מאמר שיטה

מתן Δ 9-Tetrahydrocannabinol (THC) בעכברים מתבגרים ובוגרים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68358

⸱

1 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Irvine, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine

במאמר זה

סיכום

Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) הוא המרכיב המשכר בקנאביס וחומר מבוקר בארצות הברית. מאמר זה מתאר נהלים סטנדרטיים להשגה, אחסון ומתן THC לעכברים העומדים בתקנות החוקיות הנוכחיות ומציג בקצרה שיטה להערכת ההשפעות הפרמקודינמיות הבסיסיות של THC במכרסמים.

תקציר

Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) אחראי להשפעות המשכרות (פסיכוטרופיות) של קנאביס ומוצרים שמקורם בקנאביס הזמינים כיום בשווקים החוקיים והלא חוקיים. ההשפעות הפסיכוטרופיות של THC מיוצרות באמצעות הפעלה של קולטני קנבינואידים CB1 במוח, המעורבים בדרך כלל על ידי חומרים קנבינואידים אנדוגניים (אנדוקנבינואידים). מחוץ למוח, THC תורם לוויסות של מגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים על ידי הפעלת קולטני CB1 ו-CB2. הפונקציות הפיזיולוגיות המשרתות חומרים אנדוקנבינואידים וקולטני קנבינואידים - הידועים בשם המערכת האנדוקנבינואידית - משתנים במידה ניכרת לאורך החיים, כאשר גיל ההתבגרות הוא תקופה של רגישות מוגברת לתרומות של קומפלקס איתות זה. מאמר זה מתאר פרוטוקול להכנת THC למתן פרנטרלי והערכת השפעותיו הפרמקודינמיות החריפות בעכברים משני המינים בשני שלבים התפתחותיים: גיל ההתבגרות והבגרות הצעירה. תוך התמקדות בשלוש מנות הנמצאות בשימוש נרחב בספרות (1, 5 ו-10 מ"ג/ק"ג) והמסלול התוך-צפק, מומחשות ההשפעות הידועות של THC-השראת קטלפסיה, עיכוב פעילות תנועתית ודיכוי כאב. יתרה מכך, בהתחשב במעמדו של THC כחומר מבוקר בארצות הברית, הנהלים להשגתו ואחסונו בהתאם לחקיקה הנוכחית מתוארים בקצרה.

מבוא

שכיחות השימוש בקנאביס באוכלוסייה הבוגרת של ארצות הברית טיפסה ברציפות בעשורים האחרונים ונותרה גבוהה בשנת 2023. בקרב מבוגרים בגילאי 19 עד 30, כ-42% דיווחו על שימוש בקנאביס בשנה האחרונה, 29% בחודש האחרון ו-10% דיווחו על שימוש יומיומי או כמעט יומיומי (20 פעמים או יותר ב-30 הימים האחרונים)1. עבור מבוגרים בגילאי 35 עד 50, הנתונים הם 29%, 19% ו-8%, בהתאמה. למרות שהערכות אלה אינן שונות סטטיסטית מאלו שהתקבלו בשנת 2022, הן מצביעות על עלייה במהלך 5 ו-10 השנים האחרונות עבור שתי הקבוצות הדמוגרפיות1. חשוב לציין, הראיות הנוכחיות מצביעות על כך שכ-9% מהאנשים המשתמשים בקנאביס מפתחים סבילות ותלות לסם - מצב המכונה הפרעת שימוש בקנאביס (SUD)2 ודאגה בריאותית פוטנציאלית3.

כמו בסמים פסיכואקטיביים אחרים, השימוש בקנאביס מתחיל בדרך כלל בשנות העשרה המוקדמות ועולה בהדרגה במהלך גיל ההתבגרות. בשנת 2023, 8% מתלמידי כיתות ח' בארצות הברית, 18% מתלמידי כיתותי' ו-29% מתלמידי כיתהי"ב דיווחו שהשתמשו בסם לפחות פעם אחת4. למרות יציבות יחסית בשנים האחרונות, גם לנוכח ירידה בתפיסת הסיכון 5,6, מספרים אלה נותרו גבוהים מדי. בנוסף לשימוש הנרחב שאינו רפואי, קנאביס הראה פוטנציאל טיפולי במגוון מצבים רפואיים 7,8. צורה סינתטית של המרכיב המשכר (הפסיכוטרופי) שלה, Δ 9-tetrahydrocannabinol (THC) (איור 1), משמשת במשך יותר מ-40 שנה כתרופת מרשם לטיפול בבחילות ואובדן תיאבון בחולי HIV וסרטן העוברים כימותרפיה 9,10. גם THC וגם הקנבידיול האנלוגי שלו (CBD) (איור 1), שאינו פסיכוטרופי, היו מעורבים בניהול כאב, דלקת והפרעות נוירולוגיות שונות11,12. לכן, ההתפשטות המהירה של מוצרים שמקורם בקנאביס רפואי - למשל, באפילפסיה בילדות ואוטיזם - מציגה גם קבוצות חדשות של צעירים לסם. התפתחויות אלה מדאיגות במיוחד בהקשר חברתי שבו שינויי חקיקה והרחבת הקבלה מזינים אינטרסים פיננסיים שיכולים לגבור על דאגות בריאות ובטיחות הציבור13.

