ניתוח רב-מודאלי של מיקרופלסטיק במי שתייה באמצעות צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המציג מצע שקוף ושטוח אופטית ללכידה וניתוח יעילים של חלקיקים מזהמים במי השתייה. מוצג כאן צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון (SNAP): צינור גמיש ללכידה, כימות וזיהוי של חלקיקים במדיה נוזלית.

Abstract

ההשפעה הביולוגית של זיהום מיקרופלסטיק במקורות מזון ומים אנושיים אינה ידועה ברובה, ומקורות מי שתייה אינם פטורים מזיהום מיקרופלסטיק זה. כאן, אנו מדגימים גישה יעילה ללכידה, כימות וזיהוי מיקרופלסטיק במי שתייה. אנו מציגים זרימת עבודה אנליטית הנקראת Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) המנצלת ננו-ממברנות סיליקון ניטריד חדשות המאפשרות "גורם ריכוז" משמעותי, המאחד חלקיקים מרחפים לאזור תצפית מישורי לניתוח חלקיקים אינדיבידואליים, ניתנים לכימות ורב-מודאליים על אותו מצע. היתרונות העיקריים של SNAP נובעים מהשימוש בממברנות אולטרה-דקות מבוססות סיליקון ניטריד השוכנות בדיסקי סינון בגודל קונבנציונלי, המאפשרים לכידה וניתוח ישירים של MPS פולימריים על רקע לא פולימרי. דגימות מי שתייה שמקורן באזור רוצ'סטר, ניו יורק, נאספו ממקורות ברז למגורים ונותחו באמצעות SNAP. החלקיקים בכל דגימה אופיינו במיקרוסקופ אלקטרונים אופטי וסורק (SEM), ספקטרוסקופיה ראמאן וספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרות אנרגיה (EDX), ומרכיבים שונים שזוהו כומתו ביחס לסך החלקיקים שנלכדו.

Introduction

מיקרופלסטיק מוגדר כפולימרים סינתטיים בגודל קטן מחמישה מילימטרים בגודל ^1,2. זיהום מיקרופלסטיק (MP) הוא דאגה הולכת וגוברת לבריאות האדם, סביבה ואקולוגית. זיהום MP נמצא במקורות מים מכל הסוגים; מים מתוקים, אוקיינוסים ואפילו מקורות מי שתייה³. חברי פרלמנט נוצרים מפירוק מקורות פלסטיק ראשוניים⁴, כמו גם טקסטיל סינטטי ^5,6,7. חברי פרלמנט נמצאים בכל מקום ונמצאו ברקמות אנושיות, כגון שליה, צואה ודם ^8,9,10. יש עניין גובר במחקר MP, כפי שמעידים יותר מ-4,100 ו-4,600 פרסומים בשנים 2023 ו-2024, בהתאמה (נתוני PubMed; מילת המפתח "microplastics"), כמו גם דאגה ציבורית גוברת לגבי חשיפה אנושית לחברי פרלמנט. בתגובה לדאגה ציבורית גוברת, מספר גופי רגולציה ממשלתיים כמו מדינת קליפורניה¹¹ וכמה מדינות באיחוד האירופי¹²יישמו (או יהיו) תקנות על רמות MP במי שתייה., בהתחשב בכל האמור לעיל, הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב הכריזה לאחרונה על חברי פרלמנט כמזהם חדש לדאגה. עם זאת, הערכת סיכונים אנושיים נפגעת קשות על ידי היעדר שיטות לזיהוי אמין וניתן לשחזור של חברי פרלמנט.

אפיון חברי הפרלמנט מסתמך על שיטות אנליטיות כגון מיקרוסקופיה אופטית ואלקטרונים¹³, וטכניקות ספקטרוסקופיות וספקטרומטריות ^1,14,15 כדי להבין את המאפיינים החזותיים של חברי פרלמנט⁷ והרכבם, בהתאמה. דגימות המכילות MPS צריכות לכלול ניתוחים מרובים כדי לאפיין, לזהות ולכמת MPS, ולפחות לדרוש ספקטרוסקופיה/ספקטרומטריה (כלומר, ספקטרוסקופיה של ראמאן, ספקטרוסקופיה אינפרא אדום, או כרומטוגרפיה של גז פירוליזה-ספקטרומטריית מסה וכו') לפי כמה כתבי עת דרישות מינימליות למדידת פלסטיק בדגימות סביבתיות, כגון מדע הסביבה הכוללת¹⁶. ספקטרוסקופיה של ראמאן היא תכליתית יותר מספקטרוסקופיה אינפרא אדום (IR), במיוחד בכל הנוגע לזיהוי חומרים בדגימות ביולוגיות. ספקטרוסקופיה של ראמאן היא טכניקת פיזור אור, המאפשרת לה לנתח חלקיקים קטנים יותר ביתר קלות מאשר IR, טכניקת ספיגת אור המחייבת חלקיקים גדולים יותר ויש לה יותר אילוצים על מיקום הדגימה¹⁷. בעבר הוצע כי מצעים לספקטרוסקופיה של ראמאן הכוללים סיליקון או תחמוצת סיליקון יכולים להניב תוצאות אמינות עם רעשי רקע מינימליים¹⁸.

מצעים לטכניקות אנליטיות מסוימות התואמות בדרך כלל לסוג אחד של ניתוח (כלומר, מצעים מצופים זהב הנדרשים לספקטרוסקופיה IR) אינם תואמים לרוב למיקרוסקופ אור שידור ו/או החזרה. לאחר מכן, תת-דגימה משוכפלת פופולרית בקרב חוקרים כדי לייצר דגימות המתאימות לכל ניתוח נפרד, אך תת-דגימה גוזלת זמן ויכולה להוציא חלקיקים בשפע נמוך ^1,2,6. בדרך כלל, העברות ידניות של חלקיקים ממצע אחד למשנהו נחוצות כדי לנתח את אותו חלקיק לאפיון וזיהוי על ידי שיטות אנליטיות שונות, אך העברות איטיות וידניות אלה מגבירות את הסבירות להטיה, זיהום ואובדן, כמו גם מגבילות את הניתוח של MPS רק לחלקיקים בגודל הגדול ביותר שניתן לתפעל ידנית¹³. זרימות עבודה לא אופטימליות אלה מציגות אתגרים רבים ובעיות אמינות, התורמות לשונות המשמעותית בכימות MP המדווח בספרות ^3,7.

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה אנליטית שאנו מכנים צינור ניתוח ננו-ממברנות סיליקון (SNAP) כדי ללכוד, לאפיין, לזהות ולכמת חברי פרלמנט, ולהדגים את התועלת של SNAP על ידי ניתוח דגימות מי שתייה שמקורן באזור רוצ'סטר, ניו יורק. SNAP מופעל על ידי דיסקי סינון בקוטר 25 מ"מ בגודל קונבנציונלי עם ננו-ממברנות סיליקון משולבות (ראה טבלה משלימה S1 לתכונות הממברנה), המציעות מצע אחיד לריכוז וניתוח MPS ממי שתייה באמצעות טכניקות מרובות^15,19. לאחר ריכוז ולכידת MPS ברצף על ננו-ממברנות עם גדלי חיתוך הולכים ופוחתים (20 מיקרומטר מיקרו-נקבובי סיליקון ניטריד (MPSN) עם נקבוביות גליליות ו-8.0 מיקרומטר מיקרו-חריץ סיליקון ניטריד (MSSN) עם נקבוביות פריזמה מלבניות), SNAP מאפשר שלושה שלבים אנליטיים רצופים: 1) צביעת דגימה, מיקרוסקופיה אופטית וכימות MP, 2) זיהוי חלקיקים באמצעות ספקטרוסקופיה של ראמאן, ואחריו 3) אפיון חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), מאפשר ניתוחים מרובים של אותם חלקיקים שנלכדו על מצע ננו-ממברנה אחד.

אנו מדגימים צינורות SNAP מרובים על ידי שימוש הן בדיסקי מסנן ננו-ממברנה סיליקון (SiN) לא מצופים והן בדיסקי סינון ננו-ממברנה סיליקון מצופים זהב (Au-SiN): צינור A) SNAP המבוצע על SiN ואפיון רציף של אותם MPS באמצעות טכניקות אנליטיות מרובות; צינור B) SNAP בוצע על Au-SiN עם ספקטרוסקופיה של ראמאן; ו-Pipeline C) SNAP בוצע על Au-SiN עם SEM המצויד בספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרות אנרגיה (EDX) (איור 1). וריאציות SNAP הן אפוא זרימות עבודה אנליטיות גמישות ויעילות שניתן להשתמש בהן עבור מספר סוגי דוגמאות וטכניקות אנליטיות. בניגוד לשיטות שפורסמו בעבר המסתמכות על ממברנות פולימריות¹¹, היתרונות של SNAP נובעים מהשימוש שלה בננו-ממברנות סיליקון, שבהן MPS פולימרים סינתטיים נלכדים על קרום לא פולימרי מבוסס סיליקון, מה שמאפשר זיהוי קומפוזיציה של MPS על רקע לא פולימרי. יתר על כן, ננו-ממברנות סיליקון מציעות מישורי מוקד אחידים בניגוד לממברנות פולימריות, הנוטות להתקמט, מה שמאפשר טכניקות מיקרוסקופיה וספקטרוסקופיה אוטומטיות מרובות.

