מאמר שיטה

חקר האירועים התאיים הרציפים של פגוציטוזיס המופעלים על ידי גודנטי בהסמה בתאי יונקים

DOI:

10.3791/68321

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מבהיר את העיבוד הפגוציטי של חלקיקי Godanti Bhasma (GB) בתאי יונקים, ומאפיין את ספיגתם התאית, דינמיקת הוואקואול, החמצה ופירוק. ממצאים אלה לא רק מקדמים את הבנתנו את מנגנוני הפגוציטוזה הבסיסיים, אלא גם מבססים את GB כמערכת מודל מבטיחה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגוציטוזיס הוא מנגנון תאי חיוני שדרכו תאים בולעים ומפרקים חלקיקים זרים, פתוגנים או פסולת, וממלאים תפקיד מפתח בהגנה החיסונית ובשמירה על הומאוסטזיס של רקמות. שיבושים בתהליך זה קשורים למחלות שונות. כדי לחקור את האירועים המורכבים המעורבים במסלול הפגוציטוזיס, חלקיקים חכמים מתקדמים וטכניקות ניטור יעילות הם חיוניים. Godanti Bhasma (GB), תרופה הודית מסורתית המורכבת מחלקיקי סידן גופרתי ביו-אקטיביים, מופנמת במהירות על ידי פגוציטוזיס בתאי יונקים, וגורמת לוואקולציה ציטופלזמית משמעותית. שלבי המפתח של פגוציטוזיס המושרה על ידי GB הוערכו כאן באמצעות ציטומטריית זרימה (FC), הדמיית תאים חיים וטכניקות צביעה ספציפיות. ניתוח ציטומטרי זרימה הדגים היווצרות מבנים דמויי פגוציטים הקשורים להפנמת חלקיקים. הדמיית תאים חיים אפשרה תצפית בזמן אמת על תהליכים פגוציטים, כולל קליטת חלקיקים, היווצרות ואקואול, פירוק חומרים נבלעים ותחלופת ואקואולרים. צביעה באדום ניטרלי וכתום אקרידין שימשה להערכת החמצת הוואקולרית. מעניין לציין כי טיפול במעכב הליזוזומלי BFA1 בתאים שטופלו ב-GB לא הוביל לוואקולציה, כפי שמעיד היעדר ספיגה אדומה ניטרלית, תוך הדגשת הדרישה לסביבה חומצית להתרחשות ואקואולציה. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל של פגוציטוזיס המושרה על ידי GB כמודל להבהרת האירועים התאיים הרציפים המעורבים בתהליך זה, שהוא קריטי להבנת אינטראקציות מארח-פתוגן, סחר תוך תאי ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות להפרעות הקשורות לפגוציטוזיס.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגוציטוזיס הוא תהליך תאי חיוני המבוצע על ידי פגוציטים מקצועיים השוכנים ברקמות, כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים, כמו גם פגוציטים לא מקצועיים, כגון תאי אפיתל ופיברובלסטים, הבולעים ומפרקים חלקיקים זרים. תאים אלה מפנימים ומחסלים חלקיקים זרים, פתוגנים או פסולת תאית, ותורמים באופן משמעותי להגנה החיסונית ולהומאוסטזיס של רקמות1. תהליך זה מתחיל בזיהוי פתוגנים, פסולת או חלקיקים באמצעות קולטני זיהוי דפוסים (PRRs), כגון קולטנים דמויי טול (TLRs), הנקשרים לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים (PAMPs)2. זיהוי זה מעורר היווצרות של פגוציטית, שבה בליטות קרום הפלזמה משתרעות סביב חלקיק המטרה3. חוטי אקטין ממלאים תפקיד מכריע בשלב זה, ומניעים את שיפוץ הממברנה הדרוש לבליעת חלקיקים4. ברגע שהחלקיק סגור בפגוזום, נוצרת שלפוחית הקשורה לממברנה. הפאגוזום עובר התבגרות, המאופיינת בהיתוך עם אנדוזומים מוקדמים ואז מאוחרים, ואחריו שילוב של ליזוזומים המכילים אנזימים הידרוליטיים5. אנזימים אלה, כגון קטפסינים, ליזוזים ונוקלאזות, מופעלים על ידי החמצה בתוך הפגוזום, המושגת על ידי ATPase ואקואולרי (V-ATPase), ומורידה את ה-pH ל-4.5-5.5. תהליך ההשפלה מסתיים באקסוציטוזיס של שאריות מהתא. תפקוד לקוי בתהליך דינמי ומורכב זה עלול לגרום לאתגרים חיסוניים משמעותיים 6,7,8.

כדי להעריך במדויק את התהליך התאי המורכב של פגוציטוזיס, יש צורך בשיטות משופרות וקלות לניטור האירועים התאיים העיקריים של פגוציטוזיס. באופן מסורתי, שיטת ניטור לכימות פגוציטוזיס כוללת טכניקות כגון קיבוע פגוציטים במרווחי זמן קבועים מראש להדמיה מיקרוסקופית, מדידת הפנמה של מטרות מסומנות צבע באמצעות הדמיה או זרימה ציטומטרית או ספירת מספר תאי המטרה שנותרו לאחר משך מוגדר של פגוציטוזיס, עם זאת, שיטות אלו אינן לוכדות את התנודות מדקה לדקה המתרחשות במהלך תהליך הפגוציטוזיס9. יתר על כן, שיטות המסתמכות על אינדיקטורים עקיפים כמו ספיגת צבע עשויות שלא לשקף במדויק אירועים פגוציטים בפועל עקב העברת צבע פסיבית פוטנציאלית10.

ההתקדמות האחרונה בהדמיית תאים חיים, ציטומטריית זרימה וטכניקות צביעה חוללו מהפכה ביכולתנו לנטר פגוציטוזיס בדיוק מרחבי-זמני גבוה. הדמיית תאים חיים, למשל, מאפשרת התבוננות רציפה בתהליכים דינמיים עם מעקב אחר אירועים עוקבים11. ציטומטריית זרימה נמצאת בשימוש נרחב לניתוח תאי יונקים וזיהוי סמנים ביולוגיים במחקר קליני12. עם זאת, שיטות FC מסורתיות אינן מצוידות להעריך את המאפיינים המורפולוגיים והמרחביים של תאים בודדים12. ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) משמשת כחלופה חזקה המאפשרת איסוף מידע מפורט מתאים בודדים. IFC משלב את היכולות האנליטיות של ציטומטריית זרימה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, ומאפשר ניתוח של תא בודד עם פירוט מורפולוגי ומרחבי. חלקיקים שונים, כולל חרוזי לטקס פלואורסצנטיים, זימוזן-APC וננו-חלקיקים סינתטיים, משמשים בדרך כלל לחקר פגוציטוזיס, ומספקים תובנות לגבי מעורבות קולטנים, היווצרות פגוזומים ותגובות חיסוניות12.

בניגוד לטכניקות ביוכימיות קונבנציונליות, המסתמכות בדרך כלל על ניתוח נקודות קצה, הדמיית תאים חיים מספקת ניטור רציף ודינמי של תהליכים תאיים. שיטה זו מציעה רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה ויכולת לצפות באירועים עוקבים בפגוציטוזיס. כתוצאה מכך, זהו כלי רב עוצמה לחקר התהליך המורכב של פגוציטוזיס, המאפשר תובנות מדויקות ומפורטות יותר על התנהגויות ומנגנונים תאיים13.

בנוסף להתקדמות במערכות הדמיה, יש צורך בחלקיקים פגוציטים חכמים שיכולים להדגיש באופן מובהק אירועים פגוציטים, במיוחד שלבי הפירוק המתרחשים בתוך הפאגוזום. מחקרי פגוציטוזיס משתמשים לעתים קרובות בחלקיקים כגון חרוזי לטקס, זימוזן, חיידקים, תאים אפופטוטיים וננו-חלקיקים סינתטיים כדי לחקור מנגנונים כמו מעורבות קולטנים, היווצרות פגוזומים ותגובות חיסוניות. בעוד שחלקיקים אלה מספקים תובנות חשובות, יש להם מגבלות במעקב אחר תהליך הפירוק המלא או הערכה ישירה של הבשלת הפגוזומים. לדוגמה, חרוזי לטקס אינם מתכלים ואינם יכולים להפגין פירוק, בעוד שזימוזאן וחיידקים דורשים לעתים קרובות תיוג מורכב ועשויים שלא להניב פרופילי פירוק עקביים14,15.

המחקר הקודם שלנו הדגים את התועלת של GB, פורמולה איורוודית מסורתית המורכבת בעיקר מסידן גופרתי, כחלקיק אידיאלי לחקר התבגרות ופירוק פגוזומים16. GB מתמוסס עם הזמן בסביבה החומצית של הפגוזום, ומאפשר הדמיה ברורה של פירוק החלקיקים. יתר על כן, היכולת של GB לגרום להיווצרות ואקואול חזקה מקלה על חקירת שלבים מובחנים של התבגרות פגוזום, מהיווצרות מוקדמת ועד להחמצה ופתרון בסופו של דבר. בניגוד לחלקיקים אחרים, GB מבטל את הצורך בתיוג חיצוני, ומספק מערכת עצמאית לחקר מחזור החיים המלא של פגוזומים, מה שהופך אותו למודל אידיאלי להבנת הדינמיקה של פגוציטוזיס והפרעות נלוות16.

מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור שנועד להעריך פגוציטוזיס המושרה על ידי חלקיקים והיווצרות ואקואול באמצעות Godanti Bhasma (GB) הן בשורות תאים פגוציטים מקצועיים (RAW 264.7) והן לא מקצועיים (HeLa ו-3T3-L1). המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק פלטפורמה חזקה לחקר מנגנוני קליטה תאיים, ביוגנזה ואקואולרית ועיבוד חלקיקים תוך תאיים על פני סוגי תאים שונים. GB הושעה ב-DMEM בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל, וכדי להבטיח אחידות, חלקיקים גדולים יותר הורשו לשקוע בזמן שהחלק העליון נאסף לשימוש ניסיוני. עבור מבחני זרימה ציטומטרית, תאים נזרעו בצפיפות של 2 x 105 תאים לבאר בצלחות של 12 בארות, ו-300 מיקרוליטר של תרחיף העבודה GB נוספו לכל באר. עבור ניתוחים מבוססי הדמיה, 5,000-10,000 תאים נזרעו לכל באר בצלחות של 96 בארות או על שקופיות תא. שיטה זו מבססת את GB כמודל אמין לחקירת היווצרות ואקואול והפנמת חלקיקים בסוגי תאים מגוונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים וזריעה

  1. הכן מדיום DMEM שלם בתוספת 10% FBS מומת חום ואנטיביוטיקה (100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). עקר את כל הריאגנטים והציוד לפני השימוש.
  2. תרבית תאי 3T3-L1, HeLa ו-RAW 264.7בצלוחיות 25 ס"מ ו-35 מ"מ באמצעות DMEM. שמרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO2 והחליפו את המדיום כל 48 שעות.
  3. לתת-תרבית יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ואז לנתק תאים דבקים באמצעות 500 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA ולדגור למשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של DMEM כדי לנטרל את תמיסת Trypsin-EDTA, פיפטה ליצירת מתלה חד-תאי והתאם את הנפח ל-10 מ"ל עם DMEM טרי. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות, השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום טרי.
  4. מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 0.4% טריפן כחול (1:1), סופרים תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר, מחשבים צפיפות כתאים / מ"ל = ספירה ממוצעת x 104 x 2.
  5. עבור צלחות של 96 בארות: הוצא 100 מיקרוליטר מתרחיף התאים (המכיל 10,000 תאים) לכל באר. עבור מגלשות חלל, זרע 50 מיקרוליטר מתרחיף התא (המכיל 5000 תאים) לשני חללים, ומשאיר את החלל האמצעי ריק. הוסף 50 מיקרוליטר של DMEM לכל אחד מהחללים הזרעים.
  6. דגרו את הלוחות והמגלשות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך 24 שעות כדי לאפשר היצמדות וייצוב של התאים. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 20 כדי להעריך מורפולוגיה, מפגש וזיהום לפני שתמשיך בניסויים.

2. הכנת תמיסה/קוקטייל מלאי GB לתרבית תאים

  1. רכשו GB ושקלו 100 מ"ג מהאבקה במדויק. השעו את האבקה ב-10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. מערבל את המתלה ותן לו לעמוד דקה אחת כדי לאפשר לחלקיקים גדולים יותר להתיישב. לאחר מכן, העבירו את 5 המ"ל העליונים של המתלה לצינור צנטריפוגה סטרילי.
  3. ייעד את תרחיף GB זה של 5 מ"ל כפתרון המלאי לניסויים הבאים בתרבית תאים. מערבל את התרחיף ביסודיות כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים לפני הוספתו לתאים.

3. ניתוח ציטומטריית זרימה

  1. קצור תאי RAW 264.7, HeLa, או 3T3-L1 על ידי טריפסיניזציה, נטרול עם DMEM מלא, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות, השעיה מחדש ב-1 מ"ל של מדיום טרי, ערבב 10 מיקרוליטר עם 0.4% טריפאן כחול (1:1), ספר תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר, חשב צפיפות והתאם ל-2 x 105 תאים/מ"ל.
  2. זרע 2 x 105 תאים לבאר בצלחת של 12 בארות ותרבית למשך 24 שעות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  3. טפל בתאים עם תרחיף GB (300 מיקרוליטר לבאר) למשך פרקי זמן שונים: 30 דקות, שעה ו -12 שעות. לאחר הטיפול יש לשטוף את התאים פי 5 עם PBS כדי להסיר חלקיקים עודפים.
  4. נסה את התאים כמו בשלב 1.3 ושטוף אותם היטב עם PBS. טען את המתלה המוכן ליציאת הדגימה של ציטומטר הזרימה. הפעל את התוכנה ובחר את הגדרות הרכישה המתאימות. בחר מצב שדה בהיר להדמיה.
  5. התחל ברכישת נתונים על ידי לחיצה על הפעל בתוכנה. רכוש נתונים עבור לפחות 10,000 אירועים כאשר המערכת מצלמת תמונות של תאים בודדים העוברים דרך תא הזרימה.
  6. השתמש בתרשים פיזור של שטח לעומת יחס גובה-רוחב כדי לבודד תאים שלמים. זה עוזר לא לכלול כפולות ואשכולות. הצג את התמונות המתאימות בספריית התמונות. אסוף תמונות תאים בודדות מספריית תמונות התוכנה כדי לחקור את השינויים המורפולוגיים הנגרמים על ידי הטיפול.
  7. לניתוח חלקיקים, זרע 2 x 105 תאים לבאר בצלחות של 12 בארות ותרבית למשך 24 שעות. טפל בתאים עם תרחיף GB (300 מיקרוליטר לבאר) למשך פרקי זמן שונים: 1 שעה, 7 שעות, 14 שעות ו -24 שעות.
  8. לאחר הטיפול יש לנער בעדינות את צלחת התרבות למשך דקה אחת ולאסוף את אמצעי התרבות לצינורות של 1.5 מ"ל. שטפו את התאים פי 5 עם PBS כדי להסיר חלקיקים חוץ-תאיים.
  9. הוסף 500 מיקרוליטר של חוצץ RIPA (20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5; 150 מ"מ NaCl; 0.1% טריטון X-100; 1% נתרן דאוקסיכולאט) כדי ליזק לחלוטין את התאים.
  10. הפעל את מדיום התרבות ודגימות התאים הליזים המכילים חלקיקים בנפרד דרך ציטומטר הזרימה. טען את הדגימות ליציאת הדגימה של המערכת. הפעל את התוכנה ובחר את הגדרות הרכישה המתאימות. בחר מצב שדה בהיר לניתוח חלקיקים.
  11. התחל ברכישת נתונים על ידי לחיצה על הפעל בתוכנה. רכוש נתונים עבור לפחות 20,000 אירועים כאשר המערכת מצלמת תמונות של חלקיקים בודדים העוברים דרך תא הזרימה.
  12. השתמש בתרשים פיזור של שטח לעומת יחס גובה-רוחב כדי לשער את כל החלקיקים. השתמש בכלי תרשים הפיזור כדי לנתח את ספירת החלקיקים.

4. מיקרוסקופ זמן-lapse

  1. תרבית תאי 3T3-L1 (3.0 x 104) בצלחת 35 מ"מ עם 2 מ"ל DMEM ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 עד שהם מגיעים למפגש של 70%.
  2. מערבבים היטב 300 מיקרוליטר של תרחיף GB לתוך מדיום התרבית הטרי של 2 מ"ל שחומם מראש ולאחר מכן מניחים את צלחת התרבות עם התאים וה-GB, על שלב מיקרוסקופ ההדמיה.
  3. בחר את המטרה פי 10. הפעל את תאורת שדה הבהיר באמצעות כפתור בהיר. לחץ על הלחצן סרט כדי להיכנס למצב קיטועי זמן. הגדר את זמן המרווח ל-5 דקות. התחל להקליט על ידי לחיצה על הקלטה לחצן.
  4. צלם תמונות בכל מרווח של 5 דקות למשך 16 שעות עד 24 שעות, תוך הבטחת הדמיה רציפה בתנאים סטנדרטיים בחממת CO2 .
  5. השתמש בתוכנת ImageJ כדי להרכיב את התמונות שצולמו לסרטון זמן-lapse. טכניקה זו מאפשרת בידול של שלבים שונים של פגוציטוזיס, מהפנמה ועד פירוק מוחלט של חלקיקים.

5. מכתים אדומים ניטרליים

  1. לאחר 24 שעות של צמיחת תאים בצלחות של 96 בארות ומגלשות חלל, ערבבו היטב את מלאי המתלים של חלקיקי GB והוסיפו 30 מיקרוליטר של המתלה לכל באר או חלל.
  2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 24 שעות כדי לגרום להיווצרות ואקואול. השתמש בבארות או חללים לא מטופלים כבקרות שליליות.
  3. לצביעה בצבע אדום ניטרלי (NR), הכינו תמיסת NR של 0.5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM נטול סרום, וסננו אותה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
  4. להדמיה של ואקואולים בצלחות של 96 בארות ומגלשת חלל: הסר את המדיה, הוסף 60 מיקרוליטר של צבע NR ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS כדי להסיר עודפי צבע ולאחר מכן להמשיך בהדמיה מיקרוסקופית.
  5. בחנו את הווקואולים תחת מיקרוסקופ באמצעות המטרה 20x, כדי להעריך את הגודל, המורפולוגיה ומספר הוואקואולים.

6. טיפול בבפילומיצין A1 להיווצרות ואקואול ועיכוב החמצה

  1. הכן תמיסת מלאי של Bafilomycin A1 (BFA1) בריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל (160.5 ננומטר) על ידי המסה של 100 מיקרוגרם של BFA ב-50 מיקרוליטר של DMSO, ולאחר מכן דילול ב-950 מיקרוליטר של DMEM. לדלל 1 מיקרוליטר ממלאי זה ב-1.6 מ"ל של DMEM כדי לקבל פתרון עבודה של 0.1 ננומטר.
  2. מערבבים היטב ומוסיפים 100 מיקרוליטר מתמיסת ה- BFA העובדת לבארות המכילות תאים בצלחות 96 הבארות. כמו כן, הוסף 30 מיקרוליטר של תרחיף חלקיקי GB כדי להעריך עיכוב של היווצרות ואקואול ופגוזום.
  3. כדי לעכב את החמצת הפגוזום, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת ה- BFA העובדת לבארות עם ואקואולים שנוצרו מראש (שטופלו בעבר בחלקיקי GB). דגרו את כל הבארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 24 שעות.
  4. הוסף 60 מיקרוליטר של צבע אדום ניטרלי (NR) לכל באר, דגר למשך 15 דקות נוספות ונתח היווצרות ואקואול והחמצה.

7. מכתים כתומים אקרידין (AO).

