מאמר שיטה

הכנה מיטוכונדריאלית ממיקרוגליה לניתוח גליקן

DOI:

10.3791/68179

⸱

30 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותח פרוטוקול להכנת מיטוכונדריה מטוהרת מתאי מיקרוגליה, בידוד חלבונים מיטוכונדריאלים לשחרור N-גליקן, וזיהוי מהיר של גליקנים תת-תאיים, מיטוכונדריאלים באמצעות יינון אלקטרו-ספריי לייזר בעזרת מטריצת אינפרא אדום יחד עם ספקטרומטריית מסה מדויקת ברזולוציה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת דפוסי הגליקוזילציה של חלבונים מיטוכונדריאלים במיקרוגליה היא קריטית לקביעת תפקידם במחלות ניווניות. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה חדשה ובעלת תפוקה גבוהה לניתוח גליקומי של חלבונים מיטוכונדריאלים המבודדים ממיקרוגליה מתורבתת. שיטה זו כוללת בידוד של מיטוכונדריה מתרביות מיקרוגליה, הערכת איכות של דגימות מיטוכונדריה, ואחריה מיצוי חלבון אופטימלי כדי למקסם את זיהוי הגליקן, וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRAM) של יינון לייזר בעזרת מטריצת אינפרא אדום (IR-MALDESI) כדי לספק פרופילים מפורטים של גליקוזילציה מיטוכונדריאלית.

פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של שמירה על שלמות המיטוכונדריה במהלך הבידוד ומשתמש בבקרת איכות קפדנית כדי להבטיח שחזור, כולל מדידת טוהר המיטוכונדריה לאחר המיצוי. גישה זו מאפשרת פרופיל מקיף של שינויי גליקוזילציה במיטוכונדריה של מיקרוגליה בתנאי ניסוי שונים במבחנה, מה שמציע תובנה לגבי שינויים מיטוכונדריאלים הקשורים למחלות ניווניות. גישה זו יכולה להיות מותאמת לטיפולים אחרים במבחנה , סוגי תאים מתורבתים אחרים או תאים ראשוניים. באמצעות גישה סטנדרטית זו, אנו שואפים לקדם את ההבנה של גליקנים מיטוכונדריאלים של מיקרוגליה, ולתרום לתחום הרחב יותר של מחקר נוירודגנרטיבי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגליה הם תאי החיסון המולדים הדומיננטיים במוח ומהווים 10-15% מהתאים במוח הבוגר 1,2. הם משתמשים ברפרטואר הקולטנים שלהם כדי לנטר באופן דינמי את המיקרו-סביבה במוח ולווסת את תפקוד המוח הרגיל כדי לשמור על הומאוסטזיס במוח3. מיקרוגליה רגישים מאוד לשינויים במיקרו-סביבה שלהם ועוברים שינויים במורפולוגיה של התא, באימונופנוטיפ ובתפקוד עם מצבים פתולוגיים או גירויים שונים. מצבי הפעלה של מיקרוגליה מושפעים מדרישות האנרגיה התאית הנדרשות לתפקודם, כגון פגוציטוזיס, ייצור ציטוקינים או תיקון רקמות. לכן, חילוף החומרים של האנרגיה התאית ממלא תפקיד מכריע בוויסות שינויים בתפקוד המיקרוגליה4. חוסר ויסות מיקרוגליה מוביל לשחרור מוגזם של ציטוקינים פרו-דלקתיים (למשל, IL-1β, TNF-α) ומיני חמצן תגובתיים (ROS), מה שגורם למוח לדלקת עצבית 5,6. חוסר ויסות כרוני של מיקרוגליה והסביבה הנוירו-דלקתית הנובעת מכך מניחים את הבסיס לניוון עצבי7.

המוח מהווה רק 2% ממשקל הגוף אך 20% מסך צריכת האנרגיה של הגוף. מיטוכונדריה הם מקור האנרגיה העיקרי בתאי המוח ופועלים כשחקני מפתח בפתוגנזה של הפרעות מוח חריפות וכרוניותכאחד. מחקרים קודמים ביססו מתאם חזק בין הפעלת מיקרוגליה ותפקוד מטבולי לקוי בגיל9 והפרעות הקשורות לגיל כמו מחלת אלצהיימר10,11, והדגישו את התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בהזדקנות תאית וניוון עצבי. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל לירידה בייצור האנרגיה, לעקה חמצונית מוגברת ולעלייה בדלקת עצבית במהלך הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל.

בעוד שמחקר מקיף הבהיר את תפקיד המיטוכונדריה בחילוף חומרים אנרגטי, הזדקנות והפרעות מוחיות, תפקידם של שינויים נפוצים לאחר תרגום, כגון גליקוזילציה, בביולוגיה ובתפקוד המיטוכונדריה עדיין לא נחקר מספיק. גליקוזילציה, התוספת האנזימטית של חלקי סוכר הנקראים גליקנים לחלבונים על ידי אנזימי גליקוזילציה, היא השינוי הנפוץ ביותר לאחר התרגום ברוב תאי המוח, כולל מיקרוגליה. מיקרוגליה מופעלת מווסתת את תפקודם החיסוני תחת גירויים דלקתיים על ידי ויסות ביטוי הגליקן התוך-תאי או פני התא12. התגובות הפרו-דלקתיות והאנטי-דלקתיות המוצגות על ידי מיקרוגליה לאחר גירוי מווסתות גם על ידי הגליקנים13. לחלבונים מיטוכונדריאלים יש גם שינויים גליקניים אלה, המווסתים את תפקודם ולוקליזציה. עם זאת, ניתוח מפורט של דפוסי הגליקוזילציה המיטוכונדריאלית הספציפיים לתא במיקרוגליה חסר בשל האתגרים הטכניים בחקירת גליקוזילציה תת-תאית. למרות התפקידים המאופיינים היטב של גליקוזילציה בוויסות הפנוטיפ של המיקרוגליה, תפקידם של גליקנים בוויסות תפקוד המיטוכונדריה וכתוצאה מכך, אימונופנוטיפ תאי במיקרוגליה נותר לא מובן היטב.

מחקרים מוגבלים שחקרו גליקוזילציה של חלבון מיטוכונדריאלי התמקדו בעיקר בזיהוי מבוסס לקטין של דפוסי גליקוזילציה. לקטינים הם חלבונים קושרי גליקן הקושרים חלקי גליקן ביומולקולריים14,15, חסרי הספציפיות והיכולת לספק מידע מפורט על הרכב הגליקן. שיטות ספקטרומטריות מסה מציעות זיהוי מפורט של הרכבי הגליקן כדי להתגבר על האתגרים האנליטיים שמציב ניתוח הלקטין . שיטה אחת כזו, יינון אלקטרו-ספריי בלייזר בעזרת מטריצת אינפרא אדום (IR-MALDESI), משתמשת באסטרטגיית יינון היברידית, תוך שימוש בלייזר אמצע IR כדי לעורר באופן מהדהד מים המצויים בדגימות ביולוגיות16 כדי לספוג את המינים הנייטרליים ולהכפיף אותם לפלומת אלקטרוספריי אורתוגונלית, ולאחר מכן ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה מדויק ברזולוציה גבוהה של Orbitrap. IR-MALDESI הוכח בעבר לניתוח ישיר של מטבוליטים של רקמות17, עם יתרונות מובהקים של ניתוח מהיר18, שיטת יינון רך ויכולת החיזוי של תכולת חומצה סיאלית של גליקנים מקושרים ל-N בהתבסס על דפוסי ההתפלגות האיזוטופיים של תוספות גליקן כלוריות19. עם זאת, לא הוכחה התאמה של פלטפורמה זו לניתוח ישיר של גליקנים תת-תאיים.

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול תפוקה גבוהה לבידוד מיטוכונדריאלי מתאי מיקרוגליה, בידוד של N-גליקנים מיטוכונדריאלים וזיהוי וניתוח N-גליקן מיטוכונדריאלי באמצעות ספקטרומטריית מסה IR-MALDESI. פרוטוקול זה יהיה בסיסי בחשיפת תובנות חדשות לגבי תפקיד הגליקוזילציה בתפקוד המיטוכונדריה, ועשוי לזהות מטרות טיפוליות חדשות להפרעות נוירו-דלקתיות ונוירודגנרטיביות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית קו תאים BV2 Microglial

  1. שמור על תאי BV-2 (תאי מיקרוגליה שמקורם בעכברים C57BL/6) במצע גלוקוז נמוך DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניציליום-סטרפטומיצין (PenStrep) ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA).
  2. לגדל את התאים בצלוחיות T-175 ולאפשר להם להגיע למפגש של 70-80%.
  3. פיצול התאים על ידי דגירה עם אנזימי דיסוציאציה של התאים למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2, ולאחר מכן השבתת האנזימים עם נפח שווה של מדיה תאית, וצנטריפוגה של תאים למשך 5 דקות ב-500 × גרם בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: אנזימי הדיסוציאציה של התאים המשמשים כאן עדינים יותר על תאי BV2 מאשר טריפסין וניתן להשתמש בהם כדי להגן על ביטוי האנטיגן על פני התא.
  4. שאפו את המדיה, השעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מצע גידול, וספרו את התאים באמצעות טריפן כחול (ראה טבלת החומרים).
    הערה: השתמשנו במונה תאים אוטומטי לשלב זה כדי לספור תאים.
  5. כדי לבצע את הבידוד המיטוכונדריאלי, המשך אם כדור התא מכיל 2 × 107 (20 מיליון תאים / גלולה).

2. בידוד המיטוכונדריה מתאי מיקרוגליה

הערה: עבדו במהירות, שמרו על הכל על הקרח לאורך כל ההליך. ערכת הבידוד המיטוכונדריאלי המשמשת לבידוד מיטוכונדריאלי כוללת שלושה מרכיבים: ריאגנטים A (מאגר ליזיס תאים), מגיב B (מאגר מייצב) ומגיב C (מאגר שטיפה מיטוכונדריאלי). הוסף מעכבי פרוטאז למגיב A ולמגיב C מיד לפני השימוש.

  1. גלולה 2 × 107 תאים על ידי צנטריפוגה של תאים שנקטפו בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2.0 מ"ל ב-500 × גרם למשך 5 דקות. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט.
  2. הוסף 800 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריאלי A (מאגר ליזיס תאים), מערבולת במהירות בינונית למשך 5 שניות, ודגר את הצינור על קרח למשך 2 דקות בדיוק.
    הערה: אל תחרוג מהדגירה של 2 דקות.
  3. הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריאלי B (חיץ מייצב), מערבולת במהירות מקסימלית למשך 5 שניות, ודגר את הצינור על קרח למשך 5 דקות, מערבולת במהירות מקסימלית בכל דקה.
  4. הוסף 800 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריה C (מאגר שטיפה מיטוכונדריאלי), הפוך את הצינור מספר פעמים לערבוב, וצנטריפוגה את הצינור ב-700 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אין מערבולת.
  5. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 2.0 מ"ל וסובבו ב-3,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. העבירו את הסופרנטנט (חלקים ציטוזוליים) לצינור חדש. הגלולה מכילה את המיטוכונדריה המבודדת.
  7. הוסף לגלולה 500 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריה C, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות.
  8. השתמש בגלולה לכימות ועיבוד חלבון או אחסן את הגלולה ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

3. הערכת חלבון באמצעות בדיקת microBCA

הערה: ניתן לבצע הערכת חלבון לפרוטוקול זה באמצעות ריאגנטים ובדיקות שונות. ניתן לבצע כימות של חלבונים ציטוזוליים או מיטוכונדריאלים על ידי נורמליזציה כנגד ריכוז החלבון הכולל המשמש בבדיקה.

  1. הכן תקני אלבומין בסרום בקר (BSA) בין 0 מיקרוגרם/מ"ל ל-200 מיקרוגרם/מ"ל (0 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 20 מיקרוגרם/מ"ל, 40 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל) וריקים עם מאגר ליזה בלבד.
  2. הוסף 150 מיקרוליטר מכל תקן לצלחת 96 הבארות בעלת התחתית השטוחה המכילה את הדגימות.
  3. מערבבים 25 חלקים של Micro BCA Reagent MA (תמיסת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA)) ו-24 חלקים Reagent MB (תמיסת נחושת גופרתית) עם חלק אחד של Reagent MC (מאגר מייצב) (25:24:1, Reagent MA:MB:MC) ליצירת מגיב עובד. הוסף 150 מיקרוליטר של מגיב BCA מעורב לכל דגימה ותקן.
  4. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. השתמש בקורא צלחות כדי למדוד את הספיגה ב-562 ננומטר ולכמת את ריכוז החלבון עם העקומה הסטנדרטית. הפחיתו את הספיגה הסטנדרטית הריקה ממדידת הספיגה של כל התקנים הבודדים האחרים ושכפולי דגימה לא ידועים כדי לקבל את ריכוזי החלבון בדגימה.

4. בקרת איכות תכשיר מיטוכונדריאלי (כתם מערבי)

  1. השעו מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית במאגר בדיקת הרדיו-אימונו-משקעים (RIPA) כדי לבצע כימות חלבון. קבע את ריכוז החלבון עבור כל דגימה באמצעות בדיקת מיקרו BCA.
  2. דנטורציה של הדגימות במאגר הדגימה בטמפרטורה של 94 מעלותצלזיוס למשך 5 דקות.
  3. טען כמויות שוות (20 מיקרוגרם) של חלבון מיטוכונדריאלי לג'לים טרומיים (ראה טבלת חומרים), יחד עם סמן המשקל המולקולרי.
  4. הפעל את הג'ל למשך 50 דקות ב 100 וולט.
    הערה: זמן הריצה עשוי להשתנות, לכן הקפד לעצור את הג'ל כאשר החלבונים הגיעו לקצה הג'ל המצוין על ידי הצבע במאגר הדגימה.
  5. העבירו את החלבונים מהג'ל לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) באמצעות פרוטוקול ההעברה היבשה במערכת העברת כתמים מערבית למשך 7 דקות ב-20 וולט.
  6. הוצא את הממברנה וחסום באמצעות תמיסת החסימה (טבלה 1) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  7. הוסף דילולים מתאימים של נוגדן ראשוני לממברנה בחסימת המאגר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס(COXIV = 1:3,000, GAPDH = 1:3,000).
    הערה: ניתן לבדוק את היעדר זיהום גרעיני, רשתית אנדופלזמית (ER) בתכשיר המיטוכונדריאלי על ידי שימוש בסמנים נוספים כמו למין (סמן גרעיני) ו-ERp57 (סמן ER) בכתמים מערביים.
  8. שטפו את הממברנה למשך 3 x 15 דקות עם מאגר הכביסה (טבלה 1).
  9. לדגור את הממברנה עם הדילול המתאים של נוגדן משני מצומד HRP בחסימת מאגר בטמפרטורת החדר למשך שעה
  10. שטפו את הממברנה למשך 3X15 דקות עם מאגר הכביסה.
  11. לפיתוח, השתמש בערכת מצע כימילומינסצנטית.
  12. סרוק את הממברנה באמצעות הדמיית ג'ל וממברנה.

5. בידוד חלבון מיטוכונדריאלי למיצוי N-glycan ממיקרוגליה

  1. השעו מחדש את המיטוכונדריה המבודדת ב-50 מיקרוליטר של מאגר בידוד חלבון (טבלה 1) והשאירו על הקרח למשך 20 דקות.
  2. יש לשאוב ולהוציא שלוש פעמים ולהשאיר 20 דקות על קרח (מערבולת לפני השימוש). אם הגלולה המיטוכונדריאלית אינה מסיסה במלואה, הוסף עוד 50 מיקרוליטר של מאגר הבידוד ובריכה לאותו צינור.
  3. צנטריפוגה במשקל 13,000 × גרם למשך 10 דקות.
  4. שחזרו את הסופרנטנט, הקפיאו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוסלמשך שעה אחת לפחות, וייבשו כמה שיותר ברכז ואקום.
  5. השעו לפני בידוד הגליקן באמצעות מאגר העיכול PNGase (טבלה 1) עבור IR-MALDESI.

6. הכנת N-glycan מיטוכונדריאלית עבור IR-MALDESI

  1. טען 25-250 מיקרוגרם חלבון (בנפח מקסימלי של 250 מיקרוליטר) של חלבונים מיטוכונדריאלים מבודדים על מסנן חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 10 kDa.
  2. צמצם את דגימות החלבון כדי לחשוף את חלקי הגליקן על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של 1 M dithiothreitol (DTT) לכל דגימה במסנן.
  3. יש לדלל את הדגימה ב-200 מיקרוליטר של מאגר עיכול PNGase ומערבולת קלות כדי למנוע הפרעה למסנן.
  4. דנטורציה של החלבונים המיטוכונדריאלים על ידי דגירה של הדגימה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. השתמש ב-50 מיקרוליטר של 1 M יודואצטמיד כדי לאלקילאט את המיטוכונדריה כדי לתת ריכוז סופי של ~200 מ"מ, ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  6. כדי לרכז עוד יותר את השיטות המיטוכונדריאליות המפורקות, צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 × גרם למשך 40 דקות. השלך את הזרימה.
  7. שטפו את הדגימה עם 100 מיקרוליטר של מאגר עיכול PNGase.
  8. רכז את הגליקופרוטאין על המסנן ב-14,000 × גרם למשך 20 דקות והשליך את הזרימה. חזור על שלב הכביסה והתרכיז פעמיים, בסך הכל פי 3, ומניב תרכיז בנפח המת של המסנן (~5 מיקרוליטר). השליכו את כל הזרימה.
  9. השלך את בקבוקון האיסוף לאחר השלמת השטיפות. השתמש בבקבוקון אוסף חדש לכל חומרי הניקוי והשטיפות העתידיות.
  10. כדי לבקע את הגליקנים מתבניות גליכונדריאליות שעברו דנטורציה, העבירו לבקבוקון איסוף טרי והוסיפו 2 מיקרוליטר של PNGase נטול גליצרול (75,000 יחידות/מ"ל) למסנן. הוסף 98 מיקרוליטר של מאגר עיכול PNGase, והביא את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר וערבב על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה על המסנן.
  11. דגירה של דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות כדי לבקע אנזימטית את כל ה-N-גליקנים מחלבונים מיטוכונדריאליים.
  12. לחסל את ה-N-גליקנים המיטוכונדריאלים המשוחררים על ידי צנטריפוגה של הדגימה ב-14,000 × גרם למשך 20 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  13. שטפו את הגליקנים המיטוכונדריאלים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חוצץ עיכול PNGase למסנן ולצנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 20 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. אסוף את הכביסה המכילה את כל ה-N-גליקנים שנותרו באותו בקבוקון איסוף כמו חומר הנוזל. חזור על הפעולה פעמיים והסר את המסנן מבקבוקון האיסוף.
  14. דגרו את דגימות הגליקן המיטוכונדריאלי במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה (30-60 דקות) וייבשו עד להשלמה בטמפרטורת החדר ברכז ואקום (4-6 שעות עבור 400 מיקרוליטר).
    הערה: ניתן לאחסן N-גליקנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים לפני הניתוח.
  15. השעו מחדש את הגליקנים המיובשים המקושרים ל-N ב-50 מיקרוליטר של מים בדרגת LC/MS ישירות לפני ניתוח IR-MALDESI.