אפיינו בעבר את השימוש בננו-ממברנות סיליקון לניתוחי MP על ידי מודלים אנליטיים, אתגרי חלקיקי מודל, ודגימות מי שתייה ואוויר^19,20, כמו גם על ידי השוואת תכונות הסינון והמיקרוסקופיה האופטית שלהם באמצעות חלקיקי מודל מול ארבע ממברנות בשימוש נרחב¹⁵. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים באופן היוריסטי את התועלת של SNAP לניתוח חברי פרלמנט בארבע דגימות מי שתייה. דגימות נאספו מארבעה מקורות מים נפרדים סביב אזור רוצ'סטר רבתי, ניו יורק. כל דגימה שנכללה במחקר הזה מקורה במקור מים עילי מובחן, כמו למשל אגם אונטריו, אגם הרוש, תערובת של הרוש ואונטריו, ואגם קנאנדאיגואה (איור 2). חלקיקים שנלכדו ממקורות מי השתייה הללו כללו פלסטיק נרחב כמו פוליסטירן (PS) ופוליאתילן (PE), מתכות כבדות כמו ברזל, סיליקה וחלקיקים לא סינתטיים.

Protocol

1. נהלי בקרת איכותוהכנת תמיסה Ultrapure 

1. ניקוי קולט אדים וכפפות זרימה למינרית
   1. Don PPE (ציוד מגן אישי): מעיל מעבדה 100% כותנה וכפפות ניטריל.
      הערה: PPE רציף לאורך כל הפרוטוקול.
   2. ריסוס כפפות ניטריל עם 99% אלכוהול איזופרופיל (IPA). יש לשפשף את הידיים זו בזו, ולאחר מכן לשטוף במים מסוננים של ~18 MΩ, 0.22 מיקרומטר. עשה זאת פי 3 כדי להסיר את חומר השחרור מהכפפות.
   3. קפלו מגבון משימה עדין מסיבים טבעיים לרבעים, ולאחר מכן רססו עם 70% IPA. נגבו את משטח מכסה המנוע מאחור לפנים במשיכות ארוכות, וקפלו מחדש את מגבון המשימות העדין למשטח שאינו בשימוש כל שתי משיכות. המשך לנקות את מכסה המנוע עד לניקוי כל המשטחים, והחלף את המגבון בחדש לאחר שהוא התלכלך.
   4. חשפו את שטיח הסיליקון וגלגלו על פני מכסה המנוע כדי לאסוף את כל החלקיקים שנותרו. כדי לנקות את גליל הסיליקון, יש לרסס עם 99% IPA ולשפשף ביד עטויה כפפה, ולאחר מכן לשטוף במים מסוננים של 18 MΩ, 0.22 מיקרומטר. חזור על הפעולה 3x, ולאחר מכן הניח לייבוש באוויר במכסה המנוע.
   5. שטפו מחדש כפפות כמו בשלב 1.1.2.
2. מים טהורים במיוחד וייצור IPA.
   1. מלאו בנפח 1 ליטר במים של 18 MΩ והניחו אותה במכסה המנוע.
   2. יש להניח מזרק של 60 מ"ל ומסנן מזרק מנותק של 0.22 מיקרומטר על ידי סינון של לפחות 200 מ"ל של 18 MΩ מים דרך המזרק והמסנן המצורף.
      הערה: משאבת מזרק תחסוך זמן אך אינה דרישה לביצוע הפרוטוקול המתואר.
   3. שטפו מיכל זכוכית עם מכסה הברגה 3x במים מסוננים של 18 MΩ, 0.22 מיקרומטר. מלאו במים מסוננים של 0.22 מיקרומטר מסוננים במזרק 18 MΩ.
   4. חזור על שלבים 1.2.1-1.2.3 עם ריכוז האחוז הרצוי של IPA במקום 18 MΩ, מים מסוננים של 0.22 מיקרומטר כדי ליצור IPA טהור במיוחד.

2. לכידת חלקיקים מדגימות נוזל באמצעות סינון

הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול שלהלן עם דגימות נוזליות שאינן מים. יש להשאיר את שיטות איסוף הדגימה המאומתות לשיקול דעתו של החוקר בהתבסס על צרכי המחקר שלו ושל המדגם.

1. דון PPE.
   הערה: ודא שהכפפות ומשטחי מכסה המנוע מנוקים בהתאם לשלבים 1.1.2-1.1.5.
2. רססו אטם סיליקון עם Ultrapure 99% IPA, שפשפו באצבעות עטויות כפפות ולאחר מכן שטפו במים Ultrapure חזור על פעולה זו 3x עבור כל אטם.
   הערה: מספר האטמים שישמשו בסינון שווה למספר דיסקי המסנן שיש להשתמש בהם, בתוספת 1. עיין באיור 1B לגרפיקת ההרכבה החזותית.
3. תוך שימוש במזרק המוכן בשלב 1.1.2, שטפו את החלק הפנימי של מזרק 60 מ"ל עם המים האולטרה-טהורים על ידי הוצאת 30 מ"ל מים טהורים ו-30 מ"ל אוויר לתוך המזרק. הברג פילטר מזרק, ואז נער במרץ והוציאו. חזור על זה 3x.
   הערה: ניתן להשתמש במזרק בכל גודל לפי הצורך על סמך נפח הדגימה.
4. הרכיבו את מכשיר הסינון כפי שמוצג בגרפיקת ההרכבה החזותית באיור 1B.
   הערה: השתמש בפינצטה נקייה כדי לטפל בדיסקי מסנן ואטמים במהלך ההרכבה והפירוק.
   1. עבור סינון עוקב, ודא שיש אטם בין הדיסק לפריט התמיכה, אטם בין כל דיסק ואטם בין הדיסק למשפך הסינון.
   2. ודא שהדיסקים מסודרים עם מסנן החיתוך הגדול ביותר בחלק העליון של הערימה ומסנן החיתוך הקטן ביותר בתחתית.
5. הפעל את הוואקום למנגנון כך שתהיה זרימה שלילית דרך ערימת דיסק המסנן.
6. מדידת זיהום רקע
   הערה: התהליך הבא מאפשר הערכה של ניקוי המזרק ויצירת המדיה Ultrapure, וקביעת חלקיקי הרקע שנתרמו על ידי רכיבי המערכת.
   1. עם המזרק השטוף, הוציאו 50 מ"ל מים טהורים לאט על הננו-ממברנה במרכז הדיסק העליון כדי להבטיח שכל הנוזל המוזרם מסונן.
      הערה: אם מסננים נפחי דגימה גדולים יותר (כלומר, >50 מ"ל), מוצע משפך סינון זכוכית. נקה את משפך סינון הזכוכית כמו בשלב 2.3. תוכנות מעבדה נוספות עלולות להיות כרוכות בסיכון נוסף לזיהום חלקיקים. שמור על חריצות עם נהלי ניקוי ואשר תמיד ניקיון עם סינון ריק לפני השימוש בדוגמאות המעניינות.
   2. אפשר למים האולטרה-טהורים לסנן. השאר את הוואקום דולק למשך דקה נוספת לאחר הסינון. לאחר שהדגימה יבשה לחלוטין, כבה את הוואקום.
   3. הסר בזהירות את דיסקי המסנן מהאטמים באמצעות פינצטה נקייה והנח דיסקים במיכל הנקי והמסומן המתאים לאחסון, כגון צלחת פטרי מזכוכית או קופסה כהה.
   4. דמיין את דיסקי המסנן במיקרוסקופיה לניתוח אופטי, ספירת חלקיקים וכו'.
7. עבור דגימות נוזלים, נקה אטם נוסף כמו בשלב 2.2. השג מזרק חדש עבור כל דגימת מדיה נוזלית ייחודית וחזור על שלב 2.3.
8. ספוג את כמות הדגימה הרצויה והוציא את הדגימה לאט על הננו-ממברנה במרכז הדיסק העליון.
9. לאחר השלמת סינון הדגימה, בצע שטיפות 3x עם 1 מ"ל מים טהורים במיוחד כדי להבטיח שכל החלקיקים בדגימה נשטפו מספיק מכל המשטחים על הממברנה במרכז דיסק המסנן.
10. השאר את הוואקום דולק למשך דקה נוספת כדי לייבש לחלוטין את הדגימה שנשטפה פי 3, ולאחר מכן כבה את הוואקום.
    1. חזור על שלבים 2.7-2.10. עבור כל שכפול שיבוצע של המדגם המעניין.

3. הכנת צבע פלורסנט וצביעה

הערה: צביעה פלואורסצנטית עם אדום נילוס ו/או כחול טריפאן עלולה להפריע ללייזרים ספקטרוסקופיים של ראמאן מעניינים.

1. מכתים באדום נילוס (NR)
   1. דון PPE.
   2. נקה כפפות ומכסה המנוע כמו בשלבים 1.1.2-1.1.5.
   3. השלם את סינון הדגימה כמתואר בשלבים 2.7-2.10.
   4. שטפו שני מיכלי פקק בורג מזכוכית במים Ultrapure 3x.
   5. הכן תמיסה של 0.1 מ"ג/מ"ל של NR ב-Ultrapure 99% IPA במיכל זכוכית נקי.
   6. יש להפוך בעדינות פי 10 לערבוב.
   7. סנן את תמיסת ה-NR עם מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לתוך מיכל מכסה בורג הזכוכית השני.
      הערה: המסנן המשמש לסינון מראש של ה-NR צריך להיות בעל חתך קטן יותר מהמסנן המשמש לסינון הדגימות.
   8. הנח את דיסק המסנן שיוכתם על פריט התמיכה של בקבוק איסוף הוואקום.
   9. פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת 0.1 מ"ג/מ"ל NR על הננו-ממברנה במרכז דיסק המסנן.
      הערה: הכתם צריך לכסות במלואו את המשטח הנקבובי של הננו-ממברנה. אם 20 מיקרוליטר אינם מספיקים, הוסף כתם נוסף עד שכל האזורים הנקבוביים של הננו-ממברנה מכוסים כראוי בכתם.
   10. דגרו את הכתם למשך 5 דקות.
   11. סנן את הכתם בוואקום לאחר השלמת הדגירה.
   12. שטפו 3x עם 1 מ"ל של Ultrapure 99% IPA כדי להסיר עודפי כתם NR.
       הערה: המשך לסעיף הצביעה של Trypan Blue למטה לאחר שלב זה אם יש לבצע צביעה נגדית.
   13. אפשר לדיסק המסנן לשבת על פריט התמיכה כשהוואקום פועל למשך 2 דקות כדי לסנן ולייבש כל נוזל שנותר. אם לא יבש לאחר 2 דקות, העבירו את דיסק המסנן באמצעות צלחת פטרי זכוכית נקייה לתנור של 70 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
   14. לאחר הייבוש, בצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כמתואר בשלב 2.6.4 והמשך לסעיף 4.
2. צביעה בכחול טריפן (TB)
   1. דון PPE.
   2. נקה כפפות ומכסה מנוע כמתואר בשלבים 1.1.2-1.1.5.
   3. השלם את סינון הדגימה משלבים 2.7-2.10 או התחל בשלב 3.2.4.
   4. שטפו שני מיכלי פקק בורג מזכוכית במים Ultrapure 3x.
   5. הכן כתם שחפת של 0.4% במיכל אחד.
      הערה: המסנן המשמש לסינון מקדים של השחפת צריך להיות בעל חתך קטן יותר מהמסנן המשמש לסינון הדגימות.
   6. יש להפוך בעדינות פי 10 לערבוב.
   7. סנן את תמיסת כתמי השחפת עם מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לתוך מיכל מכסה בורג הזכוכית השני.
      הערה: המסנן המשמש לסינון מקדים של השחפת צריך להיות בעל חתך קטן יותר מהמסנן המשמש לסינון הדגימות.
   8. הנח את דיסק המסנן שיוכתם על פריט התמיכה של בקבוק איסוף הוואקום.
   9. פיפטה 20 מיקרוליטר של כתם ה-0.4% TB על הננו-ממברנה במרכז דיסק המסנן.
      הערה: הכתם צריך לכסות במלואו את המשטח הנקבובי של הננו-ממברנה. אם 20 מיקרוליטר אינם מספיקים, הוסף כתם נוסף טיפה עד שכל האזורים הנקבוביים של הננו-ממברנה מכוסים כראוי בכתם.
   10. דגרו את הכתם למשך 5 דקות.
   11. מסנן את הכתם בוואקום לאחר הדגירה למשך 5 דקות.
   12. יש לשטוף בנפחים של 1 מ"ל מים טהורים במיוחד פי 3.
   13. אפשר לדיסק המסנן לשבת על פריט התמיכה כשהוואקום פועל למשך 2 דקות כדי לסנן ולייבש כל נוזל שנותר. אם לא יבש לאחר 2 דקות, העבירו את דיסק המסנן באמצעות צלחת פטרי זכוכית נקייה לתנור של 70 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
   14. לאחר הייבוש, בצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כמתואר בשלב 2.6.4 והמשך לסעיף 4.

4. כימות חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. לכידת תמונות מיקרוסקופיה אופטית
   1. שביתו את דיסק המסנן על שקופית מיקרוסקופ באמצעות אטם סיליקון, או השתמשו בשקופית יישור ספציפית לשימוש בדיסק סינון עם מיקרוסקופ stage. העבר את דיסק המסנן להדמיה למיקרוסקופ stage.
   2. צלם את הננו-ממברנה באמצעות תאורת שדה בהיר כך שהספירה המקסימלית שזוהתה היא ~ 90% מהטווח המרבי של מצלמת הגלאי.
      הערה: ערך 90% זה הוא ~59,000 עבור גלאי 16 סיביות עם רמות לבן ב-65,535.
   3. צלם את הננו-ממברנה באמצעות תאורה פלואורסצנטית כך שעוצמות הפיקסלים המקסימליות יהיו בסביבות ~25% מהטווח המרבי של מצלמת הגלאי.
   4. שמרו את התמונה בתבנית TIFF מורכבת של 16 סיביות.
2. כימות חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
   1. באמצעות פלטפורמת ניתוח התמונה, הפרד את הערוצים הפלואורסצנטיים של ה-TIFF המרוכב שנוצר ב-4.1.4 מערוץ השדה הבהיר באמצעות פונקציית הערוצים המפוצלים .
   2. סף את עוצמות הפיקסלים באמצעות הפונקציה Threshold לערך של 10,000.
      הערה: אם קיימת פריחה על החלקיקים, הסף נמוך מדי ויש להעלותו.
   3. שמרו תמונה נפרדת בתבנית PNG.
   4. הסירו את הכתמים בתמונה כדי להסיר פיקסלים של רעש באמצעות הפונקציה Despeckle .
   5. פרשת המים של התמונה באמצעות פונקציית פרשת המים .
      הערה: פונקציה זו מפרידה חלקיקים סמוכים בגודל דומה, במחיר של פירוק חלקיקים רציפים גדולים לחתיכות קטנות יותר. מכיוון שלעתים קרובות יש הרבה יותר חלקיקים קטנים מאשר חלקיקים גדולים, זה יכול להיות פשרה טובה אך יכולות להיות לו השפעות לא מכוונות, כגון פירוק סיבים ארוכים לגדילים של חלקיקים קטנים. בדוק את תוצאות התמונה לפני קבלת נתונים.
   6. הגדר את קנה המידה של תמונות הפלואורסצנט הספות על ידי מדידת רוחב הנקבובית בתמונת השדה הבהיר. השתמשו ברוחב הנקבוביות הנמדד כדי להגדיר את קנה המידה בפיקסלים/מיקרומטר.
      הערה: עבור נקבוביות מלבניות, הרוחב הקטן ביותר יתאים לתווית המוצר. עבור נקבוביות עגולות, הקוטר יתאים לתווית המוצר המציינת את גודל הנקבוביות (כלומר, חתך) של הננו-ממברנה.
   7. החל את פונקציית ספירת החלקיקים של פלטפורמת ניתוח התמונה על התמונה הפלואורסצנטית הספואית, והעריך את השטח, המינימום והמקסימום.
   8. עבד את תמונות הפלואורסצנט והשדה הבהיר כדי ליצור חומרים מרוכבים המדמים את התחומים הפלואורסצנטיים.
   9. סף את התמונה הפלואורסצנטית באמצעות אותו ערך כמו בשלב 4.2.2.
   10. מיזוג ערוצים באמצעות פלטפורמת ניתוח התמונות. הקצו את הערוץ הפלואורסצנטי לערוץ ' אדום ' ואת תמונת השדה הבהיר לערוץ 'אפור '.
   11. שמור את הקומפוזיציה כקובץ PNG.

