הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת מערכת תרבית משותפת של אורגנואידים של גידול המעי הגס שמקורם בחולה ולימפוציטים חודרים לגידול (TILs)

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68346

⸱

27 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מתאר שיטה ליצירת מודל אורגנואיד של סרטן המעי הגס (CRC) שמקורו בחולה בתרבית משותפת עם לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) כדי לחקור את האינטראקציות והפוטנציאל הטיפולי שלהם. מודל זה מספק פלטפורמה פרה-קלינית לחקר תגובות חיסוניות במיקרו-סביבת הגידול ולניבוי היעילות של טיפול מבוסס TIL לטיפול מותאם אישית ב-CRC.

תקציר

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הסרטן השלישי בשכיחותו בעולם. לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) זוהו כסמן פרוגנוסטי חשוב ב-CRC. היישום הטיפולי של TIL כבר הראה תוצאות מבטיחות במלנומה ובסרטן צוואר הרחם. עם זאת, השימוש בהם בטיפול ב-CRC נותר בשלב גישוש. מודל מתאים להערכת יעילות TIL אינו זמין כיום, מה שמעכב התקדמות נוספת בתחום זה. מודלים של אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO), השומרים מקרוב על המאפיינים של רקמת הגידול המקורית ומשקפים הטרוגניות בין מטופלים, מספקים פלטפורמה מצוינת לחקר האינטראקציה בין CRC ל-TILs. במחקר זה, מתוארת שיטה להקמת מודל אורגנואיד CRC שמקורו בחולה מרקמת גידול שזה עתה נכרתה, ואחריו בידוד והרחבה של TILs. מערכת זו מאפשרת תרבית משותפת של אורגנואידים CRC ו-TILs, ומאפשרת הערכה של ציטוטוקסיות מתווכת TIL ותגובות חיסוניות. על ידי ניתוח יעילות ההרג של TIL על אורגנואידים, ניתן לחזות את התוצאות הפוטנציאליות של אימונותרפיה מבוססת TIL לטיפול מותאם אישית ב-CRC. יתר על כן, הנדסה נוספת של TIL עשויה לשפר את יעילותם נגד הגידול, ולהציע אסטרטגיה מבטיחה לפיתוח טיפולים תאיים יעילים יותר. מודל קו-תרבית PDO-TIL זה מספק כלי רב עוצמה להערכה פרה-קלינית של טיפולי TIL ואסטרטגיות טיפול מותאמות אישית ב-CRC.

מבוא

סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים והקטלניים ביותר בעולם, המהווה אתגר מרכזי לבריאות הציבור1. למרות ההתקדמות בשיטות הטיפול, כולל ניתוחים, כימותרפיה ואימונותרפיה, הפרוגנוזה עבור חולי CRC - במיוחד אלה עם מחלה גרורתית - נותרה גרועה. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) ממלאת תפקיד חיוני בעיצוב התקדמות הסרטן ותגובות הטיפול, כאשר לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) מתגלים כמרכיב מרכזי המשפיע על התגובה החיסונית נגד סרטן2. TILs, אוכלוסייה מגוונת של תאים חיסוניים המצויים בתוך גידולים, זוהו כסמנים פרוגנוסטיים משמעותיים ב-CRC, עם רמות גבוהות של חדירת TIL הקשורות לעתים קרובות לתוצאות קליניות טובות יותר3. מחקרים אחרונים הדגישו גם את הפוטנציאל הטיפולי של TIL בסוגי סרטן אחרים, כגון מלנומה4 וסרטן צוואר הרחם5, שבהם אימונותרפיה מבוססת TIL הראתה יעילות מבטיחה.

עם זאת, למרות ההצלחה של TIL בסוגי סרטן מסוימים, יישומם ב-CRC נותר תחום של חקירה מתמשכת. המורכבות וההטרוגניות של CRC, יחד עם מיקרו-סביבת הגידול המדכאת את מערכת החיסון, מציבים אתגרים לאימונותרפיה יעילה מבוססת TIL6. גידולי CRC מציגים לעתים קרובות TME7 מדכא חיסון מאוד, המאופיין בנוכחות של תאי T רגולטוריים (Tregs), תאים מדכאים שמקורם במיאלואיד (MDSCs) ומקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs), כולם מעכבים באופן פעיל את תפקוד TIL. יתר על כן, תאי CRC מבטאים לעתים קרובות מולקולות מחסום חיסוניות, כגון PD-L1, שיכולות לעכב עוד יותר את ההרג בתיווך TIL8. בנוסף, ההטרוגניות הגנטית של גידולי CRC, יחד עם סטרומה מדכאת חיסון, מסבכת את יכולתם של TIL למקד ולחסל ביעילות תאי גידול, מה שמקשה על השגת אותה רמת הצלחה שנראית במלנומה ובסרטן צוואר הרחם9. פער קריטי במחקר הנוכחי הוא היעדר מודלים מתאימים במבחנה שיכולים לדמות במדויק את האינטראקציות בין CRC ל-TILs. מודלים כאלה חיוניים להערכת הפוטנציאל של TIL בטיפול ב-CRC ולאופטימיזציה של יישומם לאסטרטגיות טיפול מותאמות אישית.

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) התגלו ככלי רב עוצמה למידול סרטן אנושי10. תרביות תלת מימד אלה, שמקורן ברקמות גידול חולים, מחקות מקרוב את המאפיינים ההיסטולוגיים והגנטיים של הגידולים המקוריים, ומספקות ייצוג מדויק יותר של הביולוגיה של הגידול בהשוואה לקווי תאים דו-ממדיים מסורתיים. מודלים של PDO שומרים גם על הטרוגניות בין מטופלים, מה שהופך אותם לאידיאליים עבור גישות רפואה מותאמת אישית11. ב-CRC, PDOs שימשו לסינון תרופות ולחקר הביולוגיה של הגידול12, אך השימוש בהם להערכת תגובות חיסוניות - במיוחד בהקשר של TIL - נותר מוגבל. התכנון של מודל תרבית משותפת של תאים חיסוניים PDO חייב לאזן את המורכבות של המיקרו-סביבה עם יכולת בקרה ניסויית. למרות שרכיבים כמו מקרופאגים ותאים דנדריטיים יכולים לשפר את הביומימיקרי, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) הפכו לבחירה המיינסטרים בשל הנגישות שלהם. עם זאת, ל-PBMCs יש שיעור נמוך של תאי T ספציפיים לגידול, ותת-אוכלוסיות המונוציטים עלולות להפריע ליציבות המיקרו-סביבתית13. לעומת זאת, TIL מעשירים באופן טבעי שיבוטים מגיבים לגידול ונושאים פנוטיפ תשישות באתר, מה שהופך אותם למודל מעולה לניתוח מדויק של מנגנוני התחמקות חיסונית בסרטן המעי הגס.

מטרת מחקר זה היא לפתח פלטפורמה חדשה במבחנה להערכת תגובות אנטי-גידוליות בתיווך TIL ב-CRC על ידי הקמת מערכת תרבית משותפת של CRC PDOs ו-TILs. מודל זה מאפשר הערכה ישירה של ציטוטוקסיות TIL כנגד PDOs CRC וניתוח תגובות חיסוניות בהקשר ספציפי למטופל. שימוש במערכת זו עשוי לספק תובנות עמוקות יותר לגבי הפוטנציאל של אימונותרפיה מבוססת TIL עבור CRC ולתמוך בחקר אסטרטגיות לשיפור יעילות TIL באמצעות גישות הנדסיות. שיטות קודמות הוגבלו על ידי המספר הקטן של TILs14. ברוב המקרים, PBMCs עברו תחילה תרבית משותפת עם PDOs למשך שבועיים, ולאחר מכן ניתן היה להרחיב TIL ספציפיים לגידול מה-PBMCs ולאחר מכן תרבית משותפת נוספת עם PDOs כדי לצפות בהשפעות ציטוטוקסיות15. עם זאת, גישה זו סובלת גם מזמן מידול ממושך ותשואה כוללת נמוכה. לעומת זאת, השיטה המתוארת מאפשרת בידוד והקמה של PDOs ו-TIL מדגימות רקמת גידול קטנות יותר, אשר לאחר מכן ניתן לתרבית משותפת ישירה. גישה זו עשויה להציע נוחות רבה יותר הן מבחינת המתודולוגיה והן מבחינת היעילות. בסופו של דבר, מערכת זו שואפת לספק כלי רב עוצמה להערכה פרה-קלינית של טיפולי TIL, ולסלול את הדרך לאסטרטגיות טיפול מותאמות אישית שעשויות לשפר את התוצאות עבור חולי CRC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים הכוללים חומרים שמקורם בבני אדם נערכו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו מראש על ידי ועדת האתיקה של בית החולים ג'ונגשאן המסונף לאוניברסיטת דאליאן (מספרי אישור: KY2023-206-1). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים שסיפקו דגימות קליניות למחקר זה. הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

קריטריוני ההכללה כללו רקמת סרטן המעי הגס הראשונית שאושרה פתולוגית, גודל מדגם מספיק (≥1 סמ"ק), ללא היסטוריה של טיפול ניאו-אדג'ובנטי (כימותרפיה או טיפול ממוקד), והסכמה מדעת חתומה. קריטריוני ההדרה כללו איכות דגימה ירודה עם נמק או פיברוזיס העולה על 50%, נוכחות של זיהום חמור או מחלה אוטואימונית במקביל, היסטוריה של ממאירויות אחרות וסירוב המטופל להשתתף.

1. הכנת ריאגנט תרבית תאים

  1. מדיום תרבית עבור PDOs CRC: הכן מדיום שלם של CRC PDOs בהתאם להרכב המתואר בטבלה 1.
  2. מדיום שלם (CM) עבור TILs16: תוסף מדיום RPMI1640 עם 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, HEPES, 2-מרקפטואתנול ו-3000 IU/mL IL-2.
  3. מדיום הרחבת TIL (EM): תוספת מדיום RPMI1640 עם 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, HEPES ו-600 IU/mL IL-2.
  4. AdDMEM++++: תוסף DMEM מתקדם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% HEPES, 1% גלוטמין ו-5 מ"מ Y-27632.
  5. מאגר עיכול CRC: הוסף 50 מיקרוליטר קולגנאז מסוג IV ו-10 מיקרוליטר תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B ל-AdDMEM++++.
  6. תמיסת שטיפת רקמות: הוסף 2% פניצילין-סטרפטומיצין ל-PBS.

2. עיבוד רקמות שמקורו במטופל

  1. לכרות את רקמת הגידול העיקרית של סרטן המעי הגס (יבוצע על ידי מנתחים מנוסים). לאחר האיסוף, חלקו את הרקמה לשני חלקים. הניחו חלק אחד ב-AdDMEM++++ בקופסת קרח והעבירו אותו למעבדה לדיסוציאציה ותרבית של תאי גידול. הנח את החלק השני ב-4% פרפורמלדהיד לניתוח היסטופתולוגי17.
  2. יש להפשיר את המטריגל באיטיות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את מאגר הליזיס של אריתרוציטים לטמפרטורת החדר. הכן מספריים לרקמות, מלקחיים, מדיום AdDMEM++++ ומאגר עיכול CRC.
  3. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי ושוטפים שלוש פעמים עם 5 מ"ל PBS. החלף בכלי חדש ושטוף שלוש פעמים עם מאגר שטיפת טישו של 5 מ"ל כדי למזער זיהום.
  4. טוחנים את הרקמה במספריים, מעבירים אותה למאגר העיכול ודוגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד לדיסוציאציה מוחלטת.
  5. חותכים את הרקמה במספריים לרקמות ומעבירים אותה לתמיסת עיכול הרקמות. עכל את הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ופקח עד להשלמת דיסוציאציה של הרקמות.
  6. הוסף נפח שווה של AdDMEM++++ כדי לנטרל את העיכול. צנטריפוגה בטמפרטורה של 380 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  7. השליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה. שימו לב למספר האריתרוציטים בגלולה. מוסיפים 1-3 מ"ל אריתרוציטים ליזאט ודוגרים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
    1. סיים את הליזיס בנפח שווה של AdDMEM++++. צנטריפוגה בטמפרטורה של 380 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של כ-25 מעלות צלזיוס.
  8. השליכו את ה-supernatant באמצעות פיפטה והשעו מחדש את כדור התא בנפח מתאים של AdDMEM++++.
  9. כימות תאים ברי קיימא באמצעות אי הכללה כחולה של טריפאן כדי להשיג השעיה של תא בודד של רקמת הגידול.

3. הקמת מודל PDO ותרבות TIL

  1. חלקו את ההשעיה התאית הבודדת של רקמת הגידול לשני חלקים: השתמש באחד להקמת מודל PDO והשני לתרבית TILs.
  2. לאחר ספירת התאים, ערבבו 80,000 תאים לבאר של תרחיף התאים עם מטריג'ל ביחס של 1:1 להקמת מודל PDO.
  3. השעו מחדש את תרחיף התאים הנותר ב-CM בצלחת של 24 בארות בריכוז של 1 ×-106 תאים/מ"ל לתרבית TILs.
  4. התבוננו מדי יום. צלם תמונות כדי לתעד את הסטטוס של PDOs ו-TILs. החלף את המדיום כל יומיים.

4. טיהור והרחבה של TIL

  1. תרבית TIL למשך 10-20 יום לפני הטיהור.
  2. אוספים TIL לתוך צינור צנטריפוגה. שוטפים את צלחת הבאר במדיום טרי ואוספים את כל התאים שנותרו מצלחת הבאר.
  3. צנטריפוגה ב-125 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של כ-25 מעלות צלזיוס.
  4. השליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה. יש לשטוף עם 2 מ"ל PBS וצנטריפוגה שוב בחום של 125 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של כ-25 מעלות צלזיוס.
  5. ביצוע ספירת תאים.
  6. השתמש בחרוזים מגנטיים CD3+ למיון כדי לבודד תאי CD3+T18.
  7. דגרו את הנוגדן עם תרחיף התא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  8. דגרו את החרוזים המגנטיים עם תרחיף תאי הנוגדן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  9. הנח את עמודת המיון במגנט המיון. הוסף את תרחיף התא לעמודה ואפשר רק לתאים החיוביים המסומנים בחרוזים מגנטיים להישמר בעמודת המיון.
  10. הסר את עמודת המיון מהשדה המגנטי. הוסף תמיסת מאגר כדי להעלים את התאים החיוביים שנשמרו בעמודה. השעו מחדש את התאים ב-2 מ"ל PBS וצנטריפוגה ב-195 × גרם למשך 5 דקות בכ-25 מעלות צלזיוס.
  11. השליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה. השעו מחדש את התאים בצלחת של 12 בארות עם מדיום EM טרי בריכוז של 1 × 106 תאים/מ"ל. הוסף נוגדן CD3 של 5 מיקרוגרם/מ"ל. העבירו את התאים לצלוחיות תרבית חדשות כל 3 ימים.

5. היסטולוגיה ואפיון IHC של PDOs

  1. שאפו את מדיום התרבות לאחר שהאורגנואידים גדלו לגודל של 50 מיקרומטר.
  2. תקן את כדורי האורגנואיד ישירות ב-4% פרפורמלדהיד. שואבים את האורגנואידים, צנטריפוגה ב-195 × גרם למשך 5 דקות בכ-25 מעלות צלזיוס, מטמיעים ב-2% אגרוז, מאפשרים ריפוי ומעבירים ל-4% פרפורמלדהיד לקיבוע בן לילה.
  3. למחרת, בצע התייבשות שיפוע. הכן גושי שעווה, חתוך קטעים של 4 מיקרומטר, החזר לחות באמצעות שיפוע ובצע צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים CK7, CK20, Ki-67 ו-CDX-2.

6. אפיון IF של TIL

  1. טהר את ה-TILs, תרבית אותם עד שמגיעים למספר מתאים, וחלץ חלק לאפיון.
  2. אפיון תאי ההרחפה בשיטת ההתקלפות. הגדר את מהירות הסיבוב של המתקלף ל-343 × גרם למשך 4 דקות בכ-25 מעלות צלזיוס.
  3. ספרו וזרעו את התאים ב-1 × 104 בכל שקופית.
  4. חבר את התאים בחוזקה לשקופיות באמצעות צנטריפוגה.
  5. תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ושטוף שלוש פעמים עם PBS.
  6. דגירה עם תמיסת חסימה (PBS המכיל 2% FBS) למשך שעה.
  7. דגירה עם נוגדנים ראשוניים (CD45, CD3, EpCAM) למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  8. הכן ודגירה עם הנוגדן המשני לפי הריכוז המומלץ של היצרן למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
    הערה: שימו לב להומולוגיה של נוגדנים.
  9. יש לדגור עם DAPI למשך 15 דקות בטמפרטורה של כ-25 מעלות צלזיוס.
  10. התבונן בתאים המוכתמים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

7. מערכת תרבות משותפת של PDOs ו-TIL

  1. הוסף IFN-γ למדיום האורגנואיד כדי לשפר את הצגת האנטיגן. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 24 שעות15.
  2. יש לדלל את הנוגדן נגד CD28 עם PBS. מצפים צלחת של 96 בארות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים לכל באר. אוטמים את הצלחת עם סרט איטום ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. לאחר 24 שעות, נתק את האורגנואידים לתאים בודדים באמצעות TrypLE. ספרו את התאים ושטפו פעמיים עם PBS.
  4. אסוף את ה-TIL המזווג, ספר את התאים ושטוף פעמיים עם PBS.
  5. לחסן אורגנואידים ב-1 ×-104 תאים לבאר ולחסן TIL ב-1 ×-105 תאים לבאר כדי להשיג יחס אפקטור למטרה (E:T) של 10:1 עבור תרבית משותפת.
  6. בצע תרבית משותפת במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 3000 U/mL IL-2 ו-20 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן חוסם PD-1. דגירה למשך 3 ימים וצילום תמונות לתצפית ותיעוד.
    הערה: הגדר אורגנואידים ללא TIL כקבוצת ביקורת.

8. בדיקה פונקציונלית של TIL על ידי ציטומטריית זרימה

  1. אסוף את ה-PDOs וה-TIL בסוף תקופת התרבות המשותפת.
  2. שטפו את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות בכל פעם. השליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.
  3. הכן את קוקטייל הנוגדנים המכיל CD3-FITC, CD4-APC/Cyanine7, CD8-APC, CD107a-PE-Cyanine7, CD279-PE ו-7-AAD.
  4. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, מוגנים מפני אור.
  5. הוסף 1 מ"ל PBS כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.
  6. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS.
  7. בצע ניתוח ציטומטריית זרימה. עיין באיור משלים 1 לאסטרטגיית הניתוח המפורטת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקמה ואפיון של CRC PDOs
דגימות גידול התקבלו מחולי CRC. רקמת גידול CRC שזה עתה נכרתה שימשה להקמת PDOs ו-TILs, אשר שימשו לאחר מכן בניסויי תרבית משותפת של PDO-TIL (איור 1).

figure-results-1
איור 1: סכמטי של זרימת העבודה הניסויית הכוללת. תרשים המתאר את השלבים הרציפים של תכנון הניסוי, כולל הקמת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה משתמש ברקמת CRC שמקורה בחולה כדי להשיג הן תאי גידול והן תאי TIL, מהם נוצרים PDOs ו-TIL מורחבים. האינטראקציה בין שני המרכיבים הללו נחקרת לאחר מכן באמצעות מערכת קו-תרבותית.

במחקרים קודמים, TIL חולצו באמצעות מכשור מורכב19 או ישירות מתרחיפים של רקמת הגידול20. עם זאת, שיטות אלה לרוב אינן מצליחות לייצר מספר מספיק של TIL בתוך מסגרת זמן קצרה מדגימות גידול מוגבלות, ובכך מגבילות את יישומן הנרחב הפיתוח של תרביות You...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [82172822]; תוכנית תמיכה בחדשנות כישרונות ברמה גבוהה של לשכת המדע והטכנולוגיה של דאליאן [2021RD02]; תוכנית משותפת לתוכנית המדע והטכנולוגיה של מחוז ליאונינג [2024JH2/102600067]; פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי למדע וטכנולוגיה של מחוז ליאונינג [2024JH2/101900006].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM/F-12 מתקדםג'יבקו12634028
2-מרקפטואתנולסיגמא63689
4% פרפורמלדהידבי.בי.אייE672002-0100
7-AADביולג'נד420403
A83-01טוקריס2939
תוסף B27ג'יבקו17504-44
CD107a-PE-ציאנין7ביולג'נד328618
CD279-PEביולג'נד329906
נוגדן חד שבטי CD3 (OKT3)Invitrogen14-0037-82
CD3-FITCביולג'נד300406
CD45 (תחום תוך-תאי) (D9M8I) CST13917
CD4-APC/ציאנין7ביולג'נד300518
CD8-APCביולג'נד344722
CDX-2מקסימבולרמ"א-0631
CK20מקסימבולקיט-0025
CK7מקסימבולקיט-0021
Dylight 488, עיזים נגד ארנב IgGאבקיןA23220
Dylight 549, עיזים נגד עכבר IgGאבקיןA23310
EGFפפרוטקAF-100-15
אפקאםCSTברקוד 36746ט
סרום בקר עוברי (FBS)סלמקססה211.02
מהשדה 10פפרוטק100-26
גסטרין (אנושי)טוקריס3006
גלוטמקס 100xג'יבקו35050-061
HepesסיגמאH4034
הפססיגמאH4034
ערכת הפרדת תאים CD3+ אנושית (RUO)RWDK1201-10
חלבון רקומביננטי IFN-גמא אנושיפפרוטק300-02-20UG
קי-67CST9449
מטריגלקורנינג354234
N-אצטילציסטאיןסיגמאא9165
ניקוטינאמידסיגמאN0636
ניבולומאב (אנטי-PD-1)סלרקA2002 
פניצילין/סטרפטומיציןסיגמאV900929
פניצילין-סטרפטומיציןNCM ביוטקC100C5
פרימוציןאינוויוגןAnt-pm-1
מאגר ליזה RBCתרמו-אינוויטרוגן00-4300-54
IL-2 אנושי רקומביננטי (ללא נשא)ביולג'נד589104
RPMI 1640ג'יבקו
SB202190סלרקS1077
כתם כחול טריפן 0.4%תרמו-אינוויטרוגןT10282
נוגדן CD28 אנטי-אנושי מטוהר Ultra-LEAFביולג'נד302934
נוגדן CD3 אנטי-אנושי מטוהר Ultra-LEAFביולג'נד317325
י-27632סלרקS1049

מקורות

  1. Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
  2. Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
  3. Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol Immunol. 18 (4), 842-859 (2021).
  4. Betof Warner, A., Corrie, P. G., Hamid, O. Tumor-infiltrating lymphocyte therapy in melanoma: Facts to the future. Clin Cancer Res. 29 (10), 1835-1854 (2023).
  5. Huang, H., et al. Phase I study of adjuvant immunotherapy with autologous tumor-infiltrating lymphocytes in locally advanced cervical cancer. J Clin Invest. 132 (15), e157726(2022).
  6. Mengus, C., et al. In vitro modeling of tumor-immune system interaction. ACS Biomater Sci Eng. 4 (2), 314-323 (2018).
  7. Wang, H., Tian, T., Zhang, J. Tumor-associated macrophages (tams) in colorectal cancer (crc): From mechanism to therapy and prognosis. Int J Mol Sci. 22 (16), 8470(2021).
  8. Rasyid, N. R., et al. The potential of PD-1 and PD-L1 as prognostic and predictive biomarkers in colorectal adenocarcinoma based on TILs grading. Curr Oncol. 31 (12), 7476-7493 (2024).
  9. Chen, E., Zeng, Z., Zhou, W. The key role of matrix stiffness in colorectal cancer immunotherapy: Mechanisms and therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (6), 189198(2024).
  10. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).
  11. Lv, J., et al. Construction of tumor organoids and their application to cancer research and therapy. Theranostics. 14 (3), 1101-1125 (2024).
  12. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 11 (513), eaay2574(2019).
  13. Magré, L., et al. Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies. J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).
  14. Matsueda, S., Chen, L., Li, H., Yao, H., Yu, F. Recent clinical researches and technological development in til therapy. Cancer Immunol Immunother. 73 (11), 232(2024).
  15. Cattaneo, C. M., et al. Tumor organoid-t-cell co-culture systems. Nat Protoc. 15 (1), 15-39 (2020).
  16. Itzhaki, O., et al. Establishment and large-scale expansion of minimally cultured "young" tumor infiltrating lymphocytes for adoptive transfer therapy. J Immunother. 34 (2), 212-220 (2011).
  17. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26.e16 (2020).
  18. Moore, D. K., Motaung, B., Du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Isolation of b-cells using miltenyi macs bead isolation kits. PLoS One. 14 (3), e0213832(2019).
  19. Albrecht, H. C., et al. Generation of colon cancer-derived tumor-infiltrating t cells (tils) for adoptive cell therapy. Cytotherapy. 25 (5), 537-547 (2023).
  20. Tan, Y. S., Lei, Y. L. Isolation of tumor-infiltrating lymphocytes by ficoll-paque density gradient centrifugation. Methods Mol Biol. 1960, 93-99 (2019).
  21. Ou, L., et al. Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies. EBioMedicine. 92, 104614(2023).
  22. Huang, H., et al. Patient-derived organoids as personalized avatars and a potential immunotherapy model in cervical cancer. iScience. 26 (11), 108198(2023).
  23. Parikh, A. Y., et al. Using patient-derived tumor organoids from common epithelial cancers to analyze personalized T-cell responses to neoantigens. Cancer Immunol Immunother. 72 (10), 3149-3162 (2023).
  24. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  25. Xu, Y., et al. An engineered IL-15 cytokine mutein fused to an anti-PD1 improves intratumoral T-cell function and antitumor immunity. Cancer Immunol Res. 9 (10), 1141-1157 (2021).
  26. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  27. Trefny, M. P., et al. Deletion of Snx9 alleviates CD8 T cell exhaustion for effective cellular cancer immunotherapy. Nat Commun. 14 (1), 86(2023).
  28. Sarnaik, A. A., et al. Lifileucel, a tumor-infiltrating lymphocyte therapy, in metastatic melanoma. J Clin Oncol. 39 (24), 2656-2666 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אורגנואידים של סרטן המעי הגסתרבית משותפת של אורגנואידיםאורגנואידים המופקים מחולההרחבת TILחרוזי מגנט CD3ציטומטריה זורמתבידוד תאי מערכת החיסוןהערכת ציטוטוקסיותצביעת אימונופלורסצנציה
הקמת מערכת תרבית משותפת של אורגנואידים של גידול המעי הגס שמקורם בחולה ולימפוציטים חודרים לגידול (TILs)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.