קנאביס המכיל THC ('מריחואנה') נצרך בצורות שונות, כולל עישון, אידוי, אכילים, תמיסות ושמנים. לאחר הבליעה, THC מתפזר בכל הגוף ונכנס למוח, שם הוא מייצר אופוריה, הרפיה, שינוי בתפיסה החושית ותיאבון מוגבר, אם כי הוא יכול גם לגרום לחרדה ופרנויה אצל אנשים מסוימים14,15. THC מקיים אינטראקציה עם המערכת האנדוקנבינואידית (ECB) על ידי הפעלת שני סוגים של קולטני קנבינואידים (CB) הממוקמים הן בתוך המוח והן מחוצה לו15,16. במוח, שבו קולטני CB1 נמצאים בשפע ביותר, הפעלתם משפיעה בין היתר על מצב הרוח, תפיסת הכאב, התיאבון והקוגניציה. THC גם מפעיל קולטני CB1 ו-CB2 באיברים היקפיים, ומשפיע על חילוף החומרים של אנרגיה מערכתית - כולל צריכה, ספיגה ואחסון של חומרים מזינים - כמו גם התחלת כאב, דלקת וחסינות17,18.

ל-THC יש השפעות חריפות ומתמשכות, ועדיין נדרש מחקר פרה-קליני וקליני נוסף על ההשלכות ארוכות הטווח של שימוש בקנאביס. יש לשים דגש מיוחד על תופעות הלוואי הפוטנציאליות ל-THC במינון גבוה, בהתחשב בכך שריכוז ה-THC הממוצע בקנאביס הנמכר בארה"ב עלה בעשורים האחרונים מ-8.9% ב-2008 ל-17.1% ב-2017ואף גבוה יותר בשנים האחרונות. 'מוצרי קנאביס בעלי עוצמה גבוהה' (מוצרים המכילים ריכוזים גבוהים של THC) נפוצים בשווקים חוקיים רבים ברחבי ארצות הברית, שם תכולת ה-THC הממוצעת בפרחי הקנאביס היא 20-35%, כאשר חלק ממוצרי המיצוי מגיעים עד 90% THC. במינונים גבוהים אלה, ל-THC עשויות להיות השפעות שונות מבחינה איכותית מאלו שיוצרו על ידי הקנאביס המסורתי בעל העוצמה הנמוכה ששימש בשנות ה-70 וה-80, שהכיל 6% THC או פחותמ-20. לפיכך, הבנת הפרמקולוגיה של מוצרי קנאביס בעלי עוצמה גבוהה היא קריטית כדי ליידע אסטרטגיות מניעה ולהנחות מדיניות רגולטורית ופיסקאלית. בנוסף, הבנת האופן שבו גורמים כמו גיל, גנטיקה ומצבים קיימים משפיעים על תגובות אישיות ל-THC יכולה לעזור להתאים מניעה וטיפול לאוכלוסיות ספציפיות. בפרט, יש לחקור עוד יותר את ההשלכות של שימוש בקנאביס על ידי בני נוער ואמהות לעתיד או מניקות שכן חשיפה לקנבינואידים בתקופות טרום לידתיות/סביב הלידה וגיל ההתבגרות, בהן מערכת ה-ECB ממלאת תפקיד נוירו-התפתחותי מרכזי, עלולה להוביל לתוצאות שליליות מתמשכות21. כמו כן, יש צורך במחקר נוסף כדי להבין כיצד THC מקיים אינטראקציה עם תרופות או חומרים אחרים. נתונים מקיפים על הבטיחות והיעילות של THC יכולים ליידע החלטות רגולטוריות ומדיניות בריאות הציבור, ולהבטיח שימוש בטוח בהקשרים רפואיים ולא רפואיים כאחד.

כאן, אנו מתארים נהלים סטנדרטיים להשגה, אחסון וניהול THC בסביבת מעבדה בהתאם לחקיקה הנוכחית בארצות הברית (חוק החומרים המבוקרים משנת 1971). תוך התמקדות בשלוש מנות THC הנמצאות בשימוש נרחב בספרות המדעית (1, 5 ו-10 מ"ג/ק"ג)22 ודרך המתן התוך-צפקית (i.p), הודגמו שלוש השפעות קלאסיות על THC: השראת קטלפסיה, עיכוב פעילות תנועתית ונוגדי כאב. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה גם לאחר זריקות THC מרובות כדי לחקור את ההשלכות של שימוש כרוני ב-THC, מה שמוביל לסבילות ולמגוון השלכות על בריאות הנפש שאינן נצפות בדרך כלל במתן חריף בבני אדם.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, ובוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות ניסוי.

1. נהלים להשגה ואחסון של THC

הערה: בארצות הברית, שימוש ב-THC במסגרת מחקר אקדמית דורש ביצוע מספר צעדים הנדרשים על ידי המעמד החוקי של הקנאביס. גם קנאביס וגם THC שמקורו בקנאביס מסווגים כחומרים מבוקרים בלוח I. מסיבה זו, לפני שניתן לרכוש קנאביס או THC, על החוקרים לקבל רישיון מהמינהל לאכיפת סמים (DEA). סקירה כללית של תהליך זה, שיכול להימשך עד 6 חודשים או יותר, מסופקת להלן.

  1. קביעת היקף המחקר: הגדירו את המטרה והיעדים של תהליך המחקר וציינו מדוע THC נחוץ. פתח פרוטוקול מחקר המפרט את כמויות ה-THC הדרושות, מקורו המסחרי וכיצד הוא יטופל ויאוחסן. כלול כמה שיותר פרטים רלוונטיים.
  2. קבלת אישור רגולטורי מוסדי: הגש את הצעת המחקר לוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המוסד המקומי (לעבודה פרה-קלינית) או לוועדת הביקורת המוסדית (IRB) (לעבודה קלינית). שלב סקירה זה מגן על זכויותיהם של נבדקי המחקר ומבטיח שהמחקר עומד בסטנדרטים אתיים.
  3. עמידה בתקנות המדינה: שימו לב לכל תקנות ספציפיות למדינה בנוגע למחקר קנאביס, מכיוון שהן יכולות להשתנות באופן משמעותי. לדוגמה, בקליפורניה, קבל אישור מהפאנל המייעץ למחקר של קליפורניה (RAPC)23.
  4. השגת THC: רכשו קנאביס ו-THC ממגדלים או יצרנים בעלי רישיון למטרה זו.
    הערה: רשימה של מטפחים מאושרים זמינה באתר האינטרנט של ה-DEA. המכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) מספק THC באמצעות תוכנית אספקת הסמים של NIDA24. כדי להגיש בקשה לתוכנית זו, יש לספק מידע על מוסד, פרוטוקול מחקר מפורט ותיעוד של תקנות מוסדיות כגון מכתבי אישור IACUC או IRB. מילוי טופס 222 של ה-DEA, שהוא הטופס בן העמוד היחיד המיועד במיוחד לכל מספר רישום של ה-DEA, נדרש לרכישה או העברה של חומרים מבוקרים בלוח זמנים 1.
  5. קבלה ואחסון של THC
    1. אחסן THC בכספת או בכספת נעולה היטב העוקבת אחר עיצוב שאושר על ידי ה-DEA. יש לשלוט בגישה לאזור המחקר (למשל, יש לנעול את דלתות הבניין ו/או המעבדה). רק לצוות מורשה צריכה להיות גישה ל-THC.
    2. הכן והגדר רשימה של אנשים המורשים לגשת אליה, ושמור על הרשימה מעודכנת. סמן בבירור את מיכלי ה-THC עם שם, ריכוז, תאריך קבלה ואזהרות סכנה.
    3. פעל לפי נהלי סילוק שנקבעו, הדורשים תיעוד ספציפי ועמידה בתקנות הפדרליות והמדינתיות. שמור על THC בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או פחות.
  6. ניהול מלאי:
    1. הטמיעו מערכת מלאי חזקה כדי לעקוב אחר הכמות, השימוש והמיקום של ה-THC. הכינו קלסר חומרים מבוקרים, הכולל רישיון Schedule 1, מידע אישי מורשה, רשומות של כל הקבלות, הסילוקים וכל שימוש בחומרים (איור 2).
    2. בצע ביקורות שוטפות של נוהלי המלאי והאחסון על ידי השלמת יומן המלאי הדו-שנתי כדי להבטיח עמידה בדרישות הרגולטוריות. בדוק יומני גישה ורשומות מלאי מעת לעת.
  7. הדרכה ופרוטוקולים: יש לספק הדרכה לכל אנשי הצוות המטפלים ב-THC. יש לקבוע פרוטוקולים ברורים לאחסון, טיפול וסילוק התרופה.
    הערה: על ידי יישום שיטות אלה, מעבדות אקדמיות יכולות להבטיח שהן עומדות בדרישות החוק ולשמור על סביבת מחקר בטוחה.

2. נהלים למתן THC לעכברים בהזרקת i.p.

הערה: בעת טיפול ב-THC, חיוני לשלוט בטמפרטורה ולהגן על התרכובת מפני אור כדי לשמור על יציבותה. THC רגיש לחום ויש לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או מתחת לאחסון לטווח ארוך. לאחסון לטווח קצר, ניתן לשמור THC בטמפרטורת החדר או בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות. THC רגיש גם לאולטרה סגול (UV) ולאור נראה, מה שעלול לגרום לפירוק באמצעות חמצון. כדי למנוע זאת, יש לאחסן THC במיכלי זכוכית ענבר אטומים או במיכלים שקופים עטופים בנייר אלומיניום ולאחסן בחושך. מומלץ לתייג את כל הדגימות עם תאריכים ותנאי אחסון כדי להבטיח מעקב ויציבות נאותים.

  1. חומרים
    1. הכן את כל התמיסות באמצעות מים טהורים במיוחד וריאגנטים בדרגה אנליטית. השג THC מ-Cayman Chemical (אן ארבור, מישיגן) או RTI International (Research Triangle Park, NC) או דרך תוכנית אספקת התרופות של NIDA24.
  2. ציוד ואספקה
    1. ודא שהפריטים המפורטים בטבלת החומרים מוכנים לפני תחילת ההליך.
      הערה: חיוני להשתמש בבקבוקוני זכוכית (8 מ"ל או דומה) ובמיכלים בעת עבודה עם THC. פלסטיק יכול להגיב או לספוג מולקולות הידרופוביות כגון THC, מה שעלול להוביל לאובדן דגימה או לריכוזים לא עקביים. זכוכית יציבה כימית ואינה מגיבה, מה שמסייע במניעת אינטראקציות לא רצויות עם מולקולות הידרופוביות.
  3. נהלים למתן THC בעכברים
    1. הסר את מיכל ה- THC מארונית הבטיחות במקפיא.
    2. שמור את המיכל על קרח, משוך נפח מתאים של THC באמצעות פיפטה והוסף אותו בזהירות לתחתית בקבוקון זכוכית של 8 מ"ל. חשב את הנפח על סמך המינון (מ"ג/ק"ג) ומשקל הגוף של העכברים (גרם).
    3. העבירו את הבקבוקון למכסה אדים כימי ואידו בעדינות את הממס ליובש עם זרם עדין של גז חנקן. הקפד לא להתיז את התמיסה המכילה THC על דפנות הבקבוקון, מכיוון שהדבר יגרום לאובדן חמור. תהליך זה אורך כ-5-10 דקות.
    4. רשום ביומן השימוש בחומר מבוקר I בקלסר החומרים המבוקרים כמה THC נלקח מהבקבוקון שנמצא בשימוש כעת.
    5. כאשר הממס מיובש לחלוטין, הוסף נפח מתאים של Tween-80. זהו נפח Tween-80 הנדרש להשגת ריכוז סופי של 5% של Tween-80 במי מלח, כפי שמוצג בשלב 2.3.8.
    6. מחממים את הבקבוקון בכוס המכילה מים חמים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס או פחות. מערבל את הבקבוקון כדי להמיס את ה- THC במלואו ולחזור על הפעולה לפי הצורך.
    7. הוסף בהדרגה תמיסת מלח סטרילית במרווחים קטנים: למשל, 200 מיקרוליטר, 300 מיקרוליטר, 500 מיקרוליטר ו -1 מ"ל. מערבולת ומחממים.
    8. חזור על שלבים 2.3.6 ו-2.3.7 עד להוספת הנפח הכולל של מי מלח הדרוש ליצירת תמיסת THC סופית ב-5% Tween-80 ו-95% מלח והתמיסה מומסת במלואה.
    9. (אופציונלי) סוניק את הבקבוקון באמבט מים אולטראסוני המוגדר לכ-100% הספק ב-40 קילו-הרץ ו-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ודא שהתמיסה צלולה וללא כל חומר לא מומס. צבע הנוזל עשוי להשתנות בהתאם לרכב בו נעשה שימוש.
    10. שקלו את העכבר וקבעו את הכמות המתאימה להזרקה. נפח ההזרקה צריך להיות 10 מ"ל/ק"ג לעכבר.
    11. המשך עם הזריקות התוך-צפקיות (i.p). ודא שתמיסות THC מוכנות טריות ביום השימוש.

3. נהלים להערכת ההשפעות הפרמקולוגיות של THC

  1. חיות
    1. השתמש בעכברים משני המינים למחקר זה.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש בעכברים מתבגרים (יום לאחר הלידה, PND, 30-35) ובוגרים (PND 70-75) C57BL/6J משני המינים ממעבדות ג'קסון (פרמינגטון, קונטיקט).
      הנוהל חל על זני עכברים אחרים.
    2. שיכנו את העכברים בכלובים מאווררים (4-5 לכלוב) עם מזון ומים זמינים אד ליביטום. הקצו בעלי חיים מותאמים לגיל ולמשקל באופן אקראי לקבוצות טיפול ואפשרו להם להתאקלם לפחות שבוע אחד לפני הניסויים.
    3. שמרו על חדרי המגורים במחזור אור של 12 שעות/12 שעות חושך (אורות דולקים בשעה 6:30 בבוקר) עם טמפרטורה קבועה (20 ± 2 מעלות צלזיוס) ולחות יחסית (55%-60%).
  2. קבוצות ניסוי
    1. חלקו כל קבוצת גיל ומין לארבע קבוצות טיפול: קבוצת ביקורת אחת לרכב ושלוש קבוצות טיפול THC למינונים של 1, 5 ו-10 מ"ג/ק"ג.
  3. מינהל תרופות
    1. THC טרי כמתואר לעיל ברכב של 95% מי מלח עם 5% Tween-80 וניתן בהזרקת i.p.
  4. בדיקות התנהגותיות
    הערה: בדוגמה זו, כל חיה עברה את הבדיקות המתוארות להלן כדי לעקוב אחר השפעות ה-THC22. שלושת המבחנים ההתנהגותיים נערכו ברצף על אותה קבוצה של בעלי חיים. סדר ההליכים היה: תנועה (30 דקות לאחר THC), קטלפסיה (45 דקות לאחר THC) וטבילת זנב (60-, 180 ו-300 דקות לאחר THC) (איור 3). עבור ניסויי הנשים המתבגרות, השתמשנו שוב באותה קבוצה שטופלה ברכב ולאחר מכן נתנו 1 מ"ג/ק"ג או 10 מ"ג/ק"ג THC לאותה קבוצה על מנת לבצע את בדיקות הקטלפסיה וטבילת הזנב. גישה זו אפשרה לנו להגיע לעוצמה סטטיסטית מספקת תוך מזעור מספר בעלי החיים בשימוש, בהתאם להנחיות אתיות. ההתנהגות תועדה באמצעות מצלמת וידיאו, וקבצי סרטים נותחו באמצעות תוכנת מעקב התנהגותית.
    1. בדיקת קטלפסיה
      הערה: קטלפסיה בעכברים היא מצב פיזיולוגי (פתו) המאופיין בחוסר תנועה רצונית, נוקשות היציבה והתנגדות לשינויים חיצוניים בתנוחת הגוף. זה נחשב לאחת מארבע ההשפעות הסטנדרטיות של THC, יחד עם עיכוב תנועה, נוגדי כאב וירידה בטמפרטורת הגוף. בדוגמה זו, התנהגות קטלפטית הוערכה על סמך נהלים שנקבעו22, כמפורט להלן:
      1. הגדרה: הכן מוט אופקי (באורך 7 ס"מ) מוגבה 4 ס"מ מעל פני השטח של ספסל מעבדה נקי עם תאורת סביבה רגילה (160 לוקס). מקם טיימר אלקטרוני בקרבת מקום שמוכן לשימוש.
      2. העבירו את העכבר ממתקני הדיור למעבדת הבדיקה והתאקלמו בתוך הכלוב למשך 60 דקות לפני הבדיקה. ללבוש חלוק מעבדה נקי וללא בושם.
      3. בעזרת כפפות לטקס נקיות, הוציאו בעדינות את העכבר מהכלוב שלו, תנו בבטחה כמות מתאימה של THC או רכב והחזירו אותו לכלוב.
      4. בזמן מתאים לאחר הזרקת THC (45 דקות במקרה זה), הוציאו את העכבר מהכלוב והניחו בעדינות את כפותיו הקדמיות על המוט האופקי.
      5. רשום זמן חוסר תנועה באמצעות הטיימר האלקטרוני.
        הערה: זמן חוסר תנועה מוגדר כזמן שעובר מרגע הנחת העכבר על המוט ועד לרגע שבו הוא מסיר כף אחת או את שתיהן.
      6. עצור את הטיימר כאשר העכבר מסיר את אחת הכפות או את שתיהן מהמוט או כאשר מגיע זמן הניתוק של 10 שניות.
      7. חזור על הבדיקה פעמיים עבור כל עכבר, עם מרווח מנוחה של 2 דקות בין ניסיונות.
      8. השתמש בממוצע של שני זמני חוסר התנועה לניתוח נתונים סופיים.
      9. מדד תוצאה: השתמש בזמן חוסר תנועה (בשניות) כאינדיקטור לקטלפסיה.
    2. מבחן שדה פתוח (פעילות תנועתית בסביבה חדשה)
      הערה: היפו-תנועה הנגרמת על ידי THC מוערכת באמצעות מבחן השדה הפתוח ובהתאם לפרוטוקולקבוע 25.
      1. הגדרה: השתמש בזירה בשטח פתוח המצוידת בציוד מעקב וידאו לבדיקה זו. ודא שהזירה בשטח הפתוח נקייה וללא רמזי ריח מניסויים קודמים.
        הערה: ניתן לבצע ניקוי יעיל באמצעות מוצרים זמינים מסחרית המתוארים בטבלת החומרים.
      2. העבירו את העכבר ממתקני הדיור למעבדת הבדיקה והתאקלמו בכלוב למשך 60 דקות לפני הבדיקה. ודא שבחדר הבדיקה יש תאורה בעוצמה נמוכה (10 לוקס)25. לבשו חלוק מעבדה נקי, ואל תשתמשו בבושם.
      3. בעזרת כפפות נקיות, הוציאו בעדינות את העכבר מהכלוב שלו, תנו בבטחה כמות מתאימה של THC או רכב, והחזירו את העכבר לכלוב.
      4. בזמן מתאים לאחר הזרקת THC (30 דקות במקרה זה), הנח את העכבר בעדינות במרכז הזירה, תוך הקפדה על מזעור לחץ הטיפול.
      5. הקלט הפעלות של 10 דקות באמצעות מצלמת וידיאו ותוכנת מעקב התנהגותית.
      6. לאחר הבדיקה, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו ונקו את הזירה היטב עם תמיסת הניקוי שתוארה לעיל.
      7. מדד תוצאה: חשב את המרחק הכולל שנסע, נמדד במטרים, כפרמטר העיקרי לכימות פעילות תנועתית.
    3. מבחן טבילת זנב (סף נוסיספטיבי, המכונה גם מבחן נסיגת זנב מים חמים)
      הערה: Nociception מוערכת באמצעות מבחן טבילת הזנב, כפי שתואר קודם לכן26. בדיקה זו משמשת להערכת יעילותם של משככי כאבים פוטנציאליים ולהערכת הסבילות להשפעותיהם. במהלך הבדיקה מופעל חום על זנב העכבר כגירוי כואב, ונמדד הזמן להרחיק את הזנב ממקור החום.
      1. הגדרה: הכינו אמבט מים הנשמר ב-54 מעלות צלזיוס בתאורת סביבה רגילה (160 לוקס). מקם טיימר אלקטרוני בקרבת מקום שמוכן לשימוש.
      2. רסנו בעדינות את העכבר באמצעות כיס רקמות רכות שנוצר באמצעות רפידות אילוף לחיות מחמד (Glad), כדי להבטיח שהזנב יישאר נגיש.
      3. טבלו