5. ספקטרוסקופיה של ראמאן

1. הפעל את מכשיר ה-Raman ואת המחשב המשויך אליו, ואפשר לכל אחד מהם להתחיל.
2. פתח את התוכנה במחשב המחובר למכשיר ה-Raman.
3. כאשר התוכנה מאותחלת, ודא שמצב פעילות המערכת והגלאי הנוכחי בסרט התחתון של מסך התוכנית קוראים מוכן והם בצבע ירוק, בהתאמה.
4. אם לחצן הכיול האוטומטי (AC) בתחתית המסך אדום, הפעל את הכיול האוטומטי הרצוי ואפשר לו להסתיים לפני שתמשיך.
5. אם משתמשים רק בלייזר אחד וסורג אחד:
   1. לחץ על יציאה במסך הכיול האוטומטי, ולאחר מכן בחר את הלייזר והסורג הרצויים מהרשימות הנפתחות המתאימות להם תחת הגדרת מכשיר בכרטיסייה רכישה .
   2. חזור ללחצן ה-AC האדום בתחתית המסך ולחץ על לייזר/סורג נוכחי ואפשר לשגרת הכיול לפעול.
6. אם אתה משתמש בכל הלייזרים והסורגים, פשוט בחר את כל הלייזרים והסורגים ואפשר למערכת לפעול.
7. אם אתה משתמש ביותר מלייזר ו/או סורג אחד, בחר בלייזר/סורגים מותאמים אישית ובחר את כל ההגדרות הרצויות. לאחר מכן, אפשר לכיול לפעול.
8. בחר את המטרה למרחק עבודה ארוך פי 20 (LWD) בצריח המכשירים, ובתוך התוכנה תחת הגדרות מכשיר בכרטיסייה רכישה .
9. אם מטרה זו אינה זמינה, השתמש במטרה חלופית בהגדלה נמוכה (למשל, 5x או 10x) עם מרחק עבודה המתאים לגובה דיסק המסנן.
   הערה: התחל עם מטרת הגדלה נמוכה יותר כדי להקל על הניווט הראשוני על פני הננו-ממברנה של דיסק המסנן.
10. הנח את דיסק המסנן על המיקרוסקופtagה כך שהוא נמצא בנתיב האופטי.
11. לחץ על Video Acquisition ברצועת הכלים העליונה כדי להפעיל את האופטיקה של התצוגה החזותית.
12. השתמש בגלגלי המיקוד הגסים והעדינים במכשיר כדי להביא את הננו-ממברנה של דיסק המסנן למיקוד.
13. ריבוע גס את הנקבוביות עם קווי הסמן הנקודתיים על מסך המחשב.
14. סובב בעדינות את דיסק המסנן על ה-stagכדי להשיג יישור ריבועי זה, או השתמש בשקופית יישור ספציפית לשימוש בדיסק סינון במיקרוסקופ stage.
15. תחת הכרטיסייה רכישה בפינה השמאלית העליונה, ודא שמצב התאורה שנבחר הוא שדה כהה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
16. כדי להשיג תמונה תפורה, נווט אל הכרטיסיה וידאו ברצועת הכלים כרטיסיות נתונים.
17. נווט לשדה הראייה הרצוי הראשון, ולאחר מכן לחץ על פסיפס כפתור בפינה השמאלית העליונה של חלון הווידאו והוסף למפה. נווט לפינה הנגדית החיצונית של האזור הרצוי עם הג'ויסטיק של המכשיר והוסף למפה.
18. הפעל את רכישת הפסיפס עם ViewSharp כדי להבטיח שכל האזורים נמצאים כראוי במיקוד בתמונה הסופית.
    הערה: יעדי הגדלה נמוכים יותר ייקחו פחות זמן לרכישת פסיפס התמונה, בעוד שיעדי הגדלה גבוהים יותר ייקחו זמן רב יותר.
19. לאחר יצירת פסיפס התמונה, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שלח ל-ParticleFinder.
20. נווט אל הכרטיסיה ParticleFinder ברצועת הכלים השמאלית העליונה כדי לקיים אינטראקציה עם הגדרות הסף.
21. כדי להבטיח שהחלקיקים המתאימים נבחרו, לחץ לחיצה ימנית על תמונה תחת הכרטיסייה נתונים של ParticleFinder כדי לסמן את התיבות מרכז, חלקיקים ושקיפות. קבעו את מחוון השקיפות ל- 50% ואת גודל הפיקסלים של 'מרכז' ל- 2 פיקסלים.
    הערה: בחירת המרכז תציב נקודה במרכז כל חלקיק, ובחירת החלקיק תציב שכבת-על על כל אזור שנקבע כחלקיק, בשקיפות של 50%. הגדרות אלה יאתרו כל חלקיק ויגדירו את הקצוות של כל חלקיק.
22. במידת הצורך, ערוך את סף החלקיקים ואת פרמטרי בחירת המורפולוגיה/גודל תחת הכרטיסייה ParticleFinder בצד ימין של התוכנית כדי להבטיח שכל החלקיקים ופרמטרי הגודל/צורה שלהם מזוהים כראוי. עיין בטבלה משלימה S2 לדוגמא כיצד ניתן ליישם את הפרמטרים המורפולוגיים.
    1. אם זיהוי חלקיקים אוטומטי אינו מספיק, עבור לידני והתאם בהדרגה את ערכי הסף עד שרוב האובייקטים הנכונים מזוהים כחלקיקים.
    2. אם המורפולוגיה של החלקיקים שזוהו זקוקה לליטוש נוסף, סמן את התיבה לצד החל מסננים מורפולוגיים. בחר פרמטרים מתאימים ואת עוצמתם בתפריטים הנפתחים המתקבלים.
       הערה: הסדר שבו הפרמטרים נבחרים יכול להשפיע על הפלט.
23. אם הגודל, הצורה או איכויות מורפולוגיות אחרות של החלקיקים הם גורמים קריטיים, סמן את התיבה לצד החל מסנן חלקיקים מראש ולאחר מכן בחר וערוך פרמטרים לפי הצורך.
24. לאחר זיהוי החלקיקים והצורות/הקצוות שנבחרו מקובלים, נווט ברשימת התצוגה המקדימה הניתנת לגלילה של תמונות חלקיקים תחת הקטע תוצאות . בחר חלקיקים מעניינים על-ידי לחיצה על תמונת החלקיקים המשויכת.
25. הפעל את השידור החי view עם כפתור מצלמת הווידאו בחלק העליון של המסך.
26. עבור למטרה 50x LWD על ידי לחיצה על מספר ההגדלה ובחירת המטרה המתאימה בתפריט הנפתח, בתוך היישום בסרט התחתון.
27. החזר את החלקיקים למיקוד באמצעות כפתור הכוונון העדין, במידת הצורך.
28. צלם תמונות של חלקיקים בודדים כדי לנתח באמצעות ספקטרוסקופיה של ראמאן, ושמור את התמונות כקבצים נפרדים עם שמות מתאימים.
29. ודא שהאזור הרצוי של החלקיק לניתוח בספקטרוסקופיה של ראמאן ממוקם כהלכה מתחת למיקום קרן הלייזר.
30. לאחר בחירת האזור המתאים של החלקיק לניתוח, לחץ על כפתור עצור הכל בחלק העליון של החלון כדי לכבות את אופטיקת ההדמיה.
31. הגדר את הלייזר ל-532 ננומטר, בהספק של 1% עבור חלקיקים לא מוכתמים, וב-785 ננומטר או 830 ננומטר עבור חלקיקים מוכתמים פלואורסצנטיים.
32. הגדר את זמן הרכישה ל-10 שניות ואת ההצטברות ל-5.
33. בחר את הכרטיסייה ספקטרה מתפריט כרטיסיות הנתונים, ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את תצוגת זמן אמת (RTD).
    הערה: השתמש במידע שהתקבל במהלך RTD כדי למטב את ההגדרות.
34. לאחר שתהיה מרוצה מההגדרות והתוצאות, לחץ על עצור הכל כדי לעצור את ה - RTD.
35. כעת ניתן לאסוף את הרכישה הסופית על ידי לחיצה על כפתור העיגול Spectrum Aquisition לצד כפתור RTD.
36. שמור את הספקטרום שנאסף כקבצים נפרדים עם שמות מתאימים.
37. חזור על שלבים 5.28-5.36. עבור כל חלקיק מעניין.
38. בסיום הדגימה, הסר את דיסק המסנן והחזר את המטרה ל-20X LWD הן באופן ידני בהיקף והן בתוך התוכנה.
39. חזור על שלב 5.10-5.37 עבור דוגמאות חדשות.

6. זיהוי ספקטרלי

1. אם מסד נתונים ספקטרלי של Raman שנרכש או נבנה בעצמו אינו זמין, נווט אל ספריית הספקטרוסקופיה בקוד פתוח בכתובת: https://www.openanalysis.org/openspecy/
   הערה: OpenSpecy הוא מסד נתונים ספקטרוסקופיה של Raman ו-IR בקוד פתוח הכולל 636 ספקטרום משלוש ספריות שונות של 276 פולימרים וחומרים החלים על זיהוי MPS וסיבים סביבתיים²¹. נתונים ספקטרליים שעובדו לפני ואחרי הם ברי קיימא באותה מידה לשימוש עם משאב זה.
2. שמור ספקטרום Raman כקבצי .csv בודדים.
   1. סמן את עמודה A כמספר גל ואחריו מספרי הגל של הספקטרום, ועמודה B צריכה להיות מסומנת עוצמה ואחריה ערכי עוצמת השיא לכל מספר גל.
3. פתח את הספקטרום על-ידי גרירה ושחרור של קובץ .csv לסרגל העיון בפינה הימנית העליונה.
4. הפעל עיבוד מקדים וזיהוי.
5. תחת עיבוד מקדים, הפעל רעש אות סף, מנרמל מינימום-מקסימום, החלקה/נגזרת, תואם מספרי גל ותיקון קו בסיס.
   הערה: ניתן לכוונן את ההגדרות הספציפיות בו בהתאם למאפיינים האישיים של הספקטרום המנותח.
6. תחת Identification, בחר Raman כסוג הספקטרום, ו-Derivative כ-Library Transformation.
   הערה: ניתן להשתמש בספרייה זו גם עבור ספקטרוסקופיה IR. חלון הניתוח יציג ספקטרום לבן, הספקטרום שהועלה לניתוח, וספקטרום אדום, התאמת הזיהוי החשודה.
7. עם כל ספקטרום שאינו מחזיר התאמה r > 0.70, או מתאמים סבירים של צורת שיא, השתמש ב-5 התוצאות המוצעות המובילות כמקום להתחיל לחקור התאמות פוטנציאליות לפי העדפתך.
8. ודא שערכי השיא הנמדדים נמצאים בטווח של ±10 מספרי גל של שיא מתאים בספקטרום הייחוס שנבחר לפני אישור התאמה לאותו שיא.
9. רשום מתאמים ספקטרליים, ערכי המתאם שלהם ומסד הנתונים שממנו נובעת ההתאמה החשודה.
10. הורד קבצים בהתאם לצרכים האישיים.

7. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

הערה: אם לא ציפוי מתכתי של דיסק המסנן לפני ניתוח SEM, דלג לסעיף 7.2.

