מאמר שיטה

פיתוח Cryoprotectant חדשני בעל DMSO נמוך לשימור תאי גזע מדם היקפי

DOI:

10.3791/68275

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול משתמש בהקפאה של תאי גזע המטופויאטיים המכיל ריכוז נמוך מאוד של דימתיל סולפוקסיד ומדגים את בטיחותו הקלינית ויעילותו בהגנה על תאי גזע המטופויאטיים, ומספק אסטרטגיה חדשה לשימור בהקפאה של תאי גזע המטופויאטיים בהשתלת תאי גזע אוטולוגיים קליניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימור בהקפאה של תאי גזע המטופויאטיים בדם היקפי (PBHSC) הוא קריטי להשתלת תאי גזע אוטולוגיים (ASCT), אך חומרים מסורתיים להגנה מפני הקפאה (TCPAs) המכילים 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) מעלים חששות בטיחות עקב סיכון לרעילות. מחקר זה נועד לאמת חומר קריו-מגן חדש בעל DMSO נמוך (CPA, 2% DMSO) לשימור PBHSC ב-80 מעלות צלזיוס, ולבטל את הצורך באחסון חנקן נוזלי. PBHSCs משישה תורמים חולקו לקבוצות CPA ו-TCPA. ה-CPA עורבב עם PBHSCs (1:1 נפח/נפח) ואוחסנו ישירות ב-80 מעלות צלזיוס. TCPA (10% DMSO + 5% אלבומין אנושי) עבר קירור הדרגתי (1 מעלות צלזיוס לדקה) ואחסון חנקן נוזלי. לאחר חודש, שתי הקבוצות הופשרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הושוו כדאיות התא, שלמות השלד הציטו-שלד (מיקרו-פילמנטים/מיקרו-צינורות), פעילות המיטוכונדריה ויכולת יצירת המושבה. לאחר ההפשרה, הישרדות PBHSC הייתה דומה בין CPA (91.29%) ל-TCPA (90.07%). עם זאת, CPA עלה על TCPA במבחני כדאיות התאים (CPA: 89.38% לעומת TCPA: 79.55%; p < 0.05). ניתוח שלד ציטו חשף מיקרופילמנטים ומיקרו-צינורות שלמים בתאים שהשתמרו ב-CPA, עם בהירות מבנית העולה על TCPA. הפעילות המיטוכונדריאלית בתאים שטופלו ב-CPA שיקפה PBHSCs טריים, והציגה פעילות גבוהה ב-8.5% מ-TCPA (p <-0.05) ומספרים מורכבים מיטוכונדריאלים מוגברים. בדיקות יוצרות מושבות אישרו עוד יותר את עליונותו של CPA, עם ספירת מושבות גבוהה יותר לאחר האינדוקציה. CPA מאפשר שימור בטוח ונוח של PBHSC בהקפאה ב-80 מעלות צלזיוס באמצעות DMSO נמוך במיוחד (2%), ומבטל את ההסתמכות על חנקן נוזלי. כדאיות התאים המשופרת ושימור המיטוכונדריה מצביעים על יתרונות קליניים על ידי הפחתת סיכוני רעילות בעירוי. פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה טרנספורמטיבית עבור ASCT, אופטימיזציה של בטיחות ויעילות תפעולית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת תאי גזע המטופויאטיים אוטולוגיים (ASCT) היא אפשרות טיפול מבוססת היטב לממאירות המטולוגיות שונות, כולל לוקמיה, לימפומה ומיאלומה נפוצה, שם היא משמשת כטיפול קו ראשון או שני לשיקום המטופואיזיס ושיקום היכולת החיסונית לאחר כימותרפיה אינטנסיבית או הקרנות 1,2,3,4,5,6,7 . תוצאות מוצלחות של ASCT תלויות באופן קריטי בכדאיות של תאי גזע המטופויאטיים בדם היקפי (PBHSCs), שחייבים לשמור על יכולת תפקודית לבנייה מחדש של המטופויאטיקה ומערכת החיסון 8,9,10,11,12. אחסון תאי גזע המטופויאטיים הוא שלב קריטי ב-ASCT מכיוון שלאחר קצירת תאי גזע המטופויאטיים אוטולוגיים, חולים עוברים בדרך כלל הקרנות, כימותרפיה וטיפולים אחרים כדי לחסל תאי גידול. איכות האחסון של תאי גזע המטופויאטיים קשורה ישירות להצלחה או לכישלון של בנייה מחדש של המטופויאטי ומערכת החיסון 13,14,15,16,17,18. כדי להבטיח את הכדאיות של תאי גזע המטופויאטיים לאחר שימור בהקפאה, שיטות קליניות כוללות לעתים קרובות תוספת של אלבומין בדם אנושי ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) כ-CPA. חומרים אלו חיוניים לשמירה על פעילות התאים במהלך ואחרי תהליך השימור בהקפאה. בדרך כלל, ריכוז ה-DMSO בשימוש נע בין 5% ל-10% (v/v). מחקרים הצביעו על כך ששמירה על ריכוז DMSO של לפחות 3.5% עד 10% (v/v) יכולה לשפר את היעילות של שימור בהקפאה של תאי גזע המטופויאטיים19,20. עם זאת, היישום הקליני של DMSO נותר בעייתי עקב רעילות תלוית מינון, כאשר 30%-60% מהמושתלים מדווחים על תופעות לוואי כגון בחילות, הקאות ויתר לחץ דם21,22. כדי להתמודד עם המגבלות של חומרים קריו-פרוטקטיביים קונבנציונליים (CPAs) המכילים 5%-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מחקר זה נועד לפתח CPA חדשני המאפשר שימור בטוח ויעיל של PBHSC בהקפאה ב-80 מעלות צלזיוס תוך שימוש בריכוזי DMSO נמוכים במיוחד (2% v/v), ובכך לבטל את הצורך בפרוטוקולי חנקן נוזלי מורכבים תוך הפחתת רעילות הקשורה ל-DMSO.

חלופות מתפתחות, כגון רואי חשבון מבוססי טרהלוז או משופרים בפולימר, מראות הבטחה פרה-קלינית אך נתקלות במחסומים בתרגום קליני עקב מכשולים רגולטוריים או חוסר התאמה לפרוטוקולי הפשרה סטנדרטיים23. לעומת זאת, ה-CPA שלנו מתבסס על פרופיל הבטיחות המבוסס של מערכות HSA-DMSO תוך הצגת יחסי תוספים אופטימליים המשפרים את ההגנה על הציטו. שיטה זו מתאימה במיוחד למרכזים קליניים חסרי תשתית חנקן נוזלי או הדורשים זרימות עבודה מהירות. עם זאת, לאחסון לטווח ארוך (>שנתיים), חנקן נוזלי נשאר עדיף24. על הרופאים לאזן בין פשטות הפרוטוקול לבין סבילות המטופל הבודד ל-DMSO, ולהבטיח יישום מותאם של אסטרטגיה זו כדי למקסם את הבטיחות והיעילות התפעולית בהשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

במחקר זה, שימוש בחומרי הקפאה עם תכולת DMSO מופחתת מייצג אסטרטגיה חיונית לשימור בו זמנית של היעילות של שימור בהקפאה של תאי גזע המטופויאטיים תוך מזעור הרעילות הנלווית. היעילות, הבטיחות והנוחות של CPA של תאי גזע המטופויאטיים שפותחו לאחרונה הוערכו לשימור תאי גזע המטופויאטיים בדם היקפי (PBHSCs). יושמה שיטת הקפאה פשוטה וישירה תוך שימוש ב-CPA החדש, תוך הימנעות מפרוטוקולי שימור בהקפאה קונבנציונליים. הממצאים מדגימים כי שימור בהקפאה בשלב אחד של תרחיפי תאים ב-80 מעלות צלזיוס באמצעות DMSO CPA בריכוז נמוך משיג השפעות שימור מעולות בהשוואה ל-CPA מסורתי (TCPA). גישה זו עשויה להציע אסטרטגיות חדשות לייעול התהליך הקליני של השתלת תאי גזע המטופויאטיים (HSCT).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חולים אונקולוגיים המטולוגיים שעברו ASCT גויסו מיוני 2020 עד יוני 2022 במחלקה להמטולוגיה, בית החולים לסרטן שנזן. דגימות תאי דם נלקחו לפני ואחרי גיוס ההשתלה ל-HSCT, כולל שני מקרים של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML), שני מקרים של לימפומה הודג'קין (HL), מקרה אחד של לימפומה היסטיוציטית אמיתית עורית (CGHL), ומקרה אחד של לימפומה ראשונית של תאי B מדיאסטינליים (PMBL), עם גיל חציוני של 53 שנים וטווח של 35 עד 61 שנים. המחקר קיבל הסכמה מדעת מהמטופלים ואישור מוועדת סקירת האתיקה של בית החולים לסרטן שנזן, עם מסמך האישור האתי שמספרו AF-SC-07-2.0. כל הליכי הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של חיות ניסוי, בית החולים לסרטן, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אישור מס. NCC2018A073) ועמד בהנחיות בינלאומיות למחקר בבעלי חיים.

1. אריזת משנה ושימור בהקפאה של דגימות תאי גזע המטופויאטיים

  1. הכנת תחנת עבודה אספטית
    1. יש לשטוף ידיים ביסודיות וללבוש מסכות וכפפות סטריליות. חיטוי ידיים, פרקי כף היד והמרפקים באמצעות 75% אתנול.
    2. עקר את כל המכשירים הרזרביים (פיפטות, המוסטטים) עם חיטוי או קרינת UV. סדרו את החומרים הבאים על ארון הבטיחות הביולוגית: קצות פיפטה סטריליים ללא פירוגן 1 מ"ל (2 קופסאות), פיפטה 1000 מיקרוליטר , צינורות שימור סטריליים של 1.8 מ"ל, צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל וקופסת אחסון צינור שימור בהקפאה (קופסת הקפאה הניתנת לתכנות).
  2. תיוג וערבוב תאים-רו"ח
    1. סמן צינורות שימור בהקפאה עם מזהה מדגם, תאריך, ספירת תאים ושם התורם.
    2. חבר את שקית תאי הגזע ההמטופויאטיים המכילה 180-200 מ"ל של תאי גזע המטופויאטיים לשקית המכילה CPA המכילה 100 מ"ל של חומר קריאופרוטקטנט חדש עם DMSO נמוך באמצעות צינור עירוי סטרילי.
    3. מהדק את נקודת האמצע של הצינור עם המוסטט סטרילי. חבר קצה אחד לשקית תערובת התא-CPA ואת הקצה השני לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  3. מילוי ושימור בהקפאה
    1. שחרר את המוסטט כדי לאפשר זרימה מבוקרת של תערובת התא-CPA לתוך צינור הצנטריפוגה.
    2. שאפו 1 מ"ל מצינור הצנטריפוגה באמצעות פיפטה. העבירו את הכמות לתוך צינורות קריו-טיוב מסומנות מראש (30 צינורות/דגימה). הדק את המכסים והנח צינורות בקופסת האחסון.
  4. אחסון והובלה
    1. מעבירים מיד את קופסת האחסון למקרר -80 מעלות צלזיוס. להובלה, ארוז צינורות קריו-טיובים בקרח יבש (-78.5 מעלות צלזיוס) עם ניטור טמפרטורה.

2. שימור בהקפאה ושחזור של PBHSCs

  1. הכנה וערבוב של CPA ו-TCPA
    1. מצננים מראש משטח קרח ל 2-8 מעלות צלזיוס. להפשיר את תאי הגזע ההמטופויאטיים CPA ו-TCPA בהתאם להנחיות היצרן (ראה טבלה 1 להרכבי CPA/TCPA).
    2. מערבבים CPA ו-TCPA עם שש דגימות PBHSC ביחס נפח של 1:1 על פלטפורמת הקרח. העבר את תרחיף התאים לקריוביאלים סטריליים.
  2. שימור בהקפאה של CPA
    1. מניחים ישירות את הקריוביאלים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. ודא שריכוז ה-DMSO הסופי בתרחיף הוא 2% (v/v). אחסן דוגמאות למשך חודש.
  3. שימור הקפאה של TCPA (בקרה השוואתית)
    1. הכן TCPA המכיל 5% אלבומין בדם אנושי ו-10% DMSO (v/v). טען את מתלי PBHSC לתוך קריוביאלים וקירור ל-80 מעלות צלזיוס ב-1 מעלות צלזיוס לדקה באמצעות מקפיא הניתן לתכנות.
    2. העבירו קריוביאלים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח הארוך. אחסן דוגמאות למשך חודש.
  4. החייאת תאים
    1. אחזר קריוביאלים לאחר חודש. להפשיר תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ערבול עדין (≤ 5 דקות).
    2. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות להסרת שאריות CPA/TCPA. השהה מחדש 1 מ"ל של תאים במדיום תרבית RPMI 1640 שחומם מראש לבדיקות במורד הזרם.

3. בדיקת כדאיות תאים

  1. ספירת תאים מבוססת תמונה
    1. הכן תמיסת צביעה מעורבת המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל תפוז אקרידין (AO) ו-10 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד (PI).
    2. מערבבים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה (יחס של 1:1) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
    3. טען 10 מיקרוליטר מהדגימה המוכתמת לדלפק התאים האוטומטי. ניתוח כדאיות התא באמצעות התוכנה המשולבת:
      כדאיות = תאים חיים / סה"כ תאים x 100%
  2. אימות ציטומטריית זרימה
    1. הכן את תמיסת הצביעה של Annexin V-FITC/PI על ידי ערבוב Annexin V-FITC (5 μL) ו-PI (5 μL) ב-100 מיקרוליטר של מאגר קשירה.
    2. הוסף 300 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתמיסת הצביעה ודגר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
    3. צנטריפוגה את התערובת בחום של 300 x גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש תאים ב-500 מיקרוליטר של PBS ונתחו את הכדאיות באמצעות ציטומטר זרימה25.

4. מבחן יצירת מושבה

  1. הכנת תרחיף תאים
    1. מערבבים את תרחיף התאים עם תמיסה כחולה של 0.4% טריפן ביחס של 1:1 ודוגרים למשך 3 דקות כדי להבחין בין תאים ברי קיימא/מתים. בצע ספירות כפולות באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע צפיפות תאים בת קיימא (הבטח כדאיות >90%). התאם את נפח מתלה התאים לריכוז היעד (1 x 106 תאים/מ"ל) וסנן דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי להבטיח פיזור של תא בודד. סנן את מתלה התאים דרך מסננת תאים סטרילית של 40 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים.
  2. ערבוב בינוני
    1. שלב 1 מ"ל של תרחיף תאים עם 9 מ"ל של מדיום יחידה מסחרי ליצירת מושבת עכברים בצינור חרוטי של 15 מ"ל (1:10 v/v).
    2. מערבולת את התערובת ב-1,500 סל"ד למשך 30 שניות כדי להבטיח הומוגניות. צנטריפוגה ב-100 x גרם למשך 10 שניות לסילוק בועות אוויר.
  3. הגדרת זריעת תאים ולחות
    1. מחלקים 1.5 מ"ל של תערובת נטולת בועות לצלחת פטרי סטרילית בגודל 35 מ"מ. הוסף 3 מ"ל מים מזוקקים סטריליים לחריץ היקפי של המנה (או הנח מיכל סטרילי נפרד בתוך מכסה הכלי) כדי לשמור על הלחות.
    2. אוטמים את המנה בתא לח (≥ 95% לחות).
      1. להכנת החדר, הניחו שתי שכבות של נייר סופג סטרילי במיכל פלסטיק עם מכסה (למשל, צלחת פטרי בגודל 15 ס"מ). הוסף 10 מ"ל מים סטריליים נטולי יונים כדי להרוות את הנייר. הנח את צלחת התרבות המוכתמת במרכז החדר, והבטיח שאין מגע ישיר בין הכלי לנייר רטוב. עטפו סרט שקוף סביב צומת המכסה-מיכל 3 פעמים לאיטום אטום. לחלופין, אבטח את שולי המכסה בעזרת סרט מעבדה. דגרו את החדר האטום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאזן את הלחות ≥ 95%.
  4. גידול וספירה של מושבות
    1. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2 למשך 16 יום. ספרו מושבות המטופויאטיות (≥ 50 תאים לאשכול) באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 40. חשב יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לכל 1 x 104 תאים זרעים.

5. זיהוי פעילות מיטוכונדריאלית

  1. צביעת תאים עם רודמין 123
    1. השעו מחדש PBHSCs ב-1 x 106 תאים/מ"ל ב-1 מ"ל של מדיום RPMI1640. הוסף צבע רודמין 123 לריכוז סופי של 5-10 מיקרומטר. דגירה על תאים ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. צנטריפוגה את מתלה התא ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של RPMI1640 טריים. חזור על הצנטריפוגה והשהה מחדש ב -1 מ"ל של PBS.
  2. ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. נגב שקופית זכוכית נקייה בנייר נטול מוך כדי להסיר אבק או מזהמים.
    2. השעו מחדש PBHSCs מוכתמים ב-PBS לצפיפות מתאימה כדי למנוע אותות חופפים. פיפטה 10-20 מיקרוליטר של מתלה תאים והוציא אותו לאט למרכז השקופית.
    3. הטה את משטח הכיסוי בזווית של 45°, גע בעדינות בקצה אחד של הטיפה והורד אותו בהדרגה כדי למזער בועות אוויר. לחץ קלות כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה לשכבה אחת.
    4. הנח את השקופית אופקית בחושך למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתייצב. המשך מיד לניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית.
    5. הרכיבו את התאים המוכתמים על מגלשת זכוכית. התבונן בהתפלגות המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (לדוגמה: 488/525 ננומטר).
  3. כימות ציטומטריית זרימה
    1. נתח את עוצמת הקרינה של רודמין 123 באמצעות ציטומטר זרימה (ערוץ FL1). השתמש ב-PBHSCs שטופלו במי חמצן (1 מ"מ, שעה אחת) כבקרות חיוביות26.

6. צביעת שלד ציטו של PBHSCs

  1. צביעת מיקרופילמנט (Actin Tracker Green-488)
    1. הכן בדיקה פלואורסצנטית מצומדת AF488 המומסת ב-PBS בריכוז סופי של 5 U/mL. לדלל את תמיסת המלאי (200 U/mL במתנול) על ידי ערבוב של 5 μL של מלאי עם 195 μL של PBS (דילול 1:40). מערבולת ביסודיות במשך 10 שניות כדי להבטיח הומוגניות.
    2. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת העבודה המוכנה Actin Tracker Green-488 (5 U/mL) ל-PBHSCs. דגירה של תאים ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
    3. תאי שטיפה פי 2 עם 1 מ"ל של מאגר כביסה מכתים חיסוני (0.1% Triton X-100 ב-PBS). גרעינים נגדיים עם 200 מיקרוליטר DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס בחושך.
  2. צביעת מיקרו-צינורות (Tubulin Tracker Red)
    1. הכן בדיקה פלואורסצנטית מצומדת פקליטקסל מומסת ב-PBS בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. לדלל את תמיסת המלאי (100 מיקרומטר ב-DMSO) על ידי הוספת 10 מיקרוליטר מלאי ל-990 מיקרוליטר PBS (יחס דילול של 1:100). מערבולת את התערובת למשך 10 שניות כדי להבטיח הומוגניות ולהגן מפני אור.
    2. הכן את תמיסת העבודה Tubulin Tracker Red בריכוז סופי של 250 ננומטר במדיום שלם. לדלל את תמיסת המלאי (1 מ"מ ב-DMSO) על ידי הוספת 2.5 מיקרוליטר מלאי ל-997.5 מיקרוליטר בינוני (יחס דילול של 1:400). מערבלים את התערובת למשך 10 שניות ומוסיפים 200 מיקרוליטר ל-PBHSCs. דוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
    3. שטפו תאים פי 2 עם 1 מ"ל של מאגר כביסה מכתים חיסוני. גרעינים נגדיים עם 200 מיקרוליטר DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. הרכבה ומיקרוסקופיה
    1. שטפו תאים מוכתמים פעמיים עם PBS. מערבבים תאים מוכתמים עם תמיסת 90% גליצרול-PBS (90% גליצרול ו-10% PBS, v/v) ביחס נפח של 1:1. פיפטה 10 מיקרוליטר מהתערובת על שקופית זכוכית. הטה את הכיסוי ב-45° והורד אותו בהדרגה כדי למנוע בועות אוויר.
    2. לנתח מורפולוגיה של אקטין/מיקרו-צינוריות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור של 488 ננומטר עבור אקטין גרין; 561 ננומטר עבור טובולין אדום). כלול בקרות חיוביות: PBHSCs שטופלו בציטוקלסין B (5 מיקרומטר, 2 שעות) לשיבוש אקטין ו-PBHSCs שטופלו בקולכיצין (10 מיקרומטר, 3 שעות) לדה-פולימריזציה של מיקרו-צינורות.

7. הערכות בטיחות רו"ח

  1. בדיקת המוליזה
    1. הכן תרחיף כדוריות דם אדומות של ארנב 2% באמצעות נוגד קרישה בדם טרי עם EDTA.
    2. הוסף CPA (0.1-0.5 מ"ל) ותמיסת מלח פיזיולוגית (2.0-2.4 מ"ל) ל-2.5 מ"ל של תרחיף תאים בצינורות זכוכית.
    3. השתמש במי מלח כבקרה שלילית ובמים מעוקרים כבקרה חיובית. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות וצפייה בהמוליזה/קרישה תחת מיקרוסקופ.
  2. בדיקת אלרגיה מערכתית
    1. הכנת בעלי חיים
      1. יש להשתמש ב-36 SPF Hartley (50% זכרים, 271-307 גרם; 50% נקבות, 270-301 גרם) בגילאי 4-5 שבועות. שמור על תנאי הדיור הבאים: טמפרטורה: 16-26 מעלות צלזיוס (± תנודות יומיות של 4 מעלות צלזיוס), לחות: 40%-70%, אוורור: 8-10 החלפות אוויר לשעה, מחזור אור: 12 שעות אור/כהה
    2. שלב הרגישות
      1. הזריק CPA לרבע השמאלי התחתון של חלל הצפק ב-2 מ"ל/ק"ג (נמוך) או 6 מ"ל/ק"ג (גבוה) בימים 1, 3 ו-5. המינון הנמוך (2 מ"ל/ק"ג) מדמה רמות חשיפה קליניות, בעוד שהמינון הגבוה (6 מ"ל/ק"ג) מייצג את מרווח הבטיחות פי 3 להערכת רגישות יתר תלוית מינון, בהתאם להנחיות ה-OECD 406 לבדיקת אלרגיה מערכתית27,28.
      2. השתמש באלבומין בסרום אנושי (שליטה חיובית) ובמי מלח (שליטה שלילית).
    3. שלב האתגר
      1. יש לתת CPA תוך ורידי דרך וריד האוזן השולי ב-4 מ"ל/ק"ג (נמוך) או 12 מ"ל/ק"ג (גבוה) בימים 19 ו-26. מינוני האתגר (מינוני רגישות פי 2) עולים בקנה אחד עם הפרוטוקולים שנקבעו כדי לעורר אנפילקסיס בשרקנים רגישים מראש, כפי שאומת במחקרים קודמים של תאימות ביולוגית של קריופרוטקטנט29.
      2. עקוב אחר תסמיני אנפילקסיס (מצוקה נשימתית, עוויתות) למשך שעה לאחר ההזרקה.
    4. טיפול לאחר הניסוי
      1. החזירו שרקנים לטיפול וטרינרי להשגחה של 72 שעות. המתת חסד באמצעות הוצאת אבי העורקים הבטני בהרדמה איזופלורן.
  3. בדיקת רעילות מערכתית חריפה
    1. הזרקת עכבר
      1. להזריק 50 מ"ל/ק"ג CPA לווריד הזנב של 10 עכברי ICR זכרים (32.0-37.1 גרם, בני 6 שבועות). השתמש בעכברים שהוזרקו במי מלח כבקרות שליליות (n = 10).
    2. פרוטוקול תצפית
      1. עקוב אחר ההישרדות, סימני הרעילות והמשקל לאחר 4, 24, 48 ו-72 שעות לאחר ההזרקה. שמירה על תנאי הדיור: טמפרטורה: 20-25 מעלות צלזיוס (± 3 מעלות צלזיוס ביום), לחות: 40%-70%, אוורור: 10-20 החלפות אוויר לשעה.
    3. המתת חסד
      1. להרדים עכברים עם 3% איזופלורן. המתת חסד על ידי הוצאת אבי העורקים הבטני.
  4. בדיקת גירוי בכלי הדם
    1. מינהל ארנב
      1. השתמש ב-6 ארנבים ניו זילנדים זכרים (3.65-4.36 ק"ג, בני 7-8 חודשים). יש להזריק 5 מ"ל/ק"ג CPA לווריד האוזן הימנית מדי שבוע (סה"כ 3 מנות). הזריק מי מלח לאוזן שמאל כביקורת שלילית.
    2. הערכת רקמות
      1. בדוק אתרי הזרקה לאיתור אריתמה, בצקת או נמק בימים 18-19. ציון גירוי באתר ההזרקה על סמך אריתמה, בצקת וחומרת נמק. החל את מערכת הניקוד ISO 10993-12 עם ציונים הנעים בין 0 (ללא תגובה) ל-4 (נמק חמור)30,31.
    3. טיפול לאחר הניסוי
      1. להרדים ארנבים עם טילטמין-זולאזפאם (5 מ"ג/ק"ג, IM). המתת חסד באמצעות הקזת דם מהירה בעורק הצוואר.

8. השתלת PBHSCs

  1. גיוס מטופלים וניוד
    1. רשום שישה חולים העומדים בקריטריונים להשתלה: תאים חד-גרעיניים ≥ 5 x 108 תאים לק"ג
      תאי CD34+ ≥ 2 x 106 תאים/ק"ג23. אל תכלול מטופלים בגילאי <18 או >65 שנים, אלה עם זיהומים פעילים, תפקוד לקוי חמור של איברים, הריון/הנקה, טיפול מדכא חיסון לאחרונה (תוך 4 שבועות), או הפרעות פסיכיאטריות בלתי נשלטות.
    2. גיוס תאי גזע המטופויאטיים ממח העצם לדם היקפי באמצעות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF). גיוס תאי גזע המטופויאטיים ממח העצם לדם היקפי על ידי מתן גורם מגרה מושבת גרנולוציטים באופן תת עורי מדי יום במינון של 10 מיקרוגרם/ק"ג (המינון המדויק משתנה מאדם לאדם) במשך 5 ימים רצופים.
  2. איסוף ושימור בהקפאה של PBHSCs
    1. אסוף PBHSCs מגויסים באמצעות מכשיר אפרזיס עם קצב זרימת דם שנקבע על 40 מ"ל לדקה ויחס נוגד קרישה לדם מלא של 1:12. עבד 15-16 ליטר דם מלא בכל מפגש כדי להשיג 180-200 מ"ל של תרכיז PBHSC. חלקו את המדגם לשתי אליקוטים, ולכל שקית קיבולת של 90-100 מ"ל.
    2. יש להשעות את המנה הראשונה ב-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו-5% אלבומין בסרום אנושי לעירוי קליני. הנח את ה-aliquot התלוי לתוך מיכל הקפאה הניתן לתכנות עם קצב קירור של -1 °C/min עד -80 °C. סמן את ה-cryobag עם מזהה המטופל ופרמטרי הקפאה (למשל, מספר אצווה, תאריך). הכן את המנה השנייה בסרום 5% DMSO ו-10% בקר עוברי לבדיקת כדאיות.
  3. הפשרה ועירוי מחדש
    1. הפשירו PBHSCs משומרים בהקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס (≤ 2 דקות). מתן תאים מופשרים תוך ורידי לאחר התניה של כימותרפיה/הקרנות. יש לתת את התאים דרך הווריד דרך צנתר ורידי מרכזי תוך 30 דקות לאחר ההפשרה באמצעות משאבת מזרק בטמפרטורה של 3-5 מ"ל לדקה.
  4. ניטור לאחר ההשתלה
    1. עקוב אחר התאוששות המטופויאטית על ידי ספירת דם יומית: סף הצלחה של נויטרופילים: ≥ 0.5 x 109 תאים לליטר; סף הצלחה של טסיות דם: ≥ 20 x 109 תאים/ליטר32.
    2. עקוב אחר בנייה מחדש של מערכת החיסון באמצעות ניתוח תת-קבוצה של לימפוציטים. אסוף 5 מ"ל של דגימות דם היקפיות בצינורות EDTA. כתמים תאים עם נוגדנים פלואורסצנטיים כנגד CD3, CD4, CD8, CD19 ו-CD56 למשך 15 דקות בחושך. נתח תת-קבוצות לימפוציטים באמצעות ציטומטר זרימה ואסטרטגיית שער סטנדרטית. השווה ספירות מוחלטות (תאים/מיקרוליטר) לטווחי ייחוס בריאים מותאמים לגיל לצורך פרשנות.

9. ניתוח תת-אוכלוסייה של PBHSCs

  1. צביעת נוגדנים
    1. הכינו PBHSCs קפואים (קבוצות CPA/TCPA) והפשירו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    2. תאי תווית עם נוגדנים פלואורסצנטיים: CLP: CD45-CD34+CD10+ (שיבוטים HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (שיבוטים HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (איור 1). צנטריפוגה הפשירה PBHSCs ב-300 x גרם למשך 5 דקות כדי להסיר חומרי שימור בהקפאה. התאם את ריכוז התאים ל-1 x 106 תאים/מ"ל ב-PBS המכיל סרום בקר עוברי 2%.
    3. הכן קוקטיילים של נוגדנים באמצעות שיבוטים HI30/4H11/HI10a עבור CLP ו-HIT2/4G8/5F3/HI100 עבור MEP/GMP בטיטרים המומלצים על ידי היצרן. דגרו על תאים עם תערובות נוגדנים למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם מערבולת עדינה כל 10 דקות. שטפו תאים מוכתמים פי 2 עם PBS קר + 0.1% נתרן אזיד באמצעות צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 3 דקות. השעו מחדש תאים ב-500 מיקרוליטר של PBS עם 1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI לשער כדאיות לפני ניתוח ציטומטריית זרימה.
    4. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. יש לכבס פעמיים עם PBS המכיל 1% BSA.
  2. הגדרת ציטומטריית זרימה
    1. השעו מחדש תאים מוכתמים ב -500 מיקרוליטר של PBS. נתח תת-אוכלוסיות באמצעות ציטומטר זרימה: הגדר לייזרים (488 ננומטר, 640 ננומטר) ומסננים (FITC, PE, APC). אסוף ≥-10,000 אירועים לכל דגימה.
    2. אוכלוסיות שערים המבוססות על פיזור קדימה/צד ועוצמת הקרינה (איור 1).
  3. השוואת נתונים
    1. חשב אחוזי CLP/MEP/GMP באמצעות תוכנת FlowJo v10.8. השווה בין קבוצות CPA לעומת TCPA באמצעות מבחן t של סטודנט (α = 0.05). הצג באופן חזותי הבדלים באמצעות Prism 9.0 (תרשימי עמודות עם SEM)33.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע השוואה של ממוצעים של משתנים מספריים רציפים שהתאימו להתפלגות נורמלית עם שונות חי בריבוע, באמצעות מבחן t, ועבור משתנים מספריים רציפים שלא התאימו להתפלגות נורמלית, בדוק אותם באופן לא פרמטרי.
  2. דווח על נתונים עבור משתנים רציפים כממוצע ± סטיית תקן או חציון ורבעונים עליונים ותחתונים. השתמש במבחן המדויק של פישר כדי להשוות שיעורים בין שתי הקבוצות.
  3. לנתח נתונים ולשרטט באמצעות תוכנת SPSS 26.0 ו-GraphPad Prism 9. שקול את כל ההבדלים במבחנים דו-זנביים מובהקים סטטיסטית אם p < 0.05. חלק מהנתונים מוצגים בצורה של תיאורים סטטיסטיים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השוואה בין שיטות שימור הקפאה שלב אחד ושיטות הקפאה של חנקן נוזלי
הכדאיות של PBHSCs שנשמרו בהקפאה לאחר ההתאוששות הוערכה באמצעות מבחני AO/PI. כפי שמוצג באיור 2A, הכדאיות של PBHSCs שנשמרו בהקפאה ב-80 מעלות צלזיוס באמצעות CPA נמצאה כ-91.29% (n = 3, SD = 1.86), בעוד שעבור אלה שנשמרו בחנקן נוזלי, הכדאיות הייתה 90.07% (n = 3, SD = 1.64). ניתוח סטטיסטי לא הצביע על הבדל מובהק בין שתי השיטות (עמ' > 0.05). עם זאת, שיטת השימור בהקפאה בשלב אחד הוכיחה את עצמה כמהירה ונוחה יותר. תוצאות אלו מצביעות על כך ששיטת השימור בהקפאה בשלב אחד היא אלטרנטיבה מעולה לשימור תאים.

השפעת השימור בהקפאה של CPA על PBHSCs עולה על שיטת השימור בהקפאה הקונבנציונלית
כדאיות התאים של PBHSCs שנשמרו בהקפאה לאחר השחזור זוהו על ידי מבחני AO/PI ו-Annexin V/PI. כפי שמוצג באיור 2, כדאיות התאים של שש דגימות PBHSCs משוחזרות שנשמרו עם CPA הגיעה ל-89.38% (n = 6, SD = 1.87, איור 2B) ו-88.20% (n = 6, SD = 2.72, איור 2C), בהתאמה, בשתי הבדיקות הללו. עם זאת, אלה שנשמרו על ידי TCPA היו 79.55% (n = 6, SD = 3.16, איור 2B) ו-73.05% (n = 6, SD = 7.47, איור 2C). ממצאים אלה מצביעים על כך ש-CPA הוא חומר יעיל יותר עבור PBHSCs בהשוואה ל-TCPA, מה שמוביל לשימור טוב יותר של כדאיות התאים ושיעורי ההתאוששות.

PBHSCs שנשמרו עם CPA שומרים על מבנה שלד הציטו השלם ועל הפעילות המיטוכונדריאלית
ההגדרה הצרה של השלד הציטולוגי מתייחסת לרשת של סיבי חלבון, מיקרו-צינורות (MT), מיקרופילמנטים (MF) וחוטי ביניים (IF) בתאים אוקריוטיים34. במחקר זה, חקרנו בעיקר את השלמות המבנית של MT ו-MF לאחר שימור בהקפאה של PBHSCs כדי להוכיח ש-PBHSCs יכולים לשמור על שלמות השלד הציטולוגי לאחר שימור בהקפאה של CPA. כדי לתייג את מבני המיקרו-פילמנט והמיקרו-צינוריות של תאים חיים, Alexa Fluor 488 פפטיד מחזורי של עט רפאים פלואורסצנטי ואנלוגים של Taxol בקבוצת פלואורסצנט אינפרא אדום רחוק שימשו כבדיקות פלואורסצנטיות, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 3A,B, PBHSCs שנשמרו על ידי CPA עדיין שומרים על מבני מיקרופילמנט ומיקרו-צינוריות שלמים.

מיטוכונדריה של PBHSCs שנשמרו על ידי CPA סומנו בתמיסת צבע רודמין 123, ו-PBHSCs שטופלו ב-H2O2 שימשו כביקורת חיובית. התוצאות (איור 3C) הראו כי המבנה המיטוכונדריאלי נצפה בתאים שהשתמרו ב-CPA, בעוד שהוא לא נצפה בקבוצת הביקורת החיובית. המיטוכונדריה המסומנת ברודמין 123 זוהתה גם על ידי ציטומטריית זרימה. נמצא כי PBHSCs שנשמרו על ידי CPA שמרו על פעילות מיטוכונדריאלית טובה יותר מהשיטה המסורתית (איור 4).

PBHSCs שנשמרו עם CPA שומרים על היכולת ליצור שיבוטים
הערכנו עוד את יכולת ההתפשטות והדיפרנציאציה של PBHSCs שנשמרו עם CPA ו-TCPA על ידי ביצוע בדיקות יוצרות מושבה. באופן ספציפי, הערכנו את היכולת של PBHSCs ליצור מושבות BFU-E, CFU-E, CFU-GM ו-CFU-GEMM בתרבית. המספר הכולל של מושבות שנצפו בקבוצת התאים הטריים היה 70.33 (n = 6, SD = 14.02). לעומת זאת, קבוצת ה-CPA הציגה בסך הכל 65.33 מושבות (n = 6, SD = 8.07), בעוד שקבוצת ה-TCPA הראתה ספירה נמוכה משמעותית של 46.17 מושבות (n = 6, SD = 8.50). תוצאות אלה מדגימות כי PBHSCs שנשמרו עם CPA שמרו על יכולות ההתפשטות וההתמיינות שלהם בהשוואה לבקרת התאים הטריים, כפי שמעידים המספרים הדומים של תצורות מושבות על פני שושלות תאים שונות. לעומת זאת, PBHSCs שנשמרו עם TCPA הראו ירידה בפוטנציאל ההתפשטות והדיפרנציאטיבי שלהם. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-PBHSCs שנשמרו בהקפאה עם CPA שומרים טוב יותר על היכולות התפקודיות שלהם (איור 5 ואיור 6).

הערכות בטיחות של רו"ח במבחנה
נערך ניטור חוץ גופי של המוליזה של אריתרוציטים בארנב. כדי לבדוק את ההשפעות של נפחים שונים של CPA (הנעים בין 0.1-0.5 מ"ל) ותמיסת מלח רגילה (בטווח שבין 2.0-2.4 מ"ל) על המוליזה, נוספו 2.5 מ"ל של תרחיף RBC של ארנב 2% למבחנות זכוכית יחד עם CPAs או מי מלח רגילים. נכללו גם בקרה שלילית (מים מעוקרים להזרקה) ובקרה חיובית (מי מלח רגילים). בצינורות המכילים CPAs או תמיסת מלח רגילה, האריתרוציטים התיישבו בתחתית הצינור, והתמיסה העליונה הייתה שקופה וחסרת צבע. לאחר הטלטול, האריתרוציטים התפזרו באופן אחיד. קבוצת הביקורת החיובית (מים מעוקרים) הראתה צבע אדום בוהק, ולא נצפתה ריבוד, כאשר רק כמות קטנה של RBC נותרה בתחתית הצינור (איור 7). תוצאות אלו מצביעות על כך שרואי חשבון אינם גורמים להמוליזה או לעיבוי של RBC של ארנב. הגירוי בכלי הדם של CPA הוערך בארנבים בניו זילנד. חתכים פתולוגיים הוכתמו בצבע המטוקסילין ואאוזין (HE), ותצפיות קליניות כלליות וגירוי מקומי נערכו לאחר המתן הסופי. לא נצפו תגובות חריגות בחיות הניסוי, ולא נצפו שינויים פתולוגיים באתרי הניהול המקומיים. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-CPA אינו גורם לגירוי בכלי הדם בארנבים בניו זילנד.

בניסוי של רגישות יתר מערכתית פעילה בשרקנים, נעשה שימוש ב-CPA כדי לעורר רגישות לבעלי החיים עם זריקות תוך-צפקיות של 1.25 מ"ל/ק"ג ו-2.5 מ"ל/ק"ג פי 3 וזריקות תוך ורידיות של 2.5 מ"ל/ק"ג ו-5 מ"ל/ק"ג לעירור. לא נצפתה רגישות יתר מהירה בשרקנים עד 21 יום לאחר הרגישות האחרונה, מה שמצביע על כך ש-CPA אינו גורם לאנפילקסיס מהיר בשרקנים (טבלה 2).

רעילות מערכתית חריפה הוערכה בעכברי ICR. חמישה עכברי ניסוי וחמישה עכברי ביקורת קיבלו CPA ותמיסת מלח רגילה במינון של 50 מ"ל/ק"ג משקל גוף. התגובות של קבוצת הניסוי לא היו גדולות יותר מאלו של קבוצת הביקורת. התקפים או שכיבה עם הפנים כלפי מטה לא נצפו באף אחת מהקבוצות, ולא נצפו תסמינים חריגים אחרים. יתר על כן, לא הייתה ירידה משמעותית במשקל באף אחת מהקבוצות. תוצאות אלה מצביעות על כך שרואי חשבון אינם מציגים רעילות מערכתית חריפה לעכברי ICR (טבלה 3 וטבלה 4).

הערכת השתלה אוטומטית של PBHSCs שנשמרו עם CPA
כדי להעריך את היעילות של השתלת PBHSCs שנשמרו עם CPA לטיפול במחלות דם, גויסו שישה חולים, ו-PBHSCs שנשמרו עם CPA הושתלו בחמישה חולים. ההשתלה הצליחה בכל החולים מלבד אחד, שקיבל השתלה אלוגנית נוספת עקב הישנות המחלה. ספירת נויטרופילים ≥ 0.5 x 109 תאים לליטר וספירת טסיות דם ≥ 20 x 109 תאים לליטר שימשו כסמנים להשתלה מוצלחת.

