הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68336

⸱

2 במאי 2025

 ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory for Pathogens and Ecosystems, College of Life Sciences, Nanjing Normal University

במאמר זה

סיכום

שמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe מתגלים כמודל אטרקטיבי לחקר מיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח השפע וההרכבה של קומפלקסי הנשימה המיטוכונדריאלים ב-S. pombe. זה מאפשר לאפיין את הפונקציות החדשות של גנים שמורים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

תקציר

שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית חיונית לחילוף החומרים של אנרגיה תאית, ומשמשת כליבת הזרחן החמצוני. שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית מורכבת מחמישה מתחמי אנזימים וקומפלקסי העל האינטראקטיביים שלהם. ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבונים אלה חיוני להבנת תפקוד המיטוכונדריה. ניתן לחקור זאת על ידי שילוב שיטות ביוכימיות וגנטיות במודל מצוין של שמרי ביקוע אורגניזם Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), המספק מערכת פיצוי לשמרים ניצנים למחקרים של ביולוגיה מיטוכונדריאלית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד מיטוכונדריה של S. pombe וניתוח רמות ביטוי והרכבת קומפלקסים של חלבוני הנשימה המיטוכונדריאלים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) ו-BLUE NATIVE-PAGE (BN-PAGE). בקצרה, מיטוכונדריה מהמוטציות מסוג הבר והגנים מטוהרים, ואז הקומפלקסים שלהם מסיסים ונתונים ל-SDS-PAGE/BN-PAGE ו-immunoblotting. שיטה זו מאפשרת לאפיין את התפקוד החדש של הגן בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

מבוא

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כגון נשימה תאית לאנרגיה, חילוף חומרים תזונתי ומוות תאי1. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למחלות מוח, שרירים והתפתחותיות 2,3. לכן, מחקרים על מיטוכונדריה חיוניים לשיפור ההזדקנות והבריאות של האדם.

השמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) שימשו זה מכבר לחקר תפקודי הגנים במיטוכונדריה4 מכיוון שמוטציות שמרים פגומות בנשימה עדיין יכולות לייצר אנרגיה להישרדות על ידי תסיסה. עם זאת, הוא חיובי קטן ויכול להתרבות ללא DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA). כתוצאה מכך, מוטציות הגנים הפגומים בביטוי הגנים המיטוכונדריאלי מאבדות לעתים קרובות את ה-mtDNA שלהן, מה שמסבך את המחקר הנוסף. לעומת זאת, שמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), המרוחקים מבחינה אבולוציונית מ-S . cerevisiae, הם שמרים שליליים קטנים שדורשים mtDNA כדי לשרוד. יתר על כן, הארגון של mtDNA ו-mRNA מיטוכונדריאלי של S. pombe דומה לאלה של איקריוטים גבוהים יותר5. גנים חיוניים רבים (96) ב - S. pombe, בהשוואה לשישה גנים חיוניים בלבד ב- S. cerevisiae, נדרשים לביטוי גנים מיטוכונדריאלי6. לפיכך, S. pombe מתגלה כמודל אטרקטיבי לחקר פונקציות חדשות של גנים במיטוכונדריה. עם זאת, מספר הפרסומים החוקרים מיטוכונדריה ב-S. cerevisiae גדול בערך פי 100 מזה של S. pombe, והשיטות והפרוטוקולים המדווחים החוקרים מיטוכונדריה ב-S. pombe גם הם נדירים7.

שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית חיונית לייצור אנרגיה תאית ומשמשת כליבת מיטוכונדריה8. הוא מורכב ממתחמי שרשרת נשימה I-V, כגון NADH-ubiquinone oxidoreductase (קומפלקס I), סוקסינט דהידרוגנאז (קומפלקס II), יוביקינון-ציטוכרום c oxidoreductase או קומפלקס ציטוכרום bc1 (קומפלקס III), ציטוכרום c אוקסידאז (קומפלקס IV) וסינתאז ATP (קומפלקס V), יחד עם שני מצעי ביניים הנושאים אלקטרון, יוביקינון (CoQ) וציטוכרום c (Cyt c)9. הם גם מתקשרים ויוצרים קומפלקסים-על מסדר גבוה יותר, שמנגנוני ההרכבה שלהם נותרו ברובם לא ברורים10,11. עם זאת, S. pombe חסר קומפלקס I, שעשוי להיות מוחלף על ידי NADH דהידרוגנאזות חיצוניות Nde1 ו-Ndi1 פנימי 12,13,14. הגנום המיטוכונדריאלי ב-S. pombe מקודד תת-יחידה של קומפלקס III (Cob1), שלוש תת-יחידות של קומפלקס IV (Cox1, Cox2, Cox3), ושלוש תת-יחידות של קומפלקס V (Atp6, Atp8, Atp9)15,16. לאחרונה דיווחנו כי הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבונים אלה מושפעים ממחיקת RNA helicase Mss116 (Δmss116)16 וגורם ההרכבה Shy1 (Δshy1)15 ב-S. pombe, בהתאמה. כדי להקל על גילוי הפונקציות החדשות של גנים נוספים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית באמצעות שיטות אלה, כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) של רמות הביטוי וניתוח PÉC-PÉN (BN-PAGE) של הרכבת קומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ב- S. pombe.

הרציונל מאחורי בידוד המיטוכונדריה מ-S. pombe מבוסס על השיטות שנקבעו ב-S. cerevisiae17. הספרופלסטים מוכנים תחילה על ידי עיכול דפנות תאי שמרים. הם הומוגניים מכנית, והמיטוכונדריה מפוצלים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית18. לאחר מכן, חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית מסיסים ומחוסנים חיסון בעקבות SDS-PAGE ו-BN-PAGE. טכניקת BN-PAGE פותחה במקור להפרדת חלבוני ממברנה מיטוכונדריאלית כגון קומפלקסים של שרשרת הנשימה 19,20,21. חלבוני הממברנה עם קומפלקסים שלמים שהשתמרו מסיסים על ידי חומרי ניקוי לא יוניים עדינים ונטענים על ידי צבע אניוני Coomassie G-250. לפיכך, קומפלקסים של חלבונים מופרדים על פי המסה שלהם בג'ל מקורי שיפוע22. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקר קומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית ב-S. cerevisiae23 ובתאי יונקים 24,25; עם זאת, הוא לא יושם באופן נרחב על מיטוכונדריה של S. pombe.

באופן קולקטיבי, כאן אנו מציגים שיטה שבה מיטוכונדריה מבודדים מתאי S. pombe , וחלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית נתונים ל-SDS-PAGE ו-BN-PAGE ואחריהם אימונובלוטינג. תרשים הזרימה הניסיוני מתואר באיור 1. עם מיטוכונדריה ונוגדנים איכותיים, ניתן ליישם שיטה זו המתוארת ב- S. pombe גם על אורגניזמים אחרים כדי לזהות גנים נוספים עם פונקציות בביטוי ו/או הרכבת קומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ספרופלסטים של S. pombe

