טומוגרפיה סריאלית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות רובוט אוטומטי להחלפת דגימות

Summary

פרטי היישום ותהליך איסוף הנתונים לטומוגרפיה מבוססת רנטגן מבוססת סינכרוטרון באמצעות רובוט האוטומטי לשינוי דגימות בקו קרן ההדמיה Diamond Light Source (DLS) I13-2 מוצגים ונדונים כאן. זה משפר משמעותית את קצב התפוקה ואת יעילות איסוף הנתונים של קו הקרן.

Abstract

כתב יד זה מתאר תהליך עבודה לאיסוף נתונים אוטומטי המשתמש בזרוע רובוטית להחלפת דגימות, מה שמשפר משמעותית את יעילות איסוף הנתונים. המערכת, המיושמת להדמיית קרני רנטגן סינכרוטרון בקו קרן התמונה במקור האור היהלום (DLS) I13-2, עושה שימוש ברובוט להשגת טומוגרפיה סדרתית (תלת-ממד) או הדמיה (2D) בהספק גבוה. נכון להיום, עבור ניסויים רבים, הזמן הנדרש להחלפת דגימות ידנית ויישור הוא דומה, ואף עולה על משך סריקת הטומוגרפיה עצמה. כדי למקסם את השימוש היעיל בזמן הקרן הזמין ולהגדיל את התפוקה הניסיונית, אוטומציה של החלפת דגימות ויישור היא חיונית. שימוש ברובוט כמחליף דגימות יכול להגדיל את קצב התפוקה לפחות פי 4-10 לעומת הליכים ידניים, בהתאם לגודל הפיקסל שנבחר. עם מכונת Diamond II ושדרוגי Operando Coherent TO ו-Ptychographic Imaging (OCTOPI) ב-I13L, השטף המוגבר של קרני הרנטגן יקטין עוד יותר את זמני הסריקה הניסיוניים, מה שיהפוך את המערכת ליעילה אף יותר. יתרה מזאת, האוטומציה מאפשרת איסוף נתונים מרחוק, כולל שירות דואר אופציונלי למשתמשים. מרכז דגימה אוטומטי מאפשר סריקה מלאה ללא השגחה, שניתן לבצע מרחוק. זהו מאפיין ייחודי וחדשני של המערכת. כתב יד זה מתאר את כל ההליך, כולל הכנת דגימות, התקנה על מחזיקים מיוחדים, העברה לקו הקרן, והצבה על מגשים ייעודיים להחלפת דגימות רובוטיות. ההליך למיקוד הדגימות האוטומטי וצינור השחזור של טומוגרפיה מוצגים.

Introduction

אוטומציה הייתה בשימוש נרחב בתעשיות הייצור הכבד במשך עשרות שנים ^1,2,3. עם זאת, פיתוח חומרה ותוכנה רובוטית התפתחו מספיק כדי שיוכלו להתמודד עם עבודות עדינות מאוד כמו ריצוף גנום, ביצוע ניתוחים רפואיים בבתי חולים, או סיוע בניהול ניסויים כימיים 4,5,6,7. אוטומציה לא רק מבטלת טעויות אנוש, אלא גם משפרת את קצב התפוקה והיעילות⁴.

מקור קרני רנטגן סינכרוטרון מייצר קרינה אלקטרומגנטית בהירה וקוהרנטית מאוד בטווח הספקטרלי הרחב, מאינפרא-אדום ועד קרני רנטגן קשות. מקורות אלו מאפשרים ניסויי הדמיה בעלי תפוקה גבוהה ורזולוציה גבוהה עם זמני סריקה קצרים מאוד וסטטיסטיקות גבוהות. הקוהרנטיות החלקית יכולה לשמש להשגת ניגודיות טובה יותר עבור חומרים רכים סופגים חלש כמו פולימרים או דגימות רקמה ^8,9,10 בהשוואה למקורות רנטגן במעבדה. מערך נתונים מלא של טומוגרפיית רנטגן – שמאפשר ויזואליזציה של אובייקט בתלת-ממד אמיתי – דורש רכישת הקרנות של הדגימה בזוויות שונות. התקדמות בבהירות המקור, החומרה הניסיונית והבקרות מאפשרת זמני איסוף נתונים בטווח של עשרות שניות ועד^{דקות 8}. כתוצאה מכך, טעינת הדגימות ויישור הדגימות הפכו לגוזלות זמן רבה יותר מסריקת הטומוגרפיה עצמה^11,12. חשוב לציין ששינוי דגימות ידנית בניסוי טומוגרפיה סינכרוטרון יכול לקחת זמן משמעותי (בהשוואה לזמן הסריקה), שכן יש לבצע הליך בטיחות קרינה בעת כניסה וסגירת תא הניסוי. ההליך הזה בדרך כלל אורך כמה דקות. בנוסף, יישור הדגימה יכול לקחת גם כמה דקות.

אם תהליך שינוי הדגימה ויישור הדגימה יהיה אוטומטי, ייחסך זמן משמעותי. לכן, רובוט מחליף דגימות הוטמע בקו קרן ההדמיה I13-2 במתקן הסינכרוטרון DLS. כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המלא של ביצוע ניסוי מיקרוטומוגרפיית רנטגן סינכרוטרון עם מספר דגימות באמצעות רובוט מחליף דגימות בקו קרן התמונה I13-2^11,12. מימוש זה לא רק משפר את יעילות זמן הניסוי, אלא גם מאפשר ביצוע ניסויים מרחוק. החלופה היא הפעלה ידנית או חצי-אוטומטית, ששניהם איטיים משמעותית. כאן, חצי-אוטומטי פירושו שימוש ברובוט להחלפת דגימות רק ללא יישור דגימה.

