זיהוי מהיר של אנטיגן צואה של זיהום הליקובקטר פילורי על בסיס טכנולוגיית זיהוי סנדוויץ' נוגדנים כפולים

הליקובקטר פילורי (H. pylori, Hp) הוא חיידק מיקרואירופילי בצורת ספירלה, גרם שלילי¹. בשל יכולתו להתיישב ולהדביק באופן כרוני את הקיבה האנושית², פתוגן זה זוהה כגורם אטיולוגי עיקרי בהתפתחות אדנוקרצינומה בקיבה ^3,4. בשנת 2015, ~4.4 מיליארד אנשים בעולם סבלו מזיהום בהליקובקטר פילורי ⁵. השכיחות של זיהום הליקובקטר פילורי מציגה שונות גיאוגרפית ניכרת, כאשר מדינות מתפתחות חוות שיעורים גבוהים משמעותית בהשוואה למדינות מפותחות. יש לציין כי במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובקרב אוכלוסיות פגיעות מסוימות, שיעור ההדבקה יכול להגיע עד ל-75%⁶.

למרות ששיטות זיהוי מסורתיות כגון גסטרוסקופיה מדויקות, יישומן בהקרנה בקנה מידה גדול ובמעקב שגרתי מוגבל בשל פולשנותן, עלותן הגבוהה וקבלת המטופלים הנמוכה⁷. לכן, החיפוש אחר שיטות אבחון לא פולשניות, פשוטות ומהירות הפך לכיוון חשוב במחקר הרפואה הקלינית המודרנית. המטרה העיקרית של אבחנה לא פולשנית של הליקובקטר פילורי היא לזהות בצורה מדויקת, בטוחה ונוחה אם המטופל נגוע בהליקובקטר פילורי ללא בדיקה אנדוסקופית. בדיקת נשימה אוריאה (UBT ), בדיקת אנטיגן צואתי (FAT)⁸ ובדיקה סרולוגית⁹ הן טכניקות לא פולשניות פופולריות.

מבין אלה, ה-UBT הוא ההליך הכי פחות פולשני ומדויק ביותר שיש¹⁰. הרגישות והספציפיות של UBT גבוהות מ-95%¹¹. מבין שיטות האבחון הלא פולשניות הזמינות, ה-UBT הוכח כמדויק והאמין ביותר, כפי שניתן לראות במחקר אימות שנערך בעיראק, ה-UBT עשוי להיות מומלץ כבחירה הראשונה בשל ביצועיו הגבוהים יותר בהשוואה לשיטות אחרות¹². עם זאת, ל-UBT יש גם חסרונות, כגון העלות הגבוהה והצורך בניתוח ספקטרומטרי מסה, המגביל את היישום בהגדרות מרוחקות או מוגבלות במשאבים¹³.

יש צורך קריטי בפיתוח שיטת אבחון מהירה, לא פולשנית וחסכונית לאיתור זיהום בהליקובקטר פילורי , במיוחד באזורים מוגבלים במשאבים. במחקר זה פיתחנו טכנולוגיית זיהוי מהיר לאנטיגן צואתי של הליקובקטר פילורי המבוססת על טכנולוגיית זיהוי כריך נוגדנים כפולים, המסוגלת לזהות אנטיגן הליקובקטר פילורי בדגימות צואה במהירות, ביעילות ובעלות נמוכה. טכנולוגיה זו מציעה יתרונות משמעותיים, כולל סבירות, לא פולשנית, ידידותיות למשתמש ויכולת הסתגלות לאזורים מרוחקים. אנו משערים כי שיטת סנדוויץ' הנוגדנים הכפולים לגילוי אנטיגן צואה של הליקובקטר פילורי תפגין רגישות וסגוליות דומות ל-qPCR, ותמצב אותה ככלי בר-קיימא לאבחון קליני לא פולשני.

פירטנו באופן מקיף את העקרונות, הנהלים, החוזקות המתודולוגיות והיישום הקליני של זיהוי אנטיגן צואתי לזיהום בהליקובקטר פילורי . כדי לאמת את המעשיות שלו, ערכנו חקירה אפידמיולוגית וסינון בכפר שיטאן, העיר צ'ינגיואן, מחוז גואנגדונג, סין, שהוא אזור מרוחק ולא מפותח עם אוכלוסייה קבועה של כ-400 והישגים חינוכיים מוגבלים. התוצאות שלנו מדגימות כי ניתן להשלים את טכנולוגיית הזיהוי המהיר של אנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה שתוכננה כאן תוך 20 דקות. מודגש כי זיהוי מהיר של אנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה הוא כלי פוטנציאלי ומבטיח לאבחון מהיר ואמין של זיהום הליקובקטר פילורי באזורים מרוחקים ומפגרים.

מחקר חתך זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העממי של מחוז גואנגדונג (מספר אישור: KY2024-445-01), והנתונים האישיים של כל נבדקי המחקר היו חסויים לחלוטין במהלך המחקר. כל המשתתפים חתמו על הסכמה מדעת בכתב לפני הניסויים. תושבי הכפר שיטאן בעיר צ'ינגיואן, מחוז גואנגדונג, נבחרו בשנת 2024 כנבדקי המחקר, ולא היו הגבלות על גיל ומין. בדיקת כריך הנוגדנים הכפול (ניסוי איכותני) המתוארת להלן בוצעה על ידי צוות רפואי וטכני מקצועי על פי ההוראות. כל האוכלוסייה הקבועה של הכפר נבחרה למחקר זה, ללא קשר אם הם בריאים או סבלו מתסמינים או מחלות קיימות הקשורות למחלות במערכת העיכול.

1. בחירת המטופל

1. אל תכלול מטופלים אם הם השתמשו במעכבי משאבת פרוטון או ביסמוט, חוסמי קולטן H₂ או אנטיביוטיקה בחודש האחרון.
2. בקשו מכל המשתתפים למלא את השאלון באופן אנונימי. תוכן השאלון כולל חמש שאלות: האם אתה אוכל שלוש ארוחות באופן קבוע? האם אתה שותה אלכוהול? האם אתה מודע להליקובקטר פילורי? האם אתה חושב שיש צורך לבצע בדיקת הליקובקטר פילורי ? האם אתם מבינים את ההשלכות השליליות של זיהום בהליקובקטר פילורי ?

2. נוהל לזיהוי אנטיגן זיהום בהליקובקטר פילורי בצואה

הערה: האלגוריתם לבדיקת אנטיגן צואה של הליקובקטר פילורי תוכנן כדי להבטיח את הדיוק והאמינות של התוצאות, תוך התחשבות בפשטות והיגיינה. התהליך כולו מחולק לחמישה שלבים: איסוף דגימות, עיבוד דגימות, אחסון דגימות, זיהוי ופרשנות תוצאות. תרשים זרימת העבודה והתרשים הסכמטי של זיהוי הדגימה מוצגים באיור 1 ובאיור 2.

1. איסוף דוגמאות
   הערה: יש להשתמש במיכלים ספציפיים לאנטיגן הליקובקטר פילורי לאיסוף דגימות. אין לערבב את הדגימות עם מים, שתן, חומרי חיטוי וביוב.
   1. לאחר השלמת עשיית הצרכים, הסר את המכסה העליון של המיכל המיוחד כדי להוציא את מוט הדגימה.
   2. הכנס את מוט הדגימה ברציפות לחמישה מצבים שונים של השרפרף לצורך דגימה, וודא שהקצה המושחל של מוט הדגימה מוכנס לחלוטין לתוך הצואה.
   3. הכנס את מוט הדגימה בחזרה לצינור המגיב לאחר השלמת הדגימה; נפח הדגימה הוא ~5-50 מ"ג בסך הכל.
2. עיבוד מדגם
   1. נענע את צינור המגיב מצד לצד למשך ~10 שניות כדי לערבב היטב את דגימת הצואה בדילול (המרכיבים העיקריים: אתילנדיאמין חומצה טטראצטית טטרה-סודיום הידרט 0.018 גרם/מ"ל ונתרן כלורי 0.01 גרם/מ"ל).
3. אחסון לדוגמה
   1. בדוק את הדגימות בהקדם האפשרי לאחר הדגימה; אחסן אותם בטמפרטורת החדר לא יותר מ-6 שעות ובתנאי קירור (לא יותר מ-72 שעות ב-2-8 מעלות צלזיוס ולא יותר מ-6 חודשים קפואים ב-25 מעלות צלזיוס עד -15 מעלות צלזיוס) במידת הצורך כדי להאט את פירוק האנטיגן והפעילות המיקרוביאלית.
      הערה: ניתן להקפיא ולהפשיר דגימות שוב ושוב עד פי 3, ויש להחזיר דגימות מקוררות וקפואות לטמפרטורת החדר לפני הבדיקה.
4. זיהוי דוגמאות
   1. פתח את המכסה הלבן על מכסה צינור המגיב והשאר את צינור המגיב זקוף.
   2. לחץ כלפי מטה על המכסה עד לנקודה הנמוכה ביותר כך שהדגימה תזרום על כרטיס הבדיקה, ותעבור דרך אזור הזיהוי (T) ואזור בקרת האיכות (C) המצופה בנוגדנים נגד HP.
5. פרשנות התוצאות
   1. המתן 10-20 דקות כך שכל אנטיגן הליקובקטר פילורי בדגימה, אם נקשר לנוגדן, ייצור תגובה כרומוגנית מקרוסקופית באזור הזיהוי. זה מופיע בדרך כלל כקו אדום או סגול המנוגד לקו באזור בקרת האיכות.
   2. הנוכחות או היעדר תגובת הצבע ועומק הצבע קשורים לריכוז אנטיגן הליקובקטר פילורי בדגימה. השווה את כרטיסי הצבע כדי לפרש במהירות ובדייקנות את התוצאות (ראה איור 3).

3. מיצוי DNA

1. יש להניח כמות מתאימה של צואה במבחנה, להוסיף תמיסת PBS ולערבב היטב על ידי ניעור. צנטריפוגה את התערובת בחום של 12,000 × גרם למשך 5-10 דקות, ואז אספו בזהירות 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט למיצוי נוסף.
2. בהתבסס על מספר הדגימות, הכינו מספר שווה של צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. לכל צינור, הוסף ברצף 20 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל), 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים, 200 מיקרוליטר של סופרנטנט הדגימה ו-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה A. מערבבים היטב על ידי היפוך הצינורות, ואז דוגרים באמבט מתכת ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. לאחר השלמת הפירוליזה, הנח את צינור הצנטריפוגה על המסגרת המגנטית, תן לו לעמוד ואפשר לספיחה להתרחש למשך דקה אחת על החרוזים. לאחר שהנוזל בצינור מתבהר לחלוטין, השליכו את הסופרנטנט ונסו להימנע מהפרעה לחרוזים המגנטיים.
4. הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי והנח אותם על מתלה צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. בעזרת פיפטה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה E לכל צינור, ערבב היטב במשך דקה אחת, ולאחר מכן החזיר את הצינורות למתלה המגנטי. הניחו לצינורות לעמוד למשך דקה אחת, השליכו את הסופרנטנט לאחר ההבהרה והימנעו משאיבת החרוזים המגנטיים.
5. חזור על תהליך הכביסה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה W2 לכל צינור. מערבבים היטב במשך דקה, מניחים את הצינורות על המתלה המגנטי ונותנים להם לעמוד דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט בזהירות לאחר התבהרות התמיסה, וודא שהחרוזים המגנטיים יישארו ללא הפרעה.
6. מוסיפים 100 מיקרוליטר נוזל, מערבבים ודוגרים בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
7. הנח את הצינורות על המתלה המגנטי ותן להם לעמוד במשך 2 דקות. לאחר שהתמיסה מתבהרת, העבירו בזהירות את חומצת הגרעין המנופחת לתוך צינור צנטריפוגה חדש, והימנעו משאיבת החרוזים המגנטיים.
8. העריכו את טוהר ה-DNA המופק על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר (A₂₆₀) ו-280 ננומטר (A₂₈₀). חשב את יחס A₂₆₀/A₂₈₀ , שבאופן אידיאלי אמור להיות גדול מ-1.8 עבור DNA בעל טוהר גבוה.

4. qPCR לגילוי הליקובקטר פילורי ועמידות לאנטיביוטיקה

הערה: ביצענו qPCR לזיהוי זיהום בהליקובקטר פילורי על ידי הגברת הגן ureA . כל מוצרי בקרת האיכות השליליים הם מים סטריליים ומטוהרים. תוצר בקרת האיכות החיובי בערכת זיהוי חומצות הגרעין של הליקובקטר פילורי הוא חרוזים סטנדרטיים של הליקובקטר פילורי מושבת (ATCC 43504). A_{C, T} ≤ 30 עם עקומה טיפוסית בצורת S נחשבת חיובית.

1. על פי מספר הדגימות שיש לבדוק, הוציאו את התכשיר המיובש בהקפאה מהערכה, וסובבו אותו במהירות כדי לשמור על האבקה המיובשת בהקפאה בתחתית הצינור.
2. פתח בזהירות את מכסה התכשיר המיובש בהקפאה; קח את חומצת הגרעין של הדגימה לבדיקה; הוסף 25 מיקרוליטר את חומצת הגרעין הדגימה לתכשיר המיובש בהקפאה; וכסו את הצינור בחוזקה.
3. לנער ולערבב את מגיב ה-PCR באופן שווה במשך 8-10 שניות, ולאחר מכן לסובב אותו במהירות למשך 3-5 שניות.
4. עבור כל דגימה על צלחת של 32 בארות, הכינו 25 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR (אבקה מיובשת בהקפאה [המכילה את האנזים Taq (5 U/μL), דאוקסיריבונוקלאוזיד טריפוספט (2.5 מילימול/ליטר), אנזים UNG (2 U/μL), ureA קדימה (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') והפוך (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') (40 מיקרומול/ליטר)]), ו-25 מיקרוליטר (2.5 מיקרוגרם) של ה-DNA שחולץ.
5. הפעל את לוח ה-qPCR בעל 32 הבארות במכונת ה-qPCR. תכנת את המחזור התרמי: 42 מעלות צלזיוס ו-95 מעלות צלזיוס (שניהם למחזור אחד) למשך 2 דקות כל אחד; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-65 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (שני שלבים הם מחזור אחד) למשך 10x; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות וב-58 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (שני שלבים הם מחזור אחד) למשך 35 מחזורים.
6. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה ספציפית עבור qPCR ותן למכשיר לבחור באופן אוטומטי את ספי הבסיס.

5. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש בבדיקת חי בריבוע כדי לנתח את נתוני הניסוי כדי להעריך את העקביות בין שיטה זו לתוצאות ה-qPCR ולהשוות את השיעור החיובי של סקר טכנולוגיה זו עם נתוני השיעור החיוביים של זיהום בהליקובקטר פילורי בקנה מידה רחב יותר (למשל, בפריסה ארצית). קחו בחשבון הבדלים מובהקים סטטיסטית ב-P < 0.05.

סקר שאלונים
בסך הכל נרשמו למחקר 261 משתתפים, הכוללים 144 נשים ו-117 גברים, בגילאים שנעו בין 4 ל-99 שנים. הגיל הממוצע של הנבדקים היה 48.30 ± 17.61 שנים. בפיגוע השתתפו 17 קטינים (בני 17-0), 202 מבוגרים (64-18) ו-42 קשישים (>64 שנים). תוצאות השאלון מוצגות בטבלה 1. רוב הנבדקים (90.8%) חשבו שיש צורך לבצע בדיקת הליקובקטר פילורי .

תוצאות סינון של זיהוי אנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה בכפר זה
מבין 261 המשתתפים שנבדקו לאנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה, 52 (19.92%) היו חיוביים, בעוד ש-209 היו שליליים. מתוך 52 המקרים החיוביים, 32 היו נשים, המייצגות 22.22% מכלל המשתתפות, ו-20 היו גברים, המהווים 17.09% מכלל המשתתפים הגברים. בחלוקה לפי גיל, שיעורי החיוביים היו כדלקמן: לקטינים (0-17 שנים) היו 2 מקרים חיוביים (11.76%), למבוגרים (18-64 שנים) היו 41 מקרים חיוביים (20.30%), ולקשישים (>64 שנים) היו 9 מקרים חיוביים (21.43%).

השוואת עקביות בין אנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה לתוצאות qPCR
במחקר זה, נבחרו שתי דגימות עם תוצאות שונות של בדיקת qPCR כדי לאפיין את מהימנות פרוטוקול הניסוי (איור 4). מבין תוצאות אנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה של 261 נבדקים, 52 היו חיוביות ו-209 היו שליליות. מבין תוצאות ה-qPCR עם צואה של 261 נבדקים, 83 היו חיוביות ו-178 היו שליליות (טבלה 2). הרגישות והספציפיות של זיהוי אנטיגן הליקובקטר פילורי בצואה היו 60.24% ו-80.08%, בהתאמה. ערך הניבוי החיובי (PPV) של שיטה זו היה 96.15%, וערך הניבוי השלילי (NPV) היה 84.21%. מבחן העקביות של קאפה מצביע על כך שתוצאות האבחון של שתי השיטות עקביות (קאפה = 0.630, P < 0.05).

השוואה של שיעור הבדיקות החיוביות בין הכפר הטבעי הזה לכל הארץ
שיעור החיוביים היה 19.92%, שהיה נמוך במעט משיעור החיוביים הארצי של 42.8%14 (לוח 3). על פי מבחן חי בריבוע (P < 0.01), ההבדל בשיעורי החיוביים היה מובהק סטטיסטית.

איור 1: תרשים זרימה של גילוי דגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הדיאגרמה הסכמטית של איסוף וגילוי דגימות. הוצא את מכשיר הזיהוי, קרע את שקית נייר האלומיניום והוציא את צינור המגיב. משוך את מכסה הצינור הכתום והשתמש במקל הדגימה כדי לקחת דגימות פי 5 ממיקומים שונים של צואה. הכנס את מוט הדגימה בחזרה לצינור המגיב ונער אותו שמאלה וימינה למשך 10 שניות לערבוב מלא. שברו את בלוק הגבול הלבן, שמרו על צינור המגיב זקוף ולחצו על מכסה הצינור למצב הנמוך ביותר כדי להתחיל בתזמון. שימו לב למראה של רצועות אדומות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פירוש תוצאות האנטיגן. (A) דגימה. (ב,ה) שלילי (-): תוצאה שלילית מצביעה על כך שלא זוהה אנטיגן הליקובקטר פילורי בדגימה, מה שמרמז על כך שהסיכון לזיהום בהליקובקטר פילורי נמוך. תוצאה שלילית אינה יכולה לשלול לחלוטין את האפשרות של הדבקה. (ג,ו) חיובי (+): תוצאה חיובית פירושה שאנטיגן הליקובקטר פילורי מזוהה בדגימה, יש חשד לזיהום בהליקובקטר פילורי . (ד) אין השפעה: תוצאות לא חוקיות עלולות להוות בעיה בתהליך איסוף הדגימה או הטיפול בה, או שהמגיב התדרדר וניזוק, ויש לאסוף את הדגימה שוב או לחזור על שלבי הפעולה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זיהוי הליקובקטר פילורי בצואה בשיטת qPCR. (ס1) תוצאה שלילית של הגברת PCR כמותית של זיהום הליקובקטר פילורי . (ש2) תוצאה חיובית של הגברה כמותית של PCR של זיהום הליקובקטר פילורי . אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: דיאגרמה סכמטית של שיטת סנדוויץ' נוגדנים כפולים לגילוי אנטיגן צואה נגוע בהליקובקטר פילורי. נוגדן נגד HP, עכבר (VacA epitope) נקבע מראש באזור הזיהוי (T) על הממברנה. אזור בקרת האיכות (C) מתקן מראש IgG נגד עכברים וסטרפטווידין. סרט הפוליאסטר היה מצופה בנוגדנים נגד HP, עכבר, מסומן לטקס ומצומד לטקס-BSA-ביוטין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: תוצאות השאלון.

טבלה 2: תוצאות אבחון של שתי טכניקות.

טבלה 3: השוואה בין שיעורי הבדיקות החיוביות להליקובקטר פילורי בין כפר שיטאן לממוצע הארצי.

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.