  1. גדל 1 ליטר של תאי S. pombe בתמצית שמרים עם תוספי מזון (YES) מדיה (טבלה 1) עבור זן מסוים (WT או Δshy1) מ-OD600 = 0.05 ל-OD600 = 1.0.
    הערה: אין לגדל את תאי S. pombe עם OD600 יותר מ-2.0, מכיוון שהם קשים לעיכול על ידי אנזימים ליטיים ליצירת ספרופלסטים. ניתן לגדל במקביל גם זנים מסוג בר (WT) וגם זנים מוטנטיים של גנים כדי להשיג תוצאות דומות.
  2. קצור תאים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-3,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש תאים גלוליים ב-500 מ"ל של תאי dH2O ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-3,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. לשטוף תאים 1x.
  3. מדוד את המשקל הרטוב של כדור התא (כ-2 גרם עבור 1,000 OD600 תאים). השעו מחדש תאים ב-8 מ"ל של מאגר S 1x (טבלה 2; 4 מ"ל של תאי מאגר S/g). הוסף דיתיותרייטול (DTT) ל-10 מ"מ ופניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) ל-1 מ"מ טרי.
  4. הוסף אנזימים ליטיים לתרחיף התא כדי לעכל את דופן התא של S. pombe. סובב בשייקר ב-30 מעלות צלזיוס למשך הזמן התלוי באנזים הליטי בו נעשה שימוש.
    הערה: עיכול תקין של דופן התא הוא צעד חיוני לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה.
    1. עבור אנזים הליזינג, יש להוסיף 100 מ"ג אבקה לכל גרם משקל רטוב של תאים ולדגור במשך כשעתיים. עבור הליטיקאז, הוסיפו 10 מ"ג אבקה לכל גרם משקל רטוב ודגרו למשך כשעה. עבור Zymolyase-20T/100T, יש להוסיף 5 מ"ג/1 מ"ג אבקה לכל גרם משקל רטוב ולדגור למשך כשעה. עבור Lallzyme MMX, הוסף 1 גרם אבקה לכל גרם משקל רטוב ודגירה למשך כ-0.5 שעה. לאנזים Vinotaste, יש להוסיף 1 גרם אבקה לכל גרם משקל רטוב ולדגור למשך כשעתיים.
  5. שימו לב להיווצרות ספרופלסטים על ידי מיקרוסקופיה (אובייקטיבי פי 40). קחו 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים במאגר S והוסיפו ל-1 מ"ל של ddH2O, ראו שרוב התאים שבורים (איור 2C).
    הערה: לתאי S. pombe הרגילים יש צורות מוט (איור 2A). יותר מ-80% מהספרופלסטים במאגר S, אחרי עיכול יעיל, אמורים להיות עגולים (איור 2B).
  6. ספרופלסטים גלולה על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הספרופלסטים ב-8 מ"ל של מאגר 1x S קר כקרח ושטפו פי 2. השעו מחדש את הספרופלסטים בעדינות באמצעות פיפטות עם קצות חתוכים.

2. הומוגניזציה מכנית של ספרופלסטים S. pombe

  1. השעו מחדש ספרופלסטים ב-8 מ"ל של מאגר הומוגניזציה 1x קר כקרח (טבלה 3; 4 מ"ל של מאגר הומוגניזציה/תאי גרם) עם מעכבי פרוטאז 1x. העבירו תאים להומוגניזטור זכוכית מקורר מראש (מטחנת רקמות Dounce עם עלי ומבחנה).
  2. הומוגניזציה של תאים באופן מכני על ידי ביצוע כ -15 משיכות למעלה ולמטה עם העלי המתאים היטב. כדי למנוע פירוק של חלבונים מיטוכונדריאלים, הימנע מבועות במהלך שבץ מוחי ודגירה תמיד על מאגר ההומוגניזציה וההומוגנייזר על הקרח.
    הערה: ישנם שני סוגים של עליים עם התאמה הדוקה ורופפת למבחנה. אם משתמשים בעלי רופפים, ייתכן שיהיה צורך בעד 25 פעימות. יש לייעל את מספר השבץ מכיוון שיותר מדי שבץ עלול לפגוע בקרומים המיטוכונדריים, ומעט מדי שבץ מפחית את התפוקה המיטוכונדריאלית.
  3. בדוק את קרום התא השבור בספרופלסטים במיקרוסקופ (אובייקטיבי פי 40).
    הערה: רוב הספרופלסטים מאבדים את צורת השבירה והופכים לתאי רפאים במאגר הומוגניזציה. המיטוכונדריה עדיין שלמים.

3. בידוד מיטוכונדריה של S. pombe על ידי צנטריפוגה

  1. העבר תרחיף הומוגני לצינורות צנטריפוגה ותאים בלתי שבורים ופסולת על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. צנטריפוגה הסופרנטנט המתקבל למשך 5 דקות ב-3,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס וגרעיני גלולה. חזור על שלב זה 1x עד שלא תהיה היווצרות גלולה.
  3. העבירו את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגות חדשים ומיטוכונדריה גלולה ואברונים מזוהמים אחרים על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. לשפוך את הכדור ולהשעות מחדש ב-1 מ"ל של מאגר סורביטול-EDTA-MOPS (SEM) קר כקרח (טבלה 4). צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס לשטיפת המיטוכונדריה.
  5. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מאגר SEM 1x קר כקרח והעבירו את המיטוכונדריה לניסויים עתידיים.
    הערה: כדור זה מכיל מיטוכונדריה גולמית. ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עבור ניסויי SDS-PAGE ו-BN-PAGE מאוחר יותר. ניתן לטהר את המיטוכונדריה הגולמית גם על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז אולטרה-צנטריפוגה למטרות ניסוי אחרות.