1. ציפוי מתכת של דוגמאות ל- SEM
   1. התקן את דיסק המסנן על בדל SEM מפלדה באמצעות סרט פחמן.
   2. הכנס לתוך מקרטע ושאב את התא ל-50 mTorr.
   3. פתח את שסתום הבידוד המקרטע Ar (ארגון).
   4. נקה את המערכת על ידי הכנסת Ar לתא באמצעות שסתום מחט ללחץ של 300 mTorr, ולאחר מכן פנה את החדר עד ל-50 mTorr. חזור על הפעולה 3x.
   5. כוונן את הלחץ הסופי ל-100 mTorr באמצעות שסתום מחט.
   6. באמצעות יעד Au, הפקידו את Au על דיסק המסנן באמצעות התזה.
      הערה: ניתן להשתמש במקורות יעד אחרים (למשל, Pt, Ir, Si וכו') במקום Au; זרם של 20 mA מייצר 0.1 אנגסטרום/שנייה של שקיעה ב-100 mTorr.
   7. אוורור את המערכת והסר את דיסק המסנן. שמור את דיסק המסנן דבוק לבדל הנירוסטה.
2. לכידת תמונות SEM
   1. הדק את הבדל למחזיק Zeiss Auriga רב-שלבי בעזרת בורג סט.
   2. הפעל את ה- SEM ואת המחשבים המפעילים אותו ואפשר לכל אחד מהם לפעול.
   3. פתח את התוכנה המצורפת ל- SEM.
   4. ודא שהמערכת נמצאת בוואקום (5e-6 Torr).
   5. אוורור את מנעול המטען על ידי לחיצה על Vent בגוף הראשי של תא נעילת המטען, ופתח את מנעול המטען.
   6. התקן את המחזיק הרב-שלבי על ג'יג ההחדרה המצופה טפלון והדק את זרוע ההעברה באמצעות לוחית הבורג המצורפת.
   7. סגור את מנעול המטען ושאב את מנעול המטען על ידי לחיצה על אחסן בגוף הראשי של תא נעילת המטען.
      הערה: ההשלמה מתרחשת כאשר הנוריות הירוקות מפסיקות להבהב בלחצן החנות .
   8. טען את המחזיק הרב-שלבי על הבמה בתא התצפית הראשי על ידי פתיחת שער ההעברה.
   9. לחץ על העברה בגוף הראשי של נעילת העומס. השער ייפול ויחשוף את החדר הפנימי.
   10. הכנס את זרוע נעילת המטען (מוברגת למחזיק הרב-שלבי) וקבע את המחזיק הרב-שלבי לבמה.
   11. הברג את זרוע העברת נעילת המטען ומשוך את הזרוע במלואה כך שהיא תשכון במנעול המטען.
   12. סגור את שער ההעברה על ידי לחיצה על העברה.
   13. פתח את שסתום הבידוד על ידי לחיצה על EHT בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה.
   14. התאם את מרחק העבודה ל-5 מ"מ באזור הנתונים של התוכנה, ואת מתח ההאצה ל-20 קילו וולט.
   15. מקם את קרום דיסק המסנן באמצעות הג'ויסטיקים XY ו-Z.
   16. הרם את ה-stage באמצעות ג'ויסטיק Z עד שהתמונה תתמקד.
   17. תקן אסטיגמציה על ידי כוונון כפתורי הצלקות XY וגלגל המיקוד בקונסולה המרכזית.
   18. חלקיקים לדוגמה של תמונה בהגדלה הרצויה על ידי כוונון גלגל ההגדלה בקונסולה המרכזית, לכידת תמונות ברזולוציה של 2,048 x 1,536 בפורמט tiff של 8 או 16 סיביות.
3. ניתוח חלקיקי EDX
   1. כבה את ה-ChamberScope CCD בשולחן העבודה של מחשב ה-SEM.
      הערה: אם שלב זה לא הושלם, גלאי ה-EDX יוצף באות ולא יירשמו נתונים.
   2. קרר את גלאי ה-EDX על ידי פתיחת תוכנת APEX EDX במחשב ה-EDX, על ידי הפעלת הגלאי בתפריט בפינה השמאלית העליונה.
   3. צלם תמונת SEM ברזולוציה נמוכה שניתן להשתמש בה למיפוי, על-ידי לחיצה על לכידת תמונה.
   4. פתח את תפריט כרטיסיית המיפוי בחלק העליון של מסך התוכנה.
   5. תחת הגדרות, התאימו את הרזולוציה (256 x 256) ואת זמן השהייה של הפיקסלים (0.16 מיקרון) ואת מספר המסגרת (32-64) כדי לספק זמן צילום משוער שאמור להיות באורך ~5 דקות.
   6. לחץ על צור מפה בפינה הימנית העליונה של התפריט.
   7. בחר Confirm Element Preview כדי להתאים באופן ידני את חיפוש הרכיבים, או הסתמך על הפסגות שזוהו אוטומטית מהתוכנה.
   8. צור דוח באמצעות הפונקציה דיווח אוטומטי בחלק הימני העליון של תוכנת המיפוי בסיום.

Results

ריקים בתהליך וזיהום רקע
תוצאה ריקה מקובלת היא כזו שאינה מכילה חלקיקים או כל כך מעט חלקיקים עד שזיהום הרקע (כלומר, התהליך) (אם קיים) אינו מפעיל סבירות גבוהה לבלבל או לשבש את תוצאות הניסוי. תוצאה ריקה לא אופטימלית היא כזו המכילה חלקיקים רבים שיהיה קשה להבחין בין החלקיקים המעניינים לבין זיהום הרקע.

הרמה המקובלת של זיהום התהליך צריכה להיות קרוב לאפס או קרוב ככל האפשר, אך אם לא ניתן להשיג אפס, אז עקביות במספר חלקיקי הרקע הנצפים היא המפתח. הפעל מספר דוגמאות ריקות כדי לקבוע את עקביות התוצאות. חריצות בפרוטוקולי בקרת איכות (עיין בסעיף 1), הפחתת זיהום ותנאים סביבתיים נאותים במהלך העיבוד הם בעלי חשיבות עליונה לשמירה על רמות זיהום רקע נמוכות. תוצאות זיהום הרקע והקבילות עשויות להיות תלויות במידה רבה גם בניתוק הננו-ממברנות המשמשות, ובניקיון הכללי של תנאי המעבדה. קחו בחשבון שכאשר מנתחים חלקיקים קטנים יותר עם ממברנות חתך נמוכות יותר (למשל, < 8 מיקרומטר), השפע היחסי של החלקיקים המעניינים ומזהמי רקע בגודל דומה יגדל באופן אקספוננציאלי, מה שיחייב רמות גבוהות יותר של קפדנות בבקרת איכות²². בעוד שכל רמת זיהום אינה מקובלת, כל עוד התנאים נשלטים היטב ומושגת רמה גבוהה של עקביות, עדיין ניתן לבצע ניתוחים טובים של מיקרופלסטיק סביבתי או ניתוחים מעניינים.

סינון לדוגמא
יש צורך בסינון דגימה אידיאלי כדי ליצור ניתוח רב-מודאלי נאמן, כפי שמוצג במפל הנתונים לדוגמה באיור 3. סינון דגימה כזה יביא לחלקיקים מפוזרים היטב על פני השטח הננו-ממברני (למשל, עם כשליש משטח הפנים של הממברנה). חלקיקים מפוזרים בצורה גרועה, כמו במקרה של צבירת חלקיקים (גושים גדולים של חלקיקים חופפים), יבלבלו בין שיטות ספירת חלקיקים ידניות ואוטומטיות, מכיוון שחלקיקים חופפים אינם מובחנים בקלות בביטחון. נתונים כאלה בדרך כלל אינם נכללים בניתוח, מה שעלול להוביל לאובדן מידע בעל ערך מעניין. חלקיקים מפוזרים היטב, כפי שמוצג באיור 4A,B, מבטיחים שכל ניתוח ספקטרוסקופי או כימות אינו מסובך על ידי חלקיקים מוערמים או חופפים בהרכבים שונים, מה שעלול להחזיר תוצאות שקשה יותר לפרש, לזהות ולכמת במדויק.

מכתים אדום נילוס וכחול טריפאן
תמונות מייצגות של מופעי צביעת חלקיקים פלואורסצנטיים אופטימליים מוצגות באיור 3B על דיסק מסנן SiN מנותק של 20 מיקרומטר. שטיפה תת-קרקעית של כתם ה-NR או השחפת ממשטח הננו-ממברנה עלולה ליצור תוצאות חיוביות כוזבות. חלקיקים שיוריים המורכבים משני הכתמים שנשמרו על פני הממברנה עקב שטיפה לא מספקת עלולים להתפרש באופן שגוי כחלקיקים מוכתמים. סימן לכך שהתרחשה שטיפה לא מספקת הוא אם אזורים של הננו-ממברנה ללא חלקיקים או שאריות סרטים/שאריות הניתנות לזיהוי מהדגימה המסוננת זוהרות במהלך התצפית, כפי שמוצג באיור 5A. לאחר ההדמיה, כל עוד דיסק המסנן נשמר בתנאים נקיים, ניתן לבצע שטיפה חוזרת על ידי הנחת דיסק מסנן הננו-ממברנה הבודד בחזרה על מנגנון סינון הוואקום (מינוס האטמים), הפעלת הוואקום וסינון נפח נוסף של Ultrapure 99% IPA (עבור NR) או מים אולטרה-טהורים (עבור שחפת) על הננו-ממברנה של דיסק המסנן. רשום את הנפח הכולל של מדיית שטיפה נוספת שבה נעשה שימוש. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צלם תמונות מיקרוסקופיה של כל משטח הננו-ממברנה לפני ביצוע שטיפה חוזרת כדי לקחת בחשבון כל זיהום שעלול להיגרם משלב השטיפה מחדש.

ספקטרוסקופיה של ראמאן
ספקטרוסקופיית רמאן המבוצעת על SiN לא מצופה עשויה לייצר שיא בולט בהתאם לאורך גל הלייזר, ושיא זה עשוי להסוות אותות שפע נמוכים בערך בתוך אזור מספר הגל של 520 ס"^{מ-1 23}. אם ספקטרום ראמאן מעניין מופרד מספיק משיא הרקע של סיליקון או סיליקון ניטריד, שימוש בדיסקי מסנן SiN לא מצופים אמור להניב תוצאות ספקטרוסקופיה נאותות של ראמאן. בדוח זה, צינורות B ו-C השתמשו שניהם בדיסקי סינון Au-SiN. ציפוי הזהב של Au-SiN מסווה את שיא ה-Si האינהרנטי, ומאפשר לאסוף ספקטרום שפע נמוך בצורה מהימנה יותר ליד או במספרי גל של 520 ס"^מ-1 . בנוסף, ניתן להשתמש ב-Au-SiN עם ספקטרוסקופיה IR אם Raman אינו זמין. התחל תמיד עם הגדרות ההספק הנמוכות ביותר (כלומר, עוצמת לייזר) במכשיר ולאחר מכן הגדל בהדרגה, מכיוון שחלק מהחלקיקים המעניינים יכולים להיות שבירים, כגון חלקיקים מחומצנים, ועלולים להינזק או להיהרס על ידי הלייזר.

בעת ניתוח חלקיקים נבחרים עם ספקטרוסקופיה של ראמאן, קביעת האמינות של ספקטרום מוחזר היא קריטית. חלקיקים מסוימים עשויים להאיר אוטומטית, והפלואורסצנטיות הזו תוסיף רעש למדידה הספקטרלית שעלול להסוות או לסבך את פירוש אותות החלקיקים. רעש זה ילבש צורה של פס בעוצמה גבוהה המשתרע על פני טווח רחב של מספרי גל, תוך ערבוב הנתונים הבסיסיים. ספקטרום תקין, המודגם באיור 3C ובאיור 4C,D, עוד לפני תיקון קו הבסיס, יהיה בעל פסגות מוגדרות בבירור על פני טווחים קצרים יותר של מספרי גל. אם לא מתעוררות פסגות שגדולות לפחות פי שלושה מכל אחד מהאותות שמסביב, סביר להניח שהספקטרום שנאסף הוא רעש רקע, או שנדרשות הגדרות מכשיר שונות כדי לנתח את החלקיק המדובר. ודא שנבחר אורך גל הלייזר המתאים עבור כל דגימה. לייזרים באורך גל נמוך יותר, כגון לייזר 532 ננומטר, אינם יכולים להתמודד מספיק עם האות שנוצר על ידי הקרינה. לייזר באורך גל גבוה יותר, כגון לייזר 782 ננומטר או 830 ננומטר, יכול להתעלם מספיק מהפלואורסצנטיות כדי להחזיר ספקטרום. בהתאם לסוג הדגימה, לייזרים שונים יתאימו לסוגי חלקיקים שונים, ובמידת האפשר, ניתן להחליף אותם במהלך איסוף הנתונים על דיסק מסנן יחיד.

כדי לקבוע את הרכב החלקיקים, הספקטרום שנאסף שלהם מושווה לאלה שבמסד נתונים של ספקטרום ייחוס. זיהוי אמין של ספקטרום חלקיקים נתון יניב מקדם פירסון (r) גדול מ-70% (r > 0.70). נתוני Raman תת-אופטימליים מוצגים באיור 5B, שם < 0.70. תוצאות זיהוי MP שימושיות בקביעת מקורות פוטנציאליים לזיהום MP. כדי להציג תוצאות זיהוי חלקיקים, ניתן להציג תמונה וספקטרום של החלקיק המנותח כמו באיור 3C ואיור 4C.

מיקרוסקופ אלקטרונים סורק
גם דיסקי מסנן SiN וגם Au-SiN תואמים ל-SEM מיד לאחר לכידת חלקיקים על ידי סינון. אם דיסקי מסנן ה-SiN אינם מצופים ב-Au או Pt לפני SEM ולאחר לכידת חלקיקים, חלקיקים מסוימים עשויים להיות "נטענים" בקלות רבה יותר על ידי קרן היינון של ה-SEM, מה שעלול לגרום לחלקיק לזרוח או להיראות בהיר מאוד בתמונות. בהירות/זוהר זה יכול לגרום לבעיות בהדמיה עקב ניגודיות לקויה, כגון מיסוך המורפולוגיה של החלקיק. כדי לצמצם, בצע מיקרוסקופיה אופטית/פלואורסצנטית וספקטרוסקופיה של ראמאן לפני SEM כדי לסמן חלקיקים קשים לניתוח או קטנים מעניינים לניתוח SEM/EDX מאוחר יותר, ולאחר מכן לצפות את הננו-ממברנה ב-Au או Pt כמתואר בסעיף פרוטוקול 7, ולבצע SEM/EDX.

ציפוי SiN או Au-SiN עם Au או Pt לאחר לכידת חלקיקים ולפני ניתוח SEM מסייע במניעת אפקט טעינה זה במהלך ההדמיה, מכיוון שחלקיקים אינם רגישים עוד ליינון מתחת לשכבת המתכת המושלכת. ציפוי זה משפר את הניגודיות והרזולוציה, כך שניתן להשיג הבנה מורפולוגית גדולה יותר של חלקיק נתון, כפי שניתן לראות באיור 3D (סיבים לעומת שבר) או מורפולוגיות פני השטח, כגון בורות וסדקים על חלקיקים מחומצנים. חלקיקי ציפוי מתכת לפני ניתוח SEM ימנעו לצמיתות את ניתוחם הנוסף באמצעות ספקטרוסקופיה או הדמיה פלואורסצנטית, מה שהופך רק ניתוחי SEM/EDX לאפשריים. ציפוי החלקיקים וביצוע SEM/EDX צריכים להיות השלבים האחרונים בכל תהליך אם מתוכנן.

ניתן לבצע מדידות EDX על חלקיקים שנלכדו לפני ואחרי ציפוי מתכת. EDX יכול לחשוף את הרכב היסודות הספציפי של חלקיק או אזור נתון, שמשתלב היטב עם כל חלקיקים קטנים ממגבלת הגודל של הגילוי לניתוח ראמאן, או הרכבים יסודיים שיכולים להיות קשים לניתוח עם אורכי גל מסוימים של לייזר ראמאן כגון מתכת, סגסוגות, חלקיקים רוויים במים וחלקיקים שזוהרים חזק כאשר הם נחשפים לקרני הלייזר של ראמאן הזמינות לשימוש. במחקר זה, חלקיקים צופו בשכבה בעובי 6 ננומטר של Au. הדמיית SEM נעשתה בין הגדלה של 200x-3,000x עם הספק אלומה של 20 קילו וולט ואורך מוקד של 5 מ"מ. תמונות SEM בהתאמה של חלקיקים נבחרים מוצגות באיור 3D.

תוצאות מייצגות של EDX מוצגות באיור 3F. אלמנטים שזוהו במשקל אחוז נמוך מ -1% יכולים להיחשב עקבות או לא אמינים בהתאם לרגישות המכשיר; לכן, קבענו סף של 1%. אם צופו חלקיקים נבחרים לניתוח EDX, כמות ניתנת לזיהוי של הציפוי תהיה נוכחת בדוח הנתונים היסודיים. אם משתמשים בדיסקי מסנן SiN לא מצופים, ייצפו אותות Si ו-N, כפי שמוצג באיור 3F. רוב חלקיקי הפולימר הסינתטיים יכילו גם את היסודות C, H ו-O, למרבה הצער, מכיוון שרוב החלקיקים הלא סינתטיים ממקורות ביולוגיים עשויים גם הם מאותם יסודות, אך חלקיקים לא סינתטיים יכולים לכלול גם יסודות כמו S, כמו במקרה של חלבונים. דמיון זה בהרכב הוא הסיבה לכך ששיטת הצביעה הנגדית עם אדום הנילוס וכחול טריפן שימושית להבחנה בין חלקיקים סינתטיים לעומת חלקיקים לא סינתטיים, אך אינה כלי זיהוי ממצה, שכן אדום הנילוס מסוגל גם להכתים חלקיקים לא סינתטיים במקרים מסוימים. יש להשתמש בפרמטרי ניתוח נוספים כמו אלה שהוצעו לעיל בשילוב עם כל הליכי צביעה כדי לאשר את התוצאות. בנוסף, EDX יכול להיות כלי שימושי לזיהוי פוטנציאלי של חלקיקים שנמצאים מחוץ למגבלת הגודל של הזיהוי עבור ספקטרוסקופיה של ראמאן (כלומר, ננו-פלסטיק בגודל < 1 מיקרומטר).

איור 1: צינורות SNAP. (A) סכמות של צינורות SNAP, המאפיינים את אותם חלקיקים על אותו ננו-ממברנה באמצעות סדרה של טכניקות אנליטיות שונות. צינור א') מדגים 1) חלקיקים מעניינים שנלכדו מדגימות מי שתייה באמצעות סינון ואקום הם 2) צבועים באדום נילוס וכחול טריפן להבחנה של חלקיקים פולימריים סינתטיים לעומת לא סינתטיים, בהתאמה, ואחריהם 3) זיהוי חלקיקים באמצעות ספקטרוסקופיה של ראמאן, ו-4 ) SEM/EDX לאפיון מורפולוגיה של חלקיקים וזיהוי יסודות. צינור ב) מדגים 1) לכידת חלקיקים על Au-SiN ואחריה 2) ספקטרוסקופיה של ראמאן. צינור ג) מדגים 1) לכידת חלקיקים על Au-SiN ואחריו SEM/EDX. (B) סכמטי של דיסק המסנן ואטם הסיליקון במערך הסינון במנגנון הוואקום, המתאר את הסינון הרציף דרך ננו-ממברנה MSSN של 20 מיקרומטר, ולאחר מכן 8.0 מיקרומטר MSSN, מופרדים על ידי אטמי סיליקון. קיצורים: SNAP = צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון; SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; EDX = ספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרת אנרגיה; MPSN = סיליקון ניטריד מיקרו-נקבובי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מקורות איסוף דגימות מי שתייה. מפה אזורית שפורסמה על ידי רשות המים של מחוז מונרו המתארת את המיקומים שמהם נאספו כל אחת מארבע דגימות מי השתייה באזור רוצ'סטר רבתי, ניו יורק. הדגימות מקורן במקורות מים עיליים שונים: אגם אונטריו (כחול), אגם הרוש (ירוק), אגם הרוש ואגם אונטריו (צהוב) ואגם קנאנדאיגואה (סגול). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סיכום של ניתוחים מ-SNAP Pipeline A שבוצעו על חלקיקים שנלכדו מדגימות מי שתייה. (A) תמונה בגווני אפור של חלקיקים שנלכדו מדגימת מי שתייה מייצגת אחת על SiN מנותק של 20 מיקרומטר. (B) תמונת כיסוי בצבע כוזב של חלקיקים מוכתמים נגדית כדי לייצג את אדום הנילוס (חלקיקים אדומים בצבע כוזב) וכחול טריפן (חלקיקים כחולים בצבע כוזב). (C) ייחוס (אדום) וספקטרום ראמאן שנאסף (לבן) המזהה חלקיק מוכתם באדום הנילוס כפוליאתילן עם ערך r של פירסון של 0.97, עם תמונה מייצגת של החלקיק שנותחה. (D) מיקרוגרף אלקטרונים של שני סוגי חלקיקים שונים שמדגים ניתוח מורפולוגיה של חלקיקים של סיב (פאנל עליון) ושבר (פאנל תחתון), שניהם לוקחים את הכתם הכחול של טריפאן. (E) כימות של חלקיקים מוכתמים באדום הנילוס שנלכדו ברצף על ננו-ממברנות חתוכות של 20 מיקרומטר ו-8 מיקרומטר. (F) ניתוח יסודות EDX מסוכם של מקטע שנבחר באופן אקראי ופרטים אנליטיים של התוצאות עם תמונת SEM מייצגת של החלקיק שנותח. קיצורים: SNAP = צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון; SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; EDX = ספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרת אנרגיה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סיכום הניתוחים מ-SNAP Pipeline B שבוצעו על חלקיקים שנלכדו מדגימות מי שתייה. ניתוח ספקטרלי של רמאן של שלושה חלקיקים אקראיים מארבע דגימות מי שתייה ביתיות שנלכדו על דיסקי מסנן 20 מיקרומטר MPSN ו-8.0 מיקרומטר MSSN Au-SiN. תמונות שדה כהה מייצגות של שטח הממברנה הפעיל הכולל עבור 20 מיקרומטר ו-8 מיקרומטר Au-SiN מוצגות בהתאמה ב-A ו-B. חלקיקים מופיעים צהובים במצב הדמיה זה בעוד הרקע נשאר כהה, מה שמאפשר ספירת חלקיקים אוטומטית קלה. ספקטרום ראמאן מייצג של חלקיקים סינתטיים ולא סינתטיים על (C) 20 מיקרומטר ו-(D) 8.0 מיקרומטר Au-SiN. ספירת החלקיקים הכוללת עבור (E) 20 μm ו- (F) 8.0 μm Au-SiN מחולקת לפי טווחי גודל שנקבעו על ידי תוכנת איתור החלקיקים האוטומטית. קיצורים: SNAP = צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון; SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; EDX = ספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרת אנרגיה; MPSN = סיליקון ניטריד מיקרופורוזי; MSSN = מיקרו-חריץ סיליקון ניטריד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תוצאות הדמיה פלואורסצנטית תת-אופטימלית וספקטרוסקופיה של ראמאן. (A) תמונת פלואורסצנטיות תת-אופטימלית של חלקיקים מוכתמים (פאנל שמאלי), כאשר הממברנה שמרה על הכתם האדום של הנילוס, ככל הנראה מתת-שטיפה. שני חלקיקים, סיב מוכתם בכחול טריפן ושבר מוכתם באדום נילוס (פאנל ימני), נבחרו לספקטרוסקופיה של ראמאן. (B) תוצאות ספקטרוסקופיה תת-אופטימליות של ראמאן כאשר מקדם פירסון (r) קטן מ-70% (r < 0.70). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: מאפיינים של ננו-ממברנות סיליקון בתוך דיסקי מסנן. בטבלה זו מתוארות תכונות הממברנות בתוך דיסקי מסנן ה-SiN, כולל גודל הנקבוביות המינימלי, אחוז הנקבוביות, עובי הממברנות עם ובלי ציפוי Au, האזור הפעיל של הממברנה וחדירת הגז דרך הממברנה בלחץ חיובי המופעל בלחץ קבוע מוגדר. חתך (כלומר, גודל נקבוביות), נקבוביות, עובי ושטח ממברנה נקבעים על ידי תכונות מדידה בתמונות SEM. נתוני חדירות הגז מדווחים כסטיית תקן ממוצעת ± (n = 10) עבור לחץ חיובי N 2 המופעל ב-103.42 kPa. קיצורים: Au = זהב; Si_x N_y = סיליקון ניטריד לא סטויכיומטרי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה S2: ספירת חלקיקים ופרמטרים של ParticleFinder. פסיפסי תמונה של כל שטח הממברנה נלקחו מכל דגימה, וכל פסיפס תמונה נותח כדי לאסוף את ספירת החלקיקים הכוללת. בטבלה זו מתוארים הפרמטרים שבהם נעשה שימוש ובאיזה סדר לקבוע את ספירת החלקיקים הכוללת עבור כל תמונה לדוגמה, וספירת חלקיקים בשברים בגודל נתון. הפרמטרים משתנים מדגימה לדגימה בהתחשב בסוג, בכמות ובצורת החלקיקים, כמו גם בהשתקפות הספציפית של כל ממברנה במהלך ההדמיה. הנתונים מטבלה זו מוצגים באופן חזותי באיור 4. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

הפחתת זיהום מיקרופלסטיק היא נושא הולך וגובר לדאגה; והצעד הראשון להפחתה הוא זיהוי נוכחות של זיהום. שיטה יעילה של לכידה וניתוח מיידי חיונית לחיסכון בזמן החוקרים ולשימור מדדי דגימה רגישים. דוח זה מתאר זרימות עבודה גמישות המבוססות על וריאציות של שיטות ה-SNAP שפותחו שלנו לניתוח MPS כאלה בדגימות נוזליות, תוך שימוש במצע יחיד לכל הניתוחים שבוצעו. יש לסנן את הדגימה בוואקום כך שהחלקיקים יילכדו ויבודדו על גבי ננו-ממברנה מסיליקון השוכנת בתוך דיסק מסנן. הפחתה מספקת של זיהום רקע היא קריטית לתוצאות משמעותיות. כל חלקיקים מזהמים על המזרק המחלק או משפך הוואקום מזכוכית במהלך הסינון עלולים לזהם את הדגימה ולהיתפס בו זמנית, ולכן הקפדה על פרוטוקולי בקרת האיכות של סעיף 1 היא חיונית לתוצאות מדויקות. בקרות מדיה בלבד מומלצות כדי ליידע את החוקרים על זיהום רקע ספציפי לתהליכים בודדים ולתנאי מעבדה. הפרוטוקול המתואר כאן מסתמך על סינון ואקום של דגימה נוזלית, כמו גם לכידה ובידוד של חלקיקים מהדגימה על שני דיסקי מסנן SiN מנותקים שונים. עבור כל הצינורות, לכידת חלקיקים ובידודם חייבים להקדים שיטות אחרות, אך כל שיטות הזיהוי האחרות יכולות להיעשות בסדר המתאים ביותר לחוקר.

שני מיקרוסקופים פלואורסצנטיים שימשו למחקר זה כדי להדגים יכולת חזרה של תוצאות על פני מכשירים. שלבי ההדרכה מפרטים באופן ספציפי את השימוש באולימפוס BX61 למיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשל הדומיננטיות של השימוש בו והופעל לפי הוראות המכשיר תוך שימוש בשדה בהיר להדמיה בגווני אפור, ערוץ TRITC (לדוגמה ~ 543 ננומטר; אמ. ~593 ננומטר) להדמיית חלקיקים מוכתמים ב-NR, ותעלת Cy5 (לדוגמה ~649 ננומטר; אמ. ~667 ננומטר) להדמיית חלקיקים מוכתמים בשחפת, לפי העניין. כדי להציג את תוצאות הצביעה, אנו ממליצים לבנות שכבת-על של תמונות הערוץ (אנו משתמשים ב-FIJI/ImageJ לעיבוד תמונה, המכונה לאחר מכן פלטפורמת ניתוח התמונה), ברזולוציה של 2,048 x 2,040 פיקסלים ועומק של 16 סיביות. ניתן להציג תמונות ננו-ממברנה שלמות כמו באיור 4A,B או כאזורי עניין נבחרים כפי שמוצג באיור 3A,B.

אדום הנילוס משמש בדרך כלל להכתמת פולימרים סינתטיים אך יכול להכתים פולימרים לא סינתטיים ממקורות ביולוגיים בשל אופיו הליפופילי וההידרופובי, מה שעלול להציג תוצאות חיוביות כוזבות המעוותות את תוצאות כימות MP 24,25,26. שלב צביעה נגדית של Trypan Blue, כמתואר בסעיף פרוטוקול 3, מומלץ כדי לסייע בהבחנה של אירועים חיוביים כוזבים, אך אינו פתרון ממצה ויש לשלב אותו עם מדדי ניתוח נוספים כדי לאשר את התוצאות. פלואורסצנטיות של חלקיקים בצבע אדום הנילוס היא דאגה בניתוח ספקטרוסקופיה של ראמאן מכיוון שהיא עשויה להגדיל משמעותית את אות הרקע. במחקר זה, לעומת זאת, הצבנו פולימרים עם אדום נילוס וטריפן כחול לפני ספקטרוסקופיית ראמאן עם לייזר של 830 ננומטר, ונצפה רעש מועט, כפי שמוצג באיור 3.

אורכי גל מסוימים של לייזרים המתאימים לספקטרוסקופיה של ראמאן אינם מסוגלים להתעלם מהפלואורסצנטיות מחלקיקים מוכתמים, כגון לייזר 532 ננומטר, ולכן עלולים להציג קושי משמעותי בהערכה נכונה של הרכב החלקיק המבוקש. ציפוי מתכת של החלקיקים לאחר הלכידה שימושי לשיפור הניגודיות במהלך הדמיית SEM אך אינו תואם לכל ניתוח ספקטרוסקופי או פלואורסצנטי שלאחר מכן. רשום את כל המדידות הרצויות לפני הגדרת הניסוי כדי להבטיח שזרימת התהליך וסוגי הציפוי נלקחים בחשבון כראוי. ניתן להשתמש בדיסקי המסנן Au-SiN עבור כל הניתוחים שהוזכרו כאשר מיקרוסקופ שידור אינו חיוני לזרימת העבודה, או כאשר נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של Raman או IR.