חשיבות האוטומציה מודגשת בפרויקטים של אוטומציה בקווי קרן צילום סינכרוטרונים אחרים, כאשר הפרויקטים הדומים ביותר בקו הקרן 2BM של APS¹³, קו קרן SLS TOMCAT¹⁴, קו קרן EMBL P14 על PETRA III¹⁵, וקו קרן IMAGE במכון הטכנולוגי של קרלסרוהה (KIT) למקור אור¹⁶. ב-2-BM APS, הדגימות הדורשות סריקה עם רובוט מותקנות על מתקן קינטי סטנדרטי, הממוקם במגש מחליף דגימות בקיבולת מקסימלית של 60 דגימות בכל פעם. זרוע אחיזה אוספת את הדגימה ומתקינה אותה על שלב הסיבוב. עם זאת, יישור הדגימה נעשה באופן מקוון באמצעות סטריאוסקופ. מערכת דומה הותקנה בקו הקרן של TOMCAT ב-SLS, אך כאן התהליך אוטומטי לחלוטין, שיכול לבצע פריקה-עומס דגימות, יישור, סריקה של אזור רלוונטי נכון ושחזור. מספר הדגימות הכולל שניתן לסרוק בו זמנית הוא 60. לאחרונה, קו הקרן P14 ב-PETRA^{III 15} התקין מערכת החלפת דגימות שיכולה לטפל בדגימות ביולוגיות רכות בגודל של 1 מ"מ. המיקום והמרכז מתבצעים באמצעות הליך של שלוש קליקים-מרכז. בקו קרן IMAGE ב-KIT, תחנת קצה של הדמיה/טומוגרפיה בקצב גבוה מאפשרת מדידה של עד 1,500 דגימות בתוך יומיים^ו-16. בשונה ממערכות הרובוטים שהוזכרו לעיל, מערכת קו הקרן I13-2 יכולה כיום לטפל בדגימות בקוטר של עד 8 מ"מ ולמדוד עד 112 דגימות במשמרת של שמונה שעות, ללא התערבות אנושית, כולל מרכז דגימה אוטומטי.

ההגדרה הטומוגרפית הנוכחית ב-I13-2, קו קרן Diamond-Manchester Imaging דווחה בפרסום^{שהוזכר 17}. למען השלמות, ההיבטים המרכזיים של ניסויי הטומוגרפיה מסוכמים כאן; אנא עיין גם באיור 1. מחסנית שלב הטומוגרפיה מורכבת משושה רגליים (PI miCos) למניפולציה של דגימה וכן ליישור הטיית ציר הסיבוב. שלב סיבוב עם מיסב אוויר מותקן מעל המשושה. לשלב הסיבוב יש תנועות נדידה מצוינות (<2.4 מיקרוראד) ושגיאה צירית מצוינת (<100 ננומטר). מערכת גלאי הטומוגרפיה מצוידת בארבעה הגדלות (או שדה ראייה) שונים. למחקר הנוכחי נעשה שימוש במטרות של 1.25× (גודל פיקסל אפקטיבי של 2.6 מיקרון עם שדה ראייה 6.7 מ"מ x 5.6 מ"מ) ו-4× (גודל פיקסל אפקטיבי של 0.81 מיקרון עם שדה ראייה של 2.1 מ"מ x 1.8 מ"מ). המטרה 1.25× כללה סינטילטור LuAg:Ce של 500 מיקרון, בעוד שהמטרת 4x כללה סינטילטור LuAg:Ce של 100 מיקרון (Crytur). גלאי sCMOS (pco.edge 5.5) מקליט את תמונת מסך הסינטילציה המוגדלת באמצעות עינית פוטוגרפית נוספת פי 2 (כל האופטיקה של מיקרוסקופ היא מאולימפוס). הפיקסלים האפקטיביים נעים בין 2.6 מיקרון ל-0.33 מיקרון, עם רזולוציה של כ-1 מיקרון בהגדלה הגבוהה ביותר בשימוש. שבב הגלאי מורכב מ-2560 x 2160 עם גודל פיקסל של 6.5 מיקרון, וקצב הקריאה המרבי של מערך הפיקסלים הוא 100 הרץ.

Protocol

הערה: מחקר זה עושה שימוש בדגימות חרקים מהמוזיאון להיסטוריה של הטבע (NHM), לונדון, לניתוח פנוטיפי השוואתי. הדגימות נרכשו על ידי מוזיאון ההיסטוריה הטבעית, בהתאם להליכי רכישה סטנדרטיים כדי להבטיח שהדגימות נאספו ונתרמו כחוק.

1. תכנון הניסוי

1. בדקו את היתכנות ביצוע ניסויי טומוגרפיה או הדמיה עם הדגימה הרלוונטית בקו הקרן I13-2 על ידי יצירת קשר עם צוות קו הקרן באמצעות הקישור הבא: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. הגישו הצעה לקבלת משבצת זמן לביצוע הניסוי המתוכנן באמצעות הקישור הבא: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. דונו בהכנת הדגימה ובתהליך מדידת הדגימה עם צוות קו הקרן לאחר קבלת ההצעה ותיאום הניסוי. ניסויים שנערכו באמצעות הרובוט כוללים דרישות מסוימות, המפורטות בסעיף הבא (סעיף 2).
4. דון במידות הדגימה ובהרכב עם צוות קו הקרן כדי לוודא שהניסוי יכול להתבצע בהצלחה בקו הקרן.
5. התחל להתכונן לביקור הניסיוני זמן רב מראש על ידי מעקב אחרי ההוראות באתר (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. השלים את ההדרכה לבטיחות לפני המפגש הניסיוני.

2. הכנת דגימות (לניסויים ברובוטיים)

1. הכינו בסיסי דגימה^{תואמים ל-SPINE 18} להרכבת דגימות. התקן כל דגימה על בסיס דגימות סטנדרטי בסגנון SPINE המצויד בברקוד מטריצת נתונים כדי לאפשר מעקב אוטומטי אחרי דגימות.
2. חבר את הדגימה לבסיס באמצעות אחת משתי תצורות. התקנת פין: מקבע את הדגימה על פין דגימה בסגנון SPINE (ראו איור 1C, הטבה). מיכל או התקנה ישירה: מניחים את הדגימה בתוך מיכל תואם, כמו צינור מיקרו-צנטריפוגה/צינור פולימיד, או ישירות על בסיס הדגימה.
3. בדוק תאימות ממדית עם האחיזה הרובוטית על ידי אימות שהדגימה המותקנת נמצאת בתוך מעטפות הגודל המותר כדי להבטיח טיפול רובוטי בטוח (ראו איור 2):
   אפשרות א': נכנסת לתוך גליל בקוטר 8 מ"מ על גובה 20 מ"מ.
   אפשרות ב': נכנסת לתוך גליל בקוטר 3.5 מ"מ על גובה 33 מ"מ.
4. ודא ששתי התצורות ממוקדות בבסיס הדגימה. ודא שהגובה הכולל (דגימה + הרכבה + בסיס) לא עולה על 27 מ"מ או 40 מ"מ, בהתאם לתצורה שנבחרה.
5. בעת התקנת דגימות על פיני דגימות SPINE, ודאו שהדגימה ממוקמת מעל הפין, מבלי שחלק ממנה מוסתר על ידי ציר הפינים. הדגימה חייבת להיות מותקנת אנכית ומרכזית על בסיס הפין כדי למנוע מגע עם הרובוט לאחיזה. זה חשוב במיוחד עבור הרכבה באופציה B המתוארת בסעיף 2.3 של הפרוטוקול, וכן עבור דגימות מוארכות המותקנות מעל פיני הדגימה.
6. בעת ההתקנה בתוך מיכלים או צינורות, אבטח את הדגימה היטב בתוך המיכל כדי שלא תזוז במהלך ההובלה או הטיפול הרובוטי. ודא שהמיכל עצמו נשאר מיושר אנכית על בסיס הדגימה.
7. קבע את רכיב ההרכבה הנבחר (פין או מיכל) בצורה מאובטחת ואנכית לבסיס הדגימה כדי להבטיח יציבות מיקום לאורך כל הניסוי.
8. השתמש בשיטת דבק או אבטחה אמינה למניעת ניתוק במהלך המשלוח ומניפולציה אוטומטית, שכן שני התהליכים עלולים לגרום למתחים מכניים.
   הערה: דבקים נפוצים כוללים ציאנואקרילט (דבק על), שעוות פרפין ודבק מותך חם. התייעץ עם צוות קו הקרן אם לא בטוח לגבי תאימות חומרים.
9. בדוק שכל הדגימות ממוקמות בגובה אחיד מהקצה העליון של המיכל או על פין הדגימה. לגבי דגימות המותקנות בתוך מיכלים, ודא שהמרחק הצידי מקיר המיכל זהה בכל הדגימות.
   הערה: מיקום עקבי חיוני ליישור אוטומטי אמין. דגימות קטנות יותר יחסית לשדה הראייה מאפשרות סבילות גבוהה יותר.
10. תעד את קוד מטריצת הנתונים המשויך לכל דגימה כדי להבטיח זיהוי נכון של המדגם במהלך ניתוח הנתונים.
11. יצר קובץ samples.csv שיקשר כל שם לדוגמה לקוד מטריצת הנתונים של בסיס הדגימה ולהעביר את הפרמטרים הרלוונטיים לריצת סריקות טומוגרפיה.

3. אריזה ומשלוח דגימות

1. לא יאוחר מ-15 ימי עבודה לפני המפגש הניסוי, יש להגיש את הערכת הסיכון הניסויית (ERA) ולהצהיר על כל הדגימות שם. ה-ERA הזה צריך לקבל אישור מקבוצת הבריאות והבטיחות של DLS (HSE) לפני שמותר למשלוח/הבאת דגימות לאתר.
2. השתמשו בבסיס הדגימה האוניברסלי עם קומבינציית אחסון ו/או מכולת משלוח המותקנת על פין דגימה, הנקראת גם Uni-puck. זה די חשוב אם שולחים בדואר.
3. אם הדגימות אינן נכנסות לחריצי הדגימה של מיכל האחסון המוזכר בשלב 3.2, יש לבצע סידורי התקנה חלופיים, כגון שימוש במכסי הגנה מגנטיים שמתאימים לבסיס הדגימה ומביאים את הדגימות ישירות למדידות.

4. סידור ניסיוני

1. כוון את פרמטרי מקור הרנטגן כדי למקסם את הניגודיות בדגימה. כדי להשיג זאת, יש להזיז את כל הספקטרום ו/או לסנן את ספקטרום הרנטגן.
2. אופטימיזציה של המצלמה למרחק דגימה בהתבסס על ספקטרום קרני הרנטגן ורמת ניגודיות הפאזה הרצויה לדגימה נתונה.
3. בחר את ההגדלה של המיקרוסקופ לפי גודל הדגימה ושדה הראייה הנדרש, ובחר את המטרה המתאימה למיקרוסקופ.
4. יישר את מיקום המצלמה האופקי (ציר X במעבדה) ביחס לקרן הרנטגן.