7. איתור גליקנים משוחררים על ידי ספקטרומטריית מסה IR-MALDESI

  1. בצע כיול מסה בכל יום של הניסוי. טען את תמיסת הכיול על משאבת מזרק ודחף דרכה בקצב של 1.2 מיקרוליטר לדקה. הפעל מתח של 3.5 קילו וולט כדי להשיג פלומת אלקטרוספריי יציבה לכיול מסה במצב חיובי ושלילי כאחד.
  2. פיפטה 5 מיקרוליטר של גליקנים מיטוכונדריאלים תלויים על נקודת דגימה על מגלשת מיקרובאר טפלון.
  3. השתמש בלייזר אמצע IR הפועל באורך גל של 2.97 מיקרומטר לאבלציה עם אנרגיה של 1.8 mJ לכל פרץ.
  4. יינון וזיהוי N-גליקנים במצב יינון שלילי. השתמש בממס אלקטרוספריי המורכב מ-60% אצטוניטריל וחומצה אצטית של 1 מ"מ כדי ליצור פלומת אלקטרו-ספריי יציבה עם קצב זרימה של 2 מיקרוליטר לדקה במתח של 3.2 קילו וולט.
  5. כדי לבצע את הניתוח, חבר IR-MALDESI לספקטרומטר מסה HRAM המוגדר לעוצמת פתרון מסה של 240,000FWHM ב-m/z 200, תוך ניתוח בין 500 ל-2,000 m/z במצב יינון שלילי.
  6. כבה את בקרת הרווח האוטומטית (AGC) והגדר זמן הזרקה קבוע של 90 אלפיות השנייה. השתמש במקור EasyIC עבור כיול פנימי בזמן-אמת של כל ספקטרום כדי להשיג דיוק מדידת מסה גבוה (MMA).

8. ניתוח נתוני N-glycan מיטוכונדריאלי

  1. זהה ידנית את הגליקנים המקושרים ל-N על ידי חיפוש מסות מונואיזוטופיות ואישור התפלגויות איזוטופיות באמצעות מרווח m/z כדי לקבוע יונים טעונים כפולים ומשולשים בעלי סף שטף יונים מינימלי של 1,000 יונים לשנייה.
  2. המר את ספקטרום המסה הגולמי מיחסי m/z למסות מונואיזוטופיות ניטרליות.
  3. העלה את המסות המונואיזוטופיות לכלי מקוון לחיזוי מבנה אוליגוסכריד כדי לקבוע הרכבי גליקן פוטנציאליים. אשר ביאורים באמצעות מסד נתונים גליקומי שנאסף בניסוי20; ודא שכל זיהוי נמצא בשוליים של 2.5 ppm MMA, מכיל את מבנה הליבה הגליקני המקושר ל-N (Hex3HexNAc2), ואינו כולל פנטוז, KDN או HexA חד-סוכרים.
  4. צייר את מבני הגליקן המאושרים באמצעות מינוח SNFG21.
  5. השג את השפע היחסי של גליקנים מספקטרום המסה הגולמית ונרמל כנגד כמות החלבון המיטוכונדריאלי במיקרוגרם כדי להשיג יונים/ש/מיקרוגרם.
  6. השתמש בניתוח חי בריבוע כדי לבדוק את מידת ההתאמה בין ההתפלגות התיאורטית והניסויית של הגליקנים המקושרים ל-N כדי לקבוע את מספר תוספות הכלור. זה מאפשר קביעה ישירה של מספר החומצות הסיאליות19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מייצג מתאר סכמטי של השלבים הכרוכים בבידוד המיטוכונדריה מקו תאי המיקרוגליה BV2 לניתוח גליקן ספקטרומטרי מסה. יכולת השחזור של בידוד חלבון מיטוכונדריאלי בין תכשירים מיטוכונדריאלים שונים מאותה צפיפות התחלתית של תאי המיקרוגליה מיוצגת באיור 2, אשר אינו מראה הבדל משמעותי בין ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי המוערך באמצעות בדיקת מיקרו BCA.

איור 3 מייצג את טוהר הבידוד המיטוכונדריאלי באמצעות ניתוח כתמים מערביים של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגליה הם תאי החיסון השוכנים במוח, ושינויים בגליקן מווסתים את האימונופנוטיפ והתפקוד של מיקרוגליה. תפקודים חיסוניים אלה דורשים אנרגיה תאית משמעותית, המסופקת בעיקר על ידי מיטוכונדריה. יש לציין כי החלבונים המיטוכונדריאלים מציגים גם שינויים בגליקן, שנותרו לא נחקרים באופן משמעותי בשל האתגרים הטכנולוגיים בחקירת גליקוזילציה תת-תאית. רוב המחקרים החוקרים גליקוזילציה מיטוכונדריאלית מסתמכים על זיהוי מבוסס לקטין של דפוסי גליקן22, אם כי גישות אלה מוגבלות על ידי ספציפיות הקי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לסת' אייזנברג, סטודנט לתואר שני במעבדת מודימן ב-NCSU, על עזרתו בהקלטת וידאו של פרוטוקול ספקטרומטרי מסה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית העמיתים של בית הספר לחדשנות הנדסית באוניברסיטת אלבמה בברמינגהם, AG068309 ל-D.J.T. ו-R01GM087964-12 ל-D.C.M. הסכמות בכתב היד הזה שורטטו באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Equipment
Amersham 600 imagerCytvia 29194217מצלמת ג'ל וממברנה
Countess 3 מונה תאים אוטומטיFisher ScientificX003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120VThermofisher scientific 
88870003 מכשיר העברת ג'לInvitrogenIB21001מערכת העברת כתמים
מערבית מיקרוסקופ הפוךטיפול בתא04355223EA
קורא82050-760
מיני מיכל ג'לInvitrogenA25977
נדנדה באוויר הפתוחפישר מותג88861025
ילד פיפט BioTek229310
מערבל מערבולתאינטגרה- ריאגנטים לבידוד מיטוכונדריה VWR
strong> מיטוכונדריה  ערכת בידוד
Mitochondrial Thermofisherscientific 89874
מעכב פוספוטאזThermofisher מדעי 
מעכב פרוטאזThermofisher scientific בידוד 1861281
N-glycan וריאגנטים IR-MALDESI
חומצה אצטית פישר סיינטיפיקA1135050% בממס ESI
אצטוניטריל סיגמא אולדריץ'34851-4L1 מ"מ בממס ESI
אמוניום ביקרבונט Fisher ScientificA643500100 מ"מ
Thermofisher ScientificA39239Pierce FlexMix
Dithiothreitol Sigma AldrichAC4263801001 M
יודואצטמידSigma AldrichA322-10VL
LC/MS מים בדרגהThermofisherScientific 047146.M6
PNGase Fבולדוג ביוNZPP01075000 U/mL, אנזים לשחרור N-גליקן 
בידוד N-glycan וחומרים מתכלים IR-MALDESI
Amicon מסננים צנטריפוגלייםפישר סיינטיפיק UFC50102410 kDa MWCO
Orbitrap Exploris 240
Mid-IR לייזרJGM Associates, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב
שקופית מיקרובאר טפלוןפרוסוליה, אינדיאנפוליס, אינדיאנה, ארה"ב
N-glycan תוכנות ניתוח
GlycoMod Expasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy https://glyconnect.expasy.org/
<חזק><הם>בידוד חלבונים וחומרים מתכלים של כתמים מערביים 
Basix טיפים לטעינת ג'ל (10 ומיקרו; L) Basix13-611-102
טיפים לטעינת ג'ל Basix (200 ומיקרו; L) Basix13-611-116
מגרד תאיםמעבדות VWR14-388-100
i-Blot NC ערימות רגילותInvitrogenIB23001
Blot2 PVDF ערימות רגילותInvitrogenIB24001
10  µ L מיקרופיפטהפישר סיינטיפיקFBE00010
20 ומיקרו; L מיקרופיפטהInvitrogenFBE00020
200  & מיקרו; מיקרופיפטה L מותג פישרFBE00200
1000 ומיקרו; L מיקרופיפטהמותג פישרFBE01000
10  &מיקרו; טיפים לפיפט מעבדות VWR76322-528
20  & מיקרו; טיפים לפיפט מעבדות VWR76322-134
200  &מיקרו; טיפים לפיפט מעבדות VWR76322-150
1000  & מיקרו; טיפים לפיפט Lמעבדות VWR76322-154
צלחת באר מותג פישר14-388-100
בידוד חלבונים וריאגנטים לכתמים מערביים  נוגדן
Actin ( מארח: ארנב )איתות תאים8457T
אנטי-ארנב IgG HRP מקושר טכנולוגיות איתות תאים7074S
בורג 4-12% ביס-טריס פלוסInvitrogenNW04120BOX
בקר סרום אלבומיןפישר ביו-ריאגנטיםBP9700-100
נוגדן COXIV (מארח: ארנב)טכנולוגיות איתות תאים4844S
נוגדן GAPDH (מארח: ארנב)טכנולוגיות איתות תאים2118S
ערכת בדיקת חלבון MicroBCAThermofisher scientific 23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]Thermofisher scientific NP0001
PAGE סרגל סולם חלבון צבוע מראשThermofisher scientific 815-968-0747דילול= השתמש ב-7  ומיקרו; L לטעינה על באר ראשונה
פוספט חוצץ מלח Aniara DiagnosticsA12-9423-5הכן 1x PBS מ-10x אבקה 
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermofisher מדעי 32106ערכת מצע כימילומינסנט
RIPA BufferThermofisher מדעי 89901
מאגר מדגםNovexB0007מאגר דגימת הבורג LDS מוכן ביחס של 3:1 בין מדגם למאגר דגימה
Tween-20MP ביו-רפואיTWEEN201
<חזק>חומרים מתכלים לתרבית רקמות 
Countess SlidesAvantor229411
צינורות EppendorfCell Treat414004-265612-5884
2 מ"ל שואב פיפטמעבדת ויסטה5090-0010E
5 מ"ל פיפט סרולוגי פישר סיינטיפיק13-678-11D
10 מ"ל פיפט סרולוגי Basix13-678-11E
25 מ"ל פיפט סרולוגימעבדת ויסטהFB012937
50 מ"ל צינור סרולוגימעבדת ויסטה14955233
15 מ"ל צינור חרוטיAvantor229225A
50 מ"ל צינור חרוטיטיפול בתא4190-0050
T-75 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמותפישר סיינטיפיק
T-180 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמותFisher ScientificFB012939
ריאגנטים לתרבית רקמות 
BV2 קו תאי מיקרוגליאל מערך ביולוגי יצירתי CSC-I2227Zמיקרוגליה עכברית אימורטלית (BV2) שמקורה במיקרוגליה של יילודים C57/BL6 
אנזימי דיסוציאציה של תאים תרמופישר מדעי 12563029TrypLE 
מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם רמת סוכר נמוכה Gibco10567014
סרום בקר עובריCytivaSH30071.03HI
חומצות אמינו לא חיוניות מדיום חיוני מינימלי (MEM)Gibco11140050
פניציליום סטרפטומיציןCytiviaSV30010
חוצץ פוספט מי מלחקורנינג21-040-CV
כתם כחול טריפן 0.4%InvitrogenT10282
מיקרופלייט <1861274 תמיסת כיול ספקטרומטר מסה טכנולוגיות FB012937

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dos Santos, S. E., et al. Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function. J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).
  2. Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration. Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).
  3. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns. Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).
  4. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).
  5. Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. Microglia: First responders in the central nervous system. Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).
  6. Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets. Front Immunol. 13, 856376(2022).
  7. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  8. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  9. Picca, A., et al. Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention. Nutrients. 14 (12), 2406(2022).
  10. Mcavoy, K., Kawamata, H. Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).
  11. Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease. Front Immunol. 12, 624538(2021).
  12. Starossom, S. C., et al. Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration. Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).
  13. Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration. Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).
  14. Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins. Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).
  15. Cummings, R. D., Pierce, J. M. The challenge and promise of glycomics. Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).
  16. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  17. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  18. Pace, C. L., Muddiman, D. C. Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).
  19. Palomino, T. V., Muddiman, D. C. Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).
  20. Mariethoz, J., et al. Glycomics@expasy: Bridging the gap. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  21. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  22. Yu, H., et al. Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model. Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).
  23. Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin. MethodsX. 8, 101197(2021).
  24. Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. central science. 9, 1297-1312 (2023).
  25. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).
  26. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy. J Vis Exp. (109), e53735(2016).
  27. Fischler, D. A., Orlando, R. N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols. J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).
  28. Tu, A., Muddiman, D. C. Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).
  29. Barry, J. A., et al. Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  30. Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging. Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NIR MALDESI

מאמרים קשורים