מאמר שיטה

אלסטומרים מגנטו-ריאולוגיים מיקרו-דפוסיים להנעת שינויים ביישור קרדיומיוציטים

DOI:

10.3791/68271

⸱

10 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פלטפורמת בדיקת קשיחות דינמית והפיכה המיוצרת באמצעות אלסטומר סיליקון רך במיוחד (פולידימתילסילוקסן, PDMS) עם חלקיקי ברזל משובצים. בדיקה חדשנית זו מתאימה לחקר שינויים פיזיים תלויי זמן בפנוטיפים של תאים, כולל הנחיית מגע. כאן, אנו מודדים יישור קרדיומיוציטים של חולדות יילודים עם התקשות מטריצה באמצעות מגנטיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמזים הקשורים למצע, כגון מכניים וטופוגרפיים, משפיעים עמוקות על התגובה התאית. עם זאת, חלק גדול מהמחקר הבסיסי משתמש בהשפעות סטטיות או מבודדות. הכיוון וטווח הזמן של ההשפעות המכניות הללו על תגובות תאיות מתעוררות נותרו ברובם לא נחקרו. כלים לבחינת האופן שבו גירויים הקשורים למצע המשתנים בזמן מניעים תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים יכולים לפתוח את הרמה הבאה של תובנה מכנית. כאן, אנו משתמשים באלסטומרים מגנטיים (MREs) בעלי דפוס מיקרו שיכולים להתקשות ולהתרכך במהירות בתגובה לשדה מגנטי חיצוני, מה שמאפשר חקירה קפדנית יותר של ההשפעות של גירוי מכני (נוקשות) וגירוי מונחה מגע (טופוגרפי) על התמצאות ויישור קרדיומיוציטים של חולדות יילודים. על ידי שילוב בקרה דינמית של קשיחות מכנית הניתנת לכוונון זמני והיפוך, אנו יכולים לבחון בקפדנות את השפעות העומס על ידי (1) התניה מוקדמת בתנאים זהים ו-(2) שינוי חריף בביומכניקה במבחנה כדי לחקות פנומנולוגיה רלוונטית מבחינה קלינית, כגון אוטם שריר הלב כראוי. גישה זו מאפשרת לנו לחקור את השפעת העומס על תגובות תאיות בצורה מציאותית ומבוקרת יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכולתו של הלב לשאוב דם ביעילות תלויה בארכיטקטורה ובתכונות המכניות (נוקשות) של שריר הלב שלו, כאשר הארגון המדויק של התאים והרקמות חיוני להתכווצות מתואמת ולתפקוד הכללי. שריר הלב מורכב בעיקר מקרדיומיוציטים (CMs), אשר אצל מבוגרים מציגים מורפולוגיה מוארכת, כמעט דמוית מוט עם סרקומרים (יחידת ההתכווצות של ה-CMs) מיושרים לאורך התא. לעומת זאת, CMs שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים או מושרים (iPSC) שונים באופן משמעותי מ-CMs בוגרים. הם נוטים להיות בעלי צורה מעוגלת יותר, גרעין יחיד, מבנה סרקומרי לא מאורגן או לא מיושר, ותדירות פעימות לא סדירה. הדמיון המבני של ארגון in vivo של שריר הלב מאפשר סנכרון של התכווצות והעברת כוח; זה קריטי וחיוני לסיכום שריר הלב הטבעי באמצעות מודל במבחנה. כדי ליצור CMs עם מאפיינים מבניים הדומים לשריר הלב הבוגר, מחקרים קודמים הדגימו אסטרטגיות מוצלחות לשיפור ההתבגרות, כולל מניפולציה של קשיחות המצע 1,2, הפעלת מתח מכני 3, שימוש בהנחיית מגע 4,5 או שימוש בקוצב חשמלי 6,7.

זה זמן רב הובן כי נוקשות הסביבה החוץ-תאית משפיעה על התאים. מגוון עצום של נוקשות קיים בכל גוף האדם, החל ממאות פסקל (Pa) במוח ועד לעשרות ג'יגה-פסקל (GPa) בעצם 8,9,10. נמצא כי במהלך ההתפתחות, רקמות משנות את נוקשותן, ושינוי זה מווסת את ההתמיינות וההתבגרות ברמת התאים לפנוטיפים הבוגרים הדרושים לתפקוד תקין 11,12,13,14. שינויים בנוקשות נקשרו גם למצבי מחלה ולהתקדמות של פתולוגיות ספציפיות 15,16,17,18. באופן ספציפי, נוקשות שריר הלב משתנה עם התפתחות והתקדמות מחלות; לדוגמה, לשריר הלב בריא יש מודול אלסטי של ~10 kPa בניגוד ללב כושל, שיש לו מודול אלסטי של 35-70 kPa או יותר19. בנוסף, מחקרים רבים במבחנה דיווחו כי קרדיומיוציטים שגודלו על מצע הדומה לנוקשות שריר הלב המקורית היו בעלי ארגון סרקומר טוב יותר20, יצרו התכווצות אופטימלית 1,19, ומשך פוטנציאל הפעולה הארוך ביותר21.

בנוסף, ידוע יותר שתאים in vivo חשופים למגוון מורכב של רמזים טופוגרפיים בתוך המיקרו-סביבה שלהם המניעים צורה ותפקוד. רמזים טופוגרפיים אלה מגיעים בגדלים וגיאומטריות שונות, החל מהסידור האקראי של אינטגרינים ברמה המולקולרית ועד ליישור ברמת המיקרון של תאים ברקמות השריר22,23. בדומה לווסתים מכניים אחרים, טופוגרפיה חשובה למורפולוגיה של התא, כגון התפשטות, התארכות, יישור, תנועתיות, התמיינות ואפופטוזיס 24,25,26. עם הכנסת מצעי תרבית סינתטיים, פותחו שיטות ליצירת טופוגרפיה מבוקרת של פני השטח עבור תרבית תאים ורקמות 27,28,29. לדוגמה, ננו-ומיקרו-חריצים מיקרו-דפוסיים שימשו כדי לספק הנחיית מגע לתאי יונקים כך שהתאים מכוונים ומעצבים מחדש את השלד הציטוגרפי שלהם כדי לעקוב אחר המבנים הטופוגרפיים של מצע התרבית.

כאן, אנו מציגים שיטת תרבית חוץ גופית המשלבת הנחיה מבנית (רמז מגע) ומכנית (קשיחות) באמצעות מצע אלסטומר מגנטורולוגי מעוצב (MRE), חומר מתכוונן שניתן להקשיח או לרכך על ידי התאמת עוצמת השדה המגנטי 17,30,31,32 . על ידי מיקום מגנטים ליד מצע התרבית, ניתן להגדיל את הנוקשות, כאשר מידת ההתקשות ניתנת לשינוי על ידי שינוי המרחק בין הדגימה למגנט. לעומת זאת, ניתן להפחית את הנוקשות על ידי הסרת המגנט לחלוטין. גישה זו מספקת שיטה חזקה, דינמית וניתנת לשליטה לשכפול התנאים המכניים דמויי ה-in vivo, בעוד שמיקרו-דפוס פני השטח מציג אניזוטרופיה, המאפשרת יצירת מצעי תרבית תאים דו-ממדיים ביומימטיים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חותמת PDMS מעוצבת

הערה: חותמת PDMS חיונית לגמישותה, ומאפשרת מניפולציה קלה ומגע מדויק בעת הכנת משטח ה-MRE המעוצב. האופי הגמיש של החותמת מאפשר גם הסרה ללא מאמץ משכבת ה-MRE PDMS מבלי לפגוע בתבנית, מה שמבטיח הן העברת דפוס מדויקת והן שימור של משטח ה-MRE.

  1. הכן 10 גרם של 10:1 (בסיס: חומר ריפוי) 184 PDMS.
  2. יוצקים 5 גרם מ-184 PDMS לצלחת פטרי 35 מ"מ ומוציאים בחומר ייבוש למשך ~5-10 דקות, עד שכל הבועות יתפוגגו.
  3. אפשר ל-184 PDMS להתרפא חלקית בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. כאשר נותרו 5 דקות ל-184 PDMS להחלמה חלקית, הוסף שכבה דקה של 184 PDMS הנוספים לסורג העקיפה והפגה במייבש למשך ~5 דקות.
  5. מוציאים מהתנור את תבנית ה-35 מ"מ עם 184 ה-PDMS שנרפא חלקית.
  6. הפוך את סורג העקיפה עם PDMS על 184 PDMS שנרפא חלקית בצלחת 35 מ"מ.
    הערה: ודא שרשת העקיפה פונה כלפי מטה לתוך 184 ה-PDMS שנרפא חלקית בצלחת 35 מ"מ.
  7. לחץ קלות על סורג העקיפה עד שכמות קטנה של 184 PDMS מקיפה את הסורג.
  8. השתמש ב-184 PDMS הנותרים כדי למלא מחדש את הכלי המקיף את הסורג כדי להבטיח שהוא יישאר במקומו בזמן הריפוי.
  9. מכניסים את התבשיל המכיל את סורג העקיפה לתנור המוגדר ל -60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.
  10. לאחר ריפוי מלא של 184 PDMS, הוציאו את תבנית ה-35 מ"מ עם סורג העקיפה מהתנור.
  11. קלעו סביב סורג העקיפה בעזרת אזמל.
  12. מרחו כמות קטנה של אלכוהול איזופרופיל (IPA) כדי לחדור מתחת לסורג העקיפה.
  13. משוך את הסורג מ-184 PDMS בכיוון המקביל לתבניות.
  14. הסר עודף של 184 PDMS, והשאיר רק את החלק המעוצב.
  15. חתוך את חותמת 184 PDMS לגודל הדרוש.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בחותמת של 1 ס"מ × 1 ס"מ עבור המכשירים.

2. ציפוי פני השטח של חותמת PDMS

הערה: טיפול בסילאן יוצר ציפוי משטח המונע הידבקות לא רצויה בין שכבות PDMS במהלך ההטבעה, מבטיח הפרדה חלקה ושומר על איכות העברת התבנית.

  1. טיפול בסילאן (שיטה מועדפת)
    1. הנח את ה-184 PDMS המפוברקamp במנקה פלזמה O2 כשהמשטח המעוצב פונה כלפי מעלה. טפל במשטח ה-PDMS עם 45 וואט של פלזמה O2 למשך 30 שניות.
      הערה: לאחר הוצאתו ממנקה הפלזמה, הנח מכסה (או מכסה) מעל ה-amps מיד כדי להבטיח שלא תתיישב פסולת על ה-bamps.
    2. הנח 184 חותמות PDMS לתוך חומר ייבוש במכסה אדים.
    3. קרע את המכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה.
    4. הנח את מכסה צינור המיקרו-צנטריפוגה ליד 184 חותמות PDMS במייבש.
    5. הוסף 20 מיקרוליטר של טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן למכסה צינור המיקרו-צנטריפוגה.
      זהירות: כימיקל זה מסוכן לבריאות ולכן יש להשתמש בו רק בקולט אדים כימי.
    6. סגור את מייבש הכביסה ומשוך שואב אבק.
    7. הניחו לסילאן לצפות את הבולים משעה עד לילה.

3. הכנת אלסטומרים מגנטורולוגיים

הערה: כדי ליצור MREs מתכווננים והפיכים, יחס מדויק של חלקיקי ברזל קרבוניל ואלסטומר, בשילוב עם הפעלת שדה מגנטי, מאפשר התאמת קשיחות על פני מגוון ערכים. על ידי שינוי שבר החלקיקים, מודול אלסטומר הבסיס ועוצמת השדה המגנטי, ניתן לכוונן את קשיחות החומר כדי לעמוד בדרישות ספציפיות.

  1. הכנת MRE בטווח דינמי רך יותר (ראה טבלה 1 למשלampמשקולות)
    1. יש למדוד את הכמות הרצויה של מדלל סיליקון ואלסטומר אקו חלק ב' ולערבב ב-2500 סל"ד במיקסר מהיר למשך דקה אחת.
    2. הוסף לתמיסה אלסטומר אקו חלק A וחלקיקי ברזל קרבוניל וערבב ב -2500 סל"ד במיקסר מהיר למשך דקה.
      הערה: סדר הערבוב הוא קריטי כדי להבטיח את תזמון הפילמור הרצוי.
    3. בעזרת פיפטת העברה כשהקצה חתוך, מוסיפים 5 גרם מה-MRE לצלחת פטרי חדשה בגודל 35 מ"מ ומוציאים בחומר ייבוש למשך ~5 דקות, ואז מניחים להתרפא חלקית בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך ~10 דקות.
      הערה: הקפדה על פילוס נכון של התנור והמייבש חיונית להשגת דגימה שטוחה, שהיא קריטית לנוחות ההדמיה.
    4. לאחר שנותרו 5 דקות, השתמש בפיפטת העברה כדי להוסיף MRE נוסף שלא נרפא רק כדי לצפות את פני השטח של חותמת 184 PDMS. הנח את החותמת המצופה בחומר היבש כדי להסיר את הגז למשך 5 דקות.
      הערה: היזהר לא להשתמש ביותר מדי MRE מכיוון שאם הוא מכסה את שולי החותמת, זה יקשה על הסרת החותמת לאחר ריפוי מלא של ה-MRE. כמו כן, הקפידו לציין את כיוון התבנית בכל שלב כך שכאשר מוציאים את החותמת מה-MRE, ניתן יהיה למשוך אותה בכיוון המקביל לתבניות.
    5. הוציאו את ה-MRE מהתנור, והשתמשו בזוג מלקחיים כדי להזיז בזהירות את ה-amp המצופה. הפוך אותו עם הפנים כלפי מטה על ה-MRE שנרפא חלקית ולחץ קלות. מחזירים את ה-MRE וה-Stamp המצופה לתנור בחום של 60 מעלות למשך 25 דקות נוספות.
    6. לאחר ריפוי מלא, השתמש באזמל כדי לקלוע את ה-MRE בתחתית החותמת, בניצב לתבניות.
    7. מרחו כמות קטנה של IPA על אזור החיתוך סביב החותמת.
      הערה: ה-IPA צריך לחלחל לתוך החתך ולהתחיל לנוע מתחת לחותמת.
    8. בעזרת מלקחיים, משוך את החותמת מה-MRE בכיוון המקביל לתבניות.
  2. טווח דינמי נוקשה יותר הכנת MRE (ראה טבלה למשלampמשקולות)
    1. הכן 30:1 184 PDMS.
      הערה: הכינו תוספת מכיוון שחלקם יישארו דבוקים למיכל הערבוב.
    2. הוסף את הכמות הרצויה של 527 PDMS חלק A וחלק B, ואז חלקיקי ברזל קרבוניל ו-30:1 184 PDMS ביחסים בהתבסס על הדוגמה בטבלה.
    3. מערבבים אותו בחום של 2500 סל"ד במיקסר מהיר למשך דקה.
    4. בעזרת פיפטת העברה כשהקצה חתוך, מוסיפים 5 גרם מה-MRE לצלחת פטרי חדשה בגודל 35 מ"מ ומוציאים בחומר ייבוש למשך ~5 דקות, ואז מניחים להתרפא חלקית בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך ~40 דקות.
    5. לאחר שנותרו 5 דקות, השתמש בפיפטה העברה כדי להוסיף MRE נוסף שלא נרפא כדי פשוט לצפות את פני השטח של חותמת ה-PDMS. הנח את החותמת המצופה בחומר היבש כדי להסיר את הגז למשך 5 דקות.
      הערה: היזהר לא להשתמש ביותר מדי MRE מכיוון שאם הוא מכסה את שולי החותמת, זה יקשה על הסרת החותמת לאחר ריפוי מלא של ה-MRE. כמו כן, הקפידו לציין את כיוון התבנית בכל שלב כך שכאשר מוציאים את החותמת מה-MRE, ניתן יהיה למשוך אותה בכיוון המקביל לתבניות.
    6. מוציאים את ה-MRE מהתנור.
    7. השתמש בזוג מלקחיים כדי להזיז בזהירות את החותמת המצופה, הפוך אותה עם הפנים כלפי מטה על ה-MRE שנרפא חלקית ולחץ קלות.
    8. מכניסים את ה-MRE עם החותמת המצופה על המדף העליון לתנור בחום של 60 מעלות למשך הלילה.
    9. לאחר ריפוי מלא, השתמש באזמל כדי לחתוך את ה-MRE בתחתית החותמת, בניצב לתבניות.
    10. החל IPA על אזור החיתוך סביב החותמת.
      הערה: ה-IPA צריך לחלחל לתוך החתך ולהתחיל לנוע מתחת לחותמת.
    11. בעזרת מלקחיים, משוך את החותמת מה-MRE בכיוון המקביל לתבניות.
טווח קשיחותחומריםמשקל לדוגמה
רך10–80 kPaאקו (A+B)11.25 גרם (A)11.25 גרם (B)
מדלל סיליקון22.5 גרם
חלקיקי ברזל45 גרם
נוקשה יותר60–120 kPa527 PDMS (A+B)18.75 גרם (A)18.75 גרם (B)
חלקיקי ברזל37.5 גרם
184 PDMS (בסיס + ריפוי)14.5 גרם (בסיס)0.5 גרם (ריפוי)

טבלה 1: דוגמה למשקלים של כל החומרים לייצור MRE רך וקשיח יותר. המשקולות בטבלה מיועדות לייצור סך של 90 גרם חומר MRE. הכנה פחותה יכולה להתבצע על ידי ערבוב כל המרכיבים באותם יחסים כמו משקולות הדוגמה בטבלה.

4. הכנת תרבית תאים

הערה: הכנת תרבית תאים כוללת בחירת קו התאים המתאים, הכנת אמצעי תרבית עם חומרים מזינים וגורמי גדילה נחוצים, והבטחת תנאים סטריליים למניעת זיהום. התאים מצופים בכלי תרבית ומודגרים בתנאים אופטימליים (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס עם CO2 מבוקר). ניטור קבוע, שינויים בינוניים ומעבר מבוצעים כדי לשמור על צמיחת תאים בריאה.

  1. עקר את פני ה- MRE על ידי שטיפתו עם 70% אתנול 3 פעמים ואפשר לכביסה השלישית לשבת במשך 20 דקות.
  2. שטפו את משטח ה-MRE 3 פעמים עם מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS) על ידי הוספת נפח מספיק כדי לכסות את הכלי לחלוטין, ולאחר מכן שאיבת כל הנוזלים.
  3. יש לצפות את פני השטח של ה-MRE בפיברונקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס כדי לקדם הידבקות תאים למכשיר.
  4. שטפו את משטח ה-MRE 3 פעמים עם PBS, בדומה לשלב 4.1.2.
  5. זרע את קרדיומיוציטים של חולדות יילודים בצפיפות של 20,000 תאים/ס"מ2.
  6. הוסף מגנטים למכשירים באופן זמני כדי להקשיח את המטריצה במהלך תרבית התאים.
    הערה: היזהר בעת הנחת מכשירים עם מגנטים בחממה. יש למקם את המכשירים רחוק זה מזה כדי להבטיח שהמגנטים לא יתקשרו. מחקר זה ממליץ על שימוש בחממות מרופדות נירוסטה על פני חממות מרופדות נחושת מכיוון שיש פחות אינטראקציה.

5. צביעה והדמיה

  1. הדמיית תאים קבועה
    הערה: הדמיית תאים קבועים כוללת מספר שלבים מרכזיים להמחשת רכיבים סלולריים ספציפיים. ראשית, תאים מקובעים כדי לשמר את המבנה שלהם. לאחר מכן, קרום התא עובר חדירה כדי לאפשר חדירת כתם, ואחריו שלב חסימה כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים או כתמים לאתרים לא מכוונים, כגון חלבונים אחרים או פסולת תאית. לאחר מכן התאים מוכתמים בצבעים או בנוגדנים המכוונים למולקולות ספציפיות, וכל כתם עודף מוסר באמצעות כביסה. לבסוף, התאים המוכתמים מצולמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח מבנים תאיים.
    1. יש לשטוף פעם אחת עם PBS 1x על ידי הוספת נפח מספיק כדי לכסות את הכלי לחלוטין, ולאחר מכן לשאוב את כל הנוזלים.
    2. תקן תאים באמצעות 4% (v/v) paraformaldehyde למשך 10 דקות.
    3. שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS (בדומה לשלב 5.1.1).
    4. הוסף 0.1% טריטון X (ב-1x PBS) ודגירה למשך 5 דקות כדי לחלחל.
    5. שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS (בדומה לשלב 5.1.1).
    6. הוסף NH4Cl (50 מ"מ ב-1x PBS) ודגירה למשך 15 דקות להרוות.
    7. שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS (בדומה לשלב 5.1.1).
    8. הוסף מאגר חוסם (5% BSA ב-1x PBS) ודגר למשך שעה בטמפרטורת החדר (RT).
    9. שלב את הנוגדן הראשוני נגד α-אקטינין ב-1:200 ל-5% BSA (ב-1x PBS).
      הערה: מערבבים היטב את הנוגדן.
    10. הוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית לדגימה.
      הערה: הוסף מספיק כדי לכסות את כל הדגימה.
    11. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: שקול להניח את הדגימה על הנדנדה במהירות איטית כדי לעזור לפתרונות להתערבב.
    12. שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS (בדומה לשלב 5.1.1).
    13. לדלל את הנוגדן המשני (555 Alexa Fluor goat anti-mouse) ב-1x PBS (1:2000).
      הערה: הנוגדנים המשניים רגישים לאור (פלואורופורים). כאשר אינם בשימוש ישיר, ודא שהם מכוסים ומחוץ לאור.
    14. הוסף את תמיסת הנוגדנים המשנית לדגימה.
    15. דגירה ב-RT למשך שעתיים.
    16. שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS (בדומה לשלב 5.1.1).
    17. הוסיפו DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל במים מעוקרים נטולי יונים) ודגרו במשך 5-10 דקות בחושך.
    18. צלם את התאים במיקרוסקופ זקוף עם עדשת טבילה פי 20.
    19. צלם 50 תמונות לכל מכשיר.
    20. עבד את התמונות באמצעות תוסף ImageJ שנקרא Directionality.
      הערה: אפשרויות כיווניות: מחקר זה השתמש ב-n = 45 פחים, בטווח שבין 0° ל-176° כדי למנוע אפקט עטיפה. השיטה שננקטה הייתה כיוון שיפוע מקומי, וטבלת התצוגה נבחרה. פלט הכיוון מתאים לזווית הווקטור הממוצעת (המציינת את זווית היישור), בעוד שתפוקת הטוב מייצגת את אורך הווקטור הממוצע (המציין את מידת היישור).
  2. הדמיית תאים חיים
    הערה: הדמיית תאים חיים מאפשרת מעקב אחר תהליכים תאיים דינמיים בזמן אמת תוך שמירה על התאים במצבם הטבעי והחי. טכניקה זו כוללת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתא דגירה כדי לצלם תמונות או סרטונים ברזולוציה גבוהה של תאים בזמן שהם גדלים, מתחלקים או מגיבים לגירויים. מאפשר חקר התנהגות ואינטראקציות תאיות לאורך זמן ומספק תובנות חשובות לגבי תפקוד הדינמיקה של התא.
    1. דגרו על התאים ביחס SiR-actin 1:1000 עם אמצעי תרבית למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. שאפו את המדיה והחליפו אותה ב-1:2000 (SiR-actin: Media).
      הערה: דילול זה נועד להפחית את רעילות התאים להדמיה חיה ממושכת.
    3. אסוף תמונות אימונופלואורסצנטיות כל 15 דקות למשך 5 שעות במיקרוסקופ זקוף עם תא דגירה, שלב אוטומטי ועדשת טבילה פי 20.
      הערה: עבור ניסוי הדמיית תאים חיים, המגנט נוסף ברגע שה-MRE הוכנס למערכת ההדמיה החיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאלסטומרים מגנטיים מבוססי סיליקון רכים במיוחד (MREs) יש מודולים אלסטיים הניתנים לכוונון מדויק על ידי הפעלת שדה מגנטי. זה מאפשר התאמות דו-כיווניות מהירות בתחום הפיזיולוגי, עם שליטה מדויקת הן על קצב השינויים והן על גודלם (איור 1). מכניקת הג'ל הוערכה על ידי מדידת המודול האלסטי כפי שתואר קודם לכן, והמודול האלסטי הממוצע נמצא כ-36.3 ±-5.2 kPa עם מגנט ו-9.3 ±-1.2 kPa ללא מגנט עבור התחום הדינמי הרך יותר MRE בעוד שה-MRE הנוקשה יותר נע בין 51.3 ±-7.0 kPa עם מגנט ו-40....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו נבדקה בקפדנות, אך תשומת לב קפדנית למספר שלבים חיונית לניסוי מוצלח.

בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בסורג עקיפה מסחרי כתבנית הראשית לדפוס. עם זאת, ניתן להשתמש בתבניות דפוס חלופיות - כגון תבניות סיליקון או SU8 המיוצרות במיקרו - ליצירת מגוון רחב של דפוסים בגדלים שונים33,35. חלק מחומרי ה-PDMS הזמינים מסחרית מגיעים בדוגמת36,37 מראש, שיכולים לשמש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז דלאוור לחקר השרירים והשלד COBRE (P20 GM139760), עם מענקים מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור. ברצוננו להביע את תודתנו הכנה לסאגאר דושי מהמרכז לחומרים מרוכבים (CCM) ולאשיקה סינג ממעבדת Dhong באוניברסיטת דלאוור על תמיכתם שלא תסולא בפז בכך שאפשרו לנו להשתמש במיקרוסקופי הלייזר הקונפוקליים שלהם ועל מתן המומחיות הדרושה לאפיון פני השטח של החומרים שלנו. תרומתם שיפרה משמעותית את איכות העבודה שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
555 אלקסה פלואור אנטי-עכבר נוגדן משני לעכברים תרמופישר סיינטיפיקA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
עדשת טבילה 20xצייס421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
צלחות 35 מ"מתרמופישר סיינטיפיק130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
נוגדן ראשוני אנטי-אלפא אקטיניןאבקאםEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
מיקרוספירות אבקת ברזל קרבונילchemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
כתם DAPIתרמופישר סיינטיפיקD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
דסיקטורפישר סיינטיפיק08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
סריג דיפרקציהמעבדות תורGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
ג'ל Ecoflex חלק A ו-A BSmooth OnEcoflex  גלhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
מנקה פלזמה שולחני מורחבסיגמא אולדריץ'Z561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
פיברונקטין מפלזמה בקריתסיגמא אולדריץ'F1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer פלאקטקDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
אלכוהול איזופרופילאמזוןhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS
Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8
KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx
uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx
dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW
l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87
5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR
8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7
uIto.. V3Vf62Lnprtq2u5PRO
SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU&
dib_tag=se& hvadid=598724400239
& hvdev=c& hvlocphy=9007460&; HVN
ETw=G& HVQMT=E& hvrand=1609157
209668794739& hvtargid=KWD-3203
62094308& hydadcr=5273_13
227703& מילות מפתח=איזופרופיל+אלכוהול+
אמזון & MCID=9F9D3252906531
3EA89AB7766D9C244C& qid=1740
675756& sr=8-1-spons& sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& psc=1
מגנטCMS מגנטיקהND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
מיקרוסקופ זקוף Nikon Eclipse 80iניקוןאקליפס 80i
תנורפישר סיינטיפיק15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
מדלל סיליקוןSmooth Onמדלל סיליקוןhttps://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
כתם אקטין SiRשלד תאCY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
סילגארד 184 PDMS (בסיס + חומר ייבוש)דבקי אלסוורת'2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
סילגארד 527 PDMS חלק A & Bדבקי אלסוורת'1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
פיפטות העברהפישר סיינטיפיק13-711-5AMMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13
-711-5AMMD& searchType=
RAPID& matchedCatNo=13
-711-5AMMD
טריכלורו - (1H, 1H, 2H, 2H-פרפלואורוקטיל) סילאן &nb;סיגמא אולדריץ'448931https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
  2. Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D. Substrate stiffness influences structural and functional remodeling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Front Physiol. 12, 710619(2021).
  3. Dou, W., et al. A microdevice platform for characterizing the effect of mechanical strain magnitudes on the maturation of iPSCcardiomyocytes. Biosens Bioelectron. 175, 112875(2021).
  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
  5. Ahn, H., et al. Hierarchical topography with tunable micro and nanoarchitectonics for highly enhanced cardiomyocyte maturation via multiscale mechanotransduction. Adv Healthc Mater. 12 (12), 2202371(2023).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 989-999 (2013).
  7. Hirt, M. N., et al. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. J Mol Cell Cardiol. 74, 151-161 (2014).
  8. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  9. Swift, J., et al. Nuclear laminA scales with tissue stiffness and enhances matrixdirected differentiation. Science. 341 (6149), 1240104(2013).
  10. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear mechanics and mechanotransduction in health and disease. Curr Biol. 23 (24), R1113-R1121 (2013).
  11. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  12. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  13. Hazeltine, L. B., et al. Effects of substrate mechanics on contractility of cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells. Int J Cell Biol. 2012, 508294(2012).
  14. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  15. Deng, B., Zhao, Z., Kong, W., Han, C., Shen, X., Zhou, C. Biological role of matrix stiffness in tumor growth and treatment. J Transl Med. 20 (1), 540(2022).
  16. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 63-73 (2009).
  17. Vite, A., et al. Extracellular stiffness induces contractile dysfunction in adult cardiomyocytes via cellautonomous and microtubuledependent mechanisms. Basic Res Cardiol. 117 (1), 41(2023).
  18. Stowers, R. S., et al. Matrix stiffness induces a tumorigenic phenotype in mammary epithelium through changes in chromatin accessibility. Nat Biomed Eng. 3 (12), 1009-1019 (2019).
  19. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heartlike elasticity: scarlike rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  20. Rodriguez, A. G., Han, S. J., Regnier, M., Sniadecki, N. J. Substrate stiffness increases twitch power of neonatal cardiomyocytes in correlation with changes in myofibril structure and intracellular calcium. Biophys J. 101 (10), 2455-2464 (2011).
  21. Boothe, S. D., et al. The effect of substrate stiffness on cardiomyocyte action potentials. Cell Biochem Biophys. 74 (4), 527-535 (2016).
  22. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  23. Martínez, E., Engel, E., Planell, J. A., Samitier, J. Effects of artificial micro and nanostructured surfaces on cell behaviour. Ann Anat. 191 (1), 126-135 (2009).
  24. Ravichandran, R., Liao, S., Ng, C. C., Chan, C. K., Raghunath, M., Ramakrishna, S. Effects of nanotopography on stem cell phenotypes. World J Stem Cells. 1 (1), 55(2009).
  25. Brunetti, V., et al. Neurons sense nanoscale roughness with nanometer sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14), 6264-6269 (2010).
  26. Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S. G., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: I. Simple step cues. Development. 99 (3), 439-448 (1987).
  27. Nguyen, A. T., Sathe, S. R., Yim, E. K. F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance. J Phys Condens Matter. 28 (18), 183001(2016).
  28. DowellMesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1 (2), 78-90 (2004).
  29. Loesberg, W. A., et al. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28 (27), 3944-3951 (2007).
  30. Corbin, E. A., et al. Tunable and reversible substrate stiffness reveals a dynamic mechanosensitivity of cardiomyocytes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (23), 20603-20614 (2019).
  31. Bouhrira, N., Vite, A., Margulies, K. B. Distinct cytoskeletal regulators of mechanical memory in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 119 (2), 277-289 (2024).
  32. Lee, B. W., et al. Adult human cardiomyocyte mechanics in osteogenesis imperfecta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (4), H814-H821 (2023).
  33. Cao, Z., Ball, J. K., Lateef, A. H., Virgile, C. P., Corbin, E. A. Biomimetic substrate to probe dynamic interplay of topography and stiffness on cardiac fibroblast activation. ACS Omega. 8 (6), 5406-5414 (2023).
  34. Clark, A. T., et al. Magnetic field tuning of mechanical properties of ultrasoft PDMSbased magnetorheological elastomers for biological applications. Multifunct Mater. 4 (3), 035001(2021).
  35. Kim, Y., Kwon, C., Jeon, H. Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves. Materials. 10 (8), 973(2017).
  36. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSCderived engineered cardiac tissues. Methods Mol Biol. 2320, 171-180 (2021).
  37. Dirar, Q., et al. Activation and degranulation of CART cells using engineered antigenpresenting cell surfaces. PLoS One. 15 (9), e0238819(2020).
  38. Kim, C., Kim, H., Park, H., Lee, K. Y. Controlling the porous structure of alginate ferrogel for anticancer drug delivery under magnetic stimulation. Carbohydr Polym. 223, 115045(2019).
  39. Fan, D., et al. Recent advances of magnetic nanomaterials in bone tissue repair. Front Chem. 8, 745(2020).
  40. GonzalezRico, J., et al. Tuning the cell and biological tissue environment through magnetoactive materials. Appl Sci. 11 (18), 8746(2021).
  41. AntmanPassig, M., Shefi, O. Remote magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Lett. 16 (4), 2567-2573 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PDMS

מאמרים קשורים