5. טעינת דגימות ויישור

1. בדוק בקפידה דגימות והתקנת דגימות בתחילת כל מפגש ניסוי אם יש דגימות שנראות פגומות או מותקנות ברפיון. עדכן משתמשים על כל דגימות כאלה.
   הערה: נכון לעכשיו, קו הקרן מצויד במתקנים לעד 7 דיסקים, וכל דיסק יכול להכיל עד 16 דגימות. ניתן למדוד בסך הכל 112 דגימות במהלך ריצת רובוט אחת. אנא עיין באיור המשלים 2, שממחיש כיצד לזהות את מיקומי החריץ (הפין) של הדיסקית.
2. התקן דגימות על הדיסקית והחריצים (הפין) המתאימים כפי שזוהו בקובץ samples.csv. בצע הרצאה יבשה של תהליך החלפת דגימות הרובוט על כמה דגימות כדי לבדוק את תפקוד הרובוט, וכן לוודא שהדגימות עומדות במפרט הנדרש.
3. השתמש בבסיס דגימה עם פין דגימה (ללא דגימה) ליישור ציר הסיבוב של שלב הסיבוב למרכז הגלאי בכיוון האופקי.
4. הזז את חלק העליון של הפין למרכז מצלמת הרנטגן (איור 3A). יישר את מצלמת הטלסקופ (TC), הממוקמת בזווית 90° לקרן כפי שמוצג בתמונה (איור 3), כך שתהיה במרכז שדה הראייה (FOV). קבע את הקואורדינטות של מיקום זה בקואורדינטות פיקסל TC.
5. עדכן את מיקום המטרה של הדגימה בסקריפט שמטפל ביישור הדגימה.
6. התקן דגימה מייצגת. הרץ את סקריפט יישור הדגימה האוטומטי כדי למקם את הדגימה במרכז הסיבוב ב-TC. הקישור לתסריט מסופק בקובץ משלים 1.
7. בדוק אם אזור המדגם (ROI) ממוקם בשדה הראייה (FOV) של מצלמת הרנטגן.
8. אם התשואה אינה ממורכזת בשדה הראייה, חזור על השלבים 5.5 עד 5.7 וחדד את יישור הדגימה על ידי שינוי הקואורדינטות למיקום היעד.
   הערה: סעיפים 4 ו-5 מבוצעים על ידי איש הקשר המקומי למעט סעיף 4.2.

6. הגדרת רכישת נתונים

1. בדוק שמבנה הקבצים/תיקיות הנדרש במערכת הקבצים DLS נוצר כדי לאחסן נתונים גולמיים, קבצי מטא-דאטה ותוצאות ניתוח.
2. העתק את קובץ samples.csv לתיקייה שהוזכרה בשלב 6.1.
3. עדכן את זמן החשיפה למצלמה ואת מספר ההקרנות שיש לצבור ב-samples.csv, בהתאם למבנה הדגימה ולניגודיות הרצויה.
4. הגדר שתי קבוצות של עמדות מנוע הנקראות עמדת טעינה (LP) ומיקום סריקה (SP). LP הוא הסט שבו השלבים מותאמים לטעינת דגימה, וה-SP לסריקת טומוגרפיה של הדגימה.
   הערה: סעיף 6 מתבצע על ידי איש הקשר המקומי או נוצר אוטומטית על ידי מערכות DLS.

7. ביצוע איסוף נתונים

1. התקן את כל הדגימות במיקומים הנכונים של הפאק והפינים, כפי שמצוין בתיק samples.csv.
2. לאיסוף הנתונים, השתמשו ב-Generic Data Acquisition (GDA), תוכנה בקוד פתוח שפותחה על ידי DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). זו מערכת מבוססת Java המשמשת ב-DLS לשליטה בניסויים ולאיסוף נתונים. צילום מסך מסופק באיור משלים 1.
3. השתמש באובייקט בשם טומומטיק ב-GDA להחלפת דגימה אוטומטית, יישור דגימה ומדידת טומוגרפיה.
4. הוציא את הפקודה tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) בטרמינל GDA כדי לטעון את הקובץ. ואז תוציא את הטומומטיק. סריקה () להפעלת הפקודה.
5. הרובוט אוסף תחילה את הדגימה ממגש הטעינה ולוקח אותה לקורא הברקוד בלייזר. לאחר קריאת הברקוד, הוא מעביר את הדגימה לשלב הטומוגרפיה ומרכיב אותה. ודא שכל התהליך מתנהל בצורה חלקה.
   הערה: כאן נעשה שימוש ברובוט Yaskawa עם אחיזת כפיפה שפותחה במקום.
6. לאחר טעינת הדגימה, השלבים עוברים למיקום SP. לאחר מכן, מתבצעת פונקציית autoCentrePin בתוך הכתב הטומומטי, שממקם את הדגימה במרכז הסיבוב (COR). מדידת טומוגרפיית רנטגן באמצעות מחליף דגימות רובוטי מוכנה כעת לביצוע.
   הערה: אנא בדקו את התיק המשלים 1 עבור הקוד המדומה של הכתב הטומומטי.
7. בצע את פונקציית TomoFlyscan למדידת טומוגרפיה. הפונקציה אוספת תחילה 40 תמונות הקרנה ללא קרן רנטגן, הנקראת תמונה כהה (DI), ו-40 תמונות עם קרן רנטגן אך ללא דגימה בקרן, הנקראת תמונת שדה שטוח (FI). תמונות אלו ישמשו לנרמול תמונה במהלך שחזור הנתונים.
8. אסוף תמונות הקרנה (PI) עם הדגימה בקרן בפרקי זווית סיבוב דגימה, כפי שמצוין בקובץ samples.csv. במקרה הנוכחי, יש לו 3001 תמונות PI.
   הערה: כל השלבים, מ-7.5 עד 7.8, מתבצעים אחד אחרי השני ללא התערבות אנושית.

8. גישה לנתונים ולניתוחים

1. יש לגשת לנתונים השמורים על ידי גלישה במערכת הקבצים ובתיקייה המתאימים. הנתונים הסרוקים שהוזכרו בסעיף הקודם נשמרים בשני קבצים שונים, אחד עם קובץ *.nxs ואחד עם קובץ *.hdf שבו * הוא מספר מספרי, לדוגמה: 123456.nxs ו-123456.hdf. ה-NXS מכיל את המטא-דאטה של הסריקה, בעוד שה-HDF מכיל את כל נתוני תמונת ההקרנה (נתונים מקושרים מ-NXS).
2. השתמש בצינור השחזור של Savu¹⁹ ליצירת פרוסות דו-ממדיות מתמונות הקרנה.
3. גישה והמחשה של התמונות המחודשות באמצעות תוכנות רינדור תלת-ממדיות, כגון AVIZO/ImageJ.
   הערה: השלמת סעיפים 7 ו-8 דורשת פעולות מתואמות הן מצד משתמשים והן מצד אנשי קשר מקומיים, כאשר כל אחד מהם מבוצע על ידי תתי-שלבים נפרדים.

Results

איור 1 מציג את רובוט מחליף הדגימות Yaskawa GP7 המותקן על קו קרן Diamond I13-2 Imaging Image. איור 1A מציג את הרובוט (1) ואת אחיזת הכיפוף שתוכננה בעצם (2). האחיזה הזו יכולה להחזיק דגימה בקוטר ≤ 8 מ"מ. איור 1B מציג את הרובוט (1) ואת מערכת מצלמות האופטיקה/רנטגן (4) ו-(6) המשמשים לאיסוף נתוני טומוגרפיה. הרובוט לוקח את הדגימה ממגש הדגימה (3), שיכול להכיל 7 דיסקים יוני עם 16 דגימות, כפי שמוצג באיור 1C. הדגימות מותקנות על מקל האלומיניום (5), ואיסוף נתוני הטומוגרפיה מתבצע באמצעות מערכת הגלאי (6). הפרטים של (5) ו-(6) מסופקים בפסקה האחרונה של סעיף ההקדמה. הקו האדום השבור באיור 1B מצביע על כיוון קרן הרנטגן.

פרטים על סכמת ההרכבה הדוגמית ועיצוב האחיזה עם הכיפוף מוצגים באיור 2. איור 2A מציג דגימה גלילית מפלסטיק, שיוצרה בהדפסה תלת-ממדית, מודבקת לבסיס הדגימה. הגבול של הדגימה מייצג את המעטפת של גובה הדגימה המקסימלי והקוטר שלה. החצים האדומים מציינים את המיקום שבו מחזיק האחיזה את בסיס הדגימה כדי להזיז אותו ממגש הדגימה לשלב הטומוגרפיה ולהפך. עיצוב תלת-ממדי של אחיזת הכיפוף מוצג באיור 2B. אצבעות האחיזה מופעלות על ידי צינור הנעה מבוקר פנאומטית (איור 1B, פריט 2). החלל המרכזי באחיזה הוא בקוטר 8.9 מ"מ, כפי שמוצג באיור 2C, מה שמאפשר גודל דגימה מקסימלי של 8 מ"מ עם שוליים של ~1 מ"מ. איור 2D מציג את התמונה של חלק העליון של שלב הטומוגרפיה. דיבל מאלומיניום מותקן מעל שני השלבים האורתוגונליים ודיסק מגנטי, בקוטר מדויק כך שהשקע בתחתית בסיס הדגימה מתאים. מכיוון שהדיסק הזה מגנטי, הוא מחזיק את בסיס הדגימה המותקן היטב במקומו במהלך מדידות הטומוגרפיה.

לניסוי מייצג זה, נבחרו 64 דגימות חרקים שסופקו על ידי מוזיאון הטבע (NHM) בלונדון. הדגימות נבחרו לייצג מגוון פנוטיפים של פרוקי רגליים תוך התאמה למגבלות הגודל של האחיז. מכיוון שפרוקי רגליים, במיוחד חרקים, מהווים את רוב המגוון המכריע של המינים הידועים, עם למעלה ממיליון מינים בעלי שם, הם קשים במיוחד לדגימה למחקרים השוואתיים של פנוטיפ. לכן, הדגימה הנוכחית מדגימה את הפוטנציאל של גישה זו על ידי דגימת שלוש קבוצות ברמת מחלקה של פרוקי רגליים: ארכנידה, אנטוגנתה ואינסקטה, וכן דגימה מדויקת יותר בתוך חרקים כדי ללכוד שונות בשבעה סדרות, כולל ארבעה מהסדרות העשירות ביותר במינים הקיימות כיום. הדגימות הוצמדו לכרטיס עם דבק. הקלפים הותקנו לאחר מכן על פיני הדגימה. הנחת דגימות (חרקים) ישירות על פיני הדגימה נמנעת, שכן מבנה סופג מאוד בקרן עם דגימות ספיגה נמוכה ייצור ארטיפקטים של פסים במהלך השחזור, בנוסף לקושי להרכיב אותן בצורה בטוחה על פיני הדגימה. טבלה 1 מציגה את קובץ התבנית samples.csv שהמשתמש ימלא עם הפרמטרים הנדרשים לטומוגרפיה (עמודות A, B, C, E, F, G, H, K). תיאור כל אחת מהעמודות מופיע בטבלה. העמודות D, I, J ו-L ב-input_file מתמלאות לאחר יישור ואופטימיזציה של פרמטרי הטומוגרפיה בקו הקרן. כל 64 הדגימות נמדדו תחילה עם נקודת ראייה של 1.25x (שדה ראייה של 6.7 מ"מ x 5.6 מ"מ) במרחק התפשטות אופטימלי של קרני רנטגן (מדגימה לגלאי), ולאחר מכן אותן דגימות נמדדו עם מטרת 4x תוך שימוש בפרמטרים אופטימליים משלהן. לאחר שהדגימות נטענות למגש הדגימה ותיבת הניסוי מאובטחת, הסריקה מתחילה באמצעות GDA.

יישור אוטומטי של הדגימה בוצע באמצעות סקריפט שנכתב בפייתון (מיקום הקובץ ב-GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). בהתחלה, יישור הדגימה נקבע באמצעות שילוב של בסיס דגימה ופין דגימה ללא הדגימה. איור 3 מציג את סיכת הדגימה, כפי שנראית במצלמת הטלסקופ הצדדי (מצלמה ממוקמת בזווית 90° לקרן הרנטגן - איור 1B, פריט 4), המשמשת כדגימת יישור סטנדרטית. תמונת מצלמת הטלסקופ בינאריזציה כך שניתן יהיה לזהות את הדגימה מהרקע. קצוות הדגימה נקבעים ומסומנים כגבול לבן, כפי שמוצג באיור 3. מיקום הקואורדינטות הייחוס של הדגימה הוא החלק העליון של הפין המסומן כעיגול לבן בשקע באיור 3A. בהסתכלות על תמונת הרנטגן, ה-ROI של הדגימה ממוקם על ה-COR, ומיקום קואורדינטות המטרה הנדרש, המסומן כצלב חץ כחול כפול עם נקודה אדומה (איור 3B), נקבע במצלמה הצדדית. הגדרת מיקום המטרה הזו מאפשרת למקם את הדגימה לא רק על ה-COR, אלא גם כמה מ"מ למעלה/נמוך או קצת לא במרכז, במידת הצורך. לאחר שהדגימה נטענה בשלב הטומוגרפיה, מבוצעת פונקציית המרכז האוטומטית. הסקריפט מזיז תחילה את הדגימה למיקום היעד (איור 3B) ומגיע ל-0°. לאחר מכן, הוא מזיז את הדגימה ל-90° (איור 3C) וקובע כמה דגימה יש להזיז כדי להכניס אותה למרכז הסיבוב (COR). זה בדרך כלל לוקח בערך 15-20 שניות. הדגימה נמצאת כעת על ה-COR (איור 2D), וה-COR כבר מיושר למרכז המצלמה. המערכת מוכנה כעת לרכישת טומוגרפיה.

במחקר חרקים זה של NHM, בוצעו 128 סריקות טומוגרפיה ללא התערבות אנושית. המדידה ארכה בסך הכל 17 שעות. כל סריקה הייתה בערך 8 דקות. ניסוי כזה ללא השימוש ברובוט היה לוקח כ-20 עד 25 דקות לסריקת טומוגרפיה. זה מרמז שסריקות טומוגרפיה עם רובוטים מהירות פי 3-4 מסריקה ידנית במקרה הנוכחי. טבלה 2 מציגה קובץ יומן טיפוסי שנוצר בסוף סריקת אצווה של רובוט, כולל הפרמטרים הנדרשים לקישור כל מספר סריקה לדגימה המתאימה. פרטים נוספים מסופקים באגדה של טבלה 2 .

איור 4 מציג תמונות הקרנה מנורמלות של אחת הדגימות, חרק (מחלקה – חרק, סדר – קולאופטרה), שצולם במהלך ניסוי הטומוגרפיה שהוזכר לעיל בהגדלה של פי 1.25 ופי 4. השורה העליונה, איור 4A-C, מציגה דגימה עם 1.25x, ואז אותה דגימה צולמה עם 4x, כלומר איור 4D-F. איור 4 A–F מציג את תמונות ההקרנה שנרכשו ב-0°, 90° ו-180°. המלבן הצהוב מציג את שדה הראייה של תמונות ההקרנה המוגדלות שנרכשו עם אובייקטיב 4x. חשוב לציין כי לאחר שהדגימות נטענו על המגש המוצג באיור 1C, כל התהליכים התקדמו ללא התערבות אנושית. שימו לב ששתי הסריקות הללו נלקחו במרחק ~8.5 שעות זה מזה. זה מצביע על יציבות ויכולת השחזור של ההגדרה.

איור 5 מציג פרוסות אופקיות או רוחביות מתוך מערך פרוסות השחזור הטומוגרפי של הדגימה המוזכרת באיור 4. גם הפרוסות 1.25x (איור 5A) וגם 4x (איור 5B) מצוירות ללא חיתוך התמונות ויש להן 2510 על 2510 פיקסלים. הפרוסות ממוקמות היטב בתוך שדה הראייה, מה שמראה שהתמקדות באזור עם הגדלה גבוהה יותר אפשרית ללא צורך בהתערבות פיזית.

התוצאות המוצגות כאן מראות כי יישום מערכת רובוטית להחלפת דגימות בניסויי מיקרוטומוגרפיה סינכרוטרונית מספק מספר יתרונות משמעותיים. אלה כוללים שיפור בתפוקה, שיפור היעילות התפעולית, ויכולת לבצע סריקות בהגדלות מרובות (zoom-in) מבלי לדרוש התערבות אנושית. בהתחשב במספר הדגימות שצריך לסרוק, כמו במחקר NHM שהוצג כאן, יהיה בלתי אפשרי להגיע למסקנות סטטיסטיות חזקות ועקביות באמצעות סריקה ידנית.

