מאמר שיטה

מוטגנזה חצי אקראית המושרה באור כחול על DNA אקסוגני ספציפי בזן Escherichia coli BL21

692 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68283

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול המתואר מתאר שיטות יעילות לזיהוי כל DNA אקסוגני תוך יצירת מוטציות רק על אותם DNA אקסוגני ב-Escherichia coli.

תקציר

טכנולוגיות מוטגנזה היו בשימוש נרחב בגידול וריאציות, אבולוציה מכוונת והנדסת חלבונים. עם זאת, רוב השיטות יכולות לגרום רק למוטציות DNA גנומיות אקראיות שאינן ניתנות לשליטה, מה שמוביל לעיוותים או אפילו להשפעות קטלניות. כאן, על ידי מינוף המיזוג של שלוש מערכות: עורך בסיס ציטוזין (CBE), יסודות p-Mag/n-Mag המושרים באור כחול, ופולימראז RNA מפוצל T7, שיטה מתוארת זו משלבת מערכת מוטגנזה חצי אקראית הניתנת לשליטה באור כחול, ספציפית לאזור DNA.

מערכת זו יכולה להפוך ציטוזין לתימין ב-DNA החל ממקדם T7 וכלה בסיום T7. כל גן אקסוגני במורד הזרם של מקדם T7 יכול להיות מוטציה. כלים אלה תוכננו גם בשני חלקים כדי להפוך את המערכת לניתנת לשליטה באור כחול. החלק הראשון נוצר על ידי מיזוג CBE עם n-Mag וגן N-terminal-T7 RNA פולימראז. החלק השני כלל היתוך p-Mag עם פולימראז C-terminal-T7 RNA. תחת אור כחול, שני החלקים הללו הורכבו כדי לתפקד כמחולל מוטציות על DNA בין מקדם T7 לסיום T7. ללא אור כחול, p-Mag מנותק מ-n-Mag, ומשחרר את ה-CBE מעריכת ה-DNA.

מטרת פרוטוקול זה היא ליצור מוטציות אקראיות ספציפיות לאזור ב-Escherichia coli עם בקרת אור כחול ולאמת עוד יותר את הפלסמידים המוטנטיים. ניתן להתאים את המערכת למערכת אבולוציה in vivo שבה ניתן לבחור את הפונקציה של הגן המעניין, ולאסוף את המוטציות הרצויות למחקר נוסף.

מבוא

מוטציות אקראיות וברירה טבעית הם כוחות המפתח המניעים את האבולוציה, שיצרה שונות גנטית גדולה בין מינים. התהליך האבולוציוני שימש ככלי רב עוצמה להנדסת חלבוניםעם פונקציות אופטימליות או חדשות. שיעורי המוטציות הטבעיות משכפול ה-DNA הוערכו כ-1ל-10 9 בסיסים לחלוקת תא במספר פרוקריוטים ואיקריוטים2. שיעורי מוטציות טבעיים נמוכים הופכים את זה לבלתי מעשי לייצר מגוון גנטי גדול במעבדות. המחקרים התמקדו בפיתוח שיטות המגבירות את שיעורי המוטציות כדי לכסות כמה שיותר אתרים בגן נתון תוך פרק זמן סביר.

מערכות מרובות פותחו כדי להשיג שיעורי מוטציות גבוהים יותר במחקרי אבולוציה במעבדה 3,4,5,6,7,8,9,10. מערכות אבולוציה במבחנה ממנפות PCR מועד לשגיאות, מוטגנזה רוויה מכוונת אתר או עיצוב ספרייה חישובית כדי להציג מוטציות בגנים מעניינים1. ספריות הדנ"א הופכות לתאים מארחים שבהם תוצרי החלבון נבדקים או נבחרים. שלבי המוטגנזה והברירה באבולוציה במבחנה אינם מחוברים, מה שמגביל את היעילות וההיקף של האוכלוסיות שניתן לייצר11. מערכות אבולוציה in vivo התגברו על המגבלות על ידי הכנסת מערכות מוטציות לתאים וצימוד שלבי המוטגנזה והברירה כדי לאפשר אבולוציה מתמשכת. שיטות מוטגנזה מוקדמות יותר השתמשו במוטגנים כימיים 3,4 וזני מוטטורים 5,6. עם זאת, שיטות אלו סובלות משיעורי מוטציות נמוכים, חוסר שליטה וספקטרום מוטציות צר או לא אחיד12. מחקרים אחרונים פיתחו מערכות אבולוציה חדשות ומשופרות in vivo, המיוצגות על ידי OrthoRep, מערכת שכפול DNA אורתוגונליתמועדת לשגיאות 7,8; MutaT7, מיזוג של ציטידין דאמינאז ל-T7 RNA פולימראז9; ו-EvolvR, מיזוג של ניקאז Cas9 ל-DNA פולימראז10 הנוטה לשגיאות. לשיטות אלו יש תאי מארח שונים, הקשר יעד וקלות יישום.