4. SDS-PAGE ואימונובלוטינג של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית

  1. מדוד את ריכוז החלבון הכולל של אליקוט מיטוכונדריאלי באמצעות ערכת כימות חלבון BCA על ידי דילול תרחיף המיטוכונדריה פי 25 בערך.
  2. הוסף מאגר טעינה SDS-PAGE ל-40 מיקרוליטר של חלבונים מיטוכונדריאלים כוללים. דנטורציה של חלבונים על ידי דגירה למשך הזמן המצוין בטמפרטורה המתאימה.
    1. כדי לזהות S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 ו-Atp6, דנטורציה של חלבונים מיטוכונדריאלים ב-45 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. כדי לזהות S. pombe Cox2 ו-Hsp60, דנטורציה של חלבונים מיטוכונדריאלים ב-90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. טען כ-20 מיקרוגרם (כ-4 מיקרוליטר) של חלבונים מיטוכונדריאלים לתוך ג'ל 12% SDS-PAGE. בצע אימונובלוטינג של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית עם נוגדנים מתאימים כמתואר בשלב 615.
    הערה: חלבוני S. pombe Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ו-Atp6 מקודדים על ידי mtDNA, שקשה לערוך כמו תיוג עם אפיטופ משותף אפילו ב-S. pombe. לפיכך, נדרשים נוגדנים ספציפיים כדי לזהות חלבונים אלה. כדי לאמת את הטוהר והשלמות של המיטוכונדריה המבודדת, ניתן לבדוק בו זמנית את חלבוני שרשרת הנשימה הללו בסופרנטנט, שאמור להכיל חלבונים ציטופלזמיים וגרעיניים. לעומת זאת, ניתן לבדוק את החלבונים הציטופלזמיים והגרעיניים המייצגים כגון אקטין והיסטון H3 בדגימת המיטוכונדריה.

5. הכנת דגימה מיטוכונדריאלית עבור BN-PAGE

  1. מיטוכונדריה גלולה מנקודות קודמות בשלב 3.5 על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש ב-2 מ"ג חלבונים מיטוכונדריאלים (כ-400 מיקרוליטר של אליקוטים מיטוכונדריאליים) לניתוח BN-PAGE.
  2. השעו מחדש את המיטוכונדריה ב-200 מיקרוליטר של חוצץ ג'ל 3x BN-PAGE (1.5 M 6-Aminocaproice acid; 150 מ"מ Bis-Tris, pH 7.0, מותאם עם HCl). הוסף 2 מיקרוליטר של 100x PMSF ו-1 מיקרוליטר של 1 M MgCl2. צנטריפוגה את המתלים למשך 15 דקות ב-12,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. השעו מחדש את גלולת המיטוכונדריה ב-160 מיקרוליטר של 5% (w/v) digitonin (DG) או 64 μL של 5% (w/v) n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). דגירה על קרח למשך 30 דקות עם ערבוב עדין כל 10 דקות.
    1. עבור הניסויים הראשונים ב-S. pombe, הוסיפו 4 מ"ג חומר ניקוי DG לכל מ"ג של חלבונים מיטוכונדריאלים כדי להמיס את הממברנות המיטוכונדריאליות כדי לשמור על קומפלקסים-על של שרשרת הנשימה. הוסף 1.6 מ"ג חומר ניקוי DDM לכל מ"ג של חלבונים מיטוכונדריאלים כדי להפריד את קומפלקסי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית הבודדים. התאם את ריכוז הטיפול ב-DG ו-DDM על ידי הגדלה או הקטנה של פי 2 בהתאם לתוצאות הראשוניות של קומפלקסים שונים של חלבונים ב-BN-PAGE.
  4. צנטריפוגה את המתלים למשך 5 דקות ב-20,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט ומדדו את ריכוז החלבון המסיס עם ערכת הכימות BCA.
  5. הוסף 80 מיקרוליטר (1/2 נפח חומר ניקוי) של מאגר דגימה 3x BN-PAGE (טבלה 5) לכ-160 מיקרוליטר של סופרנטנט שטופל ב-DG או הוסף 32 מיקרוליטר (1/2 נפח חומר ניקוי) של 3x BN-PAGE מאגר דגימה לכ-64 מיקרוליטר של סופרנטנט שטופל ב-DDM.
    הערה: בניגוד ל-SDS-PAGE, לא ניתן לנטרל את דגימות החלבון של BN-PAGE על ידי הרתחה.

6. BN-PAGE ואימונובלוטינג של קומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית

  1. הרכיבו את ג'ל Bis-Tris המקורי הטרומי (שיפוע של 3%-12%). לחלופין, הכינו את ג'ל Bis-Tris המקורי בעבודת יד (שיפוע של 3%-12%) על ידי ערבוב של 3% ו-12% ג'ל BN-PAGE (טבלה 6) במיקסר שיפוע.
  2. טען דגימות חלבון שטופלו ב-DG או DDM וסמן חלבון במשקל מולקולרי גבוה עבור PAGE מקורי.
    1. בסך הכל נדרשים 100 מיקרוגרם חלבונים מיטוכונדריאלים מסיסים לניתוח BN-PAGE של קומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית. טען כ-12 מיקרוליטר של דגימת חלבון שטופלה ב-DG או 5 מיקרוליטר של דגימת חלבון שטופלה ב-DDM לתוך ג'ל BN-PAGE. התאם את נפח הטעינה כדי לוודא שעוצמות בקרת הטעינה, כגון חלבון מטריצה מיטוכונדריאלית Mcp60 (Hsp60), שוות בין כל הדגימות לאחר החשיפה הסופית15.
  3. הפעל את הג'ל במתח/זרם קבוע של 80 V/6 mA למשך כ-30 דקות באמצעות מאגר קתודה עם 0.02% (w/v) Coomassie G-250. לאחר מכן, החלף את מאגר הקתודה הכחול במאגר קתודה ללא Coomassie G-250 והמשך לפעול בזרם קבוע של 10 mA למשך כ-3 שעות עד שחזית הצבע הכחול של Coomassie G-250 תגיע לתחתית הג'ל.
    1. כדי למנוע פירוק או פירוק של קומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית, הפעל את הג'ל עם מאגרים מקוררים מראש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. עבור הג'ל הטרומי, השתמש במאגר הריצה הטרומי. עבור הג'ל בעבודת יד, השתמש במאגר הריצה של האנודה 1x BN-PAGE (50 מ"מ Bis-Tris, pH 7.0, מותאם עם HCl) ובמאגר ריצה קתודה 1x BN-PAGE (15 מ"מ Bis-Tris, pH 7.0, מותאם עם HCl; 50 מ"מ טריסין).
  4. חותכים את נתיב הג'ל העמוס בטוש חלבון. מכתים את הסמן עם מאגר Coomassie R-250 למשך 15 דקות. הימנע עד שהסמן נראה לעין.
    הערה: סמן החלבון בעל המשקל המולקולרי הגבוה עבור PAGE מקורי אינו מוכתם מראש. זה יהיה גלוי לאחר צביעה עם Coomassie R-250.
  5. טבלו את החלק השני של הג'ל במאגר ההעברה 1x BN-PAGE (טבלה 7) לאיזון של 30 דקות. שטפו את קרום כתם PVDF בגודל זהה של 0.45 מיקרומטר עם 100% מתנול וטבלו אותו במאגר ההעברה BN-PAGE לאיזון למשך 10 דקות. העבירו חלבונים בג'ל לקרום כתם PVDF של 0.45 מיקרומטר תחת זרם קבוע של 300 mA למשך שעתיים.
    הערה: ממברנת הניטרוצלולוזה (NC) אינה מומלצת מכיוון שממברנת ה-NC קושרת את צבע Coomassie G-250 בחוזקה רבה.
  6. שטפו את קרום ה-PVDF עם 100% מתנול כדי לשטוף את הצבע הכחול של Coomassie G-250. דגרו את קרום ה-PVDF במאגר חוסם מבוסס 1x TBS (50 מ"מ Tris, pH 8.0, מותאם עם HCl; 150 מ"מ NaCl) המכיל 5% (w/v) חלב דל שומן למשך שעה אחת ב-25 מעלות צלזיוס.
  7. דגרו על קרום ה-PVDF עם הנוגדנים הראשוניים המצוינים כנגד קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית S . pombe למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ריכוז נוגדן Cob1 לגילוי קומפלקס III הוא 1: 1,000. ריכוז נוגדן Cox1 לגילוי קומפלקס IV הוא 1: 2,000. ריכוז נוגדן Atp6 לגילוי קומפלקס V הוא 1: 200.
  8. שטפו את קרום ה-PVDF עם מאגר TBST 1x (טבלה 8). דגרו את קרום ה-PVDF עם הנוגדן המשני בריכוז של 1: 10,000 למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס.
  9. שטפו את קרום ה-PVDF עם מאגר TBST 1x. חשוף וסרוק את קרום ה-PVDF. יישר את התמונה החשופה של ג'ל BN-PAGE עם התמונה של סמן החלבון המקורי כדי להעריך את המשקלים המולקולריים של קומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית וקומפלקסים-על.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעבר השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחקור את ההשפעות של מחיקת shy1, הומולוג S. pombe של SURF1 אנושי, על ביטוי חלבוני שרשרת נשימה מקודדים mtDNA והרכבה של קומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית. מצאנו שרמות המצב היציב של Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ו-Atp6 הופחתו באופן משמעותי בזן Δshy1 (איור 3), מה שמצביע על כך ש-Shy1 נדרש לביטוי של חלבוני שרשרת נשימה המקודדים על ידי mtDNA. יתר על כן, ניתוח BN-PAGE הראה כי השפע של קומפלקסי שרשרת נשימה מסיסים ב-DG III2IV2 ו-III2IV הופח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד מיטוכונדריה של S. pombe וביצוע SDS-PAGE ו-BN-PAGE כדי לנתח את הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

