זיהוי מיני מיקובקטריום בשיטת שבב מיקרו-מערך DNA

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטת שבב מיקרו-מערך DNA לזיהוי מיני מיקובקטריום , שתשפר את דיוק האבחון והיעילות של מחלות קשורות לשימוש קליני.

תקציר

מחקר זה מציג שיטת שבב מיקרו-מערך DNA המיועדת לזיהוי מדויק של מיני מיקובקטריום . על ידי מינוף עקרונות הגברה והכלאה אסימטריים של PCR, שיטה זו מכוונת ל-17 מיקובקטריות נפוצות, כולל אלה בקומפלקס Mycobacterium tuberculosis ומיקובקטריות שונות שאינן שחפתיות. זה ישים למגוון רחב של דגימות קליניות כמו ליחה, מוגלה, נוזל שטיפת סימפונות, נוזל מוחי ונוזל ניקוב מחולים החשודים במחלות מיקובקטריאליות. הבדיקה כוללת הגברה של רצפי מטרה בגנום Mycobacterium באמצעות PCR אסימטרי, ולאחר מכן הכלאה עם הבדיקות על שבב המיקרו-מערך. סידור הבדיקה הייחודי (חוזר על עצמו פי 5 במיקרו-מערך של 12 שורות x 10 עמודות) והשימוש בבדיקות בקרה משפרים את אמינותו. ניסויים קליניים עם 1,724 דגימות הראו ביצועים גבוהים. השיטה השיגה 100% ספציפיות קלינית, רגישות והתאמה כללית בהשוואה לתוצאות הריצוף, למעט שתי דגימות מיקובקטריאליות נדירות שאינן שחפתיות מעבר לטווח הזיהוי שלה. שיטת שבב מיקרו-מערך DNA זו מציעה שיפור משמעותי לעומת טכניקות אבחון מסורתיות, מקצרת את זמן האבחון ומספקת זיהוי מקיף יותר, ובכך יש לה פוטנציאל רב באבחון וניהול מחלות מיקובקטריאליות.

מבוא

מיקובקטריום, סוג של חיידקים, מקיף קבוצה מגוונת של אורגניזמים בעלי השלכות משמעותיות על בריאות האדם ובעלי החיים. Mycobacterium tuberculosis, הגורם לשחפת (TB), הוא נגע בריאות עולמי ארוך שנים. למרות עשרות שנים של מאמצים במניעה וטיפול, שחפת נותרה איום גדול על בריאות הציבור, ואחראית למספר מדהים של מקרי מוות שנתיים וזיהומים חדשים ברחבי העולם ^1,2. מיקובקטריות שאינן שחפתיות (NTM) מוכרות יותר ויותר כפתוגנים חשובים, במיוחד באוכלוסיות חולים ספציפיות ובסביבות סביבתיות.

הזיהוי המדויק של מיני Mycobacterium הוא אבן הפינה לניהול יעיל של מחלות ^3,4. לשיטות אבחון מסורתיות יש מגבלות מובנות. טכניקות מבוססות תרבות, שהסתמכו עליהן לאורך ההיסטוריה, ידועות לשמצה בגוזל זמן. תהליך הבידוד והתרבות של מיקובקטריות יכול להימשך שבועות עד חודשים, שבמהלכם החולים עלולים לחוות התקדמות מחלה והעברה פוטנציאלית לאחרים. יתר על כן, חלק מהמינים המיקובקטריאליים קשים מאוד לתרבית, מה שמוביל לתוצאות שליליות כוזבות ולטיפול מאוחר או שגוי ^5,6.