  1. לטפל בתאים שגודלו במגלשות חלל עם 50 מיקרוליטר של GB ולדגור למשך הלילה בתנאי ניסוי סטנדרטיים.
  2. לאחר הטיפול, דגרו את התאים בתמיסה כתומה אקרידין (1 מ"ג/מ"ל) למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר צביעה סלקטיבית של ואקואולים ואברוני שלפוחית חומציים.
  3. שטפו את התאים פי 3 עם מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר צבע לא קשור ולמזער את הקרינה ברקע.
  4. נתח במהירות את השקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה פי 20 וטווח מסנן עירור כחול של 450-492 ננומטר, כדי להעריך את המורפולוגיה התאית וספיגת תפוז אקרידין, מה שיספק תובנות לגבי דינמיקת ואקואולרי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר מדגיש תגובות תאיות מרכזיות לחלקיקי GB בתאי יונקים. השתמשנו בציטומטר זרימת הדמיה כדי לחקור את ההפנמה של חלקיקי GB בתאי 3T3-L1 (איור 1). התאים נחשפו לחלקיקים למשך זמן שנע בין 30 דקות ל-12 שעות. אחרי 30 דקות צפינו בחלקיקים על פני התא (איור 1B), וממברנת התא החלה להתקפל פנימה באתרי ההיצמדות, מה שמצביע על התחלת ההפנמה (איור 1C). הרחבה עגולה של הממברנה, ככל הנראה פגוציטית, נוצרה סביב אתר ההתקשרות (איור 1C

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגוציטוזיס משמשת כמנגנון הגנה חיסוני חיוני, המאפשר בליעה וחיסול לאחר מכן של חלקיקים, פתוגנים ותאים אפופטוטיים. כדי להבין את תהליכי היווצרות והבשלה של פגוזומים, חלקיקים תואמים ביולוגית חכמים בשילוב עם טכניקות הדמיה מתקדמות חיוניים לחקר אירועים דינמיים כגון התקדמות ואקואולרית, החמצה ופירוק של חומרים נבלעים18,19. השתמשנו ב-GB, חלקיק מודל תואם ביולוגית, עבור מערכת בדיקת הפגוציטוזיס. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) גילה כי חלקיקי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר הליבה של מועצת המחקר למדע והנדסה (SERB) (CRG/2022/009045), המחלקה למדע וטכנולוגיה, ממשלת הודו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
25 ס"מ2 צלוחיות תרבותNEST, הודו707001
צלחות 96 ו -6 בארותTarsons India Pvt. Ltd., קולקטה, הודו; Thermo Scientific, הודו980040; 140675
כתום אקרידיןSRL, הודו82407
אנטיביוטיקה ותמיסת טריפסין-EDTAהיי מדיה, הודו628242; 655111
קווי תאים- HeLa, 3T3-L1 ו-RAW-264.7המרכז הלאומי למדעי התא (NCCS), פונה, מהרסטרה
כלי תרבות (35 מ"מ) SPL Lifesciences, הודו101350
דולבקו מדיום נשר שונה (DMEM)MP Biomedicles, הודו1033126
סרום בקר עוברי (FBS)היי מדיה, הודו651257
ציטומטר זרימהMillipore, ארצות הבריתאמניסציטומטרים של זרימה להדמיית אמניס,
מיקרוסקופ פלואורסנטיDiGi Lab, הודודגם: DiGi 110 Infinity
גודנטי בהסמהפטנג'לי איורווד240002
צבע אדום ניטרליCDH, הודו593630
מיקרוסקופ זמן-lapseNanoEnTek Inc.  סיאול, קוריאה.ג'ולימנתח תאי פלורסנט חכם של JuLi,
מיקרוסקופ זמן-lapseלידס מיקרו IMA. בריטניהS.No. LIM225552358A58מיקרוסקופ הפוך EA PRIME

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
  3. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  4. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).
  5. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: Going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).
  6. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  7. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  8. Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes. J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).
  9. Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays. Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).
  10. de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization. J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).
  11. Chu, C. C., et al. High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).
  12. Park, Y., et al. Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals. Front Immunol. 11, 203(2020).
  13. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).
  14. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  15. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).
  16. Das, S. K., et al. Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay. Methods. 230, 158-168 (2024).
  17. Huss, M., et al. Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1. J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).
  18. Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages. Front Immunol. 14, 1204223(2023).
  19. Lancaster, C. E., et al. Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes. J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).
  20. Krendel, M., Gauthier, N. C. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).
  21. Barger, S. R., et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).
  22. Ghosh, M., et al. Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles. J Vis Exp. (125), e56093(2017).
  23. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J Vis Exp. (120), e54646(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neutral RedAcridine Orange

מאמרים קשורים