הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב Vivo יישום של תיוג קירבה מבוסס TurboID ב-Drosophila melanogaster

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68193

⸱

13 ביוני 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, אנו קובעים פרוטוקול מפורט לתיוג קרבה מבוסס TurboID (PL) בשחלות D. melanogaster , המכסה שלבים מתוספת ביוטין ודיסקציה של שחלות ועד לאימות ביטוי טרנסגנים והעשרה של פפטידים ביוטיניליים לספקטרומטריית מסה.

תקציר

תיוג קרבה (PL) הוא שיטה רבת עוצמה למיפוי רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון. התקדמות בתיוג אנזימים, במיוחד TurboID, הרחיבה את השימוש בו במערכות ביולוגיות. TurboID הוא יתרון במיוחד עבור יישומי in vivo בשל חוסנו, אי-רעילותו וקלות השימוש בו. אנזים זה מבצע ביוטינילציה מופקרת של ביומולקולות סמוכות, כולל חלבונים וחומצות גרעין, בטווח של כ-10 ננומטר בנוכחות ביוטין. יישמנו שיטה זו כדי לחקור את האינטראקטום של קישוא (Zuc), גורם מפתח בביוגנזה של RNA (piRNA) המקיים אינטראקציה עם piwi על הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (OMM) בתאי קו הנבט של שחלת Drosophila melanogaster . על ידי ביטוי Zuc-TurboID בתאי נבט ותוספת ביוטין, גרמנו לביוטינילציה של חלבוני Zuc-proximal. ניתוח ספקטרומטריית מסה בעקבות העשרת פפטידים ביוטיניליים זיהה חלבונים בסמיכות ל-Zuc, כולל אינטראקטורים ידועים בביוגנזה של piRNA. מעניין שגילינו אינטראקטורים חדשים של Zuc המעורבים בקיפול חלבונים, ארגון ממברנות וסחר בשלפוחית.

מבוא

שיטות מיפוי קונבנציונליות של אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), כגון ספקטרומטריית מסה של טיהור זיקה (AP-MS) ומערכות שמרים-2-היברידיות (Y2H), לרוב אינן מצליחות ללכוד חלבונים בעלי שפע נמוך, המתבטאים באופן חולף או קשורים לממברנה. מגבלה זו נובעת מחוסר יכולתם לשכפל את התנאים הפיזיולוגיים הטבעיים של תא חי 1,2,3. כדי להתגבר על אתגרים אלה, PL התגלתה כטכניקה רבת עוצמה למיפוי פרוטאום ברזולוציה גבוהה ברמת תת-אברונים in vivo. PL ממנף את ההיתוך של אנזים מופקר עם חלבון פיתיון, ומאפשר לאנזים לזרז את היווצרותן של מולקולות תגובתיות קצרות חיים1. מולקולות תגובתיות אלה, כגון ביוטין, מסמנות באופן קוולנטי חלבונים בטווח של כמה ננומטרים מחלבון ההיתוך4. לאחר מכן, חלבונים ביוטיניליים מבודדים ומנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי להקל על זיהוי חלבון בקנה מידה גדול 5,6.

במהלך השנים האחרונות פותחו אנזימים מופקרים שונים לקידום טכניקות PL. שני אנזימים בשימוש נרחב הם ביוטין ליגאז מוטנטי R118G שמקורו ב-Escherichia coli ואנזים אסקורבט פרוקסידאז 2 שמקורו באפונה (APEX2). BioID ממיר ביוטין ו-ATP לביוטיניל-5'-אדנילט (bioAMP)1. מולקולה ריאקטיבית זו נקשרת קוולנטית לשאריות ליזין של חלבונים סמוכים ברדיוס ± 10 ננומטר. יתרון מרכזי של PL מבוסס BioID הוא השימוש בביוטין. זוהי ביומולקולה טבעית ולא רעילה באורגניזמים חיים, המאפשרת תיוג בטוח in vivo 6. עם זאת, ל-BioID יש מגבלות, כולל קינטיקה איטית של תיוג (18-24 שעות) ודרישה לטמפרטורה גבוהה (37 מעלות צלזיוס) לפעילות קטליטית אופטימלית4. תכונות אלו עלולות לעכב את יישומו בחקר תהליכים ביולוגיים דינמיים. בינתיים, APEX2 מזרז את היווצרותם של רדיקלים ביוטין-פנוקסיל בנוכחות ביוטין-פנול ומי חמצן (H2O2)7. רדיקלים אלה מגיבים בעיקר עם שרשרת הצד של חומצות אמינו עשירות באלקטרונים כמו טירוזין ויכולים גם לקשור ציסטאין, היסטידין וטריפטופן8. יכולת התיוג המהירה של האנזים פרוקסידאז (< 1 דקה) מתאימה ללכידת PPIs דינמיים וחולפים9. יתר על כן, יש לו טווח זיהוי רחב יותר (עד 20 ננומטר) מאשר ביוטין ליגאז. עם זאת, ל-PL מבוסס APEX2 יש חסרונות, כולל הדרישה לחומר מחמצן רעיל, H2O2, והחדירות הנמוכה של ביוטין-פנול, המגבילים את הישימות in vivo10.

בשנת 2018, ברנון ועמיתיו פיתחו ליגאז ביוטין חדש בשם TurboID, גרסה מוטנטית של 35 קילו-קילו-D של BirA (הביוטין ליגאז שנמצא ב-E. coli)4. אנזים זה משלב מוטציה במיקום R118 (R118S) יחד עם 15 מוטציות אחרות ביחס ל-BirA. הוא מציג פעילות קטליטית גבוהה פי שניים מ-BioID. ביוטינילציה המושרה על ידי TurboID תוך 10 דקות מייצרת נתונים פרוטאומיים עם גודל וסגוליות דומים ל-18 שעות של תיוג על ידי BioID. יתר על כן, הוא מפגין פעילות תיוג מצוינת ב-30 מעלות צלזיוס4. לכן, TurboID מתאים יותר ליישום באורגניזמים כמו Drosophila או Caenorhabditis elegans, המגדלים בדרך כלל ב-25 מעלות צלזיוס ו-20 מעלות צלזיוס, בהתאמה.

במחקר זה, אנו שואפים להשתמש ב-PL מבוסס TurboID למחקר אינטראקטום בשחלת דרוזופילה. הפרוטוקולים המתוארים כאן משמשים למיפוי האינטראקטום של Zuc בתאי קו הנבט. Zuc הוא אנדונוקלאז הממוקם על הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (OMM), המתווך את הביוגנזה של piRNAs, RNA קטנים שאינם מקודדים קריטיים לשמירה על שלמות הגנום 11,12,13. על ידי השוואת חלבונים ביוטיניליים שזוהו מניתוח Zuc-TurboID עם אלה משני בקרות נוספות, NES-TurboID ו-Tom20-TurboID, הגדרנו מועמדים מובהקים הפועלים באינטראקציה עם Zuc.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. PL בטיסה למבוגרים

  1. הכנת מזון ביוטין
    1. הכן תמיסת NaOH של 1 M על ידי דילול מלאי NaOH של 10 M במים מזוקקים משולשים (TDW). אחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT). הכן תמיסת מלאי ביוטין 1 M על ידי המסת 0.0049 גרם אבקת ביוטין ב-20 מ"ל TDW. הוסף 150-200 מיקרוליטר של 1 M NaOH כדי להגביר את מסיסות הביוטין. מערבולת להומוגניזציה של התמיסה. יש לאחסן את תמיסת מלאי הביוטין בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. מוציאים מזון זבוב מהבקבוקון ומכניסים אותו למיקרוגל למשך 2 דקות עד שהוא נמס.
      הערה: מזון זבובים סטנדרטי מכיל 5% קמח תירס, 3% שמרים, 10% סוכרוז, 1% אגר, 0.3% חומצה פרופיונית ו-0.3% מתיל 4-הידרוקסיבנזואט13.
    3. מוסיפים ציר ביוטין למזון המומס בריכוז סופי של 100 מיקרומטר, ואז מערבבים על ידי מערבולת. יש להוציא מיד 4.5 מ"ל של מזון בתוספת ביוטין לכל בקבוקון ריק באמצעות פיפטה סרולוגית. הניחו למזון להתקרר במשך 30 דקות, הניחו מכסה כותנה על הבקבוקון, ולאחר מכן אחסנו את מזון הביוטין בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להוסיף ביוטין לפני שהמזון מתקרר ומתקשה.
  2. הזנת ביוטין
    1. חצו את הזבובים הטרנסגניים המבטאים יתר על המידה חלבון היתוך TurboID עם רקמה או זבובי GAL4 ספציפיים לתא 14,15,16. כבקרה שלילית, זבובים מסוג פרא חוצה עם נהג GAL4 זבובים כדי להבטיח שאין אינדוקציה של ביוטינילציה.
    2. כעשרה ימים לאחר המעבר, הצאצאים יתחילו לבקוע. ממיסים אבקת שמרים יבשים לתוך TDW ומערבבים לעיסה חלקה. מרחו כף מעבדה של רסק שמרים על דופן בקבוקון חדש. הקש בעדינות על הבקבוקון הישן המכיל זבובים שזה עתה בקעו כדי לאסוף את הזבובים בתחתית. הפוך את הבקבוקון הישן על הבקבוקון החדש המכיל משחת שמרים, וודא ששולי שני הבקבוקונים מיושרים כדי למנוע בריחת זבובים.
    3. הקש את הבקבוקונים האלה יחד כדי להעביר זבובים מהבקבוקון הישן לחלק התחתון של הבקבוקון החדש. לאחר העברת הזבובים, הניחו היטב את כובעי הכותנה בחזרה על הבקבוקונים החדשים והישנים כאחד. המתן 3 ימים. ניתן לאחסן משחת שמרים ב- RT למשך מספר ימים.
      הערה: העברת זבובים צריכה להיעשות במהירות האפשרית מכיוון שזבובים יופתעו רק באופן זמני.
    4. הכן תמיסת חומצה פרופיונית 0.5% על ידי דילול 250 מיקרוליטר של מלאי חומצה פרופיונית ב-50 מ"ל TDW. אחסן אותו ב-RT.
    5. ביוםהשלישי , הכינו תמיסת עבודה של 100 מיקרומטר ביוטין על ידי דילול מלאי ביוטין 1 M ב-TDW, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של 0.5% חומצה פרופיונית. מערבבים תמיסת עבודה של ביוטין עם אבקת שמרים יבשים ומערבבים עד לקבלת משחה. הוסיפו כף מעבדה של רסק שמרים ביוטין לדופן בקבוקון המזון של הביוטין. ניתן לאחסן את משחת השמרים ביוטין ב-RT למשך מספר ימים.
    6. חלקו את הזבובים לשתי קבוצות. שמור קבוצה אחת בבקבוקון המזון הרגיל כביקורת והעביר את הקבוצה השנייה לבקבוקון המזון של ביוטין (תוספת משחת ביוטין ושמרים) כדי להתחיל בביוטינילציה. לאחר 16 שעות של ביוטינילציה, העבירו זבובים לבקבוקון מזון רגיל חדש.
      הערה: בעבר ביצענו בדיקת הזנת ביוטין במשך 4 שעות, 8 שעות ו-16 שעות. אות הביוטינילציה היה החזק ביותר אחרי 16 שעות האכלה, ולכן בחרנו בנקודת הזמן הזו לניסויים עוקבים.
  3. אוסף שחלות דרוזופילה
    1. הכניסו זבובים לתוך כרית הזבובים CO2 , שמרו על הנקבות והשליכו את הזכרים. לאחר שהזבובים מורדמים כראוי (לא זזים יותר), פיפטה 1 מ"ל של מדיום החרקים הקר של גרייס על צלחת הדיסקציה.
    2. קח זבוב לצלחת החיתוך בעזרת מלקחיים עדינים ותן לו לטבול במדיום. החזק את בית החזה של הזבוב בעזרת מלקחיים, היזהר לא לרסק את הגוף. לאחר מכן, השתמש במלקחיים אחרים כדי להסיר בעדינות את קצה הבטן האחורית (שם נמצא חלק איברי המין).
    3. השתמש במלקחיים כדי לסחוט לאט את השחלות החוצה (החל מהבטן העליונה למטה לתחתית).
    4. ברגע שהם יוצאים, הסר רשתות שרירים ורקמות אחרות המקיפות את השחלות. היזהר לא לפגוע בשחלות.
    5. העבירו בזהירות שחלות נקיות לצינור של 1.7 מ"ל באמצעות מלקחיים; שמור את הצינור על קרח. חזור על שלבים 1.3.2 - 1.3.4 עבור הזבובים הבאים.
    6. סובב את הצינור ב-3,500 x גרם למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השתמש בקצות מיקרופיפטה כדי להסיר את המדיום שנותר. היזהר לא לגעת בשחלות.
    7. הקפיאו את הצינור עם חנקן נוזלי, ולאחר מכן אחסנו את השחלות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. דגימות השחלות יציבות למשך שנה.

2. ביטוי טרנסגנים וזיהוי חלבון ביוטיניל על ידי בדיקת כתם מערבית

הערה: לבדיקת כתם מערבי, אסוף כחמישה זוגות שחלות לכל דגימה.

  1. ליזה של רקמות
    1. להפשיר את רקמת השחלה הקפואה. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ליזה RIPA (50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 150 מ"מ NaCl, 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS), 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 1% טריטון X-100), בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז (PI) 1x ו-1 מ"מ פניל-מתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF). אחסן את מאגר הליזה של RIPA (ללא קוקטייל PI 1x ו-1 מ"מ PMSF) ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להוסיף קוקטייל PI ו-PMSF רק ממש לפני הניסוי.
    2. לשבש את השחלות באמצעות הומוגנייזר ידני יחד עם עלי פלסטיק (דקה אחת לכל צינור). יש צורך בתהליך ליזה של רקמות על קרח למשך 10 דקות כדי להבטיח ליזה מלאה, ואחריה הומוגניזציה.
    3. צנטריפוגה ב-13,500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להפרדת ליזט חלבון מפסולת.
    4. ליזאט חלבון שקוף פיפטה לשפופרת חדשה של 1.7 מ"ל (הימנע מלקחת את שכבת השומנים מעל), ולאחר מכן אחסן ליזאט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  2. מדידת ריכוז חלבון על ידי בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA)
    1. הכן מגיב עבודה של חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) (WR) על ידי ערבוב מגיב A ומגיב B ביחס של 50:1. מערבבים 1 מיקרוליטר של ליזאט או תקן BSA מדולל עם 200 מיקרוליטר WR בצלחת של 96 בארות (בכפילויות), ואז דוגרים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. חשב כמה WR נחוץ באמצעות נוסחה זו:
        (# תקנים + # דוגמאות) × (# משכפל) × (נפח WR לדגימה)
        כדי ליצור סט של תקני חלבון, הכינו מספר דילולים של 2 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) במאגר ליזה RIPA (ללא קוקטייל PI ו-PMSF) עם ריכוזים סופיים של 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 ו-2000 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. מדוד את הספיגה באמצעות קורא מיקרו-פלטות באורך גל של 495 ננומטר. צור עקומה סטנדרטית מערכי ספיגת BSA, ולאחר מכן קבע את ריכוז החלבון.
  3. בדיקת כתם מערבי
    1. אלקטרופורזה בג'ל
      1. הוסף 30-50 מיקרוגרם ליזאט חלבון למאגר הטעינה של SDS פי 2. הוסף TDW (במידת הצורך) כדי ליצור ריכוז חלבון סופי של 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר וריכוז סופי של 1x SDS, ולאחר מכן הרתיח את הדגימה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      2. הכן את מאגר הריצה על ידי ערבוב של 25 מ"ל של מאגר MOPS 20x עם 500 מ"ל TDW כדי ליצור ריכוז 1x של מאגר ריצה. אחסן אותו ב-RT.
      3. שטפו את הבארות של ג'ל ביס-טריס עם 1 מ"ל של מאגר רץ (פי 3), ולאחר מכן הניחו ג'ל ביס-טריס בתא האלקטרופורזה. מלאו את הצד הקדמי של החדר במאגר הריצה החדש עד שכל הבארות שקועות (± 250 מ"ל). מלאו את הצד האחורי של החדר במאגר הריצה המשומש (מספיק מחצית מנפח המאגר החדש המשמש
      4. טען את הדגימה על ג'ל Bis-Tris והשתמש ב-4 מיקרוליטר של סולם חלבון צבוע מראש כסמן. בצע אלקטרופורזה (200 וולט, 30 דקות). מוציאים את הג'ל מהקסטה ושוטפים עם TDW.
    2. ספיגת קרום
      1. צור מאגר העברה על ידי הוספת 20 מ"ל של מאגר העברה (מלאי פי 25) ו-50 מ"ל מתנול ל-430 מ"ל של TDW.
      2. מסדרים כריך המורכב מרפידות ספיגה, נייר פילטר, ג'ל וקרום ניטרוצלולוזה במודול כתם. לפני ערימת שכבה חדשה, השתמש ברולר להסרת בועות.
      3. התקן את מודול הכתם על תא ההעברה, ולאחר מכן מלא את החדר ב-500 מ"ל של מאגר העברה. העברת חלבונים למשך שעה ב -175 mA.
        הערה: יש להכין את מאגר ההעברה טרי לפני הניסוי.
    3. חסימת
      1. הוסף 5 מ"ל של מלאי Tween20 ל-45 מ"ל של TDW כדי ליצור פתרון מלאי של 10% Tween20. יש להמיס שתי טבליות מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ב-400 מ"ל של TDW. הסר 4 מ"ל של תמיסה, ולאחר מכן הוסף 4 מ"ל של 10% Tween20 (ריכוז סופי 0.1%) כדי ליצור תמיסת PBST 1x. אחסן אותו ב-RT.
      2. הסר את הממברנה המוכתמת מתא ההעברה, ולאחר מכן שטוף עם 1x PBST.
        הערה: אם יש צורך לדגור את הממברנה עם נוגדנים שונים, חתוך אותה עם להב נירוסטה נקי בהתאם לגדלי החלבון הצפויים לפני ביצוע שלב החסימה.
      3. כדי לבדוק ביטויי גנים, השתמש ב-2% BSA ב-1x PBST עבור שלב החסימה (1 שעה, RT). צור תמיסת BSA של 2% על ידי הוספת 1 גרם BSA ל-50 מ"ל של 1x PBST. לזיהוי חלבון ביוטיניל, בצע חסימה באמצעות 3% BSA ב-1x PBST (לילה, 4 מעלות צלזיוס). ממיסים 1.5 גרם אבקת BSA ב-50 מ"ל של 1x PBST כדי ליצור תמיסת BSA של 3%. יש לאחסן פתרונות חסימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
        הערה: ה-BSA המשמש שונה מזה ששימש בבדיקת BCA. BSA לבדיקת BCA הוא חלק מערכת BCA.
    4. דגירה ראשונית של נוגדנים
      1. לדלל 1 מיקרוליטר של α-V5 ב-10 מ"ל של 2% BSA (1: 10,000) ו-10 מיקרוליטר של גן משק בית α-HSP90 ב-2% BSA (1: 1,000). הוסף 2.7 מיקרוליטר של מצומד סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז (SA-HRP) ל-9 מ"ל של תמיסת PBST 1x כדי ליצור תמיסת SA-HRP של 0.3 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. כדי לבדוק ביטויי גנים, דגרו את הממברנה עם נוגדן ראשוני למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לזיהוי חלבון ביוטיניל, דגרו את הממברנה למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. יש לאחסן את הנוגדן העיקרי בחזרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש בו מספר פעמים.
      3. שטפו את הממברנה עם 1x PBST למשך 3x ב-RT למשך 15 דקות כל אחד.
    5. דגירה משנית של נוגדנים
      1. הכן תמיסת נוגדנים משנית על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של IgG נגד ארנב או נגד עכבר (מצומד פרוקסידאז חזרת (HRP) מצומד) ל-10 מ"ל של 2% BSA (1: 5,000).
        הערה: עבור SA-HRP, אין צורך בנוגדנים משניים. המשך ישירות לשלב ההדמיה. יש לדלל נוגדנים משניים לפני הניסוי.
      2. דגירה של הממברנה בתמיסת נוגדנים משנית למשך 40 דקות ב-RT. יש לשטוף את הממברנה עם 1x PBST למשך 3x ב-RT למשך 15 דקות כל אחד.
    6. זיהוי חלבונים בשיטת כימילומינסנציה משופרת (ECL)
      1. מערבבים 750 מיקרוליטר לומינול ו-750 מיקרוליטר תמיסת HRP (יחס של 1:1). שמור על הממברנה לחה במאגר הכביסה בזמן הכנת התערובת.
        הערה: יש להכין תערובת זו לפני הניסוי. מכיוון שהכימיקלים רגישים לאור, הרחיקו אותם מאור השמש או ממקורות אור עזים אחרים (חשיפה לטווח קצר לתאורת מעבדה היא בסדר).
      2. טובלים את הממברנה בתמיסה למשך 30 שניות, ואז מניחים אותה בין יריעות פלסטיק שקופות. התבונן ברצועות חלבון מוכתמות עם מכשיר Chemidoc.

3. ביטוי טרנסגנים ואימות לוקליזציה על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית

הערה: כדי לבדוק ביטוי גנים ולוקליזציה, נתחו כחמישה זוגות שחלות לדגימה מנקבות בנות יומיים שניזונו משחת שמרים. שחלות צעירות מכילות בעיקר שלבים מוקדמים של תאי ביציות, שהם אידיאליים לצביעה אימונופלואורסצנטית בשל שפע תאי האחות (תאי קו הנבט) והממברנות החדירות יחסית שלהם17. שלבים מאוחרים של תאי ביצה נוקשים יותר וקשים לחדירה עקב היווצרות קומפלקס קליפת הביצה, שמתחיל בשלב 918. לבדיקת ביוטינילציה של חלבון, נתחו כחמישה זוגות שחלות לדגימה מנקבות בנות 4 ימים שהוזנו בביוטין, כמתואר בשלב 1.2.

  1. הכנת מדגם
    1. החזק את החלק האחורי של שחלה מנותחת במקומו באמצעות מלקחיים. השתמש במלקחיים אחרים כדי להפריד בעדינות את השחלה לתאי ביציות בודדים. עבדו בזהירות כדי למנוע קרע בתאי הביצים. פרוטוקול בידוד תא הביציות תואר בפירוטב-19. הכניסו בזהירות את תאי הביצים לצינור של 1.7 מ"ל, ולאחר מכן שטפו עם 1 מ"ל של 1x PBS (RT). חותכים את קצה קצות הפיפטה לפני הפיפטה כדי למנוע מתאי הביצים להיתקע בקצוות.
      הערה: השתמש רק בתאי ביצים בשלב ≤ 9 (שקופים). השלך ביציות בוגרות ותאי ביצים בשלב מאוחר ≥ 10. צנרת תגרום לתאי הביצים לצוף בתמיסה. לכן, הניחו לתאי הביצים להתיישב בתחתית (למשך 5 דקות) לפני שתמשיכו לשלבים הבאים.
  2. קיבוע
    1. יש לדלל 3.125 מ"ל של 16% פורמלדהיד (FA) ב-6.875 מ"ל של 1x PBS כדי ליצור תמיסת FA של 5%. אחסן אותו ב-RT.
      הערה: FA רגיש לאור, אז הרחק אותו מאור.
    2. פיפטה 1 מ"ל של 5% פורמלדהיד (FA) לתוך הצינור המכיל ביציות. הנח את הצינור על הרב-מסובב, ולאחר מכן תקן את הביציות למשך 30 דקות.
      הערה: משלב הקיבוע ועד לשלב הצביעה הגרעינית, מבוצעים ניסויים על רב מסובב עם סיבוב עדין.
    3. הכן 0.5% Triton X-100 ב-1x PBS (1x PBT) כתמיסת כביסה על ידי הוספת 10 מ"ל של 10% מלאי Triton X-100 ל-190 מ"ל של 1x PBS. אחסן אותו ב-RT.
    4. שטפו את תאי הביצים הקבועים פי 1, ולאחר מכן שטפו 3 פעמים ב-RT למשך 10 דקות. השתמש ב-1 מ"ל של 1x PBT הן לשלבי השטיפה והן לשלבי הכביסה.
  3. חסימת
    1. הכן 5% סרום בקר עוברי (FBS) על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של מלאי FBS ל-4.75 מ"ל של 1x PBT.
      הערה: יש להכין תמיסה זו לפני הניסוי.
    2. הוסף 1 מ"ל של 5% FBS לתוך הצינור ובצע את שלב החסימה למשך שעה אחת ב-RT. שטוף את הביציות פי 1.
  4. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. לבדיקת ביטוי ולוקליזציה של טרנסגנים, יש לדלל 2 מיקרוליטר של α-V5 ו-2 מיקרוליטר של α-ATP5A או α-Tom20 (כסמן מיטוכונדריאלי) ב-400 מיקרוליטר של 1x PBT (יחס של 1:200).
      הערה: למרות שניתן להשתמש בשני נוגדנים יחד כדי להכתים דגימה אחת, המארחים שלהם צריכים להיות שונים. זה כדי למנוע קשירה חופפת של נוגדנים משניים עוקבים.
    2. דגרו על תאי ביצים עם 400 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת (לילה, 4 מעלות צלזיוס).
      הערה: בדומה לבדיקת כתם מערבי, ניתן להשתמש בנוגדנים ראשוניים מספר פעמים לצביעה חיסונית. לפני אחסון תמיסת נוגדנים בחזרה, ודא שהיא אינה מכילה תאי ביצים.
    3. שוטפים את תאי הביצים 1x, ולאחר מכן שוטפים 3x ב-RT למשך 10 דקות.
  5. דגירה משנית של נוגדנים
    1. לדלל 2 מיקרוליטר של עז α-RB IgG Alexa Fluor 488 ו-2 מיקרוליטר של עז α-M IgG Alexa Fluor 594 ב-400 מיקרוליטר של 1x PBT (יחס של 1:200). דגרו על תאי ביצים עם 400 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מדוללת למשך שעתיים ב-RT. לזיהוי ביוטינילציה, הוסף 2 מיקרוליטר של Alexa Fluor 594 מצומד סטרפטווידין ל-1x PBT (יחס של 1:200) ודגירה יחד עם נוגדן משני.
      הערה: משלב זה, הגן על הדגימה מפני אור. יש לדלל נוגדנים משניים לפני הניסוי. ניתן להשתמש במספר נוגדנים משניים יחד, אך יש להקצות כל נוגדן ראשוני לפלואורופורים שונים שמקורם במארחים שונים גם כדי למנוע אותות חופפים. לדוגמה, 488 עז α-Rb ייקשר לארנב α-V5. באשר לעכבר α-ATP5A, 594 Goat α-M משמש כנוגדן המשני המשלים שלו. במקרה של זיהוי ביוטינילציה, יש להשמיט את השימוש בצבעים אחרים בעלי אורך גל זהה למצומד סטרפטווידין.
    2. שוטפים את תאי הביצים 1x, ולאחר מכן שוטפים 3x ב-RT למשך 10 דקות.
  6. צביעה גרעינית
    1. לדלל 1 מיקרוליטר של DAPI ב-1 מ"ל של 1x PBS (יחס של 1:1,000). דגרו תאי ביצים עם 1 מ"ל של תמיסת DAPI מדוללת למשך 5 דקות ב-RT.
      הערה: יש לדלל את DAPI טרי לפני הניסוי.
    2. שוטפים את תאי הביצים 1x, ולאחר מכן שוטפים 3x ב-RT למשך 10 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן תאי ביצים בתמיסת PBS 1x בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות לפני ההרכבה, אך מומלץ להמשיך בהקדם האפשרי.
  7. הרכבה בשקופיות
    1. נקה את מגלשת הזכוכית עם טישו נטול מוך, ולאחר מכן רשום עליה מידע לדוגמה. הסר 1x PBS מהצינור, אך השאר כמות קטנה כדי למנוע יובש.
    2. חותכים את קצה קצות המיקרופיפטה, ואז מניחים בזהירות את תאי הביצים על מגלשת הזכוכית. השתמש במלקחיים כדי לפזר בזהירות תאי ביצים על מגלשת הזכוכית ולמנוע כל גוש. התבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ (הגדלה פי 2 מספיקה) כדי להבטיח שתאי הביצים מפוזרים באופן שווה.
    3. הסר את ה-PBS שנותר ממגלשת הזכוכית באמצעות מיקרופיפטה. פיפטה 15-30 מיקרוליטר של תמיסה נוגדת דהייה (רגישה לאור) על הזכוכית מחליקה ומוודאת שהיא באה במגע עם כל תאי הביצים.
    4. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את קצה כיסוי המגלשה, ולאחר מכן הנח אותו על גבי מגלשת הזכוכית (החל מקצה אחד למשנהו) כך שיכסה את תאי הביצים. עשה זאת לאט כדי למנוע בועות. כתם את התמיסה העודפת עם טישו נטול מוך, ולאחר מכן אטום את שולי הכיסוי באמצעות לק. הניחו ללק להתייבש כראוי (± 5 דקות).
    5. דמיין את השקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי. אחסן שקופיות ב-20 מעלות צלזיוס.

4. העשרת פפטיד ביוטיניל לניתוח ספקטרומטריית מסה

הערה: דרושים כ-3 מ"ג חלבונים לדגימת ספקטרומטריית המסה. לכן, נתחו כ-100 זוגות שחלות כדי להשיג את הכמות הזו.

  1. ליזה של רקמות
    1. להפשיר את רקמת השחלה הקפואה. בינתיים, הכינו תמיסת מלח 1x Tris-buffered (TBS) על ידי המסת טבליה של 1 TBS ב-500 מ"ל TDW. אחסן אותו ב-RT. הכן 2% SDS ב-1x TBS כמאגר ליזה על ידי דילול 4 מ"ל של מלאי SDS של 10% ב-16 מ"ל של 1x TBS. אחסן אותו ב-RT.
    2. הוסף 500 מיקרוליטר של 2% SDS ב-1x TBS (בתוספת קוקטייל PI 1x) לתוך הצינור המכיל שחלות. המתן מספר דקות עד שהתאים יעברו ליזה והתמיסה תהפוך לדביקה.
    3. פיפטה ליזט לגודל 1 מ"ל המכיל סיבים אקוסטיים ממוקדים אדפטיביים (AFA). חותכים את קצות הפיפטה לפני השימוש. כדי להבטיח סוניקציה יעילה, העבירו מקסימום 500 מיקרוליטר ליזאט לכל צינור.
    4. בצע סוניקציה בתנאים הבאים: הספק שיא 75 וואט, מקדם חובה 10%, מחזורים לפרץ 200, זמן 180 שניות, טמפרטורה 6 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם דגימה חייבת להיות נתונה לסוניקציה מספר פעמים, הגדר כמה מרווחים ביניהם כדי למנוע יצירת חום עודף.
  2. משקעי אצטון
    1. העבר ליזאט לצינור בעל קשירה נמוכה של 5 מ"ל, ולאחר מכן הוסף אצטון קר לתוך הצינור ב-6x מנפח הדגימה. לדוגמה, הוסף 3 מ"ל אצטון ל -500 מיקרוליטר ליזאט.
      הערה: יש לקרר אצטון מראש ב-20 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. צינור מערבולת, טען אותו לרב-מסובב ודגירה למשך הלילה (± 16 שעות) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: זוהי נקודת עצירה, מה שאומר שניתן להשהות את הניסוי לרגע לאחר שלב זה.
    3. גלולה זירזה חלבונים ב-15,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant, ואז סובבו את הצינור ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 2 מ"ל של תמיסת תערובת המורכבת מ-90% אצטון קר ו-10% 1x TBS. פיפטה בתנועה למעלה ולמטה כדי לערבב את הגלולה והתמיסה. חותכים את קצות הפיפטה לפני השימוש.
    5. צינור מערבולת, ואז טען אותו לתוך הרב-מסובב ודגירה למשך שעתיים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    6. חלבוני גלולה ב-15,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, ואז סובבו את הצינור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. פתח את הצינור וייבש את הגלולה באוויר למשך 10 דקות.
      הערה: אין לייבש יתר על המידה את הגלולה מכיוון שיהיה קשה להשעות אותה מאוחר יותר.
    7. הכן תמיסת מלאי אמוניום ביקרבונט (ABC) של 500 מ"מ על ידי המסת 0.7906 גרם ABC ב-20 מ"ל של TDW. צור פתרון עבודה ABC של 50 מ"מ על ידי דילול של 3 מ"ל של תמיסת מלאי ABC של 500 מ"מ ב-27 מ"ל של TDW.
    8. הכן תמיסת אוריאה של 8 M על ידי הוספת 0.4805 גרם אוריאה ב-1 מ"ל של 50 מ"מ ABC.
      הערה: יש להכין תמיסת אוריאה טרייה לפני הניסוי.
    9. השעו מחדש את כדור החלבון ב-500 מיקרוליטר של 8 M אוריאה. ניתן להפחית נפח של 8 M אוריאה כדי להגדיל את ריכוז החלבון.
    10. העבירו חלבון מושעה לתוך מילי-צינור בגודל 1 מ"ל המכיל סיבי AFA, ולאחר מכן בצעו סוניקציה באותם תנאים המתוארים בשלב 4.1.4.
    11. יש לבצע בדיקת BCA כדי לקבוע את ריכוז החלבון. שלב זה הוא נקודת עצירה. אחסן את דגימת החלבון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  3. עיכול טריפסין
    1. מערבבים 3 מ"ג חלבונים עם TDW (במידת הצורך) בשפופרת בעלת קשירה נמוכה של 5 מ"ל כדי ליצור בסך הכל 500 מיקרוליטר של תמיסה.
    2. דנטורציה של חלבונים באמצעות תרמובלוק ב-450 סל"ד למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 5 מיקרוליטר של 1 M DTT (מומס ב-TDW) לתוך הצינור כדי ליצור ריכוז סופי של 10 מ"מ DTT, ולאחר מכן הפחת חלבונים באמצעות תרמובלוק ב-450 סל"ד למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    4. הכן 400 מ"מ יודואצטמיד על ידי המסת 0.0111 גרם יודואצטמיד ב-150 מיקרוליטר של ABC. הוסף 55 מיקרוליטר של 400 מ"מ יודואצטמיד לתוך הצינור (ריכוז סופי 40 מ"מ), ולאחר מכן חלבוני אלקילט באמצעות תרמובלוק ב-450 סל"ד למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: יודואצטמיד רגיש לאור, ויש להכין את כל תמיסות היודואצטמיד טריות לפני הניסוי.
    5. מדללים את הדגימה על ידי הוספת תמיסת ABC של 50 מ"מ עד שהנפח הכולל מגיע ל-4 מ"ל. לאחר הדילול, ריכוז האוריאה בתמיסה הוא בסביבות 1 M.
    6. צור תמיסת מלאי 1 M CaCl2 על ידי המסת 1.1098 גרם CaCl2 ב-10 מ"ל של TDW. הוסף 4 מיקרוליטר של 1 M CaCl2 לתוך הצינור כדי ליצור ריכוז סופי של 1 מ"מ, ואז פיפטה למעלה ולמטה כדי להומוגניזציה של התמיסה.
    7. הכן תמיסת מלאי טריפסין של 1 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 0.001 גרם טריפסין ל-1 מ"ל ABC. הוסף 150 מיקרוליטר טריפסין לשפופרת (טריפסין: דגימה = יחס 1:20). עיכול חלבון באמצעות תרמובלוק ב-450 סל"ד למשך 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להמיס טריפסין טרי לפני הניסוי. שלב זה הוא נקודת עצירה. יש לאחסן פפטידים מעוכלים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  4. העשרת פפטיד ביוטיניל
    הערה: יש להכין מאגרי כביסה ופליטה טריים לפני הניסוי.
    1. הכן 2 M אוריאה בתמיסה של 1x TBS על ידי הוספת 1.2012 גרם אוריאה ב -10 מ"ל של 1x TBS.
    2. השתמש ב-150 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים לסטרפטווידין לכל דגימה של 3 מ"ג. שוטפים את חרוזי הסטרפטווידין עם 1 מ"ל של 2 מ אוריאה ב -1x TBS. חזור על שלב זה 4x. לאחר כל שטיפה, הנח את הצינור על מתלה מגנטי למשך דקה אחת, ולאחר מכן השליך את מאגר הכביסה.
      הערה: חרוזים מגנטיים של פירס סטרפטווידין מומלצים מכיוון שהם ממזערים אותות רקע דמויי PEG בתוצאות ספקטרומטריית מסה.
    3. פיפטה 1 מ"ל של פפטידים מעוכלים לתוך הצינור המכיל חרוזים, מערבבים בעדינות ולאחר מכן מערבבים את התערובת עם הדגימה הנותרת בצינור בעל קשירה נמוכה של 5 מ"ל. הנח את הצינור על רב מסובב ודגר למשך שעה אחת ב-RT.
    4. מעבירים 1 מ"ל מהתערובת לצינור של 1.5 מ"ל ומניחים אותה על המדף המגנטי למשך דקה. השליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה עד לאיסוף כל החרוזים.
    5. הכן 2 M אוריאה ב-50 מ"מ ABC על ידי המסת 0.7207 גרם אוריאה ב-6 מ"ל של 50 מ"מ ABC. שטפו חרוזים עם 1 מ"ל של 2 מ"ל אוריאה ב-50 מ"מ 2x ועם 1 מ"ל TDW פעם אחת. לאחר כל שטיפה, הנח את הצינור על מתלה מגנטי למשך דקה אחת, ולאחר מכן השליך את מאגר הכביסה.
    6. הכן תמיסת מלאי של 10% חומצה פורמית על ידי המסת 1 מ"ל של חומצה פורמית ב-9 מ"ל של TDW. הכן את מאגר הפליטה המורכב מ-80% אצטוניטריל ו-0.1% חומצה פורמית ב-TDW. לדוגמה, ערבבו 1.2 מ"ל אצטוניטריל, 15 מיקרוליטר של 10% מלאי חומצה פורמית ו-285 מיקרוליטר של TDW כדי ליצור מאגר פליטה של 1.5 מ"ל.
      זהירות: אצטוניטריל וחומצה פורמית מזיקים בשל תכונותיהם הנדיפות לכן חבשו מסכה והיזהרו בעת הטיפול בהם.
    7. פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה לתוך הצינור, הומוגניזציה בעדינות ולאחר מכן פולט פפטידים באמצעות תרמובלוק ב-300 סל"ד למשך 5 דקות ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה, הנח את הצינור על מתלה מגנטי והעביר את הפליטה לצינור חדש של 1.5 מ"ל. הימנע מלקיחת חרוזים בעת העברת הפליטה. חזור על שלב זה 5 פעמים.
    8. הנח את הצינור המכיל 500 מיקרוליטר של פליטה על מתלה מגנטי למשך 5 דקות, ולאחר מכן העביר אותו לצינור חדש של 1.5 מ"ל כדי להבטיח הסרה מלאה של החרוזים. לאחר מכן ניתן לייבש את הדגימות המנומקות ולהשתמש בהן לניתוח ספקטרומטריית מסה.
    9. למידע נוסף על ניתוח LC-MS/MS של דגימות פפטיד מועשרות ועיבוד נתוני MS, בדוק Nguyen et al.20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תפוקות לדוגמה מתוארות באיור 1, איור 2, איור 3, איור 4 פורסמו בעבר על ידי Nguyen et al.20. איור 1 ממחיש את ההליך הניסיוני של PL מבוסס TurboID בשחלות דרוזופילה . ראשית, נוצר מבנה המשלב Zuc ו-TurboID (Zuc-V5-TurboID). תושבים תת-אברונים ידועים ומובחנים, כלומר אות ייצוא גרעיני (NES) וממברנה מיטוכונדריאלית חיצונית ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מספקים נוהל מקיף לתיוג קרבה מבוסס TurboID (PL) בשחלת דרוזופילה , שפותח באמצעות פתרון בעיות מקיף כדי להתגבר על אתגרים שונים. נושא מפתח אחד היה קשור למבנים גנטיים, שכן פריסות היתוך שונות השפיעו באופן משמעותי על ביטוי החלבון ויעילות הביוטינילציה. לדוגמה, NES-V5-TurboID הציג ביטוי וביוטינילציה חלשים יותר בהשוואה לטרנסגנים אחרים, מה שלעתים מסבך את הפרשנות של מבחנים במורד הזרם. עם זאת, מבנה מתוקן עם NES התמזג למסוף C של TurboID (V5-TurboID-NES) הראה ביטוי חזק יותר באופן משמעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לחברי המעבדה על הדיונים והעזרה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הלאומית (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (RS-2024-00345327 ל-M.L.; RS-2023-00219563 ל-M.L.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן משני <חזק>נוגדנים
עז נגד עכברים IgG (H+L), HRPInvitrogen31430בדרגה אנליטית,
נוגדן משני IgG (H+L) רגיש לאור נגד ארנב עזים (H+L) בעל ספיחה צולבת גבוהה, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731כיתה אנליטית,
נוגדן משני IgG (H+L) רגיש לאור נגד ארנב עזיםHRPInvitrogen31460דרגה אנליטית,
נוגדן HSP90 רגיש לאור (ארנב)טכנולוגיית איתות תאים4874נוגדן פוליקלונלי
חלבון פירס סטרפטווידין, HRPThermo Fisher Scientific21126סטרפטווידין בדרגה אנליטית
, Alexa Fluor 594 מצומדInvitrogenS11227רגיש לאור, דרגה
אנליטיתנוגדן V5 תג (עכבר)InvitrogenR960-25נוגדן חד-שבטי
V5-tag (ארנב) (D3H8Q)טכנולוגיית איתות תאים13202נוגדן חד-שבטי
<חזק>קווי זבוב<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות/תיאור
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3קוריאה מרכז מניות דרוזופילה2373-2סטוק זבוב
pUASp קישואים V5-TurboID/Cyoקוריאה מרכז מניות דרוזופילה2188סטוק זבוב
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyoקוריאה מרכז מניות דרוזופילה2635-4מלאי זבוב
עם [*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Fly stock
Equipments and ConsummablesCompanyCatalog NumberComments/Description
Analytical BalanceMettler ToledoME2040.1 מ"ג קריאות
אמרשם פרוטראן 0.45 NC ניטרוצלולוז ממברנות ספיגה מערביות (300 מ"מ ופעמים; 4 מ')Cytiva
10600002-Axygen 1.7 מ"ל MaxyClear Snaplock צינור מיקרוצנטריפוגהקורנינגMCT-175-Cקו-פולימר
מותג  כיסוי זכוכית (22 מ"מ x 22 מ"מ)סיגמא-אולדריץ'BR470055זכוכית בורוסיליקט
קצות פיפטה בתפזורת (10 ומיקרו; L)Vertex4110N00קצות
פיפטה בתפזורת פרופילן (1000 ומיקרו; L)Vertex4330N00קצות
פיפטה בתפזורת פרופילן (200 ומיקרו; L)Vertex4230N00
צלחת תרבית תאי פרופילן (96 בארות)SPL300096פוליסטירן, צנטריפוגה מסוג תחתית שטוחה
(עם רוטור בגודל צינור של 1.5-2 מ"ל)Eppendorf5424 Rמקוררת בזווית קבועה
(עם רוטור בגודל צינור של 5 מ"ל)Eppendorf5425 Rכף כימית בזווית קבועה, בקירור
--
מערכת הדמיה ChemiDocמערכת הדמיהBiorad12003153
< COsub>2 משטח זבוב-לוח הרדמה
CO2 מיכל ווסת-זהירות מפני גז בלחץ גבוה וסחרחורת
חממה קומפקטיתJSRJSGI-10Tזהירות גבוהה טמפרטורה
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZeissLSM 710זהירות של קרן לייזר אינטנסיבית
צינור חרוטי (15 מ"ל)SPL50015פוליפרופילן / פוליאתילן בצפיפות גבוהה 
צינור חרוטי (50 מ"ל)SPL50050פוליפרופילן / פוליאתילן בצפיפות גבוהה 
איזון דיגיטלי---
טיימר דיגיטלי---
צלחת דיסקציה--Silicon
Dumont #5SF מלקחיים Fine Science Tools11252-00טיפים סופר עדינים, זהירות של חפץ חד
מגנט DynaMag-2Invitrogen12321Dעבור צינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5-2 מ"ל
Fisherbrand  שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus (25 מ"מ x 75 מ"מ)Fisher Scientific12-550-15זהירות מחפץ חד
בקבוקי מזון זבובים (עם תקע נייר)Hansol TechFFB-21010-בקבוקוני
מזון זבובים (עם כובע כותנה)Hansol TechFFV-11010-ממוקד-אולטרה-סאונד
CovarisM220זהירות של גל קולי
סכין ג'לInvitrogenEI9010נירוסטה עם ידית פלסטיק
כיתה 3 מ"מ נייר ספיגה Chr (46 ס"מ ופעמים; 57 ס"מ)Cytiva3030-917נייר Whatmann
הומוגנייזר כף יד ועלי פלסטיקKimble749540-0000מנוע אלחוטי
בלוק חוםעדין PCRALB6400זהירות של
רקמות נטולות מוךYuhan-Kimberly41112-
חנקן נוזלי-זהירות מפני כוויות קור וכוויות
ספקטרופוטומטר מיקרופלייטטכנולוגיות Agilentאופטיקה מבוססת מונוכרומטור
מיקרוגל-זהירות של טמפרטורה גבוהה
milliTUBE 1 מ"ל סיב AFACovarisPN 520135זכוכית
מיני מיכל ג'לתרמו פישר מדעיA25977זהירות לגבי
ג'ל חלבון מיני NuPAGE Bis-tris בטמפרטורה גבוהה, 4– 12%, 1.0– 1.5 מ"מ, 10 בארותInvitrogenNP0323BOXמכילים פוליאקרילאמיד, זהירות מפני רעילות
NuPAGE Bis-tris מיני ג'ל חלבון, 4– 12%, 1.0– 1.5 מ"מ, 15 בארותInvitrogenNP0321BOXמכילים פוליאקרילאמיד, זהירות מרעילות
מברשת צבע (Ø 1.8 מ"מ) מברשת צבע791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006Mמיקרופיפטה חד ערוצית עם מפלט מתכת
