הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

מכיוון שצמחים הם אורגניזמים יושבים, נביטת זרעים היא אירוע מכריע הקובע את גורלם. ההחלטה לנבוט מוסדרת בקפדנות על ידי גורמים פנימיים וסביבתיים כאחד, כגון רמות תרדמת זרעים ראשוניים, טמפרטורה, עוצמת אור ואורך גל וריכוז חנקן 1,2,3,4,5,6. לזרעים מבנים מורכבים המורכבים ממספר סוגי רקמות⁷. בזרעים יבשים של Arabidopsis, העובר, המתפתח לשתיל, מוקף בשכבה אחת של אנדוספרם והשכבות החיצוניות ביותר, האשך. האשך מורכב משכבות מרובות של תאים מתים, בעוד שהעובר והאנדוספרם נשארים בחיים גם בזרעים יבשים. האנדוספרם נחשב בדרך כלל כרקמת אחסון המספקת חומרים מזינים לצמיחת העובר, ויחד עם האשך, מעניקה עמידות מכנית לבליטת רדיקל 8,9,10,11,12,13.

מספר מחקרים שנערכו לאחרונה הראו כי האנדוספרם ממלא תפקיד חיוני בוויסות נביטת זרעים אופטימלית 14,15,16,17. לדוגמה, קולטן האור פיטוכרום B (PHYB) בתאי אנדוספרם מזהה אור אדום (R) או אדום רחוק (FR), ומווסת את תגובות הנביטה¹⁵. האנדוספרם מתפקד גם כרקמה חישת טמפרטורה, ומדכא תגובות נביטה בטמפרטורות גבוהות¹⁶. בקרת איכות של האנדוספרם היא קריטית לנביטת זרעים אופטימלית, במיוחד בזרעים המאוחסנים לטווח ארוך¹⁷.

הדמיית תאים חיים נחוצה כעת כדי להבהיר עוד יותר את התפקודים הפיזיולוגיים של האנדוספרם. ניתוח מיקרוסקופי של תאי אנדוספרם שלמים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם האנדוספרם מווסת את נביטת הזרעים. עם זאת, הכנת תאי אנדוספרם שלמים לתצפית מיקרוסקופית היא מאתגרת, במיוחד בזרעי ארבידופסיס . קוטר הזרעים הוא כ-0.4 מ"מ, והאנדוספרם הוא שכבה חד-תאית הממוקמת בין העובר לאשכה, מה שמקשה על מניפולציה מדויקת. כתוצאה מכך, למרות תפקידיו הפיזיולוגיים החשובים, האנדוספרם נצפה לעתים רחוקות באמצעות הדמיית תאים חיים.

מאמר זה מציג פרוטוקול להכנה מהירה של דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות המתאימות להדמיית תאים חיים הן בזרעים מתפתחים והן בזרעים בוגרים.

במחקר זה נקבעו שני נהלים שונים להכנת דגימות שכבת תאי אנדוספרם חיים: אחד לפיתוח זרעים ואחד לזרעים בוגרים. נדרשות גישות שונות במקצת בהתאם למוצקות האשך. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימות אנדוספרם שלמות מזרעים מתפתחים

1. אוסף סיליקיות
   1. גדל צמחי Arabidopsis על אדמה או צמר סלעים עד לפריחה.
   2. סמן פרחים שנפתחו במלואם בחוטים צבעוניים (0 ימים לאחר הפריחה, 0 DAF).
      הערה: הימנע משימוש בחוטים ירוקים, צהובים או חומים לסימון פרחים, מכיוון שקשה להבחין בין צבעים אלה לבין צמחים גדלים או בוגרים וסיליקות.
   3. חותכים את הסיליקיות המתפתחות המסומנות בפדיקל (מצוין באיור 1(1)) ואוספים אותם בצינורות של 1.5 מ"ל.
      הערה: פיתוח סיליקיות מ-12-16 DAF מתאים להכנה באמצעות פרוטוקול זה.
2. דיסקציה של זרעים מתפתחים
   הערה: יש לבצע את השלבים הבאים על נייר סינון רטוב כדי להגן על הדגימות מפני התייבשות. מניפולציות צריכות להיעשות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   1. פיצול שסתום (מצוין באיור 1(2)) מהשסתום (מצוין באיור 1(1)) באמצעות שני מלקחיים: האחד עם קצות עבים לאחיזה והשני עם קצות חדים לקריעה).
   2. אספו בעדינות זרעים מתפתחים מהסיליקיות באמצעות מלקחיים כשהקצוות סגורים כדי להימנע מפגיעה בזרעים (איור 1(2)).
   3. החזיקו את הזרע עם מלקחיים מבלי לרסק את הזרע, צרו צלקת בגודל של כ-0.2 מ"מ על האשך והאנדוספרם המקיפים את העובר באמצעות מחט הזרקה (27 גרם, 0.40 מ"מ × 19 מ"מ) (איור 1(3)).
      הערה: המיקום האופטימלי ליצירת הצלקת הוא בצומת הקוטילדון והרדיקל.
   4. דחפו את העובר החוצה על ידי צביטת הזרע עם מלקחיים (איור 1(4)). אל תמעכו את מעטפת הזרע הריקה, המורכבת מהאשך והאנדוספרם, ונסו לשמור על צורתה העגולה.
   5. הכניסו את מחט ההזרקה לתוך מעטפת הזרעים הריקה בצלקת, ונקבו אותה מבפנים החוצה (איור 1(5)).
   6. שמור את המחט במקומה, גרד את פני האשך באמצעות מלקחיים כשהקצוות סגורים, וחתוך צד אחד של מעטפת הזרעים הריקה כדי לאפשר לה להיפתח (איור 1(6)).
   7. פתחו את מעטפת הזרעים הריקה לתוך גיליון באמצעות מלקחיים עם קצוות חדים (איור 1(7)). כעת יש לבודד את הדגימה כיריעה דו-שכבתית המורכבת משכבות האנדוספרם והאשך (איור 1(8)).
      הערה: אם הדגימה נוטה להתכרבל כאשר מים משמשים כאמצעי ההרכבה בשלב 3 להלן, חלקו את הדגימה בצורת גיליון לשני חלקים. זרעים שנקטפו מסיליקים בסביבות 18 DAF (בשלב זה, האשך חום אך עדיין לא יבש לחלוטין) ניתנים לעיבוד באמצעות פרוטוקול זה, אם כי יש לספוג את הזרעים מספר דקות לפני ההכנה.

2. הכנת דגימות אנדוספרם שלמות מזרעים בוגרים

1. ספיגת זרעים בוגרים
   1. הוסף 1 מ"ל מים מזוקקים כפולים לצינור של 1.5 מ"ל המכיל זרעי ארבידופסיס יבשים.
   2. שמור את הזרעים ספוגים לפחות 40 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2(1)).
      הערה: זרעים יבשים וזרעים תוך 40 דקות מרגע ההטמעה קשים לצלקת באשך ובאנדוספרם ולהוציא את העובר מתוך הזרע מבלי לפגוע במעטפת הזרעים הריקה בשלבים 2.2.1 ו-2.2.2, בעוד שזמן ספיגה ארוך יותר מקל על מניפולציה.
   3. השתמש במיקרופיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להעביר את הזרעים הספוגים על נייר סינון רטוב.
2. חיתוך זרעים בוגרים
   הערה: יש לבצע את השלבים הבאים על נייר סינון רטוב כדי להגן על הדגימות מפני התייבשות. מניפולציות צריכות להתבצע תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   1. החזיקו את הזרע עם מלקחיים מבלי לרסק את הזרע, צרו צלקת בגודל של כ-0.2 מ"מ על האשך והאנדוספרם שמקיפים את העובר באמצעות מחט הזרקה (איור 2(2)).
   2. דחפו את העובר החוצה על ידי צביטה של הזרע עם מלקחיים (איור 2(3)). אין לרסק את מעטפת הזרע הריקה, הכוללת את האשך והאנדוספרם. נסו לשמור על צורתו העגולה.
   3. חותכים את הצדדים העליונים והתחתונים של מעטפת הזרעים הריקה בעזרת מחט הזרקה כדי לעצב אותה לגליל (איור 2(4)).
   4. חתכו את מעטפת הזרעים הריקה בצורת גליל לאורך הציר המרכזי שלה כדי להפריד אותה לשני חלקים (איור 2(5)). יש לבודד את הדגימות כיריעות דו-שכבתיות המורכבות משכבת האנדוספרם ושכבת האשך (איור 2(6)).

3. תצפית מיקרוסקופית

1. הנח את דגימות האנדוספרם בצורת יריעה על מגלשת זכוכית והרכיב אותן במים או בפרפלואורודקלין (PFD).
   הערה: אם נשארות בועות אוויר בין הדגימה לכיסוי, פרפלואורודקלין (PFD), שדווח כשימושי במיוחד להדמיית דגימות המכילות כיסי אוויר, כגון עלים^18,19, יהיה שימושי. ידוע כי ל-PFD יש את מתח הפנים הנמוך ביותר, המאפשר לו למלא בקלות את חללי האוויר על משטח הדגימה. עם זאת, עבור הדמיית זמן-lapse, מומלץ להשתמש במים כמדיום הרכבה, שכן תכולת המים בזרעים בוגרים צריכה להיות בשפע כדי לשמור על נזילות התאים.
2. הנח כיסוי בעדינות מעל הדגימה. ודא ששכבת האנדוספרם פונה לכיסוי.
   הערה: ניתן להשתמש בלק או גריז לאיטום קצוות הכיסוי כדי למנוע ייבוש של הדגימה ואמצעי ההרכבה.

באמצעות הפרוטוקול שמוצג באיור 1, דגימות אנדוספרם הוכנו מפיתוח זרעים שנקטפו מסיליקים ב-14 DAF (בשלב זה, האשך עדיין ירוק). תאי אנדוספרם רבים על פני שטח גדול והמבנים התוך-תאיים שלהם נצפו (איור 3A). בניסוי זה נעשה שימוש בזרעים המבטאים PHYB שהתמזגו עם GFP בקצה C (PHYB-GFP). ידוע היטב ש-PHYB עובר טרנסלוקציה לגרעין עם הפעלה על ידי אור אדום ויוצר כתמים חיוביים ל-PHYB, הידועים בשם פוטו-גופים (PBs), המעורבים בנביטת זרעים 4,20,21,22. הדגימות נאספו מצמחים שגדלו בתנאי אור לבן רציף בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. כפי שמוצג באיור 3B, PBs בתוך הגרעין זוהו בתאי אנדוספרם. תוצאה זו תואמת למחקר קודם שהראה כי PHYB באנדוספרם מווסת את נביטת הזרעים האופטימלית15. בנוסף, נערכה הדמיית זמן-lapse של תאים חיים כדי לאשר שתאי האנדוספרם המבודדים שמרו על פעילות ביולוגית גם לאחר הכנת הדגימה על ידי התבוננות בפוטו-הפיכות FR/R של פיטוכרום (איור 3C). דגימות אנדוספרם הוכנו מפיתוח זרעים שנקטפו מסיליקים בסביבות 17-18 DAF. PBs התגלו בתוך הגרעין בעת הדיסקציה, בעוד שהם נעלמו לחלוטין לאחר הקרנה באור אדום רחוק. לאחר מכן, קרינת אור אדום גרמה שוב ל-PBs. הפיכות הפוטוכרום הזו זוהתה פעמיים, מה שמצביע על כך שתאי האנדוספרם שבודדו על ידי פרוטוקול זה שמרו על פעילות ביולוגית לפחות 4.5 שעות לאחר הדיסקציה (איור 3C).

לאחר מכן, הוכנו דגימות אנדוספרם מזרעים בוגרים (שבהם האשך חום), כפי שמוצג באיור 2. בניסוי זה, התנועתיות של המיטוכונדריה נצפתה באמצעות זרעים המבטאים GFP ממוקד מיטוכונדריה (mtGFP)23, שאוחסנו בחומר ייבוש בטמפרטורת החדר בחושך במשך כשנה לאחר הקטיף. דווח כי המיטוכונדריה בעובר נעים באופן פעיל ומשנים באופן דינמי את המורפולוגיה לאחר אימביביטציה והעברה לתנאי נביטה24. הדמיה פלואורסצנטית של המיטוכונדריה בתאי אנדוספרם שלמים לאחר 3 שעות של ספיגת זרעים בוצעה, וזוהתה תנועה מיטוכונדריאלית (סרטון משלים 1). המיטוכונדריה באנדוספרם נעה מיד בתוך הציטוזול לאחר תקופה קצרה של ספיגה ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר יום אחד של ספיגת זרעים ב-22 מעלות צלזיוס, נצפו מיטוכונדריה הנעים באופן דינמי יותר (איור 4 וסרטון משלים 2).

איור 1: הכנת דגימת אנדוספרם מפיתוח זרעים. שלב 1: שסתום מפוצל מהשזיף. שלב 2: הזרעים המתפתחים נאספים. שלב 3: נוצרת צלקת על האשך והאנדוספרם באמצעות מחט הזרקה. שלב 4: מסירים את העובר על ידי צביטת הזרע בעזרת מלקחיים. שלב 5: מחט ההזרקה מוחדרת דרך מעטפת הזרע הריקה מבפנים כלפי חוץ. שלב 6: משטח האשך נשרט באמצעות מלקחיים. שלב 7: מעטפת הזרעים הריקה נפתחת לצורת גיליון באמצעות מלקחיים. שלב 8: דגימת גיליון האנדוספרם הסופית מוכנה לתצפית מיקרוסקופית. כל השלבים מבוצעים על נייר סינון רטוב תחת מיקרוסקופ סטריאו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הכנת דגימת אנדוספרם מזרעים בוגרים. שלב 1: זרעים יבשים נספגים במים במשך יותר מ -40 דקות בצינור של 1.5 מ"ל. שלב 2: נוצרת צלקת על האשך והאנדוספרם באמצעות מחט הזרקה. שלב 3: מסירים את העובר על ידי צביטת הזרע בעזרת מלקחיים. שלב 4: הצדדים העליונים והתחתונים של מעטפת הזרעים הריקה נחתכים כדי לעצב אותה לגליל. שלב 5: מעטפת הזרעים הריקה בצורת גליל נחתכת לאורך הציר המרכזי שלה. שלב 6: דגימת גיליון האנדוספרם הסופית מוכנה לתצפית מיקרוסקופית. כל השלבים מבוצעים על נייר סינון רטוב תחת מיקרוסקופ סטריאו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הדמיה פלואורסצנטית של שכבת תאי אנדוספרם שלמה באמצעות זרעים מתפתחים. דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות הוכנו מפיתוח זרעים של סיליקיות 14 יום לאחר הפריחה (DAF) (A,B) ו-17-18 סיליקיות DAF (C). הדמיה מיקרוסקופית בוצעה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשת אובייקטיבית לטבילה בשמן Plan-Apochromat 63× ולייזר אור לבן. (A) תמונה קונפוקלית של האנדוספרם תחת ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) מראה אזורים גדולים עם מספר רב של תאי אנדוספרם שלמים. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) מוצגות תמונות קונפוקליות של האנדוספרם המבטא PHYB-GFP, עם PHYB-GFP בירוק ואוטופלואורסצנטי כלורופיל בציאן. גופי פוטו (PBs) בגרעין מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר; סרגל קנה מידה מוגדל: 2.5 מיקרומטר. אות ה-GFP הופרד מהאוטופלואורסצנציה של ואקואולים לאחסון חלבונים (PSVs) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי-לכל החיים (FLIM). תקופות חיים פלואורסצנטיות הושגו באמצעות TauScan והופרדו באמצעות פונקציית TauSeparation. אורך החיים הממוצע של הקרינה עבור GFP היה 2.2 ns. הקרינה של GFP התעוררה ב-488 ננומטר ונאספה בין 500-530 ננומטר, בעוד שאוטופלואורסצנציה של כלורופיל התעוררה ב-405 ננומטר ונאספה בין 688-729 ננומטר. (C) מוצגות תמונות קונפוקליות של האנדוספרם המבטא PHYB-GFP תחת אור לבן רציף (cWL), אור אדום רחוק מתמשך (cFR) או אור אדום מתמשך (cR). PHYB-GFP מוצג בירוק, ואוטופלואורסצנטיות PSV מוצגת במג'נטה. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר; סרגל קנה מידה מוגדל: 2.5 מיקרומטר. עוצמות אור: WL, 46.5 מיקרומול/מ"ר 2/s; FR, 35.2 מיקרומול/מ"ר לשנייה; R, 18.6 מיקרומול/מ"ר 2/s. אוטופלואורסצנציה של PSV נרגשה ב-561 ננומטר ונאספה בין 565-621 ננומטר. אות ה-GFP הופרד באותה שיטה שתוארה לעיל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של שכבת תאי אנדוספרם שלמה באמצעות זרעים בוגרים. הדמיה מיקרוסקופית בוצעה באותה שיטה המתוארת באיור 3. (A) מוצגת תמונה קונפוקלית של כל שכבת תאי האנדוספרם השלמה, שהתקבלה מסרט משלים 2. מיטוכונדריה מסומנת בירוק, ואוטופלואורסצנטיות PSV מסומנת במג'נטה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (B) סדרה של תמונות מוגדלות מהאזור הריבועי של הקו המקווקו בלוח (A) מציגה את התנועה של מיטוכונדריון, המסומנת על ידי ראשי חץ לבנים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרט משלים 1: מוצג סרטון זמן-lapse של mtGFP בשכבת תאי האנדוספרם של זרע בוגר 3 שעות לאחר ההטמעה. פריים אחד צולם כל 10 שניות, וקצב הפריימים של הסרטון הוא 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרט משלים 2: מוצג סרטון זמן-lapse של mtGFP בשכבת תאי האנדוספרם של זרע בוגר יום אחד לאחר ההטמעה. פריים אחד צולם כל 10 שניות, וקצב הפריימים של הסרטון הוא 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.