הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד תאים המכילים רטינואיד ריאה על ידי מיון תאים

849 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68205

⸱

11 באפריל 2025

 ,  , 
1Department of Animal Sciences, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Undergraduate Program in Biochemistry, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 3Rutgers Center for Lipid Research, 4Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול המתואר להלן הוא דרך פשוטה ויעילה לבודד תאים המכילים רטינואיד מאוכלוסיות תאי ריאה הטרוגניות מאוד על ידי שימוש באוטופלואורסצנציה ספציפית של רטינואיד ועל ידי שימוש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט.

תקציר

רטינואידים (ויטמין A והמטבוליטים שלו) הם מרכיב שומני חיוני במיקרו-סביבה המכתשית, ומטבוליזם רטינואיד ספציפי לסוג התא נדרש כדי לשמור על הבריאות התפקודית של הריאות המתפתחות והבוגרות. תאי ריאה משתמשים במסלולים ספציפיים, המאפשרים קליטה יעילה של רטינואידים במחזור הדם כרטינול (ROH), ואחריו המרה הדרגתית תוך תאית של ROH לזן הרטינואיד הפעיל מבחינה שעתוק, חומצה טרנס-רטינואית (ATRA). איתות בתיווך ATRA (או בתיווך רטינואיד) הוא חיוני לוויסות אלבאולריזציה של הריאות, ייצור פעילי שטח, אנגיוגנזה, חדירות וחסינות. חשוב לציין, תאי ריאה ספציפיים, כולל פיברובלסטים, יכולים לצבור רטינואידים בצורה של אסטרי רטיניל (RE), אותם ניתן לאחסן או לגייס עוד יותר כ-ROH להעברה לתאים השכנים בעת הצורך. ניתן לבודד ולאסוף תאים המכילים רטינואיד ריאה מהתרחיף התא הבודד של ריאות מעוכלות על ידי שימוש באוטופלואורסצנציה רטינואידית (הפליטה ב-455 ננומטר בעת עירור ב-350 ננומטר) ועל ידי שימוש במיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS). תיוג נוסף ספציפי לתאים in vivo של תאי ריאה עם חלבון פלואורסצנטי אדום מאפשר בידוד ואיסוף אוכלוסיות תאי ריאה ספציפיות המכילות רטינואיד. ניתן לנתח או לתרבית ישירות את התאים שנאספו לצורך ניתוחים נוספים של מורפולוגיה של תאים, ביטוי גנים והיענות למניפולציות פרמקולוגיות. טכניקה זו של בידוד ויישום חשובה למחקרי מודלים של בעלי חיים של בריאות הריאות ופגיעה ריאתית כדי לקבל תובנה מעמיקה יותר לגבי היבטים תאיים של חילוף חומרים רטינואיד בריאות ותקשורת תאית בתיווך שומנים.

מבוא

רטינואידים (ויטמין A והמטבוליטים שלו) הם מרכיב שומני חיוני במיקרו-סביבה המכתשית, ומטבוליזם ואיתות רטינואידים ספציפיים לסוג התא נדרשים כדי לשמור על הבריאות התפקודית של הריאה המתפתחת והבוגרת 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14. תאי ריאה משתמשים במסלולים ספציפיים, המאפשרים קליטה יעילה של רטינואידים שמקורם בתזונה במחזור הדם כמו רטינול (ROH)15,16,17,18,19, ואחריו המרה הדרגתית תוך תאית של ROH לזן הרטינואיד הפעיל מבחינה שעתוק, חומצה טרנס-רטינואית (ATRA)20. איתות בתיווך ATRA (או בתיווך רטינואיד) מושג באמצעות אינטראקציה של ATRA עם שלושת קולטני ההורמונים הגרעיניים המקבילים שלו, קולטני חומצה רטינואית (RARα, RARβ ו-RARγ21,22), והוא חיוני לוויסות אלבאולריזציה של הריאות 23,24,25,26,27,28,29, ייצור פעילי שטח 30,31,32,33,34,35, אנגיוגנזה36, חדירות37 וחסינות 38,39,40. חשוב לציין, תאי ריאה ספציפיים, במיוחד פיברובלסטים של הריאות, יכולים לצבור רטינואידים בצורה של אסטרי רטיניל (RE), אותם ניתן לאחסן או לגייס עוד יותר כ-ROH להעברה לתאים השכנים בעת הצורך1.

