מאמר שיטה

קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

DOI:

10.3791/68167

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב ומדגישים את הפרטים העיקריים לקביעת מאפיינים מורפולוגיים של מיטוכונדריה בתאים חיים, כולל הכנת דגימות, רכישת תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית לחקר מצבים שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האיזון הדינמי של היתוך וביקוע מיטוכונדריאלי תורם ישירות להומאוסטזיס המיטוכונדריאלי, המשפיע על תפקודים תאיים רבים בנוסף להומאוסטזיס אדנוזין טריפוספט (ATP). לכן, הערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתנאי לחץ חיונית למחקר מכניסטי. מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, הכולל הכנת תמיסת MitoTracker, צביעה של מיטוכונדריה, אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה וזיהוי מאפיינים מורפולוגיים. MitoTrackers הם צבעים נפוצים וחסכוניים ספציפיים למיטוכונדריה. עם זאת, שינויים מסוימים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית עשויים להתרחש עקב טיפול לא מתאים, שיכול להיות בלתי נתפס ולא לשקף את המצב האמיתי של המיטוכונדריה. לכן, יש להבין כיצד לנתח שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות MitoTrackers. הפרוטוקול השתמש בתאי SH-SY5Y מגורים עם 1-מתיל-4-פנילפירידיניום יודיד (MPP+) כדי להמחיש את הפרוטוקול של ניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי. בהשוואה לתאי ביקורת, תאים מגורים MPP+ הראו מיטוכונדריה קטנה ומקוטעת יותר, עם פרמטרים מורפולוגיים המצביעים על ירידה בטביעת הרגל המיטוכונדרית. תוצאות אלו מצביעות על כך שצביעת MitoTracker היא שיטה יעילה ואפשרית לניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי שניתן ליישם (עם שינויים קלים) לחקר מצבים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המורפולוגיה המיטוכונדריאלית נשמרת על ידי האיזון הדינמי של היתוך וביקוע מיטוכונדריאלי ומכאן משפיעה על הומאוסטזיס אנרגיה ותפקודים תאיים רבים אחרים, מה שמוביל לפתולוגיות שונות כגון מחלות ניווניות של מערכת העצבים, סרטן ודלקת 1,2,3,4,5 . כדי להתבונן במורפולוגיה המיטוכונדריאלית, פותחו מספר כתמים סלקטיביים למיטוכונדריה, כולל בדיקות ונוגדנים, לשימוש במיקרוסקופ קונפוקלי. כמה בדיקות ספציפיות למיטוכונדריון, כמו טטרמתילרוזאמין ורודמין 123, פועלות על סמך פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), מה שמגביל את יישומם במחקרים על מצבים המשבשים MMP 6,7. לעומת זאת, צביעת נוגדנים מספקת הערכה מורפולוגית בלתי תלויה ב-MMP לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים קבועים. למרות שכתם מתאים מאפשר להעריך את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתאים קבועים, בחינת המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתאים חיים שנפגעו על ידי גורמים מסוימים נותרה מאתגרת. MitoTracker, בדיקה פלואורסצנטית קטיונית חדירה לתאים וספציפית למיטוכונדריון, מציעה פתרון לאתגר זה, ומאפשרת צביעה של תאים חיים וקבועים כאחד. בדיקה זו שימשה באופן נרחב לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במחקרים על מחלות שונות 8,9,10,11. עם זאת, כמה מחקרים דיווחו על בעיות כמו אות רקע גבוה וכריכה לא ספציפית, גם כאשר נעשה שימוש בבדיקה בהתאם להנחיות שסופקו על ידי היצרן. תצפיות אלו מדגישות את החשיבות של הבנה מעמיקה של הכנת דגימה ורכישת תמונה לניתוח מוצלח של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

כדי להקל על ניתוח המורפולוגיה המיטוכונדריאלית, פותחו תוכניות ואלגוריתמים שונים לעיבוד תמונה 12,13,14,15,16. במחקר זה, השתמשנו בכלי המאקרו ניתוח רשת מיטוכונדריאלית (MiNA) ב-ImageJ כדי לנתח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית13. כלי זה מזהה ומאפיין ביעילות מאפיינים מורפולוגיים של רשתות מיטוכונדריאליות על ידי חישוב תשעה פרמטרים תיאוריים, כולל מספר הפרטים (מבנים ללא ענפים), מספר הרשתות (מספר העצמים עם פיקסל צומת אחד לפחות), אורך ממוצע (אורך ממוצע של כל המוטות והענפים), אורך חציוני (אורך חציוני של כל המוטות והענפים), סטיית תקן אורך (סטיית תקן של אורכים בודדים), גודל רשת ממוצע (המספר הממוצע של סניפים לרשת), גודל רשת חציוני (הערך האמצעי של מספר הסניפים לרשת), סטיית תקן של גודל הרשת (סטיית תקן של מספר הסניפים לרשת) וטביעת הרגל המיטוכונדריאלית (שטח האות הכולל לאחר הפרדת רקע). בפרוטוקול זה, טביעת הרגל המיטוכונדריאלית נבחרה כפרמטר מייצג.

מטרת מחקר זה היא לספק פרוטוקול שלב אחר שלב לניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי, תוך התמקדות בפרטים מרכזיים. השתמשנו בתאי SH-SY5Y המושרים על ידי MPP+ כדי להדגים פרוטוקול זה. MPP+ מעכב קומפלקס I של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בתאי עצב דופמינרגיים, וכתוצאה מכך נזק למורפולוגיה ולתפקוד המיטוכונדריאלי 8,17. פרוטוקול הניתוח המורפולוגי המתואר במחקר זה מאפשר רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה והערכת פרמטרים רלוונטיים להגדרת מאפיינים מורפולוגיים של רשתות מיטוכונדריאליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה

  1. ממיסים MPP+ עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי ליצור תמיסת מלאי של 1 מ"מ ולאחסן אותה בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס בחושך (ראה טבלת חומרים).
  2. ממיסים 50 מיקרוגרם של MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) ב-94 מיקרוליטר של DMSO כדי ליצור פתרון מלאי של 1 mM. יש להצמיד את תמיסת המלאי למספר צינורות מיקרו-צנטריפוגה ולאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  3. דגירה של תאי SH-SY5Y בצלוחיות עם מדיום F-12 Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 של Dulbecco בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) בסביבה לחה עם 5% CO2 ו-95% אוויר ב-37 מעלות צלזיוס. למעבר, נתק את התאים עם תמיסת טריפסין של 0.05% למשך דקה וצנטריפוגה בטמפרטורה של 100 × גרם למשך 3 דקות.

גירוי 2. MPP+

  1. זרע תאי SH-SY5Y על כלים קונפוקליים עם תחתית זכוכית ושמור אותם במדיום DMEM/F12 בתוספת 1% (v/v) FBS למשך הלילה.
  2. החלף את מדיום התרבית, ואז דגר את התאים עם או בלי MPP+ למשך 24 שעות.

3. מכתים של MitoTracker

  1. לחמם מראש את DMEM/F12, ולאחר מכן לדלל את פתרון המלאי של MitoTracker עם DMEM/F12 כדי לקבל פתרון עבודה של 50 ננומטר. שמור על התמיסה מוגנת מפני אור במהלך כל ההליך.
  2. הסר את מדיום תרבית התאים ושטוף את הכלים הקונפוקליים פי 2 עם DMEM/F12 טרי.
  3. דגרו תאים בכל מנה עם 1 מ"ל של תמיסת העבודה MitoTracker למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  4. הסר את פתרון העבודה של MitoTracker ושטוף פי 2 עם DMEM/F12.
  5. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F12 לכל מנה ודגר בחממת התאים לפני ההדמיה.

4. פרמטרי הדמיה למיקרוסקופ קונפוקלי

  1. שיווי משקל מראש של המיקרוסקופ לפעולות הבאות. תחת לוח הרכישה, התאם את הפרמטרים הקשורים לנתיב האור על ידי הגדרת אורכי גל העירור והפליטה.
  2. הגדר את הפרמטרים הבאים: גודל חור סיכה, 1.2 AU; גודל סריקת פיקסלים, 1,024 x 1,024; זמן השתהות פיקסלים, 2.4 מיקרומטר (ממוצע פי 2)  (שמור על עקביות למטרות כיול).

5. אופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה

זהירות: הימנע מחשיפת העיניים לקרינה ישירה ומפוזרת מלייזר גלוי ו/או בלתי נראה.

  1. השתמש באור ההלוגן כדי להתמקד בתאים באמצעות עדשת אובייקטיבית אפוכרומטית 60x (1.4 NA) כדי למנוע פוטוטוקסיות.
  2. כוונן את עוצמת הלייזר והמתח הגבוה (HV) מתחת לרמת הרוויה, הגדר את מקדם הזום ל-3 ולאחר מכן צלם את התמונות.
  3. הזז את אזור העניין והתמקד בתאים כדי לצלם תמונות מבלי לשנות הגדרות כלשהן.

6. ניתוח נתונים

הערה: הנתונים נותחו באמצעות ImageJ המותקן מראש עם תוסף MiNA13. כדי להשיג מדידות רלוונטיות מדויקות, התמונות צריכות ללכוד מיטוכונדריה שנפתרה באופן עצמאי עם צביעה נקייה ובהירה.

  1. כדי לשפר את איכות התמונה לפני טרנספורמציה בינארית ושלד, פתח את התמונה ובצע עיבוד מקדים. השתמש בכלי החזר ההשקעה כדי לבחור את האזור של תא בודד. החל את התהליך | מסננים | הפונקציה Unsharp Mask כדי לשפר את החדות, והשתמש בפונקציית Process | שפר את תכונת הניגודיות כדי להפחית הגברת יתר של רעש. כדי להסיר רעשי מלח ופלפל באופן ספציפי, השתמש בתהליך | מסננים | פונקציה חציונית (ראה איור משלים S1).
  2. כדי לבנות מודל מורפולוגי פשוט לחישוב פרמטרים תיאוריים, המר את התמונה לבינארית באמצעות סף (לחץ על תהליך | בינארי | הפוך לבינארי), ולאחר מכן שלד את התמונה הבינארית באמצעות פונקציית השלד (לחץ על תהליך | בינארי | שלד) (ראה איור משלים S2).
  3. קיבוץ כל הפיקסלים בתוך השלד באמצעות הלחצן Analyze | שלד | נתח את פונקציית השלד (2D/3D). פשט את הניתוח על ידי שימוש בכלי MiNA לחישוב תשעה פרמטרים תיאוריים בתמונה השלדית (ראה איור משלים S3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר נוהל מפורט, שלב אחר שלב לניתוח מורפולוגי מיטוכונדריאלי באמצעות שלושה מודולי אופטימיזציה תלויים זה בזה: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת דגימות, אופטימיזציה שיטתית של פרמטרים אופטיים להדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית והנחיות עיבוד תמונה חישובית. פרוטוקול הכנת דגימה אופטימלי הוא קריטי להשגת נתוני הדמיה מיטוכונדריאלית אמינים. הערכה שיטתית של ריכוזי MitoTracker Red CMXRos הדגימה מאפייני פלואורסצנטיות תלויי ריכוז. הטיפול ב-25 ננומטר הביא לאותות פלואורסצנטיים חלשים משמעותית בהשוואה לריכוזים גבוהים יותר (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מבסס מתודולוגיה שיטתית לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים בתנאי עקה. שלבים פרוצדורליים מכריעים בהדמיה מיטוכונדריאלית כוללים: ריכוז מתאים של בדיקות MitoTracker, שטיפה יסודית של כלים קונפוקליים לפני רכישת תמונה, מזעור הפרעות למצב התאי וקביעת פרמטרי הדמיה מתאימים.

שימוש בריכוזים גבוהים יותר של MitoTracker יכול לגרום לציטוטוקסיות, להפוך את המיטוכונדריה לרגישה לכוח לייזר ועלול לגרום לצבע להכתים מבנים תאיים אחרים (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81974501).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-מתיל-4-פנילפירידיניום יודיד (MPP+)מקליןM875357משמש להשראת עקה חמצונית
צלחת קונפוקליתקן801001משמש לתרבית התאים
מיקרוסקופ קונפוקליניקוןג2משמש ללכידת תמונות
תערובת איגל בינונית/תזונתית F-12 של Dulbeccoתרמו-פישר סיינטיפיק11320033משמש לאספקת הזנה לתאים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)ביוטייםST038משמש להמסת בדיקת ה-mitotracker
סרום בקר עוברי (FBS)תרמו-פישר סיינטיפיקA3161001Cמשמש לאספקת הזנה לתאים
תמונהJמכוני הבריאות הלאומייםתמונהJמשמש לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית
MitoTracker אדום CMXRosתרמו-פישר סיינטיפיקM7512משמש להמחשת מיטוכונדריה
מי מלח פוספט (PBS)תרמו-פישר סיינטיפיקC10010500BTמשמש לשטיפת התאים על כלים קונפוקליים
תא SH-SY5YATCCCRL-2266משמש להדגמת זרימת העבודה של ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית
TI-SH-U Stage AdapterניקוןMEC59110משמש לאבטחת דגימות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  3. Kalia, R., et al. Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1. Nature. 558 (7710), 401-405 (2018).
  4. Cao, Y. L., et al. MFN1 structures reveal nucleotide-triggered dimerization critical for mitochondrial fusion. Nature. 542 (7641), 372-376 (2017).
  5. Chan, D. C. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev Pathol. 15, 235-259 (2020).
  6. Solaini, G., Sgarbi, G., Lenaz, G., Baracca, A. Evaluating mitochondrial membrane potential in cells. Biosci Rep. 27 (1-3), 11-21 (2007).
  7. Gan, Z., Audi, S. H., Bongard, R. D., Gauthier, K. M., Merker, M. P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 300 (5), L762-L772 (2011).
  8. Zhong, J., et al. Roflupram exerts neuroprotection via activation of CREB/PGC-1α signalling in experimental models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol. 177 (10), 2333-2350 (2020).
  9. Xu, B. T., et al. Mitofusin-2 mediates cannabidiol-induced neuroprotection against cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacol Sin. 44 (3), 499-512 (2023).
  10. Hu, T., et al. PRDM16 exerts critical role in myocardial metabolism and energetics in type 2 diabetes induced cardiomyopathy. Metabolism. 146, 155658(2023).
  11. Reichardt, C., et al. DNA-binding protein-A promotes kidney ischemia/reperfusion injury and participates in mitochondrial function. Kidney Int. 106 (2), 241-257 (2024).
  12. Ahmad, T., et al. Computational classification of mitochondrial shapes reflects stress and redox state. Cell Death Dis. 4 (1), e461(2013).
  13. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple imagej macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  14. Hemel, I., Engelen, B., Luber, N., Gerards, M. A hitchhiker's guide to mitochondrial quantification. Mitochondrion. 59, 216-224 (2021).
  15. Vowinckel, J., Hartl, J., Butler, R., Ralser, M. Mitoloc: A method for the simultaneous quantification of mitochondrial network morphology and membrane potential in single cells. Mitochondrion. 24, 77-86 (2015).
  16. Dagda, R. K., et al. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. J Biol Chem. 284 (20), 13843-13855 (2009).
  17. Przedborski, S., Tieu, K., Perier, C., Vila, M. MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's disease. J Bioenerg Biomembr. 36 (4), 375-379 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MitoTrackerSH SY5YSkeletonizationMPP

מאמרים קשורים