T7 RNA פולימראז (T7 RNAP), מרכיב מרכזי במערכת MutaT7, נחקר והונדס בהרחבה בתחום הביולוגיה הסינתטית. שברים של T7 RNAP באו לידי ביטוי ברמות שונות בנקודות זמן שונות כדי לבנות מקצה משאבים13. RNAP T7 מפוצל עם שברי מסוף C בעלי ספציפיות מקדם שונה נבנה כדי ליצור שער לוגי AND14. היכולת של שברי T7 RNAP להרכיב מחדש פולימראז פונקציונלי הובילה לפיתוח חיישנים ביולוגיים המופעלים על ידי אור ומולקולות קטנות כאשר דימריזציה של שותפי אינטראקציה התמזגו לכל אחד ממסופי ה-N וה-C של T7 RNAP מייצרת פלט שעתוק15. ה-T7 RNAP המפוצל התמזג גם לתחומי n-Mag ו-p-Mag כדי לבנות בקרת ביטוי גנים הניתנת להשראת אור ב-Escherichia coli16. עם הפעלת האור הכחול, תחומי המגנט מתעמעמים, ומביאים שני תחומים של ה-T7 RNAP המפוצל קרוב מרחבית כדי לבצע פונקציית פולימראז. מערכת זו מאפשרת בקרה מרחבית-זמנית מדויקת של ביטוי גנים עם ביטוי בסיסי נמוך וטווח דינמי גדול.

מאמר זה מציג פרוטוקול לבניית מערכת מוטגנזה אקראית למחצה הניתנת לשליטה באור כחול (איור 1). הוא בנוי על rAPOBEC1 deaminase המותך ל-n-Mag-N-T7 RNAP. ביטוי משותף של p-Mag-C-T7 RNAP מאותו פלסמיד מאפשר בקרת אור כחול של הפולימראז ופעילויות עריכת הבסיס. המערכת משלבת את יכולת העריכה הבסיסית של rAPOBEC1 עם T7 RNAP מפוצל מבוקר אור. הוא אומת ב-E. coli באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כגן המטרה שבו עוצמתו נבחרת על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS). בהשוואה למערכת MutaT7 המקורית, המערכת מבוקרת האור הכחול שלנו מציגה מוטציות אקראיות למחצה בגן המטרה על ידי אפנון מרווח האור. במקום להמיר את כל הציטוזין לבסיסי אורציל בגן המטרה, הוא מייצר פרופיל מוטציה גדול יותר על ידי עריכת תת-קבוצה של הנוקלאוטידים באמצעות בקרת אור. ניתן להתאים את המערכת בקלות למערכת אבולוציה in vivo שבה ניתן להחליף את ה-GFP בגנים אחרים מעניינים וניתן לבחור את הפונקציה על ידי כושר התא או הישרדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לבצע תכנון מוטגנזה אקסוגנית של DNA באמצעות מערכת מוטגנזה פולימראז CBE-Mag-T7 (שלב 1). לאחר בניית פלסמיד ה-DNA האקסוגני, מתוארים שלבים לטרנספורמציה של שני הפלסמידים לביטוי מוטגנזה של פולימראז CBE-Mag-T7 בזן E. coli BL21 על ידי הוספת איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ואחריו הקרנה באור כחול המאפשר את המוטגנזה (שלבים 2-9.2). שלבי בקרת האיכות להערכת מספר המוטציות שנוצרו ב-GFP או ב-DNA אקסוגני בוצעו באמצעות ריצוף סנגר (שלבים 9.3-11.2).

1. לתכנן DNA אקסוגני ולבנות את מערכת המוטגנזה של פולימראז CBE-Mag-T7

  1. מצא את ריצוף ה-DNA או ה-cDNA האקסוגני באמצעות כלים מקוונים (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene או https://www.uniprot.org/).
    הערה: כאן, השתמשנו ברצף GFP כ-DNA אקסוגני למוטגנזה של ציטוזין.
  2. החלף את ה-DNA של gfp ב-DNA המעניין באמצעות ערכת שיבוט מתאימה.
    הערה: אנו משתמשים ב-NheI כדי להסיר את ה-DNA של gfp בפלסמיד המקורי בערכת הרכבת מושבת DNA. אלטרנטיבה היא לעבוד עם חברות לסינתזת ה-DNA. ראה משלים file 1 לרצף פלסמיד.
  3. לסנתז את כל הגנים יחד עם מערכת המוטגנזה של פולימראז CBE-Mag-T7 ולשלב אותם בעמוד השדרה של pET-11a עם עמידות לאמפיצילין.
    הערה: עבדנו עם חברת סינתזת DNA כדי לבנות את הפלסמיד הזה, והשגנו חיידקי מלאי גליצרול המכילים את פלסמיד המטרה שלנו.

2. הפעלת זן חיידקים

  1. פיפטה 10 מיקרוליטר של חיידקי מאגר הגליצרול על קצה צלחת אגר LB המכילה 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. פס את החיידקים מנקודה זו על פני הצלחת באמצעות לולאה סטרילית.
  2. דגרו את הצלחת הפוכה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחממת חיידקים.

3. הגברת פלסמיד

  1. בחר מושבה בודדת מהצלחת וחסן אותה לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל עם 15 מ"ל של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
  2. מניחים את התרבית בחממה רועדת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד למשך 14-16 שעות.

4. מיצוי פלסמיד

  1. קח 5-15 מ"ל מתרבית החיידקים הלילה והעביר אותה לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה במשקל 18,894 × גרם למשך דקה.
  2. אסוף את כדור החיידקים והסר בזהירות את כל הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה החיידקית ב-500 מיקרוליטר של מאגר השעיה מחדש על ידי מערבולת או פיפטינג.
  3. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור, ערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור פי 8-10, ותן לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לליז את התאים.
    הערה: אשר ליזה מלאה על ידי הבטחה שלא נשאר חומר פלוקולנט לבן גלוי.
  4. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל לעמודת הסיבוב המונחת בצינור איסוף. צנטריפוגה ב-18,894 × גרם למשך 2 דקות והשליכו את הזרימה. הכנס את העמודה בחזרה לצינור האיסוף.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר נטרול לליזט החיידקים, ערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור פי 8-10 עד להופעת משקע לבן, ותן לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  6. צנטריפוגה ב-18,894 × גרם למשך 5 דקות, ולהעביר את הסופרנטנט לעמודת פילטר. צנטריפוגה בעוצמה של 18,894 × גרם למשך דקה אחת לסינון התמיסה.
  7. הוסף פי 0.3 מנפח האיזופרופנול לתמיסה המסוננת, ערבב על ידי היפוך. מעבירים את התערובת לעמוד הסיבוב המאוזן.
  8. צנטריפוגה ב-18,894 × גרם למשך דקה אחת, השליכו את הזרימה והניחו את העמוד בחזרה לצינור האיסוף.
  9. שטפו את העמוד עם 750 מיקרוליטר של מאגר כביסה, צנטריפוגה ב-18,894 × גרם למשך דקה אחת, והשליכו את הזרימה.
  10. צנטריפוגה את העמודה שוב ב-18,894 × גרם למשך דקה אחת כדי להסיר את שאריות מאגר הכביסה.
  11. הנח את עמוד הסיבוב בצינור צנטריפוגה חדש. הוסף 100-200 מיקרוליטר של מאגר פליטה למרכז קרום העמוד. תן לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות וצנטריפוגה בחום של 18,894 × גרם למשך 2 דקות. אחסן את ה-DNA של הפלסמיד ב-20 מעלות צלזיוס.

5. טרנספורמציה של פלסמיד (תאים מוכשרים כימית E. coli BL21)

  1. קח 50 מיקרוליטר של תאים מופשרים מבחינה כימית BL21 על קרח. הוסף 2 מיקרוליטר של DNA פלסמיד משלב 4.11 וערבב בעדינות. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
  2. הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, ולאחר מכן העביר מיד את הצינור בחזרה לקרח למשך 2 דקות.
  3. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום LB סטרילי לכל צינור. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד למשך שעה כדי לאפשר התאוששות.
  4. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות, השליכו עודפי סופרנטנט והשאירו כ-100 מיקרוליטר השעו מחדש את התאים והצלחת על אגר LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. יש לדגור הפוך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

6. ביטוי מחולל מוטציות פולימראז CBE-Mag-T7 (צורה לא פעילה)

  1. בצע את שלבים 5.1-5.4. לפני פיזור התאים, יש למרוח באופן אחיד 1 מ"מ IPTG על פני אגר LB עם אמפיצילין. השתמש במים נטולי יונים כבקרה להשוואה עם קבוצות שטופלו ב-IPTG.
  2. לאחר גידול כל המושבות, בחר 10-20 מושבות לתרבית ב -5 מ"ל של מדיום LB המכיל 1 מ"מ IPTG בצינורות זכוכית תחתונים עגולים של 100 מ"ל עם מכסה בורג פנולי ותוחם גומי ב -16 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד למשך 8 שעות.
    הערה: ניתן לאחסן את כל המושבות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר לפני שתמשיך לשלב 7.

7. הפעל את מחולל המוטציות CBE-Mag-T7 פולימראז

  1. אסוף את החיידקים בצינורות זכוכית תחתונים עגולים של 100 מ"ל עם מכסה בורג פנולי ותוחם גומי וצנטריפוגה ב-18,894 × גרם למשך 2 דקות.
  2. שנה את המדיום למדיום LB ללא כל IPTG.
    הערה: שלב זה חשוב כדי לוודא שמחולל המוטציות הפולימראז CBE-Mag-T7 אינו יכול לערוך את עצמו. תכננו את מערכת ה-lacI/O כדי להגן על אשכולות הגנים של פולימראז CBE-Mag-T7.
  3. הקרינו את הצלחת עם רדיאטור אור כחול אחד (470 ננומטר, 4 mW/cm2) תוך כדי תרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך הזמן שנקבע מראש. בצע ריצוף סנגר כדי לאמת את המוטציות ולבדוק אם חשיפה ארוכה יותר מגדילה את תדירות המוטציות.
    הערה: כאן, הגדרנו חשיפה לאור כחול למשך 0, 8, 16 ו-24 שעות.

8. בחירת מוטציות לתפקוד חלבון מוגבר והמשך מוטגנזה

הערה: כאן, אנו משתמשים בגן gfp כ-DNA אקסוגני למוטגנזה ומחפשים מוטציות שיכולות לשפר את העוצמה הפלואורסצנטית של חלבון GFP.

  1. בחר את המושבות, סמן את המיקום על צלחת וחסן את המושבות שנאספו ל -100 מיקרוליטר של ddH2O.
  2. העבירו את 100 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים לצלחת של 96 בארות וקראו את עוצמת ה-GFP ב-Ex/Em = 488/510 ננומטר.
  3. חזור על שלבים 6.3 עד 9.2 עד שניתן יהיה לזהות כמה מושבות ברורות.

9. עצור את המוטגנזה ואמת את המוטציות

  1. לאחר ביצוע מספר שעות של הקרנת אור כחול, העבירו את כל החיידקים בחזרה למקום חשוך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.
  2. בצע את אותם שלבי מיצוי פלסמיד כמתואר בשלב 4.
  3. עצב את הפריימרים קדימה ואחורה עבור רצף Sanger.
    הערה: כאן, אנו משתמשים ב-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTGT כפריימר קדימה וב-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG כפריימר הפוך לריצוף Sanger.

10. ניתוח נתונים וחישוב שכיחות מוטציות

  1. הצג את המוטציה על ידי פתיחת קובץ ה- .ab1 ובדוק את הפסגות באופן ידני.
  2. לנתח את שכיחות המוטציות באמצעות כלים מקוונים (למשל, כלי Mutation Surveyor).
  3. העלה את קובץ הנתונים של Sanger לכלי המקוון והתחל בניתוח שיעור המוטציות.

11. הכנת מלאי גליצרול חיידקי

  1. יש לחסן מושבה בודדת לתוך שפופרת המכילה 5 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד למשך 12-16 שעות.
  2. מערבבים את תרבית החיידקים עם 50% גליצרול ביחס של 1:1. Aliquot לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מיועדות ליצירת מוטציות על DNA אקסוגני באמצעות מחולל מוטציות CBE-Mag-T7 RNA פולימראז מפוצל. גנים לבניית מערכת המוטציות של CBE-Mag-T7 RNA פולימראז וגן המטרה למוטגנזה משולבים כולם בעמוד השדרה של הפלסמיד pET-11a. טרנספורמציה מוצלחת וקרינת אור כחול בוצעו ללא כל נזק לדנ"א הגנומי של החיידקים, כפי שמוצג באמצעות מספרי מושבות נורמליים וניתנים להשוואה ב-LB-אגר (איור 2).

מוטציות ב-DNA אקסוגני זוהו באמצעות ריצוף סנגר. כפי שמוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כלי עריכת הבסיס מונחה פולימראז נוצר לראשונה על ידי Cravens et al. בשנת 2021, תוך שימוש באסטרטגיית היתוך חלבונים17. מוטציות בארבעה נוקלאוטידים של DNA שולבו בהצלחה בשיעורים של יותר מ-10-4 מוטציות ל-bp. עם זאת, מכיוון שמוטציות הוכנסו באופן רציף בין מקדם T7 לטרמינטור ללא בקרה נוספת על ידי חוקרים18, לא ניתן היה לשמר מוטציות "טובות" מעריכה מתמשכת. כדי להתמודד עם מגבלה זו, אנו משלבים מערכת מפוצלת המבוססת על שני מרכיבים מרכזיים. המרכיב ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"לבזCLS352070
אמפיציליןכימיקלים תרמו סיינטיפיקJ60977.14
רדיאטור אור כחולת'ורלאבסLIU470A
ערכת שיבוט הרכבת DNA נבE5520S
סינתזת DNA/Prmersבי.ג'י.איי גנומיקה
ערכת מידי פלסמיד EndoFree CWBIOCW2106Sמאגר P1: מאגר השעיה מחדש, מאגר P2: מאגר ליזה, מאגר E3: מאגר שיווי משקל, מאגר PS: מאגר נטרול, מאגר PW: מאגר כביסה, מאגר ללא אנדו EB: מאגר טיהור DNA, RNase A Endo-Remover FM: מאגר להסרת אנדוטוקסין, עמודות ספין DM עם צינורות איסוף
גליצרולפישר כימיקליםG33-4
שייקר דגירהתרמו סיינטיפיקSK2001CPKG
IPTG (איזופרופילתיו-ובטא;-גלקטוזיד)Invitrogen15529019
קורא מיקרופלייטתרמו סיינטיפיקVarioskan LUX
מיקרוסקופ לייקהDMI 4000B
מולטיסקןכימיקלים תרמו סיינטיפיק
זריקה אחת BL21 (DE3) אי קולי מוכשר כימיתInvitrogenC600003
ערכת טיהור פלסמיד Midi מהירה עם אנדוטוקסין נמוך של PureLinkInvitrogenא36227
פיירקס  צינורות צנטריפוגה עגולים תחתונים כבדים, עם מכסה בורג פנולי ותוחם גומיקורנינג  8422CLS8422100

מקורות

  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T7DNAIn Vivo
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים