במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב ומדגישים את הפרטים העיקריים לקביעת מאפיינים מורפולוגיים של מיטוכונדריה בתאים חיים, כולל הכנת דגימות, רכישת תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית לחקר מצבים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
במאמר זה
סיכום
תקציר
האיזון הדינמי של היתוך וביקוע מיטוכונדריאלי תורם ישירות להומאוסטזיס המיטוכונדריאלי, המשפיע על תפקודים תאיים רבים בנוסף להומאוסטזיס אדנוזין טריפוספט (ATP). לכן, הערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתנאי לחץ חיונית למחקר מכניסטי. מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, הכולל הכנת תמיסת MitoTracker, צביעה של מיטוכונדריה, אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה וזיהוי מאפיינים מורפולוגיים. MitoTrackers הם צבעים נפוצים וחסכוניים ספציפיים למיטוכונדריה. עם זאת, שינויים מסוימים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית עשויים להתרחש עקב טיפול לא מתאים, שיכול להיות בלתי נתפס ולא לשקף את המצב האמיתי של המיטוכונדריה. לכן, יש להבין כיצד לנתח שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות MitoTrackers. הפרוטוקול השתמש בתאי SH-SY5Y מגורים עם 1-מתיל-4-פנילפירידיניום יודיד (MPP+) כדי להמחיש את הפרוטוקול של ניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי. בהשוואה לתאי ביקורת, תאים מגורים MPP+ הראו מיטוכונדריה קטנה ומקוטעת יותר, עם פרמטרים מורפולוגיים המצביעים על ירידה בטביעת הרגל המיטוכונדרית. תוצאות אלו מצביעות על כך שצביעת MitoTracker היא שיטה יעילה ואפשרית לניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי שניתן ליישם (עם שינויים קלים) לחקר מצבים שונים.
מבוא
המורפולוגיה המיטוכונדריאלית נשמרת על ידי האיזון הדינמי של היתוך וביקוע מיטוכונדריאלי ומכאן משפיעה על הומאוסטזיס אנרגיה ותפקודים תאיים רבים אחרים, מה שמוביל לפתולוגיות שונות כגון מחלות ניווניות של מערכת העצבים, סרטן ודלקת 1,2,3,4,5 . כדי להתבונן במורפולוגיה המיטוכונדריאלית, פותחו מספר כתמים סלקטיביים למיטוכונדריה, כולל בדיקות ונוגדנים, לשימוש במיקרוסקופ קונפוקלי. כמה בדיקות ספציפיות למיטוכונדריון, כמו טטרמתילרוזאמין ורודמין 123, פועלות על סמך פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה
- ממיסים MPP+ עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי ליצור תמיסת מלאי של 1 מ"מ ולאחסן אותה בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס בחושך (ראה טבלת חומרים).
- ממיסים 50 מיקרוגרם של MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) ב-94 מיקרוליטר של DMSO כדי ליצור פתרון מלאי של 1 mM. יש להצמיד את תמיסת המלאי למספר צינורות מיקרו-צנטריפוגה ולאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
- דגירה של תאי SH-SY5Y בצלוחיות עם מדיום F-12 Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 של Dulbecco בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) בסביבה לחה עם 5% CO2 ו-95% אוויר ב-37 מעלו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מתאר נוהל מפורט, שלב אחר שלב לניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי באמצעות שלושה מודולי אופטימיזציה תלויים זה בזה: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת דגימות, אופטימיזציה שיטתית של פרמטרים אופטיים להדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית והנחיות עיבוד תמונה חישובית. פרוטוקול הכנת דגימה אופטימלי הוא קריטי להשגת נתוני הדמיה מיטוכונדריאלית אמינים. הערכה שיטתית של ריכוזי MitoTracker Red CMXRos הדגימה מאפייני פלואורסצנטיות תלויי ריכוז. הטיפול ב-25 ננומטר הביא לאותות פלואורסצנטיים חלשים משמעותית בהשוואה לריכוזים גבוהים יותר (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר הנוכחי מבסס מתודולוגיה שיטתית לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים בתנאי עקה. שלבים פרוצדורליים מכריעים בהדמיה מיטוכונדריאלית כוללים: ריכוז מתאים של בדיקות MitoTracker, שטיפה יסודית של כלים קונפוקליים לפני רכישת תמונה, מזעור הפרעות למצב התאי וקביעת פרמטרי הדמיה מתאימים.
שימוש בריכוזים גבוהים יותר של MitoTracker יכול לגרום לציטוטוקסיות, להפוך את המיטוכונדריה לרגישה לכוח לייזר ועלול לגרום לצבע להכתים מבנים תאיים אחרים (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81974501).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1-מתיל-4-פנילפירידיניום יודיד (MPP+) | מקלין | M875357 | משמש להשראת עקה חמצונית |
| צלחת קונפוקלית | קן | 801001 | משמש לתרבית התאים |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | ניקון | ג2 | משמש ללכידת תמונות |
| תערובת איגל בינונית/תזונתית F-12 של Dulbecco | תרמו-פישר סיינטיפיק | 11320033 | משמש לאספקת הזנה לתאים |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | ביוטיים | ST038 | משמש להמסת בדיקת ה-mitotracker |
| סרום בקר עוברי (FBS) | תרמו-פישר סיינטיפיק | A3161001C | משמש לאספקת הזנה לתאים |
| תמונהJ | מכוני הבריאות הלאומיים | תמונהJ | משמש לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית |
| MitoTracker אדום CMXRos | תרמו-פישר סיינטיפיק | M7512 | משמש להמחשת מיטוכונדריה |
| מי מלח פוספט (PBS) | תרמו-פישר סיינטיפיק | C10010500BT | משמש לשטיפת התאים על כלים קונפוקליים |
| תא SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | משמש להדגמת זרימת העבודה של ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית |
| TI-SH-U Stage Adapter | ניקון | MEC59110 | משמש לאבטחת דגימות |
מקורות
- von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
- Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
