מאמר שיטה

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

DOI:

10.3791/68238

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2SLAC National Accelerator Laboratory, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 4Department of Photon Science and Structural Biology, Stanford University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (<1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כרסום קרן יונים ממוקד קריוגני עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (CryoFIB-SEM) הפך לגישה הדומיננטית להכנת למלות בעובי של פחות מ-200 ננומטר של תאים לטומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית (CryoET). לאחרונה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית שולבה במערכות CryoFIB-SEM כדי להנחות את ייצור הלמלה לעבר מטרות המסומנות פלואורסצנטיות. עם זאת, ברוב היישומים, למערכות ההדמיה האופטית וקרן היונים יש מישורי מוקד מובהקים באזורים שונים של תא הוואקום - המתפקדים ביעילות כשני מיקרוסקופים נפרדים. תצורה זו דורשת רישום תמונה בין אופנים, שלעתים קרובות חסר את הדיוק הדרוש כדי למקד באופן אמין מבנים קטנים ונדירים באתרם. אנו מציגים זרימת עבודה המבוססת על פלטפורמת הדמיה תלת-אירועית מותאמת אישית המאפשרת הדמיה פלואורסצנטית בו זמנית וכרסום קרן יונים ממוקדת. זה מאפשר משוב פלואורסצנטי בזמן אמת שניתן להשתמש בו כדי לקבוע מתי לסיים את הטחינה על מנת לשמר מבנים בעלי תווית פלואורסצנטית מעניינים בלמלה הסופית. באמצעות גישה זו, כיוונו את המרכז לארגון מיקרו-צינוריות (MTOC) במקרופאגים מזוגגים והשגנו שיעור הצלחה של >60%, שאושר על ידי טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית לאחר מכן ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית (CryoET) מאפשרת הדמיה של דגימות ביולוגיות במצב כמעט טבעי ברזולוציה מקרומולקולרית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . עם זאת, עובי התאים האיקריוטיים - לעתים קרובות כמה מיקרונים - עולה על הנתיב החופשי הממוצע (~300 ננומטר) של אלקטרונים של 300 קילו וולט, מה שמגביל את עומק החדירה של אלקטרונים לא מפוזרים ובכך מגביל את עובי הדגימה השמיש. כדי לטפל בכך, ניתן להשתמש בקרן יונים ממוקדת (FIB) כדי להסיר את רוב התא השמור קריוגנית בתהליך המכונה כרסום CryoFIB, לייצר למלות דקות מספיק עבור הדמיית CryoET 12,13,14,15,16.

בתהליכי עבודה שדווחו בעבר, הדגימות נשמרות תחילה בקרח מזוגג באמצעות הקפאת צלילה 17,18,19 ולאחר מכן נטענות למכשיר בעל קרן כפולה המצויד הן ב-CryoFIB והן במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). ניתן להשתמש בהדמיית SEM כדי לזהות תכונות תת-תאיות מעניינות כגון אברונים ואפילו כמה מבנים חלבונים20,21. ניתן להשתמש במידע זה כדי לכוון את תהליך הטחינה של CryoFIB, שבו הדגימה מוסרת בצורה מדורגת במטרה לייצר למלה בעובי של פחות מ-200 ננומטר המתאימה ל-CryoET 13,14,22. עם זאת, גישה זו מציגה שני אתגרים מרכזיים שהפרוטוקול הנוכחי מתמודד איתם. ראשית, לעתים קרובות יש צורך להשיג CryoET של מבנים חלבונים ספציפיים, אך ה-SEM יכול להזיק, ורוב המבנים החלבונים אינם ניתנים להבחנה על ידי ה-SEM בעת הדמיית חומר ביולוגי לא מוכתם. כיצד ניתן להנחות במדויק את הטחינה לאזורים תת-תאיים ספציפיים או לאזורים המכילים ביומולקולות ספציפיות בצורה נטולת נזק? שנית, גם לאחר ייצור למלות דקות ו-CryoET שלאחר מכן, זה יכול להיות מאתגר לזהות ביומולקולות ספציפיות בשחזורים הסופיים עקב רזולוציה לא מספקת, יחס אות לרעש ו/או ניגודיות הנדרשים לזיהוי חד משמעי. כיצד ניתן לקבוע את המיקומים המרחביים של ביומולקולות אלו בתוך שחזורי cryo-ET?

כדי להתמודד עם שני האתגרים, התחום פנה יותר ויותר למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית או צבעים אקסוגניים הקושרים חלבוני מטרה משמשים באופן שגרתי לסימון ביומולקולות ספציפיות מעניינות 5,23,24. ניתן לתאם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קריוגנית של תאים מזוגגים שנלקחו לאחר הטחינה עם הטומוגרמות המתקבלות. גישה זו, המכונה מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם קריוגני (CryoCLEM), מבוססת היטב ונעשה בה שימוש נרחב כדי למקם חלבונים ספציפיים בתוך שחזורי CryoET 5,12,23,24. ההתקדמות האחרונה כוללת שימוש בביו-חיישנים פלואורסצנטיים ובשיטות סופר-רזולוציה כדי לשפר מידע משלים ודיוק מרחבי 25,26,27,28,29.