המורכבות של חילוף החומרים והאיתות של רטינואידים, כמו גם המורכבות התאית של הריאה, הופכים את המחקרים שמטרתם לחקור את חילוף החומרים של רטינואידים בריאה in vivo למאתגרים. תיארנו פרוטוקול פשוט וחזק לבידוד תאים המכילים רטינואיד (איור 1) מאוכלוסיות תאי ריאה הטרוגניות מאוד על ידי שימוש באוטופלואורסצנציה ספציפית של רטינואיד (הפליטה ב-455 ננומטר בעת עירור ב-350 ננומטר) ועל ידי שימוש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). הפרוטוקול אינו דורש תיוג תאים נוסף למעט צביעת כדאיות אם מטרת המחקר היא לבודד ולאפיין תאי ריאה חיים ראשוניים על סמך יכולתם לאחסן רטינואידים. זה מפחית משמעותית את זמן ההכנה למיון התאים, מבטל את הצורך בצביעה נוספת ומאפשר בידוד תפוקות גבוהות של תאים ראשוניים ברי קיימא. עם זאת, אם מטרת המחקר היא לבודד ולאפיין אוכלוסיות ספציפיות של תאי ריאה (פיברובלסטים, אנדותל, אפיתל או תאים חיסוניים), ניתן לבצע מיון תאים נוסף לאחר תיוג התאים הממויינים המכילים רטינואיד בנוגדנים ספציפיים לתא.

אוטופלואורסצנציה רטינואידית שימשה במחקרים שפורסמו כדי לקבוע את זהותם של תאים המכילים רטינואיד ו/או לכמת את השפע של תאים אלה בכבד 41,42,43,44, בלבלב 45,46, בכליות41,47 ובריאה41. יתרה מכך, מספר קבוצות מחקר דיווחו על שימוש בפלואורסצנטיות רטינואידים לבידוד על ידי FACS ולחקור תאים ראשוניים המכילים רטינואיד מרקמות חיות, כולל כבד 44,48,49,50,51,52,53 וריאה 1. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מראים כיצד ניתן לסמן אוכלוסיות תאים ספציפיות in vivo לפני בידוד תאים המכילים רטינואיד באמצעות tdTomato (חלבון פלואורסצנטי אדום). המאפיינים הספקטרליים של tdTomato (הפליטה ב-581 ננומטר בעת עירור ב-554 ננומטר54) והבהירות אינם מפריעים לאוטופלואורסצנציה של רטינואיד ולכן מקלים על השגת ספציפיות התא במהלך המיון. בהתחשב בתפקיד הקריטי של חילוף חומרים ואיתות רטינואידים ללא פשרות בתוך המיקרו-סביבה המכתשית הרגילה1, הטכניקה המתוארת של בידוד תאי ריאה היא כלי שימושי במחקרי מודלים של בעלי חיים של בריאות ומחלות ריאות כדי לקבל תובנה עמוקה יותר לגבי היבטים תאיים של חילוף חומרים רטינואיד בריאות ותקשורת תאית מתווכת שומנים in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים והניסויים המתוארים בעכברים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת ראטגרס (IACUC ID: PROTO202200111) על פי קריטריונים המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שהוכן על ידי האקדמיה הלאומית למדעים55.

1. שיקולים והכנות לניסוי

  1. גידול בעלי חיים ומניפולציות
    הערה: ניתן להשתמש בעכברים זכרים ונקבות בני שלושה חודשים (10-12 שבועות) במחקרים. לציטין: עכברים חסרי רטינול אצילטרנספראז (חסרי לרט, עכברי Lrat-/- 56) על רקע גנטי C57BL/6J וחברי המלטה תואמי גיל (סוג בר, עכברי Lrat+/+) שימשו בניסויים המתוארים. עכברים המבטאים את הגן tdTomato בפיברובלסטים (עכברי F-tdT) נוצרו על ידי הכלאה של עכברים שהכילו קלטת כתב tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, זן מעבדת ג'קסון #007914) עם עכברי Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, זן מעבדת ג'קסון #029567).
    1. השתמש במודל העכבר המבטא Cre, אחת מהאפשרויות הרבות הזמינות לתיוג אוכלוסיית תאי היעד in vivo.
      הערה: בהתאם לבחירת תא המטרה, ביטוי Cre, היעילות של רקומבינציה בתיווך Cre וספציפיות התא, החוקרים עשויים להשתמש בכל מודל עכבר אמין המבטא Cre.
    2. השתמש בביטוי טרנסגן tdTomato (לאחר טיפול בטמוקסיפן כמתואר להלן) כדי לתייג פיברובלסטים Col1a2+ , ולאחר מכן בידודם מתרחיפים של תאים בודדים של הריאה המעוכלת כמתואר להלן.
  2. רקומבינציה מתווכת Cre והפעלת טרנסגנים in vivo
    1. לגרום לביטוי Cre בעכברי F-tdT באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) של 2 מ"ג טמוקסיפן אחת ל-24 שעות למשך 5 ימים רצופים.
    2. יש לחטא את מקום ההזרקה עם 70% אתנול לפני ההזרקה. השתמש בעכברים לניסויים חודש לאחר הזרקת הטמוקסיפן הסופית.
    3. בדוק את היעילות של Cre-recombination לפני ניסויי המיון. אשר את הרקומבינציה היעילה של Cre וביטוי tdTomato על ידי בידוד אוכלוסיית תאי המטרה של פיברובלסטים ריאתיים מעכברי F-tdT שטופלו בטמוקסיפן באמצעות חרוזים מגנטיים נגד Pdgfrα ומיון תאים מופעל מגנטי (MACS).
  3. הכנת פתרונות, כלי פלסטיק וזכוכית
    הערה: יש להקפיד על טכניקות אספטיות עבור ההליכים המתוארים להלן. ההליכים הכוללים הכנת תמיסה, עיכול רקמות ובידוד תאים צריכים להיעשות מתחת למכסה המנוע הלמינר. יש לעקר תמיסות על ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר; יש לעקר כלים כירורגיים כמו גם כלי מעבדה על ידי חיטוי.
    1. מתחת למכסה המנוע, הכינו את תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס, נטולת סידן ומגנזיום (HBSS ללא Ca2+/Mg2+, המכילה 5.3 מ"מ KCl, 0.4 מ"מ KH2PO4, 4.2 מ"מ NaHCO3, 137.9 מ"מ NaCl, 0.3 מ"מ Na2HPO4, 5.6 מ"מ D-גלוקוז) לזלוף ריאות (5 מ"ל לעכבר). עקרו את התמיסה באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר ומלאו את המזרק בתמיסה.
    2. מתחת למכסה המנוע, הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס עם סידן ומגנזיום (HBSS עם Ca2+/Mg2+, המכילה 1.3 מ"מ CaCl2, 0.5 MgCl2·6H2O, 0.4 מ"מ MgSO4·7H2O, 5.3 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 4.2 mM NaHCO3, 137.9 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 5.6 mM D-Glucose), המכילים 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV ו-1 מ"ג/מ"ל של דיספאז עבור זלוף הריאות (10 מ"ל לעכבר). עקרו את התמיסה באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר ומלאו את המזרק בתמיסה.
    3. מתחת למכסה המנוע הלמינר, הכינו HBSS עם Ca2+/Mg2+, המכיל 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I לעיכול ריאות (10 מ"ל לעכבר). עקרו את התמיסה באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר ומלאו את המזרק בתמיסה.
    4. מתחת למכסה המנוע הלמינר, מלאו צלחת תרבית תאים (35 מ"מ 10 מ"מ, צלחת אחת לכל ריאה שנאספה מעכבר אחד) ב -2 מ"ל HBSS סטרילי עם Ca2+/Mg2+. מניחים את הכלים המכילים HBSS עם Ca2+/Mg2+ על קרח.

2. זלוף ריאות, עיכול ואיסוף תרחיף חד-תאי

  1. הרדמת העכבר על ידי מתן קוקטייל הרדמה המכיל 10 מ"ג/מ"ל קטמין ו-2 מ"ג/מ"ל קסילזין במינון של 0.01 מ"ל/גרם משקל גוף באמצעות הזרקת IP.
  2. ודא שהעכבר נמצא במצב עמוק של חוסר הכרה על ידי הערכת תגובת צביטה בבוהן. הסר את השיער הרופף והלכלוך/פסולת הגלויים מאתר הניתוח, מהדק ונגב את אזור הניתוח באמצעות 70% אלכוהול לחיטוי.
  3. בעזרת כלי ניתוח סטריליים, פתח את חללי הבטן והחזה. חותכים את הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את הריאות והלב.
    הערה: זה יבטיח מוות מיידי מכיוון שבית החזה יגרום להפסקת נשימה בזמן שהעכבר מורדם; אם מבוצע כראוי, חלק זה של ההליך ייקח עד 3 דקות מתחילת ההליך ועד לכריתת בית החזה, ולאחר מכן מותו של בעל החיים.
  4. חותכים את הווריד הנבוב התחתון ומורחים כרית סופגת כדי לספוג את הדם המשוחרר.
  5. לחלחל את הריאות באתרן דרך החדר הימני של הלב באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 25 גרם X 1 אינץ' מלאה ב-5 מ"ל של HBSS סטרילי ללא Ca2+/Mg2+. אם הזלוף יצליח, רקמת הריאה תהפוך לבנה.
  6. יש להחדיר את הריאות באתרן באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 25 גרם X 1 אינץ' מלאה ב-10 מ"ל של HBSS סטרילי עם Ca2+/Mg2+, המכיל קולגנאז מסוג IV (0.3 מ"ג/מ"ל) ודיספאאז (1 מ"ג/מ"ל).
  7. הסר את הריאות והעביר אותן לתבנית תרבית תאים (35 מ"מ X 10 מ"מ) עם 2 מ"ל HBSS סטרילי עם Ca2+/Mg2+.
  8. מתחת למכסה המנוע הלמינר, שטפו את הריאות וטחנו אותן לחתיכות קטנות באמצעות להב כירורגי סטרילי (#20, מתאים לידית #4). העבירו את הריאה הטחונה לתוך שפופרת של 15 מ"ל על ידי הוספת 5 מ"ל הראשונים של HBSS עם Ca2+/Mg2+ המכילים 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I לרקמה הטחונה והעברתה באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. אסוף והעביר את שאריות הרקמה הטחונה הנותרות על ידי שטיפת צלחת תרבית התאים עם 5 מ"ל הנותרים של HBSS עם Ca2+/Mg2+ המכיל 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I.
  9. דגרו את רקמת הריאה הטחונה ב-HBSS עם Ca2+/Mg2+ המכיל 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I על שייקר מסתובב שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. בכל אחד משלושת המרווחים של 15 דקות, מתחת למכסה המנוע הלמינר, העבירו את הרקמה הטחונה 10 פעמים דרך פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי להפריד טוב יותר את התאים.
  10. העבירו את תרחיף התאים שנוצר דרך מסננת של 100 מיקרומטר כדי לאסוף תאים בודדים לתוך צינור של 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים (תמיסת מלח פיזיולוגית המכילה 20 מ"מ HEPES, pH 7.4) המכילה פחות מ-5% מסרום בקר עוברי (FBS). אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים והשאירו את הצינור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לסלק אריתרוציטים. הוסף 20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  12. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. העבירו את תרחיף התאים שנוצר דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי לאסוף תאים בודדים לתוך שפופרת של 50 מ"ל המכילה 20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  13. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-10 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. ספרו את התאים והתאימו את ריכוז התאים ל-~5-10 x 106 תאים/מ"ל.

3. בידוד תאי ריאה המכילים רטינואיד באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)

  1. קח מנה של תרחיף תאים והניח אותו בצד כדי לשמש כבקרת שער לא מוכתמת. הוסף צבע כדאיות SYTOX Green לתרחיף התא הנותר (דילול 1:1000, ריכוז סופי 30 ננומטר).
  2. העבירו מתלי תאים דרך המסנן המחובר לצינור איסוף הפוליסטירן 5 מ"ל (12 x 75 מ"מ).
  3. המשך בבידוד תאי FACS על ידי מיון תאים חיים בודדים המכילים רטינואיד על סמך פליטתם ב-455 ננומטר. בצע אפליה בודדת ברצף באמצעות תרשים לפיזור קדימה (גובה פיזור קדימה/FSC-H לעומת אזור פיזור קדימה/FSC-A). אל תכלול תאים מתים לפי מאפייני פיזור (פיזור צד) וצביעה בירוק SYTOX.
  4. שער, מיון ואיסוף תאים בודדים, חיים, המכילים רטינואיד באמצעות פליטה ב-455 ננומטר בעת עירור ב-350 ננומטר.
    הערה: באמצעות ההליך המתואר, ניתן לאסוף כ-5.105 תאי ריאה המכילים רטינואיד מריאת עכבר אחת.
  5. לבצע ניתוח נתוני FACS באמצעות תוכנת זרימה ציטומטרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד תאים המכילים רטינואיד ריאה
ריאות עכברים (מעכברי Lrat+/+ ו-Lrat-/-) עוכלו אנזימטית, ותרחיפים חד-תאיים הוכנו ועברו ל-FACS בהתאם לנוהל המתואר לעיל. מיון תאים ואיסוף נתונים בוצעו במערכת מיון תאים של Cytek Aurora™ המופעלת על ידי תוכנת SpectroFlo CS גרסה 1.3.0 באמצעות זרבובית של 100 מיקרומטר ולחץ של 15 psi. ראשית, עלילות לפיזור קדימה (גובה פיזור קדימה/FSC-H לעומת אזור פיזור קדימה/FSC-A) יושמו על בחירה ושער של תאים בודד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היכולת של זיהוי ויטמין A ברקמות אנושיות ובעלי חיים והדמיה היסטולוגית שלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דווחה לראשונה כבר בשנות ה-40 של המאה ה-2059,60. התופעה של אוטופלואורסצנציה רטינואידית יושמה בהצלחה במחקרים שמטרתם לאתר ריכוזים גבוהים של ויטמין A ברקמות במבחנה61 ולאפיין את המורפוגנזה של רקמות עובריות של בעלי חיים62 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מאוחר יותר נצפה ואוש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (ל-IS), פרס פיתוח קריירה (ל-IS) ממרכז ראטגרס לחשיפות סביבתיות ומחלות במימון המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIH/NIEHS) P30 ES005022, וקרנות סטארט-אפ מראטגרס, אוניברסיטת מדינת ניו ג'רזי (ל-I.S). המחברים מבקשים להודות לצוות המשאב המשותף לניטור חיסוני וזרימה ציטומטרית במכון הסרטן של ראטגרס (בתמיכה, חלקית, במימון NCI-CCSG P30CA072770-5920) על תרומתם לעבודה המוצגת בכתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיפטה סרולוגית 10 מ"לAvantor/VWR76452-284
100 ומיקרו; מסננת M גריינר ביו-וואן542000
צינור בז 15 מ"לקורנינג352099
40 ומיקרו; מסננת M גריינר ביו-וואן542040
צינור בז 50 מ"לקורנינג352070
צלחת תרבית תאים, 35 מ"מ וחריפה; 10 מ"מקורנינג430165
אמצעי מיון תאיםGibcoA59688DJ
קולגנאז מסוג IV תאגיד הביוכימיה וורת'ינגטוןLS004188 
מערכת מיון תאים Cytek Aurora Cytek Biosciences
Dispase IISigma-AldrichD4693
DNase ISigma-AldrichDN25
Falcon מותג Falcon צינור תחתון עגול 5 מ"ל פוליפרופילן, 12 מ"מ וחריף; 75 מ"מCorning352063
Falcon מותג Falcon צינור עגול תחתון פוליסטירן 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים, 12 מ"מ וחריף;קורנינג
תוכנת FlowJo Becton Dickinsonזרימה ציטומטריית
תוכנה HBSS עם Ca2+/Mg2+Gibco14925-092
HBSS ללא Ca2+/Mg2+Gibco14175-095
Nalgene Rapid-Flow סטרילי חד פעמי בקבוק למעלה מסננים ThermoFisher595-3320
Red Cell lysis מאגרתוכנת Sigma-AldrichR7757
SpectroFlo CS Cytek Biosciencesגרסה 1.3.0 
עיצוב כירורגי Royaltek נירוסטה להבי אזמל כירורגייםפישר סיינטיפיק22-079-683
SYTOX כתם תאים מתים ירוקInvitrogenS34860
TamoxifenSigma-AldrichT2859
352235 75 מ"מ

מקורות

  1. Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
  2. Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I. Retinoic acid increases surfactant protein mRNA in fetal rat lung in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 271 (5), L862-L868 (1996).
  3. Ng-Blichfeldt, J. -P., et al. Retinoic acid signaling balances adult distal lung epithelial progenitor cell growth and differentiation. EBioMedicine. 36, 461-474 (2018).
  4. Chen, F., et al. Prenatal retinoid deficiency leads to airway hyperresponsiveness in adult mice. J Clin Invest. 124 (2), 801-811 (2014).
  5. Esteban-Pretel, G., Marin, M. P., Renau-Piqueras, J., Barber, T., Timoneda, J. Vitamin A deficiency alters rat lung alveolar basement membrane: reversibility by retinoic acid. J Nutr Biochem. 21 (3), 227-236 (2010).
  6. Massaro, G. D., Massaro, D. Postnatal treatment with retinoic acid increases the number of pulmonary alveoli in rats. Am J Physiol. 270 (2 Pt 1), L305-L310 (1996).
  7. Hind, M., Maden, M. Retinoic acid induces alveolar regeneration in the adult mouse lung. Eur Respir J. 23 (1), 20-27 (2004).
  8. Belloni, P. N., Garvin, L., Mao, C. P., Bailey-Healy, I., Leaffer, D. Effects of all-trans-retinoic acid in promoting alveolar repair. Chest. 117 (5 Suppl 1), 235S-241S (2000).
  9. Veness-Meehan, K. A., Bottone, F. G. Jr, Stiles, A. D. Effects of retinoic acid on airspace development and lung collagen in hyperoxia-exposed newborn rats. Pediatr Res. 48 (4), 434-444 (2000).
  10. Cho, S. J., George, C. L., Snyder, J. M., Acarregui, M. J. Retinoic acid and erythropoietin maintain alveolar development in mice treated with an angiogenesis inhibitor. Am J Respir Cell Mol Biol. 33 (6), 622-628 (2005).
  11. Massaro, G. D., Massaro, D. Retinoic acid treatment abrogates elastase-induced pulmonary emphysema in rats. Nat Med. 3 (6), 675-677 (1997).
  12. Stinchcombe, S. V., Maden, M. Retinoic acid induced alveolar regeneration: critical differences in strain sensitivity. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (2), 185-191 (2008).
  13. Fraslon, C., Bourbon, J. R. Retinoids control surfactant phospholipid biosynthesis in fetal rat lung. Am J Physiol. 266 (6 Pt 1), L705-L712 (1994).
  14. Zachman, R. D. Role of vitamin A in lung development. J Nutr. 125 (6 Suppl), 1634s-1638s (1995).
  15. van Bennekum, A. M., et al. Lipoprotein lipase expression level influences tissue clearance of chylomicron retinyl ester. J Lipid Res. 40 (3), 565-574 (1999).
  16. Blaner, W. S., et al. Lipoprotein lipase hydrolysis of retinyl ester: possible implications for retinoid uptake by cells. J Biol Chem. 269 (24), 16559-16565 (1994).
  17. Trites, M. J., Febbraio, M., Clugston, R. D. Absence of CD36 alters systemic vitamin A homeostasis. Sci Rep. 10 (1), 20386(2020).
  18. Wassef, L., Quadro, L. Uptake of dietary retinoids at the maternal-fetal barrier: in vivo evidence for the role of lipoprotein lipase and alternative pathways. J Biol Chem. 286 (37), 32198-32207 (2011).
  19. Spiegler, E., Kim, Y. -K., Wassef, L., Shete, V., Quadro, L. Maternal-fetal transfer and metabolism of vitamin A and its precursor β-carotene in the developing tissues. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1821 (1), 88-98 (2012).
  20. Kedishvili, N. Y. Enzymology of retinoic acid biosynthesis and degradation. J Lipid Res. 54 (7), 1744-1760 (2013).
  21. Channabasappa, S., Caldwell, S., Kanthan, R., Singh, B. Retinoid receptors are expressed in mouse and human lungs. Anat Rec. 305 (9), 2281-2289 (2022).
  22. Kimura, Y., et al. Retinoid receptors in the developing human lung. Clin Sci (Lond). 103 (6), 613-621 (2002).
  23. Yang, L., Naltner, A., Yan, C. Overexpression of dominant negative retinoic acid receptor alpha causes alveolar abnormality in transgenic neonatal lungs. Endocrinology. 144 (7), 3004-3011 (2003).
  24. Snyder, J. M., et al. Alveolarization in retinoic acid receptor-beta-deficient mice. Pediatr Res. 57 (3), 384-391 (2005).
  25. Gao, R. -w, et al. Retinoic acid promotes primary fetal alveolar epithelial type II cell proliferation and differentiation to alveolar epithelial type I cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (5), 479-487 (2015).
  26. Dirami, G., et al. Lung retinol storing cells synthesize and secrete retinoic acid, an inducer of alveolus formation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (2), L249-L256 (2004).
  27. Massaro, G. D., Massaro, D., Chambon, P. Retinoic acid receptor-alpha regulates pulmonary alveolus formation in mice after, but not during, perinatal period. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 284 (2), L431-L433 (2003).
  28. Massaro, G. D., et al. Retinoic acid receptor-beta: an endogenous inhibitor of the perinatal formation of pulmonary alveoli. Physiol Genomics. 4 (1), 51-57 (2000).
  29. McGowan, S., et al. Mice bearing deletions of retinoic acid receptors demonstrate reduced lung elastin and alveolar numbers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23 (2), 162-167 (2000).
  30. Yan, C., et al. Retinoic acid-receptor activation of SP-B gene transcription in respiratory epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 275 (2), L239-L246 (1998).
  31. Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Inhibition of hSP-B promoter in respiratory epithelial cells by a dominant negative retinoic acid receptor. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 276 (3), L398-L404 (1999).
  32. Yang, L., et al. Synergy between signal transducer and activator of transcription 3 and retinoic acid receptor-α in regulation of the surfactant protein b gene in the lung. Mol Endocrinol. 18 (6), 1520-1532 (2004).
  33. Metzler, M. D., Snyder, J. M. Retinoic acid differentially regulates expression of surfactant-associated proteins in human fetal lung. Endocrinology. 133 (5), 1990-1998 (1993).
  34. George, T. N., Snyder, J. M. Regulation of surfactant protein gene expression by retinoic acid metabolites. Pediatr Res. 41 (5), 692-701 (1997).
  35. Naltner, A., Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Retinoic acid stimulation of the human surfactant protein B promoter is thyroid transcription factor 1 site-dependent. J Biol Chem. 275 (1), 56-62 (2000).
  36. Ng-Blichfeldt, J. P., et al. Deficient retinoid-driven angiogenesis may contribute to failure of adult human lung regeneration in emphysema. Thorax. 72 (6), 510-521 (2017).
  37. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cell Signal. 65, 109421(2020).
  38. Mamidi, S., Hofer, T. P., Hoffmann, R., Ziegler-Heitbrock, L., Frankenberger, M. All-trans retinoic acid up-regulates prostaglandin-e synthase expression in human macrophages. Immunobiology. 217 (6), 593-600 (2012).
  39. Hashimoto, S., et al. Retinoic acid differentially regulates interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist production by human alveolar macrophages. Leuk Res. 22 (11), 1057-1061 (1998).
  40. Li, S., Lei, Y., Lei, J., Li, H. Alltrans retinoic acid promotes macrophage phagocytosis and decreases inflammation via inhibiting CD14/TLR4 in acute lung injury. Mol Med Rep. 24 (6), (2021).
  41. Nagy, N. E., et al. Storage of vitamin A in extrahepatic stellate cells in normal rats. J Lipid Res. 38 (4), 645-658 (1997).
  42. Thompson, K. C., et al. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation in vitro. Hepatology. 28 (6), 1518-1524 (1998).
  43. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (3), 232-240 (2000).
  44. D'Ambrosio, D. N., et al. Distinct populations of hepatic stellate cells in the mouse liver have different capacities for retinoid and lipid storage. PLoS One. 6 (9), e24993(2011).
  45. Apte, M. V., et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture. Gut. 43 (1), 128-133 (1998).
  46. Kim, N., et al. Formation of vitamin A lipid droplets in pancreatic stellate cells requires albumin. Gut. 58 (10), 1382-1390 (2009).
  47. Kida, Y., et al. Characterization of vitamin A-storing cells in mouse fibrous kidneys using Cygb/STAP as a marker of activated stellate cells. Arch Histol Cytol. 70 (2), 95-106 (2007).
  48. Ogawa, T., et al. Identification of vitamin A-free cells in a stellate cell-enriched fraction of normal rat liver as myofibroblasts. Histochem Cell Biol. 127 (2), 161-174 (2007).
  49. Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
  50. Bartneck, M., et al. Isolation and time lapse microscopy of highly pure hepatic stellate cells. Anal Cell Pathol (Amst). , (2015).
  51. Balaphas, A., et al. Optimized isolation and characterization of C57BL/6 mouse hepatic stellate cells. Cells. 11 (9), (2022).
  52. Kubota, H., Yao, H. L., Reid, L. M. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2339-2349 (2007).
  53. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. Eur J Histochem. 65 (4), (2021).
  54. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  55. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , The National Academies Press. Washington DC. (2011).
  56. O'Byrne, S. M., et al. Retinoid absorption and storage is impaired in mice lacking lecithin: retinol acyltransferase (LRAT). J Biol Chem. 280 (42), 35647-35657 (2005).
  57. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  58. McGowan, S. E. The lipofibroblast: more than a lipid-storage depot. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 316 (5), L869-L871 (2019).
  59. Meyer, K. A., Popper, H., Ragins, A. B. Histologic distribution of vitamin A in biopsy specimens of the liver. Arch Surg. 43 (3), 376-385 (1941).
  60. Popper, H. L. Histological demonstration of vitamin A in rats by means of fluorescence microscopy. Proc Soc Exp Biol Med. 43, 133-136 (1940).
  61. Van Exan, R. J., Hardy, M. H. Localization of vitamin A by autofluorescence during induced metaplastic changes in cultures of skin. In Vitro. 15 (8), 631-640 (1979).
  62. Schweigert, F. J., Siegling, C., Tzimas, G., Seeger, J., Nau, H. Distribution of endogenous retinoids, retinoid binding proteins (RBP, CRABPI) and nuclear retinoid X receptor beta (RXRbeta) in the porcine embryo. Reprod Nutr Dev. 42 (4), 285-294 (2002).
  63. Wake, K. Perisinusoidal stellate cells (fat-storing cells, interstitial cells, lipocytes), their related structure in and around the liver sinusoids, and vitamin A-storing cells in extrahepatic organs. Int Rev Cytol. 66, 303-353 (1980).
  64. Senoo, H., Kojima, N., Sato, M. Vitamin A-storing cells (stellate cells). Vitam Horm. 75, 131-159 (2007).
  65. Senoo, H., et al. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative--past, present and future. Cell Biol Int. 34 (12), 1247-1272 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד תאים המכילים רטינואיד ריאה על ידי מיון תאים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.