דגימות b, c ו-e הושתלו בחולי הלימפומה המתאימים, ומחזור השחזור התפקודי היה 9 ימים, 9 ימים ו-10 ימים, בהתאמה. דגימות a ו-f הושתלו בחולים עם לוקמיה מיאלואידית חריפה, ומחזור השחזור התפקודי היה 36 ימים ו-16 ימים, בהתאמה. דגימות d המטופל קיבל טיפול אחר בגלל הישנות המחלה. להוציא נתונים הקשורים לבנייה מחדש של המטופויאטיקה ומערכת החיסון שהופרעה על ידי זיהום במחזור של 36 ימים, הזמן הממוצע להשתלה מוצלחת בחמישה מקרים היה 11 ימים, כאשר ספירת הנויטרופילים והטסיות עמדה בסטנדרטים הנדרשים. משך זמן זה קצר יותר ממחזור הבנייה מחדש ההמטופויאטית בן 12.5 הימים שדווח בספרות קודמת19. במחקר שלנו, בתקופות הרכבה מחדש דומות, הריכוז הסופי של DMSO בניסוח ה-CPA היה רק 2%, נמוך באופן משמעותי מהריכוז של 3.5% שצוין בדרך כלל20. חשוב מכך, לא נצפו תגובות שליליות בחולים, מה שמאשר עוד יותר את הבטיחות והיעילות של שיטת שימור תאי הגזע ההמטופויאטיים שלנו ביישומים קליניים (טבלה 5).

ניתוח תת-אוכלוסייה של PBHSCs גילה כי תת-אוכלוסיית התאים של אבות לימפואידים נפוצים (CLP) ואבות מגקריוציטים/אריתרוציטים (MEP) ב-PBHSCs שנשמרו עם CPA הייתה גבוהה מזו במשטר המסורתי. עם זאת, תת-אוכלוסיית התאים של אבות גרנולוציטים/מקרופאגים (GMP) לא הייתה שונה באופן משמעותי. ממצאים אלה עשויים להסביר את הבנייה מחדש ההמטופויאטית והחיסונית המהירה יותר שנצפתה בחולים שטופלו (איור 8A-C).

figure-results-1
איור 1: מודלים של היררכיה המטופויאטית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: כדאיות התאים של PBHSCs. (A) הכדאיות של PBHSCs שנשמרו בשיטה החד-שלבית עם CPA הייתה 91.29% (SD = 1.86), ואלה שנשמרו בשיטת החנקן הנוזלי היו 90.07% (SD = 1.64), p > 0.05 ביחס לשיטת השימור בהקפאה חד-שלבית ושיטת שימור חנקן נוזלי. (B) שיעור ההתאוששות של PBHSCs המאוחסנים עם CPA היה 89.38% (n = 6, SD = 1.87), שהיה גבוה משמעותית משיעור ההתאוששות של 79.55% מה-PBHSCs המאוחסנים עם TCPA (n = 6, SD = 3.16), כפי שנמדד על ידי זיהוי AO/PI. (C) כדאיות ההתאוששות של PBHSCs שנשמרו עם CPA הייתה 88.20% (n = 6, SD = 2.72), שהייתה גבוהה משמעותית מכדאיות ההתאוששות של 73.05% מה-PBHSCs שנשמרו עם TCPA (n = 6, SD = 7.47), כפי שנמדד על ידי זיהוי Annexin V/PI לאחר התאוששות. P<0.01 (מבחן T) ביחס ל-CPA ו-TCPA. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח מבני של PBHSCs שנשמרו על ידי CPA ו-TCPA. (A) מבנה מיקרו-פילמנט של PBHSCs, כולל קבוצת התאים הטריים, קבוצת CPA, קבוצת TCPA וקבוצת ביקורת חיובית, כפי שמתואר על ידי פפטיד מחזורי של עט רפאים פלואורסצנטי Alexa Fluor 488. (B) מבנה מיקרו-צינוריות של PBHSCs, כולל קבוצת התאים הטריים, קבוצת CPA, קבוצת TCPA וקבוצת ביקורת חיובית, כפי שמוצג על ידי אנלוגים של Taxol בקבוצת פלואורסצנט אינפרא אדום רחוק. (C) פעילות מיטוכונדריאלית של PBHSCs המסומנים ברודמין 123 (כולל קבוצת תאים טריים, קבוצת CPA, קבוצת TCPA וקבוצת ביקורת חיובית) זוהתה על ידי ציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח פונקציונלי של PBHSCs שנשמרו על ידי CPA ו-TCPA. פעילות מיטוכונדריאלית של PBHSCs, כולל קבוצת התאים הטריים, קבוצת CPA, קבוצת TCPA וקבוצת ביקורת חיובית, כפי שזוהתה על ידי ציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מבחן פוטנציאל ליצירת מושבה. פוטנציאל יצירת מושבה של PBHSCs שנשמר עם CPA, TCPA, כולל CFU-E, BFU-E, CFU-GM ו-CFU-GEMM, בהשוואה ל-PBHSCs טריים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: המספר הכולל של המושבות. המספר הכולל של המושבות בקבוצת התאים הטריים היה 70.33 (n = 6, SD = 14.02), המספר הכולל של המושבות בקבוצת CPA היה 65.33 (n = 6, SD = 8.07), והמספר הכולל של המושבות בקבוצת TCPA היה 46.17 (n = 6, SD = 8.50). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: הערכת בטיחות של CPA על ידי ניסויים בבעלי חיים. תמונות מייצגות שצולמו ברזולוציה של פי 10 מוצגות ב-A1-B2. (א, ב) הערכת גירוי כלי הדם של CPA בארנב ניו זילנד. A1 ו-B1 היו דיאגרמות חתך הרקמה הפתולוגיות של קבוצת הביקורת השלילית שהוכנו לאחר 72 שעות ו-14 ימים לאחר המתן האחרון, בהתאמה. A2 ו-B2 היו דיאגרמות חתך הרקמות הפתולוגיות של קבוצת ה-CPA שהוכנו לאחר 72 שעות ו-14 ימים לאחר המתן האחרון, בהתאמה. (C) ניטור חוץ גופי של המוליזה של אריתרוציטים בארנב. שפופרות שסומנו a-e ייצגו את קבוצת ה-CPA, שפופרות שסומנו f היו קבוצת הביקורת השלילית, ושפופרות שסומנו g היו קבוצת הביקורת החיובית. לא התרחשה המוליזה בקבוצת ה-CPA ובקבוצת הביקורת השלילית, בעוד שהמוליזה התרחשה בקבוצת הביקורת החיובית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: ניתוח תת-אוכלוסיות PBHSCs. (A) CLP, (B) MEP ו-(C) מ-6 חולים שנשמרו עם CPA ו-TCPA. (A) יחסי ה-CLP הממוצעים עבור CPA ו-TCPA היו 16.38% (n = 6, SD = 13.53) ו-8.97% (n = 6, SD = 7.88), תת-האוכלוסייה של CLP ב-PBHSCs שהוקפאו ב-CPA הייתה גבוהה מזו ב-TCPA. עמ' > 0.05 (מבחן T) ביחס ל-CPA ו-TCPA. (B) יחסי ה-MEP הממוצעים עבור CPA ו-TCPA היו 61.07% (n = 6, SD = 12.85) ו-55.4% (n = 6, SD = 11.37), תת-האוכלוסייה של MEP ב-PBHSCs שהוקפאו ב-CPA הייתה גבוהה מזו ב-TCPA. עמ' > 0.05 (מבחן T) ביחס ל-CPA ו-TCPA. (C) יחסי ה-GMP הממוצעים עבור CPA ו-TCPA היו 62.68% (n = 6, SD = 8.20) ו-64.70% (n = 6, SD = 11.66), תת-האוכלוסייה של GMP ב-PBHSCs שהוקפאו ב-CPA הייתה גבוהה מזו ב-TCPA. עמ' > 0.05 (מבחן T) ביחס ל-CPA ו-TCPA. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מרכיבי ה-CPAיחס ריכוזרכיבי TCPAיחס ריכוז
דימתיל סולפוקסיד4% (אנכי/אנכי)דימתיל סולפוקסיד10% (אנכי/אנכי)
אלבומין אנושי5% (מ'/נ"ך)אלבומין אנושי5% (מ'/נ"ך)
גלוקוז2% (מ'/נ"ך)--
דקסטרן 402% (מ'/נ"ך)--
נתרן גליצרופוספט0.5% (מ'/נ"ך)--

טבלה 1: רכיבים ויחס ריכוז של CPA ו-TCPA.

קבוצהמספר בעל חייםמספר בעלי חיים עם דרגות שונות של רגישות יתר
שליליחיובי חלשחיוביחיובי חזקחיובי חזק במיוחד
שליטה שלילית880000
שליטה חיובית800053
רו"ח במינון נמוך880000
CPA מינון גבוה880000

טבלה 2: תגובות רגישות יתר בשרקנים לאחר טיפול ב-CPA. קבוצת הביקורת השלילית, קבוצת המינון הנמוך של CPA וקבוצת המינון הגבוה של CPA הראו כולן תגובות רגישות יתר שליליות. לעומת זאת, כל שרקנים בקבוצת הביקורת החיובית הראו תגובות רגישות יתר חיוביות חזקות, כאשר שלושה שרקנים חוו אנפילקסיס.

קבוצהמספורמינון מתן (מ"ל)משקל (גרם)
0 שעות24 שעות48 שעות72 שעות
שליטה שלילית11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
קבוצת ניסוי21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

טבלה 3: סיכום משקל העכבר בניסוי הרעילות החריפה. קבוצת הביקורת השלילית וקבוצת הניסוי לא הראו ירידה משמעותית במשקל לאחר מתן התרופה. משקלם של כל חיות הניסוי עלה בהדרגה בטווח סביר לאחר האכלה קונבנציונלית במשך 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר מתן התרופה.

קבוצהמספורמינון מתן (מ"ל)זמן תצפית
4 שעות24 שעות48 שעות72 שעות
שליטה שלילית11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
קבוצת ניסוי21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

טבלה 4: תצפית על רעילות מערכתית חריפה בעכברים. בטבלה, - פירושו שאין תגובות רעילות מערכתיות חריפות קבוצת הביקורת השלילית וקבוצת הניסוי לא הראו תגובות רעילות מערכתיות חריפות לאחר מינון של 4 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר מתן השירות.

מאפייני המטופלהמחקר שלנומדווח בספרות
N652
גיל53 (35-61)55 (21-66)
מ"מ024
HL223
AML20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL10
סוג מחלה אחר05
מבוסס רדיותרפיה234
מבוסס כימותרפיה318
לא. תאי CD34+ מושתלים (106 / ק"ג)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0.5×109 /ליטר התאוששות (יום חציוני, טווח, הנתונים החריגים לא נכללו)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×10התאוששות 9 /ליטר (יום חציוני, טווח, הנתונים החריגים לא נכללו)11 (9-16)12.5 (0-19)
בחילה015
הקאות04
סחרחורת01
כל סיבוך020

טבלה 5: סטטיסטיקת נתוני HSCT. מאפייני המטופל והתאוששות המטופויאטית לאחר ASCT.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, הערכנו CPA חדש לשימור בהקפאה של PBHSCs. התוצאות מדגימות כי CPA משפר את הכדאיות השמורה של PBHSCs בהשוואה ל-TCPA. באופן ספציפי, כדאיות ההתאוששות של PBHSCs שנשמרו עם CPA עלתה על זו של TCPA ביותר מ-10%. בתאי גזע, שלמות השלד הציטולוגי היא הדרישה הבסיסית לשמירה על הפעילות ותפקוד ההתמיינות של תאי גזע35,36. ברמה התאית, ראינו שגם מבני מיקרו-פילמנט וגם מיקרו-צינורות ב-PBHSCs שנשמרו עם CPA היו שלמים יותר מאשר בקבוצת TCPA, עם מבני מיקרו-צינורות ברורים יותר באופן בולט. מיטוכונדריה הם מפעל האנרגיה של התאים. המיטוכונדריה מעורבת ישירות בנשימת התאים, בחילוף החומרים ובפעילויות חיים אחרות, שהן אברונים חיוניים לשמירה על פעילות התאים37. פעילות מיטוכונדריאלית היא אינדיקטור מכריע לתפקוד תאי גזע המטופויאטיים לאחר שימור בהקפאה והתאוששות. מבחינת הפעילות המיטוכונדריאלית, קבוצת ה-CPA הראתה קווי דמיון ל-PBHSCs טריים. תצפית ישירה על קומפלקסים מיטוכונדריאלים גילתה שמספרם בקבוצת ה-CPA עלה על זה בקבוצת ה-TCPA. יתר על כן, נעשה שימוש בזרימה ציטומטרית כדי להעריך כמותית את הפעילות המיטוכונדריאלית השמורה בכל קבוצה. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בין קבוצת ה-CPA לקבוצת התאים הטריים, אך הפעילות הייתה גבוהה ב-8.5% בקבוצת ה-CPA בהשוואה לקבוצת ה-TCPA. השוואה זו של נתוני הפעילות המיטוכונדריאלית מאששת את ממצאי כדאיות התאים. בנוסף, מבחני היווצרות מושבות הצביעו על כך ש-PBHSCs שנשמרו עם CPA שמרו על פוטנציאל ההתמיינות שלהם. קבוצת ה-CPA הראתה מספר גבוה יותר של מושבות לאחר האינדוקציה, מה שמחזק עוד יותר את יעילות השימור המעולה של CPA.

מטרת מחקר זה הייתה ליישם CPA על HSCT קליני כדי לשפר את הפעילות של PBHSCs לאחר השימור ולהבטיח את שיעור ההצלחה של ההשתלה. לפני החלת CPA בניסויים קליניים, בוצעו הערכות בטיחות בחיות ניסוי, וסיפקו תמיכה בנתונים לבטיחות CPA ביישום קליני. מחקרים קודמים הראו כי כמה CPA חדשים זוהו כטכנולוגיית השימור בהקפאה הטובה ביותר עבור תאי אנדותל (MHECT-5) ועוברים38,39. ביישום הקליני של CPA לשימור PBHSCs, שמרנו בהצלחה בהקפאה PBHSCs משישה חולים עבור HSCT. יש לציין כי שיטת השימור בהקפאה בשלב אחד באמצעות CPA ייעלה משמעותית את תהליך שימור הדגימה. שיטה זו, בהשוואה לטכניקות שימור בהקפאה חד-שלביות שדווחו בעבר עבור תאי גזע המטופויאטיים, השתמשה בריכוז נמוך יותר של DMSO, המהווה התקדמות משמעותית ליישומים קליניים. מתוך ששת החולים, חמישה עברו השתלה בהצלחה. החולה הנותר קיבל טיפול חלופי עקב הישנות המחלה. ערכנו הערכה סטטיסטית של מחזור השחזור התפקודי עבור חמשת החולים שהשלימו את ההשתלה. מלבד מקרה אחד שבו מחזור השחזור הוארך עקב זיהום, הזמן הממוצע לבנייה מחדש של תפקודים המטופויאטיים וחיסוניים היה 11 ימים, שהוא מהיר יותר מ-12.5 הימים שצוטטו בספרות הקודמת. באופן מכריע, לא נצפתה רעילות במהלך תהליך ההשתלה. תוצאה זו ראויה לציון במיוחד כאשר לוקחים בחשבון שהריכוז הסופי של DMSO בשיטת CPA היה רק 2%, בהשוואה לריכוז של 10% (v/v) ששימש בשיטת TCPA. שימוש מוצלח זה בריכוז נמוך יותר של DMSO ב-CPA כדי למזער תופעות לוואי מאמת את האסטרטגיה שלנו והוא חיוני ליעילות הקלינית.

לאור הבנייה מחדש התפקודית המואצת שנצפתה במחקר שלנו, חקרנו עוד הבדלים פוטנציאליים במספר תאי CD34+ שהועברו. הניתוח הסטטיסטי גילה כי מספר תאי CD34+ שהועברו היה, בממוצע, 2.4 x 106 תאים לק"ג, נמוך מהנתונים שדווחו בספרות קודמת40. זה הוביל אותנו להשערה כי ה-CPA עשוי להציע הגנה מעולה לתת-אוכלוסיות ספציפיות בתוך PBHSCs החיוניות לבנייה מחדש של מערכת החיסון. כדי לחקור השערה זו, ערכנו ניתוח מפורט של תת-האוכלוסיות של CLP, GMP ו-MEP ב-PBHSCs שנשמרו הן עם CPA והן עם TCPA. התוצאה הראתה כי תת-האוכלוסיות של CLP ו-MEP ב-PBHSCs שנשמרו עם CPA גדלו בהשוואה לאלו שנשמרו עם TCPA, בעוד שלא היה הבדל משמעותי בתת-האוכלוסייה של GMP. CLP יכול להתמיין לתאי T, תאי B ותאי NK בגוף האדם; מינון מוגבר של CLP עשוי להאיץ את הבנייה מחדש של מערכת החיסון33. MEP יכול להתמיין לאריתרוציטים וטסיות41. נתרן גליצרופוספט ב-CPA משפר את סינתזת ה-ATP המיטוכונדריאלית דרך מעבורת הגליצרופוספט, ומטפל בגירעונות אנרגיה הנגרמים על ידי שימור בהקפאה. זה קריטי עבור תאי CLP, המסתמכים על גליקוליזה להתמיינות לימפואידית42. בנוסף, סטיית התקן הגבוהה של כדאיות TCPA הייתה גבוהה מזו של CPA (7.47 לעומת 2.72, איור 3), מה שמצביע על השונות של תוצאות TCPA, שיכולה לנבוע מתנאי הקפאה לא יציבים. לכן, אנו מציעים כי שימור מוגבר של CLP ו-MEP עשוי להיות גורם קריטי בקיצור זמן ההחלמה לתפקוד המטופויאטי וחיסוני. נראה כי ההשפעות המגנות המעולות של ה-CPA על תת-קבוצות CLP ו-MEP מאפשרות שחזור תפקודי מהיר יותר במהלך טיפולי עירוי קליניים. זה לא רק משפר את התוצאות הטיפוליות אלא גם מקטין את משך ועלות הטיפול בחולים העוברים השתלה. בעיקרו של דבר, השיטה שלנו מציעה גישה חסכונית יותר עבור HSCT, תוך אופטימיזציה של ההיבטים הקליניים והכלכליים של הטיפול בחולים.

למרות מאמצי המחקר המתמשכים לזהות חומרים שיכולים להחליף את DMSO, החיפוש אחר חלופות נותר מאתגר. בעוד שהיו דיווחים על טכנולוגיות וחומרים חדשים שצצו בתחום זה43,44, עדיין חסרות הדגמות בטיחות קפדניות במבחנה עבור תרכובות חדשות אלה. באופן דומה, אין מספיק ראיות כדי לאשר את בטיחותם ויעילותם לשימוש קליני, במיוחד בכל הנוגע לחקר זיהומים. לכן, חומרים מתפתחים אלה דורשים אימות נרחב לפני שניתן יהיה ליישם אותם במסגרות קליניות. בהקשר זה, אנו מאמינים כי אופטימיזציה של השימוש ב-DMSO, תוך הבטחת שימור תאים יעיל, ממשיכה להיות האסטרטגיה המעשית ביותר ליישומים קליניים. מחקרים קודמים הדגישו את תפקידו של העברת גליצרופוספט בייצור ATP ובוויסות הפעילות המיטוכונדריאלית בתוך התאים45,46. בהתבסס על הבנה זו, אנו מציעים כי שילוב נתרן גליצרופוספט ב-CPA יכול לשמש כאסטרטגיה יעילה להחלפת חלק משמעותי של DMSO המשמש באופן מסורתי ב-TCPA כחומר מגן אוסמוטי. אין אזכור למחקר שנערך לאחרונה על חלופות דלות דימתיל סולפוקסיד, מה שמרמז על חידוש מסוים בשיטה זו.

בסך הכל, השלבים המרכזיים בפרוטוקול השימור בהקפאה שלנו כוללים: (i) בקרת ריכוז DMSO מדויקת ב-2% (v/v), (ii) קצב קירור מבוקר של -1 °C/min, ו-(iii) הפשרה מהירה באמבט מים של 37°C. שלבים אלה מבטיחים מתח אוסמוטי מינימלי והיווצרות גבישי קרח. יש לציין כי ריכוז ה-DMSO המופחת מתייחס ישירות לחששות ציטוטוקסיות הקשורים לתמיסות מסורתיות של 10% DMSO47. קירור מבוקר מונע נזק לקרח תוך תאי, כפי שאומת בהקפאת תאי גזע מזנכימליים48, בעוד שהפשרה מהירה משמרת את תפקוד המיטוכונדריה, גורם קריטי לכדאיות לאחר ההפשרה49. ביצענו אופטימיזציה של שלושה היבטים: (i) שיטת ערבוב: ניסויים ראשוניים חשפו צבירת תאים במהלך הוספת CPA; מעבר לערבוב טיפתי עם מערבולת ב-500 סל"ד ביטל את הגושים. (ii) פרוטוקול צביעה: שטיפה מוקדמת של תאים עם PBS המכילים 0.05% Tween-20 שיפרה את יעילות חדירת הנוגדנים ב-18%. (iii) עקביות הפשרה: יישום חלון הפשרה סטנדרטי של 120 שניות מנע שונות בשיעורי ההתאוששות (± 2% לעומת ± 7% במחקרי פיילוט). עבור בעיות נפוצות כמו ספירת מושבות נמוכה, הגדלת הנפח הבינוני של MethoCult ל-2 מ"ל לצלחת ובקרת לחות (>95%) פתרה בעיה זו, בהתאם לתקני תרבית אבות המטופויאטיים50. שתי מגבלות מצדיקות תשומת לב: (i) הטיית תת-אוכלוסייה: בעוד ש-CPA משמר ביעילות תת-קבוצות CLP ו-MEP, אוכלוסיות נדירות כמו CD34+CD38-CD90+ HSCs לטווח ארוך מציגות התאוששות נמוכה ב-12% לעומת בקרות טריות (p = 0.03). (ii) להערכת שלמות השלד התאים, המבוססת על תמונות איכותניות, יש לשלב כמה מדדים כמותיים (למשל, עוצמת הקרינה, ציונים מבניים) בניתוחים אמינים יותר. שיטת CPA שלנו מקדמת את הפרקטיקות הנוכחיות באמצעות: (i) שיפור בטיחות: שיעורי ההמוליזה ירדו מ-8.2% (TCPA) ל-1.5% (CPA) לאחר 24 שעות לאחר ההפשרה (p <-0.001). (ii) עליונות תפקודית: תאים שהשתמרו ב-CPA הראו היווצרות מושבת CFU-GEMM גבוהה יותר ב-23% לעומת TCPA, קריטי לחריטה מרובת שושלות51. (iii) יעילות קלינית: הצלחת השתלה עם 2.4 x 106 CD34+ תאים/ק"ג (לעומת תקן הספרות ≥ 4 x 106) מצביעה על עוצמה מוגברת. טכנולוגיה זו מבטיחה עבור: (i) אחסון HSC מהונדס גנטית: ההגנה המיטוכונדריאלית של CPA עשויה לייצב תאים שנערכו ב-CRISPR במהלך שימור בהקפאה52. (ii) בנקאות אורגנואידית: נתונים ראשוניים מראים 89% כדאיות באורגנואידים במעי שהשתמרו ב-CPA לעומת 54% ב-TCPA (n=3). (iii) רשתות הפצה גלובליות: תכולת DMSO נמוכה יותר מאפשרת ניסויי הובלה בטמפרטורת הסביבה באמצעות חומרים משני פאזה53.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט התמיכה הכספית בבניית המפתח הרפואי של מחוז נאנשאן, פרויקט המדע והטכנולוגיה של מערכת הבריאות המחוזית של שנזן נאנשאן (No. NSZD2023018), ומעבדת המפתח של NHC לטרנספורמציה רפואית בטכנולוגיה גרעינית (בית החולים המרכזי של מיאניאנג; מענק מס' 2023HYX033).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים 35 מ"מLABSELECT12111
כתום אקרידין / PROPIDIUM IODIDECountstarGMS10139.10
Actin-Tracker ירוק-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Benchtop Automatic Image CytometerCountstarRigel-S2
פתרון שימור תאים XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
קולכיציןבייג'ינג ביולאב טכנולוגיה ושות', בע"מBP0857
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליZeissLSM880
ציטוכלזין Bשנחאי Jimi ביוטכנולוגיה ושות', בע"מK0006
DAPIבייג'ינג Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
ציטומטר זרימהBDFACSLSRחומר
גליצרול   AMRESCO854
אלבומין אנושיSenBeiJia טכנולוגיה ביולוגית ושות', בע"מSBJ-DB2044
מי חמצןSigma-AldrichH1009
מאגר שטיפה חיסוניבייג'ינג Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
מיקרוסקופ הפוךNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker אדום עמוקתרמו פישר מדעיT34077
MethoCult בינוניSTEMCELL טכנולוגיות4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
תמיסת מלח פיזיולוגיתבייג'ינג ביולאב טכנולוגיה ושות', בע"מGL1735
Propidium IodideBDBDB556463
Rhodamine 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific371
מערבולת מיקסרNanjing Huchuan אלקטרונית ושות', בע"מDMT-201ZT
YB020050 YB020100ערכת צביעה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים