פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בזרעי ארבידופסיס , האנדוספרם, שכבה אחת של תאים חיים הממוקמת בין העובר לאשכה, ממלא תפקיד קריטי בוויסות הבשלת הזרעים, תרדמתם ונביטתם. ניתוח מיקרוסקופי של תאי אנדוספרם שלמים חיוני להבנת התפקודים הפיזיולוגיים של האנדוספרם ברמה התאית והמולקולרית. עם זאת, הכנת הדגימה הייתה מאתגרת בשל גודלם הקטן של זרעי ארבידופסיס ומיקום שכבת תאי האנדוספרם מתחת לאשכה. מאמר זה מפרט את הכנת דגימות שכבת תאי אנדוספרם שלמות המתאימות לתצפית וניתוח מיקרוסקופי הן בזרעים מתפתחים והן בזרעים בוגרים. שיטה זו מאפשרת תצפית על שטחים גדולים ותאי אנדוספרם שלמים רבים ללא צורך בקיבוע או חתך. בנוסף, הפרוטוקול משתמש רק בציוד מעבדה סטנדרטי, כגון מחטי הזרקה, מלקחיים מדויקים ומיקרוסקופים סטריאו. גישה זו מאפשרת בהצלחה הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים של אותות פלואורסצנטיים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), בתאי אנדוספרם שלמים. שיטה זו מאפשרת התבוננות בלוקליזציה ותנועה תוך תאית של חלבונים שונים, כמו גם מורפולוגיה של אברונים, בתאי האנדוספרם של מוטציות Arabidopsis שונות. פרוטוקול זה תורם להבהרת תפקודי אנדוספרם חדשים ומרחיב את הפוטנציאל למחקרים תאיים ומולקולריים של רקמה חיונית זו.
מבוא
מכיוון שצמחים הם אורגניזמים יושבים, נביטת זרעים היא אירוע מכריע הקובע את גורלם. ההחלטה לנבוט מוסדרת בקפדנות על ידי גורמים פנימיים וסביבתיים כאחד, כגון רמות תרדמת זרעים ראשוניים, טמפרטורה, עוצמת אור ואורך גל וריכוז חנקן 1,2,3,4,5,6. לזרעים מבנים מורכבים המורכבים ממספר סוגי רקמות7. בזרעים יבשים של Arabidopsis, העובר, המתפתח לשתיל, מוקף בשכבה אחת של אנדוספרם והשכבות החיצוניות ביותר, האשך. האשך מורכב משכבות מרו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
במחקר זה נקבעו שני נהלים שונים להכנת דגימות שכבת תאי אנדוספרם חיים: אחד לפיתוח זרעים ואחד לזרעים בוגרים. נדרשות גישות שונות במקצת בהתאם למוצקות האשך. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת דגימות אנדוספרם שלמות מזרעים מתפתחים
- אוסף סיליקיות
- גדל צמחי Arabidopsis על אדמה או צמר סלעים עד לפריחה.
- סמן פרחים שנפתחו במלואם בחוטים צבעוניים (0 ימים לאחר הפריחה, 0 DAF).
הערה: הימנע משימוש בחוטים ירוקים, צהובים או חומים לסימון פרחים, מכיוון שקשה להבחין בין צבעים אלה לבין צמחים גדלים או בוגרים וסיליקות. - חותכים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול שמוצג באיור 1, דגימות אנדוספרם הוכנו מפיתוח זרעים שנקטפו מסיליקים ב-14 DAF (בשלב זה, האשך עדיין ירוק). תאי אנדוספרם רבים על פני שטח גדול והמבנים התוך-תאיים שלהם נצפו (איור 3A). בניסוי זה נעשה שימוש בזרעים המבטאים PHYB שהתמזגו עם GFP בקצה C (PHYB-GFP). ידוע היטב ש-PHYB עובר טרנסלוקציה לגרעין עם הפעלה על ידי אור אדום ויוצר כתמים חיוביים ל-PHYB, הידועים בשם פוטו-גופים (PBs), המעורבים בנביטת זרעים 4,20,21,22.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תפקידי האנדוספרם בנביטת הזרעים התגלו באמצעות ניתוחים גנטיים וביוכימיים באמצעות רקמות זרעים מופרדות, כגון ניתוח ביטוי גנים וכימות של ליפידים ופיטוהורמונים 9,14,25,26,27. בדיקת מצע מעיל זרעים במבחנה, המשלבת את מעטפת הזרעים הריקה (אנדוספרם וטסטה) עם עובר מבודד ממוטציות שונות של Arabidopsis, חשפה מנגנונים מולקולר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים לד"ר מטסושיטה ולד"ר אוקה מאוניברסיטת קיוטו על שסיפקו את מוטנט ה-phyB המבטא PHYB-GFP המונע על ידי מקדם 35S. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים, מחקר באזור מחקר מוצע (19H05713 עד K.Y.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | Watoson Bio Lab | 131-815C | |
| Coverslip (18 x 18 מ"מ) | Matsunami Glass Ind., Ltd. | ||
| DDW | מים להרכבה | ||
| נייר סינון מס' 526 (400 x 400 מ"מ) | ADVANTEC VIETNAM CO., LTD. | 02453400 | |
| Genki-kun Seru Senyo yodo kopu N-150 (55 L) | קטאקורה & Co-op Agri Corporation | קרקעות לגידול צמחים | |
| זכוכית שקופית (26 מ"מ x 76 מ"מ) | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S1215 | |
| Grodan AO 36 x 36 x 40 מ"מ קוביות | גרודן | צמר סלעים לגידול צמחים | |
| איריס מספריים | פרימיום פלוס יפן ושות', בע"מ | FC-0212 | |
| מלקחיים של תכשיטנים, דומונט מס' 5 (4 1/4 אינץ') | מלקחיים Dumont | F6521 | לקריעת |
| חבילת יישומי Leica X (LAS X) | תוכנת Leica | עבור Sterallis 8 | |
| Leica Microsystems שמן טבילה למיקרוסקופים | שמן טבילה אוטופלואורסצנטי נמוך מאוד | THMOIL-10LF | |
| LIOR מלקחיים מדויקים 110 מ"מ SL-14 | קניס בע"מ | KN33450438 | מלקחיים להחזקה |
| NAIL HOLIC | KOSE | ||
| מחטי לק 27 גרם 3/4 (19 מ"מ) RB | מיסאווה תעשיה רפואית ושות', בע"מ | מחט חיתוך | |
| לחיתוך Nichipet Air 1000 uL | Nichiryo | 00-NAR-1000 | A 1000 & מיקרו; L Micropipette |
| Perfluorodecalin | APOLLO SCIENTIFIC | PC5960 | ריאגנטים להרכבת |
| אור אדום/אור אדום רחוק לוח LED | TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD. | ||
| Schappe Spun #60 | Fujix Co., Ltd. | חוט | |
| SPINKOTE חומר סיכה 2 אונקיות | BECKMAN COULTER | 306812 | גריז |
| Sterallis 8 | Leica | סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופיה | |
| סטריאומיקרוסקופ Stemi 305 cam W | Carl Zeiss NTS Ltd. | 491903-0017-000 | |
| אור לבן LED | PANASONIC | FL40SSW/37 |
מקורות
- Bentsink, L., Jowett, J., Hanhart, J. C., Koornneef, M. Cloning of DOG1, a quantitative trait locus controlling seed dormancy in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (45), 17042-17047 (2006).
- Toh, S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