איור 1: תמונה של הרובוט והמערכת הניסיונית של טומוגרפיה שהותקנה בקו הקרן I13-2. (A) הרובוט (1) עם אחיזת כפיפה מעוצבת פנימית (2). (ב) מגש טעינת הדגימה (3) ושלב הטומוגרפיה (5). המצלמה האופטית (מצלמת טלסקופ), המסומנת כ-(4), משמשת ליישור הדגימות אל ה-COR. מערכת הגלאי (6) המשמשת למדידה כוללת מספר מטרות ממונעות לשינוי שדה הראייה באופן אוטומטי, וגלאי pco.edge 5.5. החץ האדום מקווקו מייצג את כיוון קרן הרנטגן. (ג) תמונה של מגש טעינת הדגימה עם 7 דיסקים, וכל דיסקית יכולה להכיל עד 16 דגימות המותקנות על שילוב של בסיס דגימה ופיני דגימה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: פרטים על סכמת ההרכבה של הדוגמיות ועיצוב האחיזה בכיפוף. (א) תמונה של דגימת דמה מפלסטיק מודפסת בתלת-ממד המותקנת על בסיס דגימה, המייצגת את מעטפת הדגימה המקסימלית שניתן לטפל בה על ידי האחיזה הכופפת. החצים האדומים מציינים את המיקום שבו התופס מחזיק את בסיס הדגימה. (ב) עיצוב תלת-ממדי של אחיזת הכיפיפה. אצבעות האחיזה מופעלות כדי להחזיק או לשחרר את בסיס הדגימה. (ג) שרטוט חתך אנכי של התופס עם מידות. הפתח המרבי במרכז הוא 8.9 מ"מ; לכן, גודל המדגם המרבי המותר הוא ≤ 8 מ"מ. (D) תמונה של החלק העליון של שלב הטומוגרפיה. דיבל מאלומיניום (המסומן בחץ הכחול) מותקן בראש שני השלבים האורתוגונליים. דיסק מגנטי מקובע לחלק העליון של הדאבל שעליו ממוקם בסיס הדגימה (עם הדגימה) על ידי התופס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: תמונות מהגרף הווידאו של הליך יישור COR באמצעות מצלמת הטלסקופ הצדדי. (א) תמונה של פין היישור ממש לפני תחילת שגרת היישור. הצלב כחול כפול עם נקודה אדומה מרכזית הוא מיקום המטרה, התואם ל-COR של שלב סיבוב הטומוגרפיה. ההטמעה מציגה את התמונה המוגדלת של ראש הפין המציגה את מרכז הדגימה שזוהה, הן בגובה והן ברוחב. (B) הפין מיושר למיקום המטרה ב-0°. (C) הפין סובב ל-90°, והוא מחוץ למטרה. (D) הפין מיושר למיקום היעד ב-90°. כעת הפין מיושר בשני הכיוונים האורתוגונליים; לכן, הדגימה תסתובב במרכז המצלמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: תמונות הקרנה מנורמלות של חרק שנאסף עם אובייקטיב 1.25x ו-4x. החרק השתייך למחלקת Insecta, סדרת Coleoptera. זה מייצג שתיים מתוך 128 סריקות טומוגרפיה. החרק הודבק על נייר והוצמד לסיכת הדגימה. תמונות הקרנה עם מטרה של 1.25x הן ב -(A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, ועם 4x ב-(D) 0°, (E) 90°, ו-(F) 180°. מערך סריקות טומוגרפיה של 1.25x ו-4x נאסף במפגש אחד ללא התערבות אנושית. סט תמונות בעומק 1.25x מספק תצוגה מלאה של הדגימה, וסט תמונות של 4x מראה יכולת זום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5. השוואה של פרוסת טומוגרפיה זהה שנרכשה באמצעות שני שדות ראייה שונים. פרוסה משוחזרת אחת מטומוגרפיה של תמונות ההקרנה המוצגות באיור 4 עבור הגדלות (A) 1.25x ו -(B) 4x. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: קובץ samples.csv טיפוסי שהמשתמש מספק ומכיל פרמטרים של טומוגרפיה. קובץ זה נקרא על ידי סקריפט פייתון טומומטי המשמש לרכישת נתונים. העמודות A (תיאור הדגימה), B (מזהה דיסקית), C (חריץ בפאק), E (שלב סיבוב טומוגרפיה), F (מספר FI), G (מספר DI), H (הגדלה שתשמש) ו-K (עדיפות חריץ) מתמלאות על ידי המשתמש. העמודות D (זמן חשיפה), I (מרחק התפשטות קרני רנטגן בין הדגימה למצלמה), J (תנועת מצלמה על פני הקרן כדי למקם את ה-COR במרכז המצלמה), ו-L (ברקוד בסיס הדגימה) מתמלאות לאחר היישור והאופטימיזציה הראשונית. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: קובץ יומן פלט טיפוסי שנשמר כ-Output_file.txt לאחר שכל הדגימות נסרקו. הקובץ מדווח על כל פרמטרי הקלט, ובנוסף מספק את הברקוד של הדגימה שנסרקה (עמודה M), את הנתיב לקבצי המטא-דאטה והתמונה הסרוקים (עמודה N), ואת מיקום המנוע המשמש לאיסוף FI (עמודה O). בעיקרון, קובץ הפלט הזה מספק את המידע הנדרש לשחזור וניתוח נתונים. מכיוון שלא סופק קלט בעמודה A של קובץ הקלט, עמודה זו מלאה במספר הנוכחי של הסריקה, יחד עם מספרי הדיסק והפינים. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

קובץ משלים 1: פסאודו-קוד המתאר את הסקריפט ששימש להפעלת הרובוט כמחליף דגימות. הקובץ מפרט את שגרת ההרכבה האוטומטית של דגימה, קריאת קוד מטריצת נתונים, יישור דגימה אוטומטי וביצוע סריקת טומוגרפיה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