קו-אימונו-משקעים (co-IP) שימש בדרך כלל לאיתור הרכבה של קומפלקסים של חלבונים; עם זאת, זה מאתגר עבור Co-IP לזהות את ההרכבה של חלבוני ממברנה מיטוכונדריאלית. במקום זאת, ל-BN-PAGE יש כמה יתרונות: (i) חלק מהנוגדנים אינם יכולים לזהות את האפיטופים הקבורים בקומפלקסים החלבונים המקומיים במהלך co...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים לד"ר יינג הואנג ולד"ר יינג לואו על תמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (32270048 ל-J.S. ו-31900403 ל-G.F.) מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6-חומצת אמינוקפרויססנגוןA430196
אקרילאמיד/ביס (37.5: 1) 40% BiolabGS1374
אמוניום פרסולפטסנגוןA100486
נוגדן נגד Atp6BioworldIB פנימי1:200
נוגדן נגד Cob1BioworldIB פנימי1:1000
נוגדן Anti-Cox1BioworldIB פנימי1:2000
נוגדן נגד Cox2BioworldIB פנימי: 1:1000
נוגדן Anti-Cox3BioworldInhouseIB: 1:200
נוגדן Anti-Hsp60BioworldInhouseIB: 1:3000
BCA ערכת כימות חלבוןLEAGENEPT0001
Bis-TrisYEASEN60105ES25
Coomassie Brilliant Blue G-250SERVA17524.01
Coomassie Brilliant Blue R-250SangonA100472
DigitoninSigmaD141
D-SorbitolSangonA100691
EDTASolarbioE8030
Gradient mixerדוחן מדעיMGM-50
HEPESSolarbioH8090
סמן חלבון במשקל מולקולרי גבוה עבור מקורי PAGEזמנים אמיתייםRTD6142
IgG-Alexa Fluor Plus 800 (נוגדן משני נגד ארנב)Thermo FisherA32735IB: 1:10000
Immobilon-FL 0.45 μ m PVDF ממברנהMilliporeIPFL00005
Kimble Kontes מטחנת רקמות DounceThermo FisherK8853000015
KOHSangonA610441
Lallzyme MMXLallemandN.A.
אנזים ליזינגSigmaL3768
LyticaseSigmaL4025
MgCl2SangonA601336
MOPSSangonA421333
ג'ל ביס-טריס טבעי (טרומי)SolarbioPG41510-N
PMSFSangonA610425
ג'ל טרום יצוק חוצץ ל-Native-PAGESolarbioPG00020-N
קוקטייל מעכב פרוטאז לתמציות שמריםBeyotimeP1020
סוכרוזסנגוןA610498 
TEMEDSigmaT9281
TricineSigmaT0377
Tween-20SolarbioT8220
VinotasteNovozymesN.A.
ZymolyaseMP ביומדיקל320921
: : :

מקורות

  1. Schatz, G. Getting mitochondria to center stage. Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).
  2. Schapira, A. H. Mitochondrial disease. Lancet. 368 (9529), 70-82 (2006).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: an overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Res. 18 (5), (2018).
  5. Kühl, I., Dujeancourt, L., Gaisne, M., Herbert, C. J., Bonnefoy, N. A genome wide study in fission yeast reveals nine PPR proteins that regulate mitochondrial gene expression. Nucl Acid Res. 39 (18), 8029-8041 (2011).
  6. Uehara, L., et al. Multiple nutritional phenotypes of fission yeast mutants defective in genes encoding essential mitochondrial proteins. Open Biol. 11 (4), 200369(2021).
  7. Mori, A., et al. In fission yeast, 65 non-essential mitochondrial proteins related to respiration and stress become essential in low-glucose conditions. Rl Soc Open Sci. 10 (10), 230404(2023).
  8. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  9. Rich, P. R., Maréchal, A. The mitochondrial respiratory chain. Essays Biochem. 47, 1-23 (2010).
  10. Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis. Semin Cell Dev Biol. 76, 179-190 (2018).
  11. Guan, S., Zhao, L., Peng, R. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes: From Structure to Function. Int J Mol Sci. 23 (22), 13880(2022).
  12. Luttik, M. A. H., et al. The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 Genes Encode Separate Mitochondrial NADH Dehydrogenases Catalyzing the Oxidation of Cytosolic NADH. J Biol Chem. 273 (38), 24529-24534 (1998).
  13. Li, W., et al. Yeast AMID Homologue Ndi1p Displays Respiration-restricted Apoptotic Activity and Is Involved in Chronological Aging. Mol Biol Cell. 17 (4), 1802-1811 (2006).
  14. Malecki, M., Bähler, J. Identifying genes required for respiratory growth of fission yeast. Wellcome Open Rese. 1, 12(2016).
  15. Luo, Y., Xu, Y., Ahmad, F., Feng, G., Huang, Y. Characterization of Shy1, the Schizosaccharomyces pombe homolog of human SURF1. Sci Rep. 14 (1), 21678(2024).
  16. Wang, Y., Feng, G., Huang, Y. The Schizosaccharomyces pombe DEAD-box protein Mss116 is required for mitoribosome assembly and mitochondrial translation. Mitochondrion. 76, 101881(2024).
  17. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of Mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Meth Mol Biol. 1567, 33-42 (2017).
  18. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of Mitochondria from Yeast Cells. J Vis Exp. (30), e1417(2009).
  19. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  20. Schägger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Meth Enzymol. 260 (C), 190-202 (1995).
  21. Schägger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Meth Cell Biol. (65), 231-244 (2001).
  22. Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  23. Lemaire, C., Dujardin, G. Preparation of respiratory chain complexes from Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutant mitochondria activity measurement and subunit composition analysis. Meth Mol Biol. 432, 65-81 (2008).
  24. Konovalova, S. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting. J Vis Exp. (144), e59269(2019).
  25. Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J Vis Exp. (48), e2164(2011).
  26. Flor-Parra, I., Zhurinsky, J., Bernal, M., Gallardo, P., Daga, R. R. A Lallzyme MMX-based rapid method for fission yeast protoplast preparation. Yeast. 31 (2), 61-66 (2014).
  27. Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina. Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי חלבונים מיטוכונדריאלייםBlue Native PAGESDS PAGEבידוד מיטוכונדריהסופר-קומפלקסים של שרשרת הנשימהאימונובלוטינגמיטוכונדריה של שמר fission
ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.