשת של סיבים מורכבים של סידן ובליטות היוצרות תבנית או סריג רגיל (איור 1). הפקטין מופקד במרכז התא או באיסטמוס, שם הוא מעביר פקטין ישן יותר לכיוון הקטבים (איור 2). תיוג עם נוגדן פקטין שונה דמוי JIM7 מדגיש את ההפרשה הראשונית של פקטין עתיר מתיל-אסטר ברצועה צרה באיסטמוס (איור 3A,B). פולימרים אחרים שממוקמים בדופן התא, כולל חלבון ארבינו-גלק...

Discussion

P. margaritaceum הוא אורגניזם יעיל להבהרת הדינמיקה של התפתחות דופן התא והפרשת ECM בצמחים ובאצות סטרפטופיטים. התכונות העיקריות כוללות הרגל חד תאי וקלות בתחזוקת תרבית ומניפולציה ניסיונית, דופן תא ראשונית עם סריג פקטין חיצוני מובהק ופולימרים אחרים, קלות בתיוג תאים חיים עם mAbs מכווני דופן התא שניתן לעקוב אחריהם בזמן למחקרים התפתחותיים ו/או ניסיוניים הבאים וייצור כמויות גדולות של EPS שניתן לנטר בזמן אמת באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים^1,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 מ"ל מיקרוסנט. צינורות	פישר סיינטיפיק	01-549-740
12 מיקרופלייט באר	פישר סיינטיפיק	50-233-6077
22 x 22 מ"מ כיסויים	פישר סיינטיפיק	12-541-016
45x 50 ס"מ כיסויים	חקר המוח	4550-1.5D
אגר	סיגמא אולדריץ'	A9414
אנטי חולדות FITC	סיגמא אולדריץ'	F6258
נגד חולדות TRITC	Sigma Aldrich	T4280
סידן כלורי	סיגמא אולדריץ'	C4981
קמברידג' דודי	EMS	75183-65
Fluoview	CLSM ניכר	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	13-100-675
מיקרופיפטורים	BioRad	1660499EDU
em>Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universitä t Gö ttingen - אוסף תרבות האצות ב-Gö ערכת	2640
Polysciences		18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
ציפוי מקרטע	EMS	Q150V
מערבל מערבולת	פישר סיינטיפיק	02-215-414