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005Mמיקרופיפטה חד ערוצית עם מפלט מתכת
Pipetman L ( P20L)גילסוןFA10003Mמיקרופיפטה חד ערוצית עם מפלט מתכת
Pipetman L (P2L)גילסוןFA10001Mמיקרופיפטה חד ערוצית עם מפלט מתכת
ספק כוחמדע עיקריMP-310זהירות של חשמל במתח גבוה
מסובב לתכנותBiosanRS-24-Protein
LoBind  צינורותEppendorf
30108302-סכין גילוחDorco304020נירוסטה, זהירות מחפץ חד
רולר---
פיפטה סרולוגית (10 מ"ל)SPL91010פיפטה סרולוגית מפוליסטירן
(25 מ"ל)SPL91025פיפטה סרולוגית מפוליסטירן
(5 מ"ל)SPL91005פיפטה סרולוגית מפוליסטירן
(50 מ"ל)SPL91050פוליסטירן
כובע הצמד צינורות מיקרוצנטריפוגה עם שמירה נמוכה (1.5 מ"ל)Thermo Scientific3451PK
כרית ספוגInvitrogenEI9052-מיקרוסקופ
סטריאוZeissStemi 508-מיקרוסקופ
סטריאו לייקה
תרמו-מיקסר   CEppendorf5382000015עם בלוקים בגודל 1.5 ו-5 מ"ל
פינצטהAven Tools18526פלסטיק, קצות שטוחים
מערבל מערבולתIndustriesSI-0236-XCell
II מודול כתםInvitrogenEI9051זהירות בטמפרטורה גבוהה
XCell  SureLock mini-cellInvitrogenEI0001זהירות מפני טמפרטורה גבוהה
<חזק>כימיקלים<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות/תיאור
אצטוןסיגמא-אולדריץ'650501 בדרגה אנליטית
אצטוניטרילסופלקו1.00029.1000דרגת LC-MS, זהירות מפני רעילות אינהלציה
ואמפולות סטנדרטיות של אלבומין דליקות (המכילות אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-2 מ"ג/מ"ל ב-0.9% מי מלח ו-0.05% נתרן אזיד)Thermo Scientific23209חלק מערכות בדיקת חלבון BCA של פירס (Thermo Scientific, 23225)
אלבומין, סרום בקרBioshopALB001דרגה אנליטית
אמוניום ביקרבונטSigma-Aldrich09830ביוטין בדרגה אנליטית
 Sigma-AldrichB4639סידן כלורי בדרגת תרבית תאים ורקמות
(CaCl2)Sigma-AldrichC5670בדרגת תרבית תאים
בהירות מצע ECL מערביBiorad1705060דרגה אנליטית
DAPISigma-AldrichMBD0015רגיש לאור, בדרגה אנליטית
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861בדרגה אנליטית
קורנינג35-015-CVדרגת תרבית תאים
חומצה פורמיתSigma-AldrichF0507דרגת ריאגנט, זהירות מפני רעילות שאיפה
מדיום החרקים של גרייסGibco11595030כיתה תרבית תאים שמרים
יבשים מיידייםללא מותגN1019-
יודואצטמידסיגמא-אולדריץ'I1149רגיש לאור,
מתנולקרלו ארבה41484לק בדרגה אנליטית
-מאגר
דגימה מסוג נובקס טריס-גליצין SDS מסוג שקוף (2X)InvitrogenLC2676בדרגה אנליטית
(20X)InvitrogenNP0001כיתה אנליטית
PageRuler סולם חלבון צבוע מראשThermo Fisher Scientific26616כיתה אנליטית
Phenylmethanesulfonyl fluoride Thermo Fisher Scientific36978מאגר פוספט בדרגה אנליטית
Sigma-AldrichP4417דרגה אנליטית
פירס 16% פורמלדהיד (w/v)Thermo Fisher Scientific28908כיתה אנליטית,
ערכות בדיקת חלבון Pierce BCA רגישות לאורThermo Scientific23225כיתה
אנליטיתמגיב BCA פירס A (מכיל נתרן פחמתי, סודיום ביקרבונט, חומצה ביצינצ'ונינית ונתרן טרטרט ב-0.1 M נתרן הידרוקסיד)Thermo Scientific23228חלק מערכות בדיקת חלבון BCA של פירס (Thermo Scientific, 23225)
מגיב BCA פירס B (מכיל 4% סולפט קופריThermo Scientific1859078חלק מערכות בדיקת חלבון BCA של פירס (Thermo Scientific, 23225)
חומצה פרופיוניתסיגמא-אולדריץ'סטמעכב פרוטאז בדרגת 402907 ACS
Calbiochem539134תרבית תאים ורקמות בדרגת
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936כלורי רגיש לאור
(NaCl)BioneerC-9025בדרגה אנליטית
Sigma-AldrichD6750כיתה אנליטית
נתרן דודציל סולפטSigma-Aldrich71736
נתרן הידרוקסיד (NaOH)BiosesangSR2018-100-00בדרגה אנליטית
-Ultrapure (סוג 1)
Tris-buffered מלחSigma-Aldrich94158בדרגה אנליטית
Koma BiotechK0341001ציון אנליטי
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006כיתה אנליטית
Triton x-100Sigma-Aldrich93443כיתה מולקולרית
TrypsinThermo Fisher Scientific20233כיתה תרבית תאים
Tween 20Sigma-AldrichP9416דרגה מולקולרית
אוריאהSigma-AldrichU5378מולקולרי & דרגת תרבית תאים
צנטריפוגה מנירוסטה Western blot בטמפרטורה גבוהה פוליפרופילן Scientific סרום בקר עוברי מאגר ריצה NuPAGE MOPS SDS ) קוקטייל III נתרן נתרן דאוקסיכולט בדרגה מולקולרית מים מזוקקים משולשים מאגר העברת טריס-גליצין

מקורות

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TurboID
ב Vivo יישום של תיוג קירבה מבוסס TurboID ב-Drosophila melanogaster
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.