איור משלים 1: צילום מסך של ממשק המשתמש הכללי לרכישת נתונים. ממשק זה מאפשר התאמה של פרמטרי המצלמה הבסיסיים, הדמיה חיה של הדגימה והתחלת רכישות טומוגרפיה. ניתן להתחיל את הסריקות באמצעות כפתור המסך (סריקה ידנית בלבד) או דרך ממשק שורת הפקודה, המסומן על ידי המלבן הצהוב במרכז התחתון של צילום המסך. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: צילום של תקן SPINE פאק (משמאל) וכובע הפאק (מימין). מיקומי הפינים, המוצגים באדום, שעליהם מותקנים בסיסי הדגימה, ממוספרים החל מהמיקום שמול החריץ בעמוד האחיזה המרכזי. המספר 7267 (מסומן בלבן) הוא מספר זיהוי הדיסקית. ניתן להרכיב את פקק הפאק על הפאק כדי להגן על דגימות במהלך ההובלה או האחסון. אנא ודאו שגודל הדגימות תואם לפני שאתם מנסים להתקין את הכובע. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

הכנת הדגימה ויישור הדגימה הן שני שלבים קריטיים לרובוט מחליף הדגימות האוטומטי כדי לפעול כראוי ויעיל¹¹. גודל המדגם ודרישות ההרכבה מפורטים בסעיף 2 (פרוטוקול). בעיקרון, קוטר הדגימה צריך להיות 8 מ"מ או פחות וצריך להיות ממורכז היטב בבסיס^{הדגימה 12}. אילוץ זה נקבע על ידי מממדי האחיזה. כמו כן, כל הדגימות במדידה אחת צריכות להיות באותו גובה כדי שמיקום הדגימות במרכז הסיבוב יהיה עקבי בכל הדגימות. אם הרובוט מיושר לניסוי, אז הרצת ניסוי נוסף עם רובוט מחליף הדגימה היא אוטומטית לחלוטין, למעט הגדרת אזור העניין לדגימה. דבר זה מוסבר בסעיף התוצאות המייצגות, איור 3. כמו כן, חשוב לציין שזה חלק מתהליך היישור שמתבצע על ידי צוות קו הקרן (מגע מקומי). לאחר שזה נקבע, כל מדידות הדגימה מתבצעות ללא התערבות אנושית. מנקודת המבט של המשתמש, המדידות הן אוטומטיות לחלוטין. עד כה, נעשה שימוש רק בבסיסי דגימות ופיני דגימה מ-Molecular Dimensions Ltd; עם זאת, קיימים ספקים נוספים, כמו MiTeGen ו-Hampton Research, שמייצרים בסיסי דגימות וסיכות דגימות בסגנון SPINE.

אחיזות דגימות גדולות יותר, שתוכננו להחזיק דגימות בקוטר של עד 12 מ"מ, נמצאים כעת בפיתוח ובבדיקה. זה יאפשר לרובוט לטפל בדגימות גדולות יותר, כמו אלו הממוקמות בתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה ומותקנות על בסיס דגימה. עיצוב אחיזה משופר יכול לכלול מנגנון שמתקרב לדגימה מהצד, ובכך להסיר את המגבלות הנוכחיות על גודל המדגם. יתרה מזאת, שדרוג קו הקרן יגביר את קצב התפוקה בסדר גודל גדול, ויאפשר סריקה של יותר מ-3,000 דגימות ביום. זה, בתורו, יאפשר איסוף של מערכי נתונים מובהקים סטטיסטית הכוללים כ-30,000 דגימות בתוך 10 ימים מזמן הקרן. בעתיד הקרוב ניישם צינור חדש לשחזור טומוגרפיה, שנקרא HTTomo.

יש לציין שפרמטרים כמו מרחק התפשטות קרן (מרחק דגימה לגלאי), זמן חשיפה, מספר ההקרנות וכו', צריכים להיות מאופטמים מראש, כמו בכל ניסוי טומוגרפיית רנטגן סינכרוטרונית אחרת. מגבלה נוספת היא שהשלבים המעורבים בניסוי, כגון מניפולציה של דגימות ב-6 צירים, שלבי טומוגרפיה ושלבי מניפולציה של מצלמה, היו צריכים להיות במיקום מוגדר מסוים לטעינת הדגימה ולפריקה. משמעות הדבר היא שיש להזיז את השלבים קדימה ואחורה בעת טעינת ופריקת הדגימות.

לסיכום, ניתן לבצע טומוגרפיה בתפוקה גבוהה בעזרת רובוט משנה דגימה, מה שהופך את התהליך למהיר פי 4-10 לפחות ומפחית או מבטל את זמן המת לעומת הפעלה ידנית. אוטומציה ניסיונית עם רובוטים מאפשרת לנו גם לפרוס כוח אדם בצורה יעילה יותר, שכן נדרשים פחות אנשים לבצע את המדידות. מדידת מערכי נתונים בעלי משמעות סטטיסטית חשובה בתחומים מדעיים רבים שבהם נדרש נפח נתונים אמין ומספק כדי להתמודד עם המקרה המדעי. שימוש ברובוט יכול לעזור מאוד במשימות כאלה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שלב סיבוב נושא אוויר	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	שלב סיבוב טומוגרפיה
AVIZO	ThermoFisher scientific		תוכנת הדמיה ניתוח נתונים מסחרית
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	ספק CryoCap חלופי
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	ספק CryoCap חלופי
Cryocaps( MD7-401) ו-Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	משמשים להרכבת דגימות
אופטיקת גלאי	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	אובייקט ועין פוטו
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	תוכנת רכישת נתונים גנרית
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	שלב 6-צירים להתאמת טומוגרפיה ולטיפול בדגימות
ImageJ	פותח במכונים הלאומיים לבריאות, אוניברסיטת ויסקונסין	https://imagej.net/ij/	תוכנת עיבוד והדמיה של תמונות קוד פתוח
מצלמת pco.edge 5.5 sCMOS	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	מצלמת רנטגן המשמשת לצילום טומוגרפיה
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	צינור בנייה מחדש של טומוגרפיה
סצינטילטורים	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	אופטיקה סצינטילטורית
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	דגימות מורכבות על Uni-puck להחזרה על ידי רובוט