הפרוטוקול מתאר שיטה ליצירת מודל אורגנואיד של סרטן המעי הגס (CRC) שמקורו בחולה בתרבית משותפת עם לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) כדי לחקור את האינטראקציות והפוטנציאל הטיפולי שלהם. מודל זה מספק פלטפורמה פרה-קלינית לחקר תגובות חיסוניות במיקרו-סביבת הגידול ולניבוי היעילות של טיפול מבוסס TIL לטיפול מותאם אישית ב-CRC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקמת מערכת תרבית משותפת של אורגנואידים של גידול המעי הגס שמקורם בחולה ולימפוציטים חודרים לגידול (TILs)
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן המעי הגס (CRC) הוא הסרטן השלישי בשכיחותו בעולם. לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) זוהו כסמן פרוגנוסטי חשוב ב-CRC. היישום הטיפולי של TIL כבר הראה תוצאות מבטיחות במלנומה ובסרטן צוואר הרחם. עם זאת, השימוש בהם בטיפול ב-CRC נותר בשלב גישוש. מודל מתאים להערכת יעילות TIL אינו זמין כיום, מה שמעכב התקדמות נוספת בתחום זה. מודלים של אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO), השומרים מקרוב על המאפיינים של רקמת הגידול המקורית ומשקפים הטרוגניות בין מטופלים, מספקים פלטפורמה מצוינת לחקר האינטראקציה בין CRC ל-TILs. במחקר זה, מתוארת שיטה להקמת מודל אורגנואיד CRC שמקורו בחולה מרקמת גידול שזה עתה נכרתה, ואחריו בידוד והרחבה של TILs. מערכת זו מאפשרת תרבית משותפת של אורגנואידים CRC ו-TILs, ומאפשרת הערכה של ציטוטוקסיות מתווכת TIL ותגובות חיסוניות. על ידי ניתוח יעילות ההרג של TIL על אורגנואידים, ניתן לחזות את התוצאות הפוטנציאליות של אימונותרפיה מבוססת TIL לטיפול מותאם אישית ב-CRC. יתר על כן, הנדסה נוספת של TIL עשויה לשפר את יעילותם נגד הגידול, ולהציע אסטרטגיה מבטיחה לפיתוח טיפולים תאיים יעילים יותר. מודל קו-תרבית PDO-TIL זה מספק כלי רב עוצמה להערכה פרה-קלינית של טיפולי TIL ואסטרטגיות טיפול מותאמות אישית ב-CRC.
מבוא
סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים והקטלניים ביותר בעולם, המהווה אתגר מרכזי לבריאות הציבור1. למרות ההתקדמות בשיטות הטיפול, כולל ניתוחים, כימותרפיה ואימונותרפיה, הפרוגנוזה עבור חולי CRC - במיוחד אלה עם מחלה גרורתית - נותרה גרועה. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) ממלאת תפקיד חיוני בעיצוב התקדמות הסרטן ותגובות הטיפול, כאשר לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) מתגלים כמרכיב מרכזי המשפיע על התגובה החיסונית נגד סרטן2. TILs, אוכלוסייה מגוונת של תאים חיסוניים המצויים בתוך גידולים, זוהו כסמנים פרוגנוסטיים משמעותיים ב-CRC, עם רמות גבוהות של חדירת TIL הקשורות לעתים קרובות לתוצאות קליניות טובות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים הכוללים חומרים שמקורם בבני אדם נערכו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו מראש על ידי ועדת האתיקה של בית החולים ג'ונגשאן המסונף לאוניברסיטת דאליאן (מספרי אישור: KY2023-206-1). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים שסיפקו דגימות קליניות למחקר זה. הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
קריטריוני ההכללה כללו רקמת סרטן המעי הגס הראשונית שאושרה פתולוגית, גודל מדגם מספיק (≥1 סמ"ק), ללא היסטוריה של טיפול ניאו-אדג'ובנטי (כימותרפיה או טיפול ממוקד), והסכמה מדעת חתומה. קריטריוני ההדרה כללו איכות דגימה ירודה עם נמק או פיברוזיס העולה על 50%, נוכחות של זיהום חמור או מחלה אוט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הקמה ואפיון של CRC PDOs
דגימות גידול התקבלו מחולי CRC. רקמת גידול CRC שזה עתה נכרתה שימשה להקמת PDOs ו-TILs, אשר שימשו לאחר מכן בניסויי תרבית משותפת של PDO-TIL (איור 1).
איור 1: סכמטי של זרימת העבודה הניסויית הכוללת. תרשים המתאר את השלבים הרציפים של תכנון הניסוי, כולל הקמת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה משתמש ברקמת CRC שמקורה בחולה כדי להשיג הן תאי גידול והן תאי TIL, מהם נוצרים PDOs ו-TIL מורחבים. האינטראקציה בין שני המרכיבים הללו נחקרת לאחר מכן באמצעות מערכת קו-תרבותית.
במחקרים קודמים, TIL חולצו באמצעות מכשור מורכב19 או ישירות מתרחיפים של רקמת הגידול20. עם זאת, שיטות אלה לרוב אינן מצליחות לייצר מספר מספיק של TIL בתוך מסגרת זמן קצרה מדגימות גידול מוגבלות, ובכך מגבילות את יישומן הנרחב הפיתוח של תרביות You.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [82172822]; תוכנית תמיכה בחדשנות כישרונות ברמה גבוהה של לשכת המדע והטכנולוגיה של דאליאן [2021RD02]; תוכנית משותפת לתוכנית המדע והטכנולוגיה של מחוז ליאונינג [2024JH2/102600067]; פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי למדע וטכנולוגיה של מחוז ליאונינג [2024JH2/101900006].
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 מתקדם | ג'יבקו | 12634028 | |
| 2-מרקפטואתנול | סיגמא | 63689 | |
| 4% פרפורמלדהיד | בי.בי.איי | E672002-0100 | |
| 7-AAD | ביולג'נד | 420403 | |
| A83-01 | טוקריס | 2939 | |
| תוסף B27 | ג'יבקו | 17504-44 | |
| CD107a-PE-ציאנין7 | ביולג'נד | 328618 | |
| CD279-PE | ביולג'נד | 329906 | |
| נוגדן חד שבטי CD3 (OKT3) | Invitrogen | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | ביולג'נד | 300406 | |
| CD45 (תחום תוך-תאי) (D9M8I) | CST | 13917 | |
| CD4-APC/ציאנין7 | ביולג'נד | 300518 | |
| CD8-APC | ביולג'נד | 344722 | |
| CDX-2 | מקסימבול | רמ"א-0631 | |
| CK20 | מקסימבול | קיט-0025 | |
| CK7 | מקסימבול | קיט-0021 | |
| Dylight 488, עיזים נגד ארנב IgG | אבקין | A23220 | |
| Dylight 549, עיזים נגד עכבר IgG | אבקין | A23310 | |
| EGF | פפרוטק | AF-100-15 | |
| אפקאם | CST | ברקוד 36746ט | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | סלמקס | סה211.02 | |
| מהשדה 10 | פפרוטק | 100-26 | |
| גסטרין (אנושי) | טוקריס | 3006 | |
| גלוטמקס 100x | ג'יבקו | 35050-061 | |
| Hepes | סיגמא | H4034 | |
| הפס | סיגמא | H4034 | |
| ערכת הפרדת תאים CD3+ אנושית (RUO) | RWD | K1201-10 | |
| חלבון רקומביננטי IFN-גמא אנושי | פפרוטק | 300-02-20UG | |
| קי-67 | CST | 9449 | |
| מטריגל | קורנינג | 354234 | |
| N-אצטילציסטאין | סיגמא | א9165 | |
| ניקוטינאמיד | סיגמא | N0636 | |
| ניבולומאב (אנטי-PD-1) | סלרק | A2002 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא | V900929 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | NCM ביוטק | C100C5 | |
| פרימוצין | אינוויוגן | Ant-pm-1 | |
| מאגר ליזה RBC | תרמו-אינוויטרוגן | 00-4300-54 | |
| IL-2 אנושי רקומביננטי (ללא נשא) | ביולג'נד | 589104 | |
| RPMI 1640 | ג'יבקו | ||
| SB202190 | סלרק | S1077 | |
| כתם כחול טריפן 0.4% | תרמו-אינוויטרוגן | T10282 | |
| נוגדן CD28 אנטי-אנושי מטוהר Ultra-LEAF | ביולג'נד | 302934 | |
| נוגדן CD3 אנטי-אנושי מטוהר Ultra-LEAF | ביולג'נד | 317325 | |
| י-27632 | סלרק | S1049 |
מקורות
- Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
- Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
- Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