השיטות המוצגות כאן, כמו גם הננו-ממברנות המשמשות ללכידה ובידוד של חלקיקים מעניינים, ניתנות לשינוי כך שיתאימו לצרכי החוקרים הבודדים. הננו-ממברנות מתאימות למספר ניתוחים ספקטרוסקופיים, והחוקר עשוי להחליף את המדיה המסוננת במדיית דגימה אחרת מעניינת, כולל אך לא רק רקמות בעלי חיים מעוכלות²⁷, תרופות להזרקה ודגימות שמן. שני מכשירי ספקטרוסקופיה של ראמאן שימשו למחקר זה, ושלבי ההוראה מפרטים באופן ספציפי את השימוש במכשיר Horiba XploRA Plus Raman, שאסף ועיבד את כל הנתונים המוצגים באיור 4. חשוב גם להכיר במגבלת הגודל של הגילוי עבור כל מיקרוסקופ ראמאן, כדי להבטיח שניתן לנתח את החלקיקים המעניינים כראוי עם גודל הנקודה של הלייזרים של המכשיר. כדי להציג תוצאות זיהוי חלקיקים עם ראמאן, ניתן להציג את ספקטרום הייחוס והדגימה, בתוספת תמונה של החלקיק המנותח, כמו באיור 3C ובאיור 4C.

סעיף 6 בפרוטוקול מפרט הוראות לזיהוי חלקיקים באמצעות ספרייה ספקטרלית בקוד פתוח. הלכידה המישורית של חלקיקים על ממברנה שטוחה ואחידה, כמו גם מערך הנקבוביות הרגיל של הממברנה, מאפשרים הדמיה אוטומטית וצפויה. גם העובי של 400 ננומטר או 1,000 ננומטר של ה-SiN וגם הרכב הסיליקון ניטריד שלהם מעניקים להם שקיפות אופטית מצוינת, אך עשויים גם להחזיר שיא סיליקון אינטנסיבי בכמה פרמטרים ספקטרוסקופיים של מכשירים. יש לנקוט בזהירות בעת שימוש ב-SiN חשוף שאינו מצופה מתכת עם ניתוח ראמאן. שיא ה-Si עשוי לתפקד כאות כיול, אך עוצמת השיא עשויה גם להסוות את האותות של ספקטרום בעוצמה נמוכה יותר באותו אזור מספר גל כמו האות של ה-Si. שיאי Si כאלה לא נצפו בעת שימוש בלייזר 830 ננומטר במחקר זה.

האופי האולטרה-דק של ה-SiN (בעובי 400 ננומטר או 1,000 ננומטר) ו-Au-SiN (בעובי 520 ננומטר או 1,120 ננומטר) המשמש כאן העניק להם את תכונות הסינון, האופטיקה והספקטרוסקופיות המצוינות שלהם. עם זאת, יש להגן על ממברנות אלו מפני נזק פיזי, כגון על ידי לחץ דיפרנציאלי מוגזם (כלומר, ≥-206 kPa), נגיעה ישירה בפינצטה או באצבעות, או על ידי מיקום אטם לא נכון. דיסק המסנן המאכלס את הממברנות מגן עליהן ומאפשר טיפול קל בשימוש רגיל. בעת מניפולציה של דיסקי המסנן, גע רק בטבעת החיצונית השחורה, ולעולם לא באזור הממברנה הפעילה. למרות שלא דווח כאן מבחינה כמותית, איסוף החלקיקים שנלכדו על כמות קטנה של שטח פנים של הממברנה (3 x 3 מ"מ עבור 20 מיקרומטר ו-3 x 0.7 x 3 מ"מ עבור ממברנות חתוכות של 8.0 מיקרומטר, בהתאמה) עשוי להפחית את זמן ניתוח הדגימה הכולל, על ידי הפחתת הזמן הדרוש למציאת וניתוח חלקיקים מעניינים. "גורם ריכוז" זה ראוי למחקר עתידי ועשוי להציע יתרון ייחודי של דיסקי סינון SiN לחוקרים. בשילוב עם קצבי הזרימה המנורמלים הגבוהים יותר שלהם לעומת ממברנות אחרות בשימוש נרחב לאפיון MP¹⁵, שגרות הדמיית חלקיקים אוטומטיות שצריכות רק לדמות שטח קטן יחסית של SiN שטוח ונטול מיקוד באופן אחיד עשויות להפחית עוד יותר את זמני הניתוח הכוללים. עם זאת, עדיין יש להוכיח אמפירית את כל היתרונות הקשורים לגורם הריכוז המשוער על ידי השוואת זמני העיבוד הכוללים (מסינון לניתוח תמונה) על דיסקי סינון קונבנציונליים ו-SiN.

הדגמנו באופן היוריסטי את התועלת של וריאציות SNAP על דגימות מי ברז מקומיות. הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בלכידת MP ממקורות מי שתייה סביב רוצ'סטר, ניו יורק. איסוף הדגימות התנהל באופן הבא: עבור כל איסוף דגימות, לפחות ליטר אחד של מים הועבר דרך הברז לפני תחילת האיסוף. בקבוקי פוליפרופילן חדשים ואטומים נלקחו לברז הזורם ונפתחו מיד לפני האיסוף. הבקבוקים לא נשטפו במי שתייה לפני תחילת האיסוף. כל דגימה כללה שני בקבוקים של 500 מ"ל שנאספו, אחד אחרי השני. כל דגימת מים הגיעה ממערכת צינורות נפרדת של משק בית, וחומר הצינור לא היה עקבי לאורך הדגימה. במחקר זה לא ניתן היה לשלוט במשתנים כמו כמות השימוש האחרון במים, זמן האיסוף, גיל הצינורות וגיל הבית שממנו הגיעה הדגימה. זה לא היה פרוטוקול איסוף דגימות מאומת. כל חוקר צריך לפתח ולתקף את נהלי הגבייה שלו. עם זאת, לצורך גילוי מלא של השיטות, התיאור לעיל כלול. דיסקי הסינון מאפשרים ניתוח חוזר על אותו מצע למספר שיטות אנליטיות. אין צורך בתת-דגימה או בדגימות מרובות מחוץ לשכפולי ניסוי סטנדרטיים. ביטול הצורך בתת-דגימה ודגימות מרובות מגביר את הביטחון בלכידת מידע על יעדי שפע נמוך. בנוסף להפעלת שיטות ניתוח רב-מודאליות, דיסקי מסנן ה-SiN מספקים יתרון מובהק על פני מדיות סינון אנלוגיות אחרות בשל האיכות החוסכת בזמן של קצב סינון מהיר יותר ליחידת שטח¹⁵.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L זכוכית	Pyrex	1000-1L
1 L בקבוק איסוף ואקום מזכוכית	Millipore Sigma	Z290459-1EA
100% כותנה מעיל מעבדה	Landau	LA-3172
100 מ"ל משפך סינון זכוכית	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99% אלכוהול איזופרופיל	תוכנת Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX		EDX המשמשת לביצוע ניתוח EDX על חלקיקים שנלכדו.
Denton Prep Sputtering System	Denton Vacuum	DESK II:	מערכת ציפוי זהב
FIJI, פלטפורמת ניתוח תמונות	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI היא רק ImageJ) - הפצה של ImageJ
בקבוק זכוכית עם פקק בורג	קורנינג	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	תוכנת Horiba Scientific		Horiba Raman המכילה ParticleFinder ו-ViewSharp
קולט אדים זרימה למינארי	Air Science	VLF-72A
מיקרוסקופ	אולימפוס  / ניקון	BX61 / Ti2e	ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ עם פלואורסצנטיות מתאימה למיקרוסקופיה אופטית.
מסנני MPSN SiN	SiMPore Inc.	FD25-8.0-AU; FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
מזרקי מונו-ג'קט 60 מ"ל	Coviden	8881560265
אבקה אדומה	נילוס TCI	N0659
כפפות ניטריל	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		קוד פתוח, ספרייה ספקטרלית
תנור	VWR	1310	Gravity תנור שירות הסעה
P20 פיפטה	Brandtech	705872
קצה פיפטה	בקבוקוני פרימיום	GS 151140R
תמיכה נשפכת frit	Advantec	311000	חלק ממכשיר
רמאן	Horiba	Xplora PLUS
פקק גומי	Advantec	311000	חלק ממכשיר
SEM צרור	סדרת Ziess	Auriga	Auriga, אטמי סיליקון תחנת עבודה מודולרית
	Crossbeam SiMPore	GASKET-25-R	אטמי PDMS יצוקים שקופים, רולר סיליקון בעובי 0.8 מ"מ
	Sanyue	( ASIN: B07XDTNPS3)	רולר סיליקון -  8 x 5 x 2 אינץ'
תוכנת SmartSEM	Zeiss	V8	SEM המשמשת להפעלת בקבוק ספריי Zeiss Auriga
	מסנני מזרק Uline	S-7273
nbsp;	תרמו סיינטיפיק	CH2225-PES	0.22 ומיקרו; מסנני מזרק נעילת M Luer, 25 מ"מ
משאבת מזרק	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	אופציונלי, אך מומלץ
טריפן כחול - 0.4%	Millipore Sigma	T8154-20ML
פינצטה	SiMPore	K6TWZR
משאבת ואקום	Welch	847-676-8800
צינורות ואקום	Grainger	ZUSA-HT-4037