CryoCLEM היא אחת הדרכים להתגבר על האתגר השני שזוהה לעיל, המאפשרת לקבוע את מיקומם של חלבונים ספציפיים בתוך הלמלה. עם זאת, CryoCLEM לא עושה דבר עבור המשתמש אם הלמלה הסופית אינה מכילה את החלבונים המעניינים. למרבה המזל, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית גם כדי לכוון את הטחינה לאזורי עניין מסומנים. בעוד שכרסום FIB מונחה פלואורסצנטי הוא פיתוח חדש יותר מ-CryoCLEM, זרימות עבודה ראשוניות שהופיעו לפני כעשור12, הוא מצא אימוץ מהיר ונרחב. הפרוטוקולים המוקדמים הסתמכו על מיקרוסקופי אור חיצוניים כדי לרכוש מערכי נתונים פלואורסצנטיים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, אשר נרשמו לאחר מכן לתמונות SEM וקרן יונים לאחר העברת הדגימה ל-CryoFIB-SEM. לאחרונה, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים שולבו ישירות בתאי ואקום CryoFIB-SEM. שילוב זה מפחית את זיהום הקרח במהלך ההעברות ומאפשר הדמיה של הלמלה הסופית ביתר קלות. כעת פותחו מספר פלטפורמות לשילוב מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם CryoFIB-SEM לכרסום מונחה פלואורסצנטי. אלה התמקדו בהצלחה באברונים ובמתחמי חלבון גדולים 5,23,24. עם זאת, למעט כמה יוצאים מן הכלל30, הנתיב האופטי מייצר מישור מוקד נפרד באזור פיזי אחר של תא הוואקום מה-FIB-SEM. כתוצאה מכך, עדיין נדרש רישום מדויק בין תמונות פלואורסצנטיות ויונים כדי לכוון את הכרסום, בדיוק כפי שנדרש בשימוש במיקרוסקופים אופטיים עצמאיים.

תהליך רישום זה נוטה לאי דיוק עקב שלושה גורמים עיקריים: אי התאמות מקדם שבירה (הגורמות לתזוזות מוקד לכאורה)31,32, תנועת דגימה במהלך כרסום ושגיאת לוקליזציה. יתר על כן, הרישום נעזר בדרך כלל על ידי פידוציאלים פלואורסצנטיים בגודל מיקרון הנראים הן בשיטות יונים והן באופטיות ומשמשים כזוגות נקודות יישור לחישוב טרנספורמציות בין היונים לתמונות האופטיות. עם זאת, חרוזים אלה יכולים לטשטש או להתחרות באות הקרינה מהדגימה, והלוקליזציה והיישור שלהם על פני תמונות אופטיות ויונים הם איטיים ועתירי משתמש. יחד, מגבלות אלה פגעו במיקוד שגרתי של מאפיינים קטנים ונדירים. אמנם קשה להגדיר גבול מדויק למבנים שניתן לשמר כיום בלמלה דקה, אך גישות מבוססות רישום נחשבות בדרך כלל לא יעילות ללכידת מטרות עם ממדים ציריים מתחת למיקרוןאחד 33.

כאן, אנו מדווחים על שימוש במערכת הדמיה תלת-מקרית המשלבת FIB, SEM ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית במיקום מוקד יחיד34,35. תצורה זו מאפשרת כרסום מונחה פלואורסצנטי פשוט ומדויק יותר בהשוואה לאינטגרציות שאינן מקריות על ידי ביטול הצורך ברישום תמונות אופטיות ויונים. בתנאים אידיאליים של רקע נמוך ואות גבוה, ניתן להשיג דיוק הנחיה בסדר גודל של 10 ננומטר36. זה גם מאפשר רכישת נתוני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קריוגנית רב-צבעונית לאורך תהליך הטחינה, כולל מהלמלה הדקה הסופית, מה שמאפשר ניתוח מתאם ולוקליזציה של מטרות מוגבלות תת-עקיפה35. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים בערכת כלים מותאמת אישית לשינוי תמונה כדי ליישר במדויק את תמונות הקרינה הללו עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בהגדלה נמוכה כדי לקבוע היכן לאסוף CryoET, לייעל את איסוף הנתונים ולהבטיח לכידת יעד בשחזורים הטומוגרפיים הסופיים.

כדי להנחות את הכרסום, אנו מנצלים את יכולת המערכת לנטר שינויים בעוצמת הקרינה בזמן אמת. במקום לנסות ליישר תמונות אופטיות ויונים כדי למצוא את המטרה שלנו, המשתמש פשוט צופה באות הפלואורסצנטי מהדגימה. ככל שהטחינה מתקדמת, הקרינה מתנהגת בצורה אופיינית מאוד: תחילה היא נעשית בהירה יותר כאשר מסירים את סרט התמיכה בפחמן בין אובייקט המיקרוסקופ לדגימה המסומנת פלואורסצנטית, ואז פוחתת בהדרגה כאשר חומר אוטו-פלואורסצנטי שאינו ממוקד נטחן, ולבסוף, יורד בחדות ככל שהמבנה המסומן עצמו מוסר חלקית. אות זה בזמן אמת קובע בדיוק היכן נמצא בתהליך הטחינה ומתי להפסיק את הטחינה, ומבטיח כי יעד העניין נשמר בתוך הלמלההסופית 37. בפרוטוקול המפורט, נדון גם בגישה מתקדמת יותר המשתמשת בתנודות בבהירות הקרינה עקב השפעות אינטרפרומטריות כדי להנחות כרסום לעצמים בהיקף צירי של <300 ננומטר.

אנו מדגימים את התועלת של הפלטפורמה על ידי התמקדות במרכז ארגון המיקרו-צינורות (MTOC)38. ה-MTOC הוא אברון קריטי המעורב בחלוקת תאים והתמיינותם. בתאי יונקים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של טובולין מסומן חושף את ה-MTOC כנקב פלואורסצנטי יחיד בקוטר של כ-1 מיקרומטר בתאים חיים. גישה זו שימשה כדי למקם בהצלחה את ה-MTOC בנאמנות גבוהה ללמלות דקות של תאים מזוגגים. הארגון המפורט של מיקרו-צינורות ב-MTOC והאינטראקציות שלהם עם אברונים אחרים מתגלים בשחזורים טומוגרפיים עוקבים. זרימת עבודה זו מאפשרת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתאמת ברמת דיוק גבוהה ו-CryoFIB-SEM ללא רישום, הפחתת קלט המשתמש והרחבת הגישה למבנים סלולריים שבעבר היו קטנים באופן בלתי אפשרי כדי ללכוד בחוזקה עם גישות לא מקריות.

הגדרות ותיאור המכשיר
המיקרוסקופ האופטי המשולב מתואר בפירוט ב-Boltje et al.35, ופרטים נוספים על השימוש במיקרוסקופ המשולב ניתן למצוא בפרוטוקול34 שפורסם לאחרונה. המטרה משולבת מלמטה ומצוידת ביכולות מיקום x, y ו-z כדי לאפשר יישור קו עם נקודת המקרה FIB-SEM. כיום הוא פועל עם יעד NA של 100x, 0.85 עם מתקן כיסוי. הדמיה אופטית מתבצעת באמצעות זכוכית כיסוי, המגנה על המטרה מפני חומר מקרטע וקרינה הן מה-FIB והן מה-SEM. תאורת שדה רחב מסופקת על ידי קבוצה של נוריות LED המשתרעות על פני מספר אורכי גל גלויים. זיהוי הקרינה מתבצע באמצעות גלאי sCMOS. ישנם שלושה עמדות במה מוגדרות: טעינה: מיקום הבמה שבו נטענת הדגימה; ציפוי: מיקום הבמה לציפוי באמצעות מערכת הזרקת הגז; 3-Beam: מיקום הבמה שעבורו ניתן ליישר את כל שלושת המיקרוסקופים (FIB, SEM ואופטיים).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: המערכת התלת-צירופית המשמשת כאן היא רכיב הדמיה פלואורסצנטי קריוגני מותאם אישית המשולב במערכת FIB-SEM בעלת קרן כפולה זמינה מסחרית. ניתן להתאים את העיקרון וסדר הפעולות באופן כללי ליישומים תלת-מקריים עתידיים.

1. התקנה

  1. קרר את המערכת לטמפרטורה קריוגנית. עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות שני חיישנים: האחד ממוקם על שלב הדגימה והשני בתוך החדר. שמור על שלב הדגימה חם יותר בכ-20 מעלות צלזיוס מהתא (למשל, שלב ב-~-170 מעלות צלזיוס, תא ב-~-190 מעלות צלזיוס) כדי למזער הצטברות קרח על הדגימה. תהליך הקירור אורך בדרך כלל כשעה וחצי.

2. טעינת מדגם

  1. השתמש בחנקן נוזלי כדי לקרר ידנית את תחנת ההעברה ברגע שטמפרטורת המערכת מתקרבת לטמפרטורה קריוגנית (כ-167.5 מעלות צלזיוס). טמפרטורת המערכת מוצגת בפינה השמאלית העליונה של תוכנת מיקרוסקופ האור.
  2. טען Autogrid חתוך אחד לתוך קלטת הדגימה המיועדת למערכת מיקרוסקופ האור הקריוגני. הקסטה מורכבת מכיסוי מודבק ומרווח, כאשר הרשת האוטומטית ממוקמת ביניהם. סגור את הקסטה על ידי הידוק בורג הטבעת, ולאחר מכן הכנס אותה לחריץ בתחנת ההעברה34.
  3. חבר את תחנת ההעברה למערכת והשתמש במצלמת החדר הפנימית כדי להנחות את קלטת הדגימה אל הדגימהtagהtagה.

3. מערכת הזרקת גז (GIS) לציפוי מדגם

  1. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ האור והעבר את הדגימהtagה ממצב טעינה לציפוי.
  2. הכנס את מחט ה-GIS באמצעות תוכנת הבקרה FIB-SEM על ידי לחיצה על סמל פתית השלג. תחת בקרת GIS, בחר באפשרות הכנס מחט GIS.
  3. אפשר שקיעת GIS למשך 30 שניות על ידי פתיחת זרימת הגז.
    הערה: זה משתנה בין 20 שניות לדקה אחת בהתבסס על סוג המדגם. מטרת שלב זה היא להגן מספיק על הדגימה במהלך הליך כרסום ה-FIB שלאחר מכן.
  4. החזרת מחט ה-GIS, העבר את הדגימה stage בחזרה למצב הטעינה המוגדר מראש.

4. יישור מערכת שלוש קורות

הערה: חלק זה מותאם מוואנג39.

  1. בתוכנת מיקרוסקופ האור, העבר את הדגימהtagה ממצב הטעינה למצב 3 הקרניים המוגדר מראש.
  2. בתוכנת FIB-SEM, לחץ על החלון השמאלי העליון והגדר את ה- SEM בהגדלה של פי 100.
  3. בכרטיסייה יישור של תוכנת מיקרוסקופ האור, לחץ על הפונקציה View כדי לקבל אטלס SEM של הרשת. תמונת אטלס זו משתמשת בפרמטרים שנקבעו בעבר.
  4. זהה שטח מרובע עם סרט פחמן שבור ולחץ עליו פעמיים כדי להעביר את שלב הדגימה למיקום זה.
  5. חזור לתוכנת הבקרה FIB-SEM והתאם את ה-SEM להגדלה גבוהה יותר כדי להתמקד באזור הריבועי שנבחר, הממורכז בשדה הראייה.
  6. חזור על שלבים 4.4 ו- 4.5 לפי הצורך עד שה- SEM יתמקד בתבנית הניתנת להבחנה, כגון הקצה החד של סרט פחמן שבור.
  7. הפעל את מיקרוסקופ הקרינה והתאם את קואורדינטות x, y, z כך שיתאימו לתצוגת SEM.
  8. טחנו תבנית קטנה עם ה-FIB, למשל, מלבן או עיגול קטן.
  9. ודא שהתבנית נראית הן בתצוגה של FIB והן במיקרוסקופ פלואורסצנטי. במידת הצורך, כוונן את היישור על ידי ביצוע שלבים 4.3-4.7 במידת הצורך.
    הערה: היישור והרישום של המיקרוסקופים האופטיים והיונים הושלמו.

5. לוקליזציה וכרסום יעד

הערה: חלק זה מותאם מוואנג39.

  1. עברו ללשונית לוקליזציה בתוכנת מיקרוסקופ האור, והגדירו ערוצי פלורסנט על ידי הפעלת תנאי עירור וסינון מתאימים. הקצה כל פלואורופור כערוץ נפרד וכלול ערוץ נוסף לאור המועבר (או שדה בהיר).
  2. זהה את יעד העניין על ידי כוונון עוצמת ה-LED וזמן החשיפה עבור כל ערוץ פלורסנט. כהפניה, בעת הדמיית SiR-tubulin, השתמש בחשיפה של 1.2 שניות עם הגדרת הספק LED קבועה של 30 mW.
    הערה: הפרמטרים עשויים להשתנות בין פלואורופורים. העוצמה האופטית צריכה להישאר מתחת ל-~25-50 W/cm2 בדגימה. עוצמה גדולה יותר מזה עלולה לגרום לחימום משמעותי ולדויטריפיקציה של הדגימה37,40.
  3. לאחר שתהיה מרוצה מהפרמטרים, רכוש ערימת z פלואורסצנטית לפני כרסום העובר בכיוון הצירי. לאחר מכן, סמן את היעד כהחזר ROI.
  4. עבור לתוכנת FIB-SEM כדי לצייר למלה בהחזר ההשקעה.
  5. בצע כרסום גס כדי להסיר את עיקר החומר כ-3 מיקרומטר מעל ומתחת להחזר ההשקעה. בינתיים, השאר את מיקרוסקופ הקרינה דולק במהלך הטחינה כדי לפקח על כל ירידה באות הפלורסנט.
  6. דק את ההחזר על ההשקעה ל~2 מיקרומטר באמצעות מצב חתך הניקוי.
  7. פתח את ערכת הכלים האינטרפרומטרית מבוססת Python מהמסוף כדי לנטר את האות הפלואורסצנטי תוך דילול הלמלה (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36.
  8. לכרסום וליטוש לאחר מכן, עקוב אחר אחת משתי הגישות המתוארות להלן בשלבים 5.9 או 5.10 כדי לכוון כרסום על סמך מידות היעדים שנבחרו.
    1. היקף צירי של המטרה > 300 ננומטר
      הערה: כאן נשתמש בגישה הרסנית למחצה לכרסום ישיר.
      1. ב-Python-GUI, בחר את היעד המעניין במיקרוגרף הקרינה. התוכנה תתחיל אוטומטית לשרטט את הבהירות כפונקציה של זמן עם כל פריים חדש.
      2. עקוב אחר עוצמת הקרינה באמצעות ערכת הכלים של Python. טחון את הדגימה במצב חתך ניקוי מלמטה כדי להסיר את כל חומר סרט התמיכה שנותר אם רלוונטי.
        הערה: כאשר מסירים את סרט התמיכה, יש להבחין בשיפור בקרינה.
      3. השתמש בירידות מהירות בעוצמת הקרינה - המעידה על אובדן חומר פלואורסצנטי - כרמז מתי להחליף כיווני כרסום. לדוגמא, אם נצפתה כרסום מלמטה למעלה וירידה חדה בקרינה, הפסק את הטחינה ועבור לכרסום מלמעלה למטה.
        הערה: אם מבנה מוסר מהר מדי, הפחת את זרם הכרסום בתוכנת FIB-SEM כדי להאט את הסרת המטרה.
    2. היקף צירי של המטרה ≤ 300 ננומטר
      הערה: כאן, נשתמש באפקט האינטרפרומטרי כדי לכוון כרסום36.
      1. ב-Python-GUI, בחר את היעד המעניין במיקרוגרף הקרינה. התוכנה תתחיל אוטומטית לשרטט את הבהירות כפונקציה של זמן עם כל פריים חדש.
      2. התחל בכרסום מלמעלה למטה דרך יעד בדיקה. עקוב אחר ניגודיות השוליים רגע לפני כרסום דרך המטרה דרך עוצמת הקרינה. יעד הקרינה מותאם באופן רציף לגאוס דו-ממדי, כאשר ההתאמה משמשת לקבלת עוצמה משולבת שלאחר מכן משורטטת.
      3. לאחר כרסום המטרה, התאימו את התנודות בעקבות העוצמה לפונקציית המודל הבאה באמצעות ממשק המשתמש הגרפי Python-GUI:
        figure-protocol-1
        כאשר A הוא משרעת התנודה, λ אורך הגל של העירור, k מונח שיכוך המייצג את אורך הקוהרנטיות של מקור האור, גורם פאזה Φ, ו-d הוא המרחק למושא הלכידה. ממטרת הבדיקה, ניתן לחזות את כל המונחים בגבולות סבירים כך שהמרחק, d, הוא המשתנה החופשי היחיד המשמש כדי לומר למשתמש היכן נמצא האובייקט הפלואורסצנטי ביחס לכרסום שלו. ראה Sica et al. לפרטים נוספים36.
        הערה: עבור המטרות הבאות, ערכת הכלים תתאים למעקב העוצמה עם אותה פונקציית מודל ותעריך היכן להפסיק את הטחינה מלמעלה למטה. כל האביזרים נעשים במקביל לכרסום. המטרה היא לעצור את הטחינה כאשר המטרה שוכנת בעומק השווה למחצית מעובי הלמלה הרצוי מתחת לפני השטח העליון.
      4. לאחר השלמת הטחינה מלמעלה למטה, סיים את הלמלה על ידי כרסום מלמטה למעלה במצב חתך ניקוי עד להשגת העובי הרצוי.
  9. צלם תמונה פלואורסצנטית לאחר כרסום.

6. מיקרוסקופ אור מתאם ואוסף סדרת הטיה

  1. לאחר העברת הדגימה ל-CryoTEM, אסוף אטלסview של הרשת ב-182x כדי לאפשר כיסוי מספיק של כל הרשתות.
  2. בהגדלת ביניים מתאימה הנעה בין 6,500x ל-11,000x, אסוף סדרה של תמונות מונטאז' של הלמלה הסופית בהטיה של 0°.
  3. קרא את לאחר כרסום תמונות פלואורסצנטיות רב-ערוציות ואת תמונת ההקרנה משלב 6.2 לתוכנת טרנספורמציה הקרנתית מותאמת אישית לרישום החזר ROI (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
  4. בחר בסך הכל 8-10 זוגות של נקודות ייחוס כדי לחשב במדויק את שינוי התמונה הפרויקטיבי.
    הערה: נקודות אלו יכולות להיות מאפיינים ברורים (למשל, קצוות למלות, זיהום קרח גלוי או חורי רשת פתוחים) הקיימים הן במיקרוסקופיה אופטית של שדה בהיר והן במיקרוסקופ אלקטרונים.

7. אוסף סדרת הטיה בהגדלה גבוהה

  1. השתמש בתמונה זו של מיקרוסקופ אלקטרונים פלואורסצנטי ושידור כהתייחסות למשתמשים כדי לבחור אזור הדמיה בגבול גודל מסגרת המצלמה לאוסף סדרות הטיה בהגדלה גבוהה.
  2. בחר הגדלה ופרמטרים של סדרת ההטיה על סמך השאלה הביולוגית.
    הערה: לצורך ההדגמה, אספנו נתונים מ-54° במרווחים של 2° בגודל פיקסל של 3.5 Å 41,42,43.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סימנו תאי מקרופאגים מובחנים עם סמן הטובולין SiR-tubulin לפני ההקפאה. בעקבות הפרוטוקול, זיהינו את ה-MTOC כפונקטום פלואורסצנטי יחיד בקוטר ~ 1 מיקרומטר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1A). נוסף על כך, צפינו במבנים פלואורסצנטיים דמויי סיבים שמקרינים מה-MTOC לכיוון היקף התא, בהתאם לרשת המיקרו-צינוריות (איור 1A). תמונות כרסום בשלבים בעובי דגימה שונה מוצגות באיור 1B. יש לציין שכאשר הלמלה הגיעה לעובי של כ-800 ננומטר, הנקב היחיד של MTOC התמוסס לשני כתמים סמוכים, כל אחד בקוטר של כ-700 ננומטר. ניתוח עוקב אישר שכל כתם תואם לצנטריול בודד.

הדמיה וכרסום בו זמנית אפשרו לנו לעקוב אחר שינויים בעוצמת הקרינה בזמן אמת. יש לציין כי ראינו עלייה בקרינה לאחר הסרת חומר לא פלואורסצנטי בתפזורת וסרט התמיכה הסופג (איור 1B-D). ככל שהלמלה דוללה מ-2 מיקרומטר ל-800 ננומטר, עוצמת הקרינה פחתה בחדות, מה שמשקף את ההסרה המתקדמת של מבנים מסומנים. ירידה זו נמשכה כאשר הלמלה הידלדלה עוד מתחת ל-200 ננומטר (איור 1B-D). התמונה הקרינה המתואמת ואטלס מיקרוסקופ האלקטרונים מדגימים שזרימת העבודה שלנו מאפשרת מיקוד מדויק לכרסום (איור 2A). טומוגרמות משוחזרות ומודלים מפולחים מגלים כי הצנטריולים מורכבים משלישיות מיקרו-צינוריות, בהתאם לדיווחים קודמים 42,43,44,45 (איור 2A,B). במקרים שבהם רק כתם פלואורסצנטי אחד נשמר בלמלה הסופית, אנו צופים בצנטריולה בודדת בטומוגרמה המתאימה (איור 2B).

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של CryoFM-FIB-SEM תלת-מקריים עבור לוקליזציה מדויקת של מרכז ארגון המיקרו-צינוריות. (A) (משמאל) מיקרוסקופ תאים חיים ו-CryoFM (מימין) של ה-MTOC. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) תצלומי בזק מדורגים של CryoFM ו-CryoFIB לכרסום ממוקד. תצוגת FM מקרוב מסומנת כתיבות מקווקו צהובות. צנטריולים מסומנים כחצים צהובים. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (C) עוצמת הקרינה של MTOC במהלך כרסום CryoFIB. (D) פרופיל קו פלואורסצנטי על פני ה-MTOC שנלקח בשלבים שונים במהלך כרסום CryoFIB. קיצורים: CryoFM-FIB-SEM = מיקרוסקופ פלואורסצנטי קריוגני עם כרסום קרן יונים ממוקד ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק; MTOC = מרכז מארגן מיקרו-צינוריות; ROI = אזור עניין. נתון זה נלקח מוואנג39. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פרטים מולקולריים של ה-MTOC שנחשפו על ידי זרימת עבודה תלת-מקרית של CryoFM-FIB-SEM. (A) מודל FM, EM ופילוח מתואם של ה-MTOC. (א) תמונת FM לאחר כרסום. זוהי אותה תמונה מהפאנל האחרון של איור 1B המסומן כ-180 ננומטר אך מסובב כדי להתאים לשחזור ולסגמנטציה של CryoET. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר; (ב) תצוגה מוגדלת של האזור המקווקו בצהוב מ-(א). (ג) הקרנת FM ו-TEM בקורלציה של האזור המקווקו בציאן המצוין ב-(2). סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. (ד) מודל מפולח של שחזור טומוגרפי באזור העניין (צהוב, צנטריול; ירוק, מיקרו-צינורית). סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B) תמונות FM מייצגות ופרוסות טומוגרפיות של שתי למלות שונות שמציגות כיווני צנטריולה שונים. FM: סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. פרוסה טומוגרפית: סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. קיצורים: CryoFM-FIB-SEM = כרסום קרן יונים ממוקד קריוגני עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; MTOC = מרכז מארגן מיקרו-צינוריות; FM = מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ET = העברת אלקטרונים; TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. נתון זה נלקח מוואנג39. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות שלנו מדגישות את התועלת של פלטפורמת ההדמיה התלת-מקרית, המאפשרת הדמיה פלואורסצנטית וכרסום בו זמנית. תוך מינוף משוב זה, אנו מדגימים שתי אסטרטגיות כרסום מונחות פלואורסצנטיות - הרסניות למחצה ואינטרפרומטריות - המונעות את הצורך בגישות מסורבלות ומבוססות רישום המתמודדות עם מגבלות דיוק בסיסיות הקשורות לאי התאמה של מקדם השבירה ותנועה במהלך כרסום 12,33,46 . יתר על כן, מכיוון שההנחיה המדויקת מסתמכת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולא על SEM, הקרינה האופטית אינה מובילה לנזק הניתן לגילוי כל עוד העוצמה נשמרת מתחת לסף המוביל לוויטריפיקציה37,47. היכולות שהודגמו כאן מרחיבות את הדגימות הביולוגיות הנגישות כך שיכללו מטרות נדירות וקטנות (<300 ננומטר בהיקף צירי) מעניינות תוך ייעול זרימת העבודה.

שלב המפתח בפרוטוקול זה הוא קביעת מתי להפסיק את הטחינה על סמך שינויים בבהירות הפלואורסצנטית של יעד מעניין. נכון לעכשיו, זה כרוך בהתערבות ידנית מהירה כדי להפסיק את הטחינה בזמנים הרצויים. שיטה זו הוכיחה את עצמה כמספיקה עבור היעדים הנוכחיים שנחקרו, אך שינוי עתידי יכול לשלב עוד יותר את ערכת הכלים של Python במערכת FIB כדי להפסיק ישירות את הכרסום. שינוי זה עשוי להיות נחוץ אם נדרשים קצבי כרסום מהירים יותר, מכיוון שזה ייתן פחות זמן להתערבות ידנית. לחלופין, אם ניתן לסבול שיעורי כרסום איטיים יותר, זה ייתן יותר זמן להתערבות ידנית במידת הצורך.

בעקבות יצירת מבנים ביולוגיים מעניינים המכילים למלה, תוכנת טרנספורמציה מותאמת אישית שלנו מאפשרת מתאם ברמת CryoTHEM, תוך שימוש בסקירות אטלס של lamellae כדי להנחות את איסוף הנתונים של CryoET. בסך הכל, הפרוטוקול המוצג כאן חיוני להדמיית מטרות ביולוגיות קטנות ונדירות המסומנות פלואורסצנטית על ידי טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית בדגימות תאיות איקריוטיות עבות. בהשוואה למערכות Cryo-FIB קיימות שאינן מקריות, כגון Aquilos 2 עם iFLM, זרימת העבודה שלנו משיגה אחוזי הצלחה גבוהים יותר במיקוד תכונות אלה.

דיוק המטרה הגבוה הזה בא על חשבון היעילות. מכיוון שהכרסום הוא ידני ולא אוטומטי, התפוקה של ייצור הלמלה מוגבלת. בפגישת טחינה של 8 שעות, אנו מייצרים בדרך כלל 6-8 למלות, כאשר כחמש מכילות יעד מעניין. עם זאת, אנו מאמינים שניתן יהיה להפוך את זרימת העבודה הזו לאוטומטית בעתיד כדי לשפר את התפוקה. אוטומציה תדרוש סקריפטים מותאמים אישית כדי לנטר באופן רציף אזורי כרסום פעילים בתמונת ה-FIB ולעקוב אחר עוצמת הקרינה בזמן אמת כדי להבטיח שימור מטרה. האתגרים העיקריים נותרו בעינם, כולל יצירת תקשורת יעילה בין כל הסקריפטים המותאמים אישית ותוכנת הבקרה הן עבור ה-CryoFIB-SEM והן עבור המיקרוסקופ הקרינה.

במבט לעתיד, יש עבודה רבה לעשות כדי לשלב טכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מתקדמות אחרות שנדונו קודם לכן, כולל חיישנים ביולוגיים פלואורסצנטיים, הדמיה ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, אנו צופים שגיאומטריות תלת-מקריות יהפכו לסטנדרט במכשירים עתידיים וכי הדמיית פלואורסצנטיות בו זמנית במהלך הכרסום תהפוך לשגרה. אם כן, פרוטוקול זה עשוי לשמש מדריך רב ערך לחוקרים שמטרתם ללכוד פרטים בקנה מידה מולקולרי של המבנים הביולוגיים הקטנים והנדירים, שלמרות גודלם ושפעם, הם מרכזיים בביולוגיה של התא.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לחברים מ-Delmic על עזרתם בפיתוח תהליכי עבודה של הדמיה. PDD נתמך בחלקו על ידי מלגת פנופסקי במעבדת המאיץ הלאומית SLAC כחלק מתוכנית המחקר והפיתוח המכוונת של מעבדת האנרגיה תחת חוזה DE-AC02-76SF00515 ועל ידי משרד האנרגיה, משרד המדע, המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי, תחת חוזה מס. DE-AC02-76SF00515 FWP 100883. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי AI127401 מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ל-G.J.J. J.W. נתמך על ידי מענק 2021-234593 מיוזמת צ'אן צוקרברג DAF, קרן מייעצת של הקרן הקהילתית של עמק הסיליקון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אקילוס 2 קריו-FIBתרמופישר סיינטיפיקhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m
& gad_source=1& gad_campaignid=12
764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS
s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid=
Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w
xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9
KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy
2EALw_wcB
קופסת רשת קריו תואמת Autogridמדעי מיקרוסקופיית אלקטרוניםhttps://www.emsdiasum.com/autogrid
-compatible-cryo-grid-box?srsltid=
AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk
cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
טבעות אוטוגריד וקליפים Cננוסופטhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
חבילת התוכנה של CLEMקבוצת המחקר דאלברג בסטנפורד/SLAChttps://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
דרגונפליי 2022.1מערכות מחקר אובייקטיםhttps://dragonfly.comet.tech/
אנזלדלמיק ב. ו.מערכת ENZEL היא כלי מותאם אישית ואינה זמינה מסחרית כיום
IMOD 4.12אוניברסיטת קולורדוhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
דוור חנקן נוזלי LD4ננוסופטhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023MathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
כלי מניפולטור מכסה סיכהננוסופטhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
ערכת כלים לפייתוןקבוצת המחקר דאלברג בסטנפורד/SLAChttps://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, רשת 200, רשת אלקטרומגנטיתמדעי מיקרוסקופיית אלקטרוניםhttps://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
EM סידוריאוניברסיטת קולורדו בולדרhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
ספינת סטנדרט Spearlab (דואר העברה)ננוסופטhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
פינצטהמדעי מיקרוסקופיית אלקטרוניםhttps://www.emsdiasum.com/style-3sa

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komeili, A., Li, Z., Newman, D. K., Jensen, G. J. Magnetosomes are cell membrane invaginations organized by the actin-like protein MamK. Science. 311 (5758), 242-245 (2006).
  2. Bykov, Y. S., et al. The structure of the COPI coat determined within the cell. eLife. 6, e32493(2017).
  3. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  4. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  5. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 12 (1), 150-167 (2017).
  6. Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ. Annu Rev Biochem. 86 (1), 873-896 (2017).
  7. Grimm, R., et al. Electron tomography of ice-embedded prokaryotic cells. Biophys J. 74 (2), 1031-1042 (1998).
  8. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  9. Tamborrini, D., et al. Structure of the native myosin filament in the relaxed cardiac sarcomere. Nature. 623 (7988), 863-871 (2023).
  10. Kaplan, M., et al. Bdellovibrio predation cycle characterized at nanometre-scale resolution with cryo-electron tomography. Nat Microbiol. 8 (7), 1267-1279 (2023).
  11. Schur, F. K. M., et al. An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation. Science. 353 (6298), 506-508 (2016).
  12. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophys J. 110 (4), 860-869 (2016).
  13. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. cryoEM: Methods and Protocols. , Springer. 49-82 (2020).
  14. Rigort, A., Plitzko, J. M. Cryo-focused-ion-beam applications in structural biology. Arch Biochem Biophys. 581, 122-130 (2015).
  15. Noble, A. J., de Marco, A. Cryo-focused ion beam for in situ structural biology: State of the art, challenges, and perspectives. Curr Opin Struct Biol. 87, 102864(2024).
  16. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  17. Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2006).
  18. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge freezing for electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. 481, 63-82 (2010).
  19. Chang, Y. -W., et al. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography. Nat Methods. 11 (7), 737-739 (2014).
  20. Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237.e3 (2020).
  21. Lin, C., Zhang, L., Zhang, Z., Jiang, Y., Li, X. Locating cellular contents during cryo-FIB milling using cellular secondary-electron imaging. J Struct Biol. 215 (3), 108005(2023).
  22. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nat Protoc. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  23. Carter, S. D., Mamede, J. I., Hope, T. J., Jensen, G. J. Correlated cryogenic fluorescence microscopy and electron cryo-tomography shows that exogenous TRIM5α can form hexagonal lattices or autophagy aggregates in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (47), 29702-29711 (2020).
  24. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705.e12 (2018).
  25. Perez, D., et al. Identification and demonstration of roGFP2 as an environmental sensor for cryogenic correlative light and electron microscopy. J Struct Biol. 214 (3), 107881(2022).
  26. Sartor, A. M., Dahlberg, P. D., Perez, D., Moerner, W. E. Characterization of mApple as a red fluorescent protein for cryogenic single-molecule imaging with turn-off and turn-on active control mechanisms. J Phys Chem B. 127 (12), 2690-2700 (2023).
  27. Sexton, D. L., Burgold, S., Schertel, A., Tocheva, E. I. Super-resolution confocal cryo-CLEM with cryo-FIB milling for in situ imaging of Deinococcus radiodurans. Curr Res Struct Biol. 4, 1-9 (2022).
  28. Dahlberg, P. D., Moerner, W. E. Cryogenic super-resolution fluorescence and electron microscopy correlated at the nanoscale. Annu Rev Phys Chem. 72 (1), 253-278 (2021).
  29. Perez, D., et al. Exploring transient states of PAmKate to enable improved cryogenic single-molecule imaging. J Am Chem Soc. 146 (42), 28707-28716 (2024).
  30. Li, S., et al. ELI trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  31. Loginov, S. V., Boltje, D. B., Hensgens, M. N. F., Hoogenboom, J. P., vander Wee, E. B. Depth-dependent scaling of axial distances in light microscopy. Optica. 11 (4), 553-568 (2024).
  32. Petrov, P. N., Moerner, W. E. Addressing systematic errors in axial distance measurements in single-emitter localization microscopy. Opt Express. 28 (13), 18616-18632 (2020).
  33. Yang, J., et al. Precise 3D localization by integrated fluorescence microscopy (iFLM) for cryo-FIB-milling and in situ cryo-ET. Microsc Microanal. 29 (Suppl. 1), 1055-1057 (2023).
  34. Perton, E., Boltje, D., Jakobi, A., Hoogenboom, J. Workflow for fluorescence-targeted lamella milling from vitrified cells with a coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Bio Protoc. 15 (14), e5390(2025).
  35. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. eLife. 11, e82891(2022).
  36. Sica, A. V., et al. Optical interference for the guidance of cryogenic focused ion beam milling beyond the axial diffraction limit. bioRxiv. , (2024).
  37. Dahlberg, P. D., Perez, D., Hecksel, C. W., Chiu, W., Moerner, W. E. Metallic support films reduce optical heating in cryogenic correlative light and electron tomography. J Struct Biol. 214 (4), 107901(2022).
  38. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
  39. Wang, J. Direct visualization of cellular protein complexes in situ by fluorescence-guided cryo-FIB-SEM and cryo-ET. , California Institute of Technology. (2025).
  40. Last, M. G., Tuijtel, M. W., Voortman, L. M., Sharp, T. H. Selecting optimal support grids for super-resolution cryogenic correlated light and electron microscopy. Sci Rep. 13 (1), 8270(2023).
  41. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  42. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  43. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  44. Meng, E. C., et al. UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis. Protein Sci. 32 (11), e4792(2023).
  45. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  46. Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506(2021).
  47. Li, Y., Kang, D. -D., Dai, J. -Y., Wang, L. -W. The cage effect of electron beam irradiation damage in cryo-electron microscopy. npj Comput Mater. 10 (1), 115(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cryogenic Focused Ion BeamCryoFIB SEMFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTargeted Cell MillingCryogenic Electron TomographyCorrelative Light Electron MicroscopyMicrotubule Organizing CenterLamella PreparationReal Time Fluorescence Feedback

מאמרים קשורים