הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68274

⸱

3 ביולי 2025

 ,  , 
1Centre for Research in Nanotechnology & Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Bombay, 3Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

תקציר

שלפוחית חד-כימית ענקית פשוטה (sGUV) היא שלפוחית כדורית בגודל מיקרון, המורכבת משכבה דו-שכבתית של שומנים הסוגרת תמיסה מימית בפנים ותלויה בתווך מימי אחר. כמודלים ביומימטיים של תאים ביולוגיים, sGUVs הם מערכות מבוססות היטב למחקרים ביופיזיקליים. עם זאת, sGUVs מחקים בעיקר תאים גרעיניים, ומגבילים את יישומם כמודלים לתאים שאינם גרעינים. אנו מציעים שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) כמודל ביומימטי מתאים יותר לתאים גרעיניים. cGUVs הם מבנים של שלפוחית בתוך שלפוחית, כאשר ניתן להניח ששכבות השלפוחית החיצונית והפנימית מייצגות את התא ואת הממברנה הגרעינית של התא, בהתאמה.

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לסינתזה של cGUVs. בקצרה, sGUVs נוצרו באמצעות הרכב השומנים של DMPC וכולסטרול בטווח של 37-43 מול% במדיום סוכרוז בשיטת האלקטרופורמציה. לאחר מכן, sGUVs אלה היו נתונים להלם אוסמוטי על ידי הכנסת תמיסת גלוקוז היפרטונית, מה שגרם למעבר מיידי לצורה סומטוציטית. תהליך זה הוביל להיווצרות מצב ביניים שבו השלפוחיות החיצוניות והפנימיות נשארו מחוברות דרך הצוואר, ובסופו של דבר הביא להתפתחות מבנה שלפוחית בשלפוחית, המכונה cGUVs.

יתר על כן, ידוע כי GUVs שהוכנו עם רמות כולסטרול גבוהות יותר בשכבה הדו-שכבתית מציגים חדירות יונים מופחתת. מאפיין זה מאפשר כוונון מוליכות בתמיסה הטבעתית של cGUV על ידי התאמת המוליכות של מדיום הלחות, התמיסה הפנימית באמצעות גלוקוז היפרטוני, והתמיסה החיצונית על ידי התאמת הדילול או תוספת של מדיה מוליכה, מה שהופך את ה-cGUVs המתקבלים עם מוליכות מבוקרת באזורים החיצוניים, הטבעתיים והפנימיים, רלוונטי למחקרי שדה חשמלי. אנו מציעים גישה יעילה ופשוטה זו לסינתזה של שלפוחיות מורכבות שיכולות לשמש כמודל ביומימטי לתאים אוקריוטיים בעלי גרעין, ולקדם את יישומם במחקר ביופיזיקלי.

מבוא

מודלים ביומימטיים שימשו באופן נרחב לחקר התופעות הביופיזיקליות המורכבות של קרומי התאים. מודלים ביומימטיים פשוטים אלה מספקים תובנות חשובות על ידי מזעור הפרעות מאינספור המשתנים הקיימים בתאים ביולוגיים. שלפוחיות יונילמלריות ענקיות (GUVs) הן מערכת ביומימטית בסיסית המשמשת לחקר ביופיזיקה של ממברנה 1,2. GUVs מבוססים היטב כמודל מייצג של קרום התא. הם מורכבים משכבה דו-שכבתית כדורית אחת של שומנים בגודל 10-30 מיקרומטר בקוטר והם עטופים ותלויים בתמיסה מימית. במאמר זה, אנו מכנים את ה-sGUVs האלה. מערכות אלו נבנות בגישה מלמטה למעלה, שבה רכיבים תאיים חיוניים - שומנים, חלבונים וזרזים - מורכבים כדי לחקות את המבנה והתפקוד של ממברנות ביולוגיות 3,4.

למרות ש-sGUVs פשוטים, עם רק הליבה המימית בפנים, נמצאים בשימוש נפוץ, פותחו מודלים מתקדמים יותר כדי לשכפל תכונות ספציפיות של תאים ביולוגיים. לדוגמה, GUVs עם מבנים נתמכי אקטין מחקים את השלד הציטולוגי 5,6,7, בעוד שסביבות עתירות מלח משמשות לחיקוי תנאים פיזיולוגיים. סביבות המלח הגבוהות יותר מחקות תנאים פיזיולוגיים אך קשה להשיג אותם ב-GUVs מכיוון ששיטות מסורתיות, כגון אלקטרופורמציה 8,9, לרוב אינן מתאימות לסינתזה של GUVs בגודל מיקרון בתנאים כאלה. שיטות חדשות יותר, כגון השיטה בסיוע ג'ל, המשתמשת בג'לים פולימריים או עמילניים כדי לסייע לנפיחות דו-שכבתית במהלך הידרציה, מטפלות במגבלות אלו10,11. באופן דומה, שינויים מורפולוגיים של ה-sGUVs נחקרו12. התוספת של חוטים סגורים ופתוחים, כגון אקטין מכוסה, מיקרו-צינוריות ורכיבי שלד תאים אחרים, בעלי קשיחות משתנה, ותנאי הלחץ האוסמוטי בתוכם משפיעים על המעבר המורפולוגי של שלפוחיות מנופחות אוסמוטית אך בתחילה מעין-כדוריות. ניתוח תיאורטי חושף טרנספורמציות מורפולוגיות מגוונות, כולל מבנים צינוריים, כדוריים, דמויי מחבט, דמויי דובדבן וטיפות, המתאימים היטב לתצפיות ניסיוניות12. לממצאים אלה יש השלכות משמעותיות להבנת הארגון של חוטים, מיקרו-צינורות וננו-טבעות בתוך תאים ושלפוחיות. מחקרים אחרים סוקרים שיטות לאנקפסולציה של חלבונים ובוחנים כיצד אקטין מכוסה, מיקרו-צינורות ורכיבי שלד ציטו מווסתים את צורת השלפוחיות המנופחות האוסמוטיות12,13.

יתר על כן, בהשראת ארכיטקטורת תאים אוקריוטיים, מודלים מורכבים מבוססי GUV מפותחים לקראת פיתוח מודלים מלאכותיים הדומים לביקוע וחלוקת תאים, רבייה ותכונות מרובות תאים של תאים אוקריוטיים, תאים המתרבים בעצמם 14,15,16,17 ותאים מרובי תאים. מעבר ליישום מבני, GUVs הם גם המודלים הנבחרים להבנת אלקטרופורציה של תאים - תהליך שבו שדה חשמלי מופעל גורם להיווצרות נקבוביות בקרום השומנים עקב מתח מקסוול. GUVs, עם ממדים דומים לתאים ביולוגיים, מציגים אלקטרו-דפורמציה ואלקטרופורציה תחת שדות חשמליים. מחקרים כאלה על GUVs מספקים תובנות לגבי תכונות אלקטרומכניות כגון קיבול ממברנה וקשיחות כיפוף18 ולמנגנוני אלקטרופורציה 2,19,20. עם זאת, מבחינה מעשית, מחקרים אלה מייצגים בצורה הטובה ביותר תאים גרעיניים, כגון תאי דם אדומים (RBCs).

כדי לגשר על הפער הזה, אנו מציעים שלפוחיות ענק חד-פעמיות (cGUVs) כמודל ביומימטי חדשני לתאים אוקריוטיים גרעיניים21,22. לשלפוחיות אלו יש מבנה שלפוחית בשלפוחית, כאשר הדו-שכבה הפנימית מחקה את הממברנה הגרעינית, והדו-שכבתית החיצונית מייצגת את קרום הפלזמה. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד ניתן לווסת את המוליכות החשמלית של האזורים הפנימיים, הטבעתיים והחיצוניים ללא צורך במכשור מתקדם, כגון מיקרומניפולטורים או מיקרו-מזרקים. גישה פשוטה זו לסינתזה של cGUVs מציעה פלטפורמה מבטיחה לקידום מחקר ביופיזיקלי על תאים גרעיניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תמיסות תערובת שומנים

  1. הכן תמיסה של 1 מ"ל של DMPC וכולסטרול ביחס מולארי של 63:37 בריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל. לשם כך יש להוסיף 149 מיקרוליטר DMPC (מלאי 25 מ"ג/מ"ל כפי שהתקבל מומס בכלורופורם), 252 מיקרוליטר כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל כולסטרול מומס בכלורופורם) ו-599 מיקרוליטר כלורופורם.
  2. הכינו תמיסה נוספת של 1 מ"ל של DMPC: כולסטרול ביחס מולרי של 57:43 ב-5 מ"ג/מ"ל, ערבבו 139.8 מיקרוליטר של DMPC (מלאי 25 מ"ג/מ"ל כפי שהתקבל מומס בכלורופורם), 301 מיקרוליטר כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל, מוכן מאבקה מומסת בכלורופורם), ו-559.2 מיקרוליטר כלורופורם.
  3. כדי להכתים את שכבת השומנים הדו-שכבתית, הוסף 100 מיקרוליטר של נילוס אדום (מתמיסת מלאי של 5 מ"מ) ל-1 מ"ל מתערובת השומנים המכילה DMPC וכולסטרול ביחס מולארי של 63:37 (מתואר בשלבים 1.1 ו-1.2). לחלופין, הוסף 30 מיקרוליטר של Liss Rhod-PE (מלאי של 1 מ"ג/מ"ל של Liss Rhod-PE) ל-1 מ"ל של תערובת השומנים המוכנה (המתואר בשלבים 1.1 ו-1.2).
    הערה: מכיוון שהממס (כלורופורם) נדיף מאוד, לאחר פתיחה חוזרת של הבקבוקון לשימוש בתמיסת המלאי (25 מ"ג/מ"ל של DMPC), הוא עלול להתרכז, מה שעלול לשנות את ההרכב.

2. פרוטוקול אלקטרופורמציה לסינתזה של שלפוחיות ענק חד-צדדיות פשוטות (sGUVs)

  1. יש לנקות היטב את השקופיות המצופות תחמוצת פח אינדיום (ITO) בתמיסת סבון כלים ולשטוף במים נטולי יונים (0.055 μS/cm). נקו את השקופיות בתמיסת אתנול 100%, שטפו במים נטולי יונים וייבשו בתנור בחום של 85 מעלות צלזיוס.
  2. זהה את הצד המוליך של השקופיות המצופות ITO באמצעות Clampmeter. אבטח את השקופית המצופה ITO המנוקה על ציפוי הסיבובtagה באמצעות ואקום כשהצד המוליך פונה כלפי מעלה.
  3. יש למרוח 25 מיקרוליטר מתמיסות השומנים (שהוכנו בשלב 1.1) על ידי הטלת ארבע טיפות של התמיסה על הצד המוליך של שקופית ה-ITO. לאחר מכן, קחו שקופית ITO נוספת ומרחו 25 מיקרוליטר מתמיסות השומנים (שהוכנו בשלב 1.2) על ידי הטלת ארבע טיפות של התמיסה על הצד המוליך של מגלשת ה-ITO.
  4. יבש בוואקום את שתי השקופיות המצופות בשומן בחומר ייבוש שנשמר בחושך למשך שעתיים לפחות.
    הערה: הגנה מפני אור מגנה על השומנים מפני שינויים כימיים אפשריים.
  5. סדרו שקופית ITO מצופה שומן (מצופה בשומן שהוכן בשלב 1.1) במקביל לשקופיות ITO נקיות אחרות, צד מוליך זה מול זה, עם מרווח גומי סיליקון בעובי 3 מ"מ ביניהן. אטום את המכלול בעזרת מהדק ליצירת תא אלקטרופורמציה מאובטח.
  6. בצע את אותו הליך המתואר בשלב 2.5 עבור השקופית המצופה ITO עם תמיסת שומנים שהוכנה בשלב 1.2 ליצירת תא אלקטרופורמציה.
  7. מניחים את שני התאים בחממה המתוחזקת בטמפרטורה של 38-40 מעלות צלזיוס וממלאים את החדר ב-100 מ"מ של תמיסת סוכרוז בעזרת מזרק של 2 מ"ל. הפעל שדה חשמלי AC של 5 Vpp בתדר 10 הרץ באמצעות מחולל פונקציות דו-ערוצי למשך 4 שעות.
    הערה: ודא שהצד המוליך של מגלשת ה-ITO מהודק כהלכה לתפסי התנין המתחברים למחולל הפונקציות.
  8. נתק את תא האלקטרופורמציה ממחולל הפונקציות. מוציאים את החדר מהחממה ומניחים לו להתקרר לטמפרטורת החדר. קצרו את ה-sGUVs המסונתזים משני התאים באמצעות מזרק והעבירו כל אחד מהם לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל ודגרו בטמפרטורת החדר (25-27 מעלות צלזיוס) למשך שעה אחת לפני שתחשוף אותו להלם אוסמוטי.

3. מעבר צורה בהלם אוסמוטי (sGUV-to-Stomatocyte-to-cGUV)

  1. העבר 200 מיקרוליטר של sGUVs תלויים במדיה לחות המכילה תמיסת סוכרוז של 100 מ"מ לתא תצפית.
  2. הכניסו 125 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז (300 מ"מ) לתרחיף sGUV זה המכיל 200 מיקרוליטר של סוכרוז של 100 מ"מ בתוך תא התצפית כדי לגרום להלם אוסמוטי שיוזם את מעבר הצורה של ה-sGUVs.
    הערה: בצע את אותו הליך (ניתן בשלב 3) עבור סינתזת sGUV מהרכב השומנים הניתן בשלבים 1.1 ו-1.2 עבור מעבר צורה מונע זעזועים אוסמוטיים.
  3. אפשר ל-sGUVs המושרים על ידי הלם אוסמוטי לנוח למשך שעה אחת בתא התצפית הממוקם על שלב המיקרוסקופיה.
  4. כדי לבצע ולצפות במעבר הצורה של sGUVS, מקם את תא התצפית (תא אלקטרופוזיה, צלחת פטרי, מגלשת קעור או כל תא אחר שיכול לשמש לתצפית מיקרוסקופית) על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ואפשר לשלפוחיות להתייצב.
  5. עקוב אחר מעברי הצורה המתרחשים בתוך החדר. השתמש בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ובמיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית עם עדשת המטרות Plan fluor, ELWD 20x/0.45 ו-Plan fluor, ELWD 40x/0.60 כדי לצפות במעברי הצורה של ה-sGUVs.
  6. שימו לב להיווצרות שלפוחיות סטומטוציטיות במהלך המעבר. עקוב אחר החדר לאורך זמן כאשר שלפוחיות גדולות יותר מתיישבות בתחתית, ואחריה מספר מוגבר של שלפוחיות קטנות יותר.

4. שינוי מוליכות באזורים הפנימיים, הטבעתיים והחיצוניים של cGUVs

  1. התאם את המוליכות של תמיסות באזורים שונים של cGUVs (פנימי, טבעתי וחיצוני) על ידי הוספת כמויות מתאימות (μL) של תמיסת מלח מלאי של 7.5 מ"מ לפני מתן זעזוע אוסמוטי ל-sGUVs.
    1. לדוגמה, כדי ליצור מוליכות גבוהה יותר באזורים החיצוניים והפנימיים בהשוואה לאזור הטבעתי, העבירו 200 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז לתא האלקטרופוזיה. הוסף לתא 20 מיקרוליטר של תמיסת מלח של 7.5 מ"מ. לגרום להלם אוסמוטי על ידי הוספת 125 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז של 300 מ"מ.
    2. אפשר ל-sGUVs עם הלם אוסמוטי לנוח במשך 3-4 שעות. במקרה זה, cGUVs מתקבלים עם מוליכות גבוהה יותר באזורים החיצוניים והפנימיים מאשר באזור הטבעתי בסוף.
  2. בצע אלקטרו-דפורמציה של cGUVs על ידי הפעלת פוטנציאל חשמלי AC של 7.5 Vpp ב-100 קילו-הרץ באמצעות מחולל פונקציות בתא אלקטרופוזיה המכיל אלקטרודות תיל המרוחקות 500 מיקרומטר זו מזו.
  3. לאחר הפעלת שדה חשמלי AC, צלם וידאו במהירות של 10 פריימים לשנייה והתבונן בעיוות הצורה האובלטית של השלפוחיות החיצוניות ועיוות צורת הפרולט של השלפוחיות הפנימיות, המאשר מוליכות גבוהה יותר באזורים החיצוניים והפנימיים מאשר באזור הטבעתי בתחומי cGUV.

5. ניתוח מיקרוסקופיה של cGUVs

  1. הדמיית מיקרוסקופ הפוך: בצע ניגודיות הפרעות דיפרנציאלית (DIC) ומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ הפוך ובשילוב עם מצלמה מונוכרומטית. השתמש במיקרוסקופיה DIC ואפיפלואורסצנטית עם עדשות אובייקטיביות Plan fluor, ELWD 20x/0.45 ו-Plan fluor, ELWD 40x/0.60 כדי לצפות במעברי הצורה של ה-sGUVs. השתמש במסנן ירוק (EX 510-560, DM 575, BA 590) עבור דו-שכבת הכתם האדום של הנילוס למחקר האפיפלואורסצנטי.
    הערה: תמונות DIC מספקות תובנות חשובות לגבי מצב הצוואר המחובר, ומאשרות אם הוא נשאר שלם או עובר היתוך ליצירת cGUVs.
  2. השתמש בתוכנת ImageJ כדי להוסיף סרגל קנה מידה ולחתוך תמונות מיקרוסקופיה. כדי להוסיף סרגל קנה מידה, עבור אל ניתוח | הגדר את קנה המידה כדי לכייל את התמונה, ולאחר מכן עבור אל ניתוח | כלים | סרגל קנה מידה כדי להוסיף את סרגל קנה המידה.
  3. מיקרוסקופיה קונפוקלית למורפולוגיה: כדי להשיג הבנה ברורה יותר של מורפולוגיה של cGUV, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר לסריקת ציר z בגודל צעד של 1 מיקרומטר. הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי: השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם עדשת אובייקט שמן Plan-Apochromat 40x/1.3 oil DIC כדי לצלם את ה-cGUVs. תמונה: cGUVs מוכתמים באדום נילוס או רודמין-PE באמצעות מצב ערוץ יחיד אדום, עם אורך גל עירור של 561 ננומטר וטווח פליטה של 561-695 ננומטר.
  4. כדי לשנות ולחלץ את קובץ ה-.czi של התמונה בתוכנה המקושרת למיקרוסקופ, הכנס גרפיקה כמו סרגל קנה מידה והפעל תצוגה דו-ממדית, תלת-ממדית, ולאחר מכן עבור אל עיבוד | שיטה | פרמטרים ולחץ החל כדי לקבל תמונה בפורמט JPG.
  5. הכנה למיקרוסקופיה קונפוקלית: מלאו תמיסה מימית המכילה cGUVs בתא מותאם אישית שונה (זכוכית תחתונה הוחלפה בזכוכית Coverslip) להדמיה קונפוקלית. השאירו את הדגימה ללא הפרעה למשך 10-15 דקות כדי לאפשר ל-cGUVs להסתפק בהדמיה קונפוקלית; טען את תערובת ה-cGUVs בשקופית החלל ואטום עם כיסוי כדי לעצור את תנועות ה-cGUVs. לאחר מכן, נתח את ה-cGUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסריקת z במרווחים של 1 מיקרומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

sGUVs סונתזו בשיטת האלקטרופורמציה (כפי שמוצג באיור 1) ונקטפו מהתא באמצעות מזרק. ה-sGUVs שנקטפו הודגמו בתחילה תחת מיקרוסקופ הפוך והיו נתונים להלם אוסמוטי כדי לגרום להפיכתם לצורת סטומטוציטים. לאחר שיפוץ נוסף של הממברנה, הסטומטוציט הזה הופך למבנה שלפוחית בתוך שלפוחית שנקרא שלפוחית ענקית מורכבת (cGUV) (איור 1). ה-cGUVs נותחו עוד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2), שם נעשה שימוש בניגודיות הפרעות דיפר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הרכב וסוגי השומנים קובעים במידה רבה את התכונות המכניות של הדו-שכבתי המהווים GUV. שכבה דו-שכבתית המורכבת מ-DMPC/Chol מציגה מעברי צורה ייחודיים כאשר היא נתונה להלם אוסמוטי. תחת הלם אוסמוטי היפרטוני חזק, הנוזל המימי בתוך ה-sGUV נפלט, מה שמוביל לעיוות של שכבת ה-GUV. מעברי הצורה הנצפים מושפעים בעיקר משטף המים החיצוני ומקשיחות הכיפוף של הדו-שכבתית. עיוותים אלו באים לידי ביטוי בצורות שונות, כולל צורות כוכבי ים ומשקולות, תלוי בעוצמת ההלם האוסמוטי ובהרכב השומנים של השכבה הדו-שכבתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

רופש קומאר מודה למשרד לפיתוח משאבי אנוש (MHRD), ממשלת הודו, על מלגת PMRF ומענק מגירה. אנו אסירי תודה על מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי של המתקן המרכזי, IRCC, IIT בומביי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cholesterol (Sigma grade, 99%)Avanti Polar Lipids, Inc.C8667לסינתזה של sGUV
CholoroformMerck Life Science Pvt. Ltd.DA2P711602המשמש כממס להכנת תמיסת שומנים
DMPCAvanti Polar Lipids, Inc.850345Cלסינתזה של sGUV
EthanolHaymanF204325לניקוי שקופיות ITO
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)Sigma-Aldrich466994להקפסולציה בתוך הווסיקלים הפנימיים של cGUV
GlucoseSigma-AldrichG-7021להכנת תמיסת גלוקוז, המשמשת לזעזוע אוסמוטי ל-sGUV המושעה בתמיסת סוכרוז
Liss Rhod PESigma-Aldrich810150C-1MGכדי לכתם מולקולות שומן
Nile redSigma-Aldrich72485לצביעת קרום cGUV ו-sGUV
Sodium chloride (NaCl)Sigma-Aldrich1936060521להכנת תמיסת מלח, לשינוי המוליכות  של תאי cGUV
SucroseSigma-AldrichS9378לתמיסת סוכרוז כמדיה להידרציה של תא האלקטרופורמציה
ציוד
שקופיות CavitlyBlue starהשעיה של cGUV להתבוננות במיקרוסקופ
מצלמת cMOS pco.edge 4.2Excelitas61009524לתמונות מונוכרומטיות פלואורסצנטיות ותמונות DIC
מכסה שקוף (22 x 60 ממ)Blue starלהכסה של שקופיות חלל
תא אלקטרופיוזיה של EppendrofSigma-Aldrichהשעיית sGUV בתא לצפייה אוסמוטית ומיקרוסקופית, ניתן להשתמש גם בכל תא פשוט אחר
מחולל פונקציות (ערוץ כפול)TektronixAFG3022Cמחולל פונקציות המשמש למסירת שדה חשמלי AC לתא האלקטרופורמציה 
חממהמותאם אישית מקומיתא האלקטרופורמציה מונח על 40?
שקופיות ITOSigma-Aldrich576352-10PAKשקופיות ITO המשמשות בשיטת האלקטרופורמציה
מיקרוסקופ הופכי Nikon EclipseNikonTE2000-Uלהדמיה של sGUV ו-cGUV
גיליון סיליקון (עובי 3 ממ )Sigma-AldrichGF49463141להפרדה בתא האלקטרופורמציה
מזרק (2 מ"ל)Becton Dickinson India Pvt Ltd.300844משמש בהזרקת מדיה להידרציה ואיסוף ה-sGUV מתא האלקטרופורמציה
מתקן מיקרוסקופיית קונפוקל של Zeissהמתקן המרכזי של IIT בומביי

מקורות

  1. Dimova, R. Chapter one - Giant vesicles: A biomimetic tool for membrane characterization. Advances in planar lipid bilayers and liposomes. Iglic, A. 16, 1-50 (2012).
  2. Maoyafikuddin, M., Thaokar, R. M. Effect of the waveform of the pulsed electric field on the cylindrical deformation of uncharged giant unilamellar vesicles. Langmuir. 39 (28), 9660-9670 (2023).
  3. Nair, K. S., Bajaj, H. Advances in giant unilamellar vesicle preparation techniques and applications. Adv Colloid Interface Sci. 318, 102935(2023).
  4. Göpfrich, K., et al. One-pot assembly of complex giant unilamellar vesicle-based synthetic cells. ACS Synth Biol. 8 (5), 937-947 (2019).
  5. Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In vitro reconstitution of the actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (186), e64026(2022).
  6. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  7. Fink, A., et al. Extracellular cues govern shape and cytoskeletal organization in giant unilamellar lipid vesicles. ACS Synth Biol. 12 (2), 369-374 (2023).
  8. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Meleard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. Progress in Colloid & Polymer Science. Helm, C., Loesche, M., Moehwald, H. 89, 127-131 (1992).
  10. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophys J. 105 (1), 154-164 (2013).
  11. Maoyafikuddin, M., Pundir, M., Thaokar, R. Starch aided synthesis of giant unilamellar vesicles. Chem Phys Lipids. 226, 104834(2020).
  12. Shi, C., et al. Morphological transformations of vesicles with confined flexible filaments. Proc Natl Acad Sci USA. 120 (18), e2300380120(2023).
  13. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annu Rev Biophys. 50, 525-548 (2021).
  14. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
  15. Zong, W., et al. A fissionable artificial eukaryote-like cell model. J Am Chem Soc. 139 (29), 9955-9960 (2017).
  16. Zong, W., Li, Q., Zhang, X., Han, X. Deformation of giant unilamellar vesicles under osmotic stress. Colloids Surf B: Biointerfaces. 172, 459-463 (2018).
  17. Shin, J., Jang, Y. Multicompartment synthetic vesicles for artificial cell applications. ACS Appl Eng Mater. 2 (12), 2758-2770 (2024).
  18. Riske, K. A., Dimova, R. Electro-deformation and poration of giant vesicles viewed with high temporal resolution. Biophys J. 88 (2), 1143-1155 (2005).
  19. Maoyafikuddin, M., Kulkarni, S. V., Thaokar, R. M. Synthesis method and high salt concentration can affect electrodeformation of GUVs under strong pulsed DC fields. ACS Omega. 10 (7), 6427-6436 (2025).
  20. Behera, N., Thaokar, R. M. Numerical modeling of giant pore formation in vesicles under msPEF-induced electroporation: Role of charging time and waveform. Bioelectrochemistry. 164, 108926(2025).
  21. Kumar, R., Chakrabarti, R., Thaokar, R. M. Compound giant unilamellar vesicles as a bio-mimetic model for electrohydrodynamics of a nucleate cell. Soft Matter. 20 (35), 6995-7011 (2024).
  22. Sinha, K. P., Thaokar, R. M. Electrohydrodynamics of a compound vesicle under an AC electric field. Journal of Physics. 29 (27), 275101(2017).
  23. Méléard, P., et al. Bending elasticities of model membranes: Influences of temperature and sterol content. Biophys J. 72 (6), 2616-2629 (1997).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).
  26. Almeida, P. F. F., Vaz, W. L. C., Thompson, T. E. Lateral diffusion in the liquid phases of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol lipid bilayers: a free volume analysis. Biochemistry. 31 (29), 6739-6747 (1992).
  27. de Meyer, F., Smit, B. Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (10), 3654-3658 (2009).
  28. Kraske, W. V., Mountcastle, D. B. Effects of cholesterol and temperature on the permeability of dimyristoylphosphatidylcholine bilayers near the chain melting phase transition. Biochim Biophys Acta. 1514 (2), 159-164 (2001).
  29. Corvera, E., Mouritsen, O. G., Singer, M. A., Zuckermann, M. J. The permeability and the effect of acyl-chain length for phospholipid bilayers containing cholesterol: theory and experiment. Biochim Biophys Acta. 1107 (2), 261-270 (1992).
  30. Kamiya, K., Osaki, T., Takeuchi, S. Formation of vesicles-in-a-vesicle with asymmetric lipid components using a pulsed-jet flow method. RSC Advances. 9 (52), 30071-30075 (2019).
  31. Doğan Güzel, F., Kaur, J., Zendeh, Z. Cheap portable electroformed giant unilamellar vesicles preparation kit. J Liposome Res. 33 (2), 183-188 (2023).
  32. Kaur, J., et al. On-chip label-free impedance-based detection of antibiotic permeation. IET Nanobiotechnol. 15 (1), 100-106 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GUV
סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.