צביעה מהירה בחומצה, שיטה נפוצה נוספת, יכולה לזהות מיקובקטריות על סמך תכונות דופן התא הייחודיות שלהן העמידות בפני דה-צבע. עם זאת, הוא חסר את הספציפיות להבחין בין מיני מיקובקטריום שונים, ומספק רק אינדיקציה רחבה לנוכחות מיקובקטריאלית⁷. שיטות מולקולריות כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) התגלו כחלופות להתגברות על חלק מהחסרונות הללו. PCR יכול לזהות DNA מיקובקטריאלי מהר יותר משיטות תרבית, מה שמאפשר אבחון מהיר יותר. עם זאת, מבחני PCR קונבנציונליים מכוונים בדרך כלל למספר מוגבל של גנים ועשויים שלא להציע זיהוי מקיף של מינים, במיוחד כאשר עוסקים במין Mycobacterium ⁵ הקרובים זה לזה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך DNA חוללה מהפכה בתחומי המיקרוביולוגיה והאבחון. הוא מציע את היכולת לנתח בו זמנית מטרות גנטיות מרובות, ומספק מבט מקיף ומפורט יותר על אוכלוסיית החיידקים ^8,9. מחקרים אחרונים בתחום זה האירו עוד יותר את הפוטנציאל והחשיבות של טכניקות מולקולריות מתקדמות לזיהוי מיקובקטריום. לדוגמה, מחקר של Wang et ^al.10 הדגים את הרגישות והספציפיות המשופרות של שבב מיקרו-מערך DNA שונה באיתור מיני Mycobacterium נדירים בסביבה קלינית. הממצאים שלהם הדגישו את הערך של אופטימיזציה מתמשכת של טכנולוגיית מיקרו-מערך. מחקר נוסף של וואנג ועמיתיו¹¹התמקד בשילוב של נתוני מיקרו-מערך DNA עם תוצאות קליניות בחולי שחפת. התוצאות סיפקו תובנה לגבי הערך הפרוגנוסטי של זיהוי מדויק של מיני מיקובקטריום והפוטנציאל לרפואה מותאמת אישית.

עקרון הבדיקה
ערכה זו משתמשת בטכנולוגיית שבב מיקרו-מערך DNA, בשילוב עם הגברה אסימטרית של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ועקרונות הכלאה, לזיהוי מיני מיקובקטריום. הערכה כוללת שבב זיהוי מיני Mycobacterium וריאגנטים להגברת PCR אסימטריים. השבב מקובע בבדיקות ספציפיות למין לאיתור וזיהוי מיני Mycobacterium. יעדי הזיהוי כוללים 17 מינים או קבוצות נפוצים מבחינה קלינית, כגון קומפלקס Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae ו-Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum ו Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai ו-Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi ו-Mycobacterium smegmatis.

הזיהוי של 17 מיני מיקובקטריום אלה הוא קריטי לאבחון קליני מדויק וניהול מטופלים מותאם אישית. קומפלקס Mycobacterium tuberculosis (MTBC) מקבל עדיפות בשל תפקידו בשחפת, מה שמחייב בידוד מיידי וטיפול רב תרופתי כדי לרסן את ההדבקה ולטפל בעמידות לתרופות. מינים בתוך קומפלקס Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), כגון M. avium ו-M. intracellulare, משפיעים בעיקר על אנשים מדוכאי חיסון (למשל, HIV/איידס) או כאלה הסובלים ממחלת ריאות כרונית, הדורשים משטרים ממושכים המבוססים על מקרולידים. מיקובקטריות (RGMs) הגדלות במהירות כמו M. abscessus ו-M. fortuitum ידועות לשמצה בעמידות לאנטיביוטיקה ולעתים קרובות גורמות לזיהומים חמורים בעור, ברקמות רכות או ריאות, מה שדורש שילובים אגרסיביים של ניתוח ואנטיביוטיקה ממוקדת (למשל, אמיקאצין, מקרולידים). מינים סביבתיים כגון M. gordonae או M. smegmatis הם מזהמים תכופים אך עלולים לגרום לזיהומים אופורטוניסטיים בהקשרים ספציפיים, הדורשים מתאם קליני זהיר כדי למנוע טיפול מיותר. לפתוגנים כמו M. marinum (הקשור לחשיפה למים) ו- M. ulcerans (הגורם לכיב בורולי) יש נישות אפידמיולוגיות מובהקות, המנחות, המנחות. מינים נדירים אך רלוונטיים מבחינה קלינית (למשל, M. szulgai, M. malmoense) מחקים שחפת ודורשים משטרים ספציפיים למין. זיהוי מדויק הוא בעל חשיבות עליונה, שכן משך הטיפול, בחירת התרופה (למשל, רגישות לריפמפין ב-M. kansasii לעומת עמידות פנימית ב-NTMs), והפרוגנוזה משתנים באופן דרסטי. אבחון מולקולרי ובדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית חיוניים למיטוב התוצאות, במיוחד באוכלוסיות מדוכאות חיסון או זיהומים מורכבים.

ראשית, רצפי המטרה בגנום Mycobacterium מוגברים באמצעות PCR אסימטרי. לאחר מכן, המוצרים המוגברים מוכלאים עם הבדיקות שעל השבב. אם Mycobacterium המטרה קיים בדגימה, התוצרים המוגברים ייקשרו באופן ספציפי לבדיקות המתאימות בשבב. לבסוף, על ידי סריקת אותות ההכלאה על השבב, ניתן לקבוע את מיני המיקובקטריום בדגימה.

באמצעות טכנולוגיית מיקרו-מערך של שבב גנים, קבועים על המצע בדיקות ספציפיות לזיהוי הגנים הנ"ל ובדיקות בקרה שונות. כל בדיקת זיהוי ובדיקת בקרה חוזרת על עצמה פי 5, ויוצרת מיקרו-מערך של 12 שורות x 10 עמודות. סידור הגשושית מוצג באיור 1. כל שבב מכיל ארבעה מיקרו-מערכים זהים, וכל מיקרו-מערך יכול לזהות דגימה אחת.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הראשון של צ'ואנג'ואו המסונף לאוניברסיטה הרפואית של פוג'יאן (אישור מס' 2024-K035). הסכמה מדעת הושגה מכל המטופלים לפני איסוף הדגימות הקליניות. המטופלים קיבלו מידע על מטרת המחקר, ההליכים הכרוכים בכך, וזכותם לפרוש בכל עת מבלי להשפיע על הטיפול הרפואי שלהם.

1. דרישות לדוגמא

הערה: בעת איסוף דגימות מחולים עם חשד קליני לשחפת ומחלות מיקובקטריות שאינן שחפתיות (NTM) לבדיקה בערכה זו, בצע את השלבים הבאים:

1. אסוף דגימות כגון ליחה, מוגלה או הפרשות, נוזל שטיפת סימפונות, נוזל ניקוב (כולל נוזל מוחי שדרתי, נוזל פלאורלי וצפק, נוזל קרום הלב, נוזל מפרקים ומרה) ושתן מהמטופלים.
   1. לדגימות כיח:
      1. הנחו את המטופל לשטוף את הפה במים נקיים בבוקר ולאחר מכן להשתעל ליחה עמוקה לתוך מיכל אחסון דגימה סטרילי, לאטום אותו ולשלוח אותו לבדיקה.
      2. יש להוסיף פי 1-2 נפח של 4% NaOH, לנער ולערבב באופן אחיד.
      3. לאחר 15-20 דקות מוסיפים נפח שווה של מאגר פוספט pH 6.8 ומערבבים באופן שווה.
      4. בטמפרטורת החדר יש לצנטריפוגה בחום של 2,000 × גרם למשך 15 דקות ולהשליך את הסופרנטנט. מוסיפים 1 מ"ל של 0.9% NaCl באמצעות פיפטה ומערבבים היטב; השתמש לזיהוי.
   2. לדגימות מוגלה או הפרשה:
      1. שוטפים את המשטח במי מלח רגילים סטריליים. אוספים את המוגלה או ההפרשה בעזרת ספוגית סטרילית, אוטמים אותה ושולחים אותה לבדיקה.
      2. יש להוסיף פי 3 נפח של 4% NaOH ולנער היטב כדי לערבב היטב.
      3. הניחו לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות (נערו אותו ידנית פעמיים במהלך תקופה זו), צנטריפוגה בחום של 2,000 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן השליכו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של 0.9% NaCl באמצעות פיפטה וערבב אותו באופן שווה; השתמש לזיהוי.
   3. לנוזל שטיפת הסימפונות:
      1. יש להזריק 10-20 מ"ל של מי מלח רגילים דרך צינור שטיפת סימפונות (PBAL) מוגן.
      2. אסוף את הדגימה בבקבוק סטרילי על ידי יניקה בלחץ שלילי ושלח אותה לבדיקה.
   4. לנוזל השדרה:
      1. אסוף לפחות 2 מ"ל דגימה בטכניקה אספטית.
      2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי 0.9% דרך פיפטה, ערבב היטב והשתמש לבדיקה.
   5. לדגימות שתן:
      הערה: רצוי להשתמש בכמות המלאה הראשונה של השתן בבוקר או בשתן באמצע הלילה ובשעות הלילה המאוחרות. ניתן לאסוף את השתן גם על ידי צנתור.
      1. אסוף את הדגימה במיכל סטרילי ותן לדגימת השתן שנאספה לעמוד 4-5 שעות.
      2. צנטריפוגה בחום של 2,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי 0.9% דרך פיפטה, ערבב היטב והשתמש לבדיקה.
2. אחסון לדוגמה
   הערה: אין לאחסן דגימות על מדיום מוצק קפוא, מכיוון שהקפאה עלולה להשפיע על הפעולות הבאות.
   1. אחסן דגימות הקיימות במדיום הנוזלי בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ-5 שנים.
   2. אחסן את כל הדגימות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודשיים.
3. הובלה לדוגמא
   1. בעת הובלת דגימות בידוד הבדיקה, הקפד להשתמש במיכל סגור העומד בדרישות הבטיחות הביולוגית בתנאים המותרים על פי התקנות.

2. הכנת ניסויים

1. הכנת פתרונות שטיפת שבבים
   הערה: הכן את Chip Washing Solution I ו-Chip Washing Solution II בהתאם למספר השבבים. הנפח צריך להיות כזה שניתן יהיה לטבול את השבבים לחלוטין במהלך הכביסה. מערבבים אותם באופן אחיד ומאזנים לטמפרטורת החדר (10-30 מעלות צלזיוס). הריכוז הסופי של SSC הוא פי 2, והריכוז הסופי של SDS הוא 0.2%.
   1. להכנת Chip Washing Solution I, מערבבים 20x SSC, מים מזוקקים (או מים מטוהרים) ו-10% SDS ביחס של 10:88:2 ברצף להכנת Chip Washing Solution I. לדוגמה, בעת הכנת נפח כולל של 600 מ"ל, יש למדוד תחילה 60 מ"ל של 20x SSC ו-528 מ"ל מים מזוקקים (או מים מטוהרים) ולהניח אותם בכוס של 1 ליטר ולערבב באופן שווה עם מוט ערבוב. לאחר מכן, מוסיפים 12 מ"ל של 10% SDS ומערבבים שוב באופן אחיד.
   2. להכנת Chip Washing Solution II: הריכוז הסופי של SSC הוא 0.2x. מערבבים 20x SSC ומים מזוקקים (או מים מטוהרים) ביחס של 1:99 לקבלת Chip Washing Solution II. אם ניקח כדוגמה הכנת נפח כולל של 600 מ"ל, מדוד 6 מ"ל של 20x SSC ו-594 מ"ל מים מזוקקים (או מים מטוהרים) והניח אותם בכוס של 1 ליטר וערבב באופן שווה.
      הערה: אם תמיסת 10% SDS מפתחת משקעים פלוקולנטים לבנים, מחממים אותו ב-50 מעלות צלזיוס, מערבבים היטב ולאחר מכן מכינים את מאגר הכביסה של המיקרו-מערך. אם Washing Buffer I מפתח משקעים פלוקולנטים לבנים, מחממים אותו ב-50 מעלות צלזיוס, מערבבים היטב, מאזנים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
2. הכינו 350 מ"ל תערובת מי קרח.
3. הכינו מים מזוקקים (או מים מטוהרים).

3. הכנת מכשירים וחומרים

1. בחירת מכשירים והגדרתם
   1. זהה והכן את סורק השבבים של המיקרו-מערך, וודא שהוא מכויל ומוכן לשימוש.
   2. הגדר את מכשיר מיצוי חומצות הגרעין, בדוק את תפקידיו וטען ריאגנטים נחוצים.
   3. הנח את תיבת ההיברידיזציה של תיבת ההיברידיזציה של שבב מיקרו-מערך במיקום המתאים ואשר את מצב העבודה התקין שלה.
2. הכנת כלי פיפטינג
   1. אסוף מיקרופיפטות עם מפרט של 0.1-10 מיקרוליטר, 2-20 מיקרוליטר ו-20-200 מיקרוליטר, יחד עם קצות הפיפטות הנקיים והסטריליים המתאימים להם. ודא שהמיקרופיפטות מכוילות במדויק והקצות מותאמות כהלכה.
3. סידור ציוד נלווה
   1. הכינו אמבט מים בטמפרטורה קבועה והגדירו אותו לטמפרטורה הנדרשת (50 מעלות צלזיוס).
   2. מקם את המיקרו-צנטריפוגה המסוגלת לצנטריפוגה של צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ובדוק את הגדרות האיזון והמהירות שלה.
   3. ארגן צינורות צנטריפוגה נקיים וסטריליים (200 מיקרוליטר ו-1.5 מ"ל) ורצועות שמונה בארות נקיות וסטריליות אופציונליות (200 מיקרוליטר) על מדפי צינורות הצנטריפוגה.
4. מוכנות ציוד לטיפול בדוגמאות
   1. הניחו שייקר טמפרטורה קבוע במיקום נוח והגדירו את פרמטרי הטלטול המתאימים.
   2. הניחו בצד שני מיכלים לשטיפת שבבים וודאו שהם נקיים ויבשים.
   3. מסדרים מדפי שקופיות וצנטריפוגה, ויש להם מיכל לצנטריפוגה וייבוש שבבים בהישג יד.
5. הכנת מגבר PCR
   1. הפעל את מגבר ה-PCR ותכנת אותו בהתאם לפרוטוקול הניסוי, וודא שהוא מוכן לבצע תגובות הגברה.

4. מיצוי חומצות גרעין

הערה: בצע את הפעולה באזור הכנת הדגימה ובצע את השלבים הבאים:

1. הכנה
   1. הוסף 80 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי חומצות גרעין לתוך צינור מיצוי חומצות הגרעין והוסף 1 מ"ל של 0.9% NaCl.
2. איסוף דגימות בודדות
   1. כדי להתחיל איסוף דגימות, בדוק את מקור הדגימות, בין אם הן ממדיום מוצק או ממדיום נוזלי.
   2. כדי לאסוף דגימות מדיום מוצק, השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לבחור מושבה גלויה מהמדיום המוצק המתאים. אם החיידקים גדלו לכסות את כל המדיום, בחרו כמות מתאימה של דשא חיידקים. הנח אותו בזהירות לתוך צינור מיצוי חומצת הגרעין המכיל את תמיסת מיצוי חומצות הגרעין, הקפד להימנע ככל האפשר מבחירת המדיום המוצק.
   3. עבור דגימות בינוניות נוזליות, שאפו 10-20 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים עם עכירות שווה או גדולה מתקן מקפרלנד אחד. הזריק אותו לתוך צינור מיצוי חומצות הגרעין המכיל את תמיסת מיצוי חומצות הגרעין.
      הערה: לאחר איסוף הדגימה, בין אם ממדיום מוצק או נוזלי, הדגימות מוכנות לפעולת מיצוי חומצות הגרעין שלאחר מכן.
3. מיצוי חומצות גרעין
   1. לאחר הוספת הדגימות שטופלו מראש או דגימות בידוד משלב 1.1 שהוזכר לעיל, השתמש במכשיר החילוץ המהיר של חומצת הגרעין כדי לחלץ חומצות גרעין. מניחים את חומצות הגרעין המופקות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחסון זמני.
      הערה: כאינדיקטור ליעילות המיצוי, המחלץ האוטומטי יכול לחלץ דגימות עם עומס חומצת גרעין נגיפית גדול מ-100 עותקים/מ"ל. זמן האחסון הזמני לא יעלה על חודשיים.

5. הגברת PCR

1. הכנת מערכת תגובת PCR
   1. באזור האחסון וההכנה של הריאגנטים, הכינו צינורות צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר או רצועות שמונה בארות בהתאם למספר הדגימות שייבדקו, וסמנו מראש את מספרי הדגימה. הוצא את ריאגנטים להגברת PCR מהערכה, תן להם להפשיר ולהמיס באופן טבעי, לנער בעדינות ולערבב באופן שווה, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות כדי לגרום לריאגנטים להתאסף בתחתית הצינורות.
   2. על פי מספר הדגימות, יש לחלק את ריאגנטים להגברת ה-PCR לצינורות צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר או לרצועות שמונה בארות בנפח של 18 מיקרוליטר לצינור. סגור היטב את מכסי הצינור ולאחר מכן העביר אותם לאזור הכנת תערובת תגובת ההגברה.
   3. הוסף 2 מיקרוליטר של DNA תבנית (ה-DNA של הדגימה לבדיקה (כלומר, הסופרנטנט בצינור מיצוי חומצות הגרעין), תוצרי בקרה חיוביים או תוצרי בקרה שליליים) באזור הכנת הדגימה. ודא שהנפח הכולל של כל מערכת תגובת PCR מגיע ל-20 מיקרוליטר.
      הערה: השתמש במוצרי בקרה חיובית ובמוצרי בקרה שלילית בכל פעם במהלך amplification. ניתן להשתמש במוצר הבקרה החיובי לבקרת איכות בתהליכי הגברה והכלאה של PCR, וניתן להשתמש במוצר הבקרה השלילי לניטור הסביבה ותהליך הפעולה.
2. הגברה
   1. הנח את צינורות הצנטריפוגה או רצועות שמונה בארות המכילות את הריאגנטים במכשיר ההגברה של PCR. ודא שהמכשיר מחומם מראש לטמפרטורה הנדרשת. בצע את תגובת ההגברה של PCR על פי תוכנית הרכיבה התרמית הבאה: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 600 שניות (מחזור אחד); 35 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות; הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 420 שניות (מחזור אחד); להחזיק ב-4 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן (מחזור אחד).

6. הכלאת שבבים

הערה: לפני סיום ה-PCR ampתגובת ה-PCR, בצע את הפעולות הבאות:

1. הגדר את הטמפרטורה של אמבט המים בטמפרטורה קבועה ל-50 מעלות צלזיוס וחמם אותו מראש.
2. הכנת צ'יפס
   1. הוסף 200 מיקרוליטר של מים מזוקקים (או מים מטוהרים, כפי שמוצג באיור 2A) לתחתית קופסת הכלאת שבב מיקרו-מערך הגנים. הנח את התושבת בין שני עמודי המיקום בתוך הקופסה.
   2. הנח בזהירות את השבב כשהצד הקדמי כלפי מעלה על התושבת, וכסה את השבב עם החלקת הכיסוי כשארבעת הבוסים שלו פונים כלפי מטה (כפי שמוצג באיור 2B).
      הערה: ודא את כיוון המיקום הנכון של החלקת המכסה כך שקצהו יתיישר עם התווית בקצה השבב.
3. הכנה, דנטורציה וקירור של תערובת תגובת הכלאה
   1. הכן צינורות צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר או רצועות שמונה בארות בהתאם למספר הדגימות ותייג אותם כראוי.
   2. מוציאים את מאגר ההכלאה מהערכה ומחממים אותו בחום של 50 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. לאחר ערבוב יסודי, צנטריפוגה אותו במהירות במיקרו-צנטריפוגה. יש לשים 9 מיקרוליטר של מאגר ההכלאה לכל צינור צנטריפוגה מוכן של 200 מיקרוליטר או רצועה של שמונה בארות. לאחר מכן, הוסף 6 מיקרוליטר של תוצר ה-PCR המתאים לכל צינור, וכתוצאה מכך נפח כולל של 15 מיקרוליטר לכל תערובת תגובת הכלאה.
   3. מחממים את תערובת תגובת ההכלאה (כולל מאגר ההכלאה ותוצר ה-PCR) ל-95 מעלות צלזיוס (במכשיר PCR או באמבט מים) ומפרקים אותה למשך 5 דקות. הוציאו את תערובת תגובת ההכלאה שעברה את טיפול הדנטורציה בשלב הקודם, וטבלו אותה מיד בתערובת מי קרח למשך 3 דקות.
4. תגובת הכלאה
   1. הוציאו את תערובת תגובת ההכלאה מאמבט הקרח, פיפטו אותה למעלה ולמטה פי 2 בעזרת מיקרופיפטה כדי לערבב אותה באופן שווה. לאחר שמשקעי הפלוקולנט הלבנים (אם בכלל) נעלמים, הוסיפו 13.5 מיקרוליטר מתערובת תגובת ההכלאה דרך חור הטעינה של החלקת הכיסוי (כפי שמוצג באיור 2C), כסו במהירות את תיבת ההכלאה ואטמו אותה (כפי שמוצג באיור 2D). רשום את מספר השבב, את מיקום המיקרו-מערך ואת מספר הדגימה המתאים.
      הערה: ניתן להוסיף רק דגימה אחת לכל מיקרו-מערך.
   2. הנח מיד את קופסאות ההכלאה האטומות אופקית לתוך אמבט המים בטמפרטורה קבועה שחומם מראש ל-50 מעלות צלזיוס. הפעל את הטיימר למשך 120 דקות לאחר הכנסת כל קופסאות ההכלאה.
      הערה: הימנע מהכנסת בועות אוויר במהלך תהליך הטעינה. בכל השלבים מתחילת הטעינה ועד לייבוש השבבים, הימנע מחשיפה ישירה של הנוזל במיקרו-מערכי השבבים לאוויר במשך זמן רב כדי למנוע מרקע השבב להיות גבוה מדי עקב ייבוש והפרעה לפרשנות התוצאה.
5. שטיפה וייבוש צ'יפס
   1. לאחר השלמת תגובת ההכלאה, הוציאו את קופסאות ההכלאה בצורה אופקית, פרקו אותן והוציאו את השבבים לשטיפה. הנח מיד את השבבים על מתלה השקופיות במיכל (כגון) מלא בתמיסת שטיפת שבבים I שאוזנה לטמפרטורת החדר (10-30 מעלות צלזיוס). שוטפים אותם במהירות של 80-100 סל"ד על שייקר בטמפרטורה קבועה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שוטפים את הצ'יפס עם Chip Washing Solution II מאוזן לטמפרטורת החדר במהירות של 80-100 סל"ד על שייקר בטמפרטורה קבועה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. מניחים את הצ'יפס בצנטריפוגה וצנטריפוגה בחום של 100 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. סרוק אותם לאחר הייבוש.
      הערה: אל תאפשר לשבבים להתנגש או להתחכך זה בזה.

7. סריקת שבבים ופענוח תוצאות

הערה: השתמש בסורק השבבים של המיקרו-מערך ובתוכנה המתאימה כדי לקרוא אותות ולפרש את התוצאות. ראה גם טבלה 1 לתוצאות חריגות ופתרון בעיות. בצע את השלבים הבאים כדי לפעול (עיין במדריכים למשתמש של הסורק והתוכנה).

1. הפעל את הסורק ואת התוכנה המתאימה ולאחר מכן לחץ על כפתור בקרת הלייזר כדי לאפשר לו להתחמם מראש למשך 10 דקות.
2. הזן סוגים שונים של מידע הקשור לדגימות, כגון מספר המדגם.
3. לאחר שהסורק סיים לחמם מראש, לחץ על כפתור הוצא והנח את השבב בהתמדה על חתיכת התושבת הקטנה. דחף בעדינות ואופקית את השבב לתוך פתח תא הסורק ולחץ על כפתור הטעינה .
4. הזן את מספר השבב, לחץ כדי לבחור את אזור הזיהוי (מיקרו-מערך 1-4) ולאחר מכן לחץ על בחר דגימה כדי לבחור את הדגימות המתאימות עבור כל מיקרו-מערך. לאחר מכן, לחץ על כפתור התחל זיהוי כדי לבצע סריקת שבבים. תוצאות הסריקה יוצגו על המסך ויישמרו אוטומטית.
5. לאחר סריקת שבב אחד, חזור על שלבים 7.3 ו-7.4 כדי לסרוק את השבב הבא. בצע הליך זה עד לסריקת כל השבבים.
6. השתמש בדף שאילתת נתונים כדי לבצע שאילתת נתונים ופעולות הדפסה.
7. לאחר השלמת כל הפעולות, כבה תחילה את הלייזר, לאחר מכן צא מהתוכנה ולבסוף כבה את הסורק.

תוצאות

תוצאות חיוביות
עבור הבדיקות של הסוג Mycobacterium (בקרה פנימית, IC) ו-Mycobacterium tuberculosis, ערכי התוצאה החיובית שלהם נקבעים בשיטת מאפיין ההפעלה של המקלט (ROC). עבור הבדיקות המשמשות לזיהוי 16 NTM האחרים, ערכי התוצאה החיובית שלהם נקבעים בשיטת האחוזון.

בקרת איכות ניסויית
תוצאת הזיהוי של תוצר הבקרה החיובי צריכה להיות "קומפלקס Mycobacteriumtuberculosis " (כפי שמוצג באיור 3A); תוצאת הזיהוי של תוצר ...

דיון

שיטת שבב המיקרו-מערך של ה-DNA שהוצגה במאמר זה יכולה לזהות ישירות חומצות גרעין בדגימות קליניות (כולל ליחה, מוגלה, נוזל שטיפת סימפונות, נוזל מוחי ונוזל ניקוב) מחולים החשודים בשחפת ומיקובקטריוזיס שאינו שחפתי ויכולה לקצר משמעותית את הזמן לאבחון מאושר. שיטת שבב המיקרו-מערך של DNA המוצגת במחקר זה מייצגת התקדמות משמעותית בזיהוי מיני Mycobacterium . הוא מציע מספר יתרונות על פני שיטות אבחון מולקולריות מסורתיות וכמה קיימות¹².

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הזרקת נתרן כלורי 0.9% (NaCl)	פוג'ואו הייוואנגפויאו	H35020289
מכשירי הגברה של אפלייד ביוסיסטמס	תרמו פישר סיינטיפיק	Veriti 96-Well Thermal Cycler
קפיטלביו LuxScan10K/B	קפיטל ביו	לוקסקאן10K/B
מכונת כביסה CapitalBio 24	קפיטל ביו	מכונת כביסה 24
צנטריפוגה	אפנדורף	ר5424ר	מהירות MaX: 15000 דקות-1
מאגר הכלאה
שבב וכיסוי מיקרו-מערך גנים של HybSet
ערכת זיהוי מיני Mycobacterium	קפיטל ביו	301030
בקרות שליליות, בקרות חיוביות
מחלץ חומצות גרעין	טיאנלונג	ג'ין רוטקס 96
מגיב הגברת PCR
pH 6.8 מאגר פוספט	ShangHai yuanye ביוטכנולוגיה	R20029-10
פיפטורים וטיפים	תרמו סיינטיפיק	0.1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L, ו- 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA ערכת מיצוי או טיהור חומצות גרעין	טיאנלונג	qEx-DNA/RNA
SDS	קפיטל ביו	441060
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	שילונגס  מדעי	XK13-011-00027
SSC	קפיטל ביו	441050
אמבט מים תרמוסטטי	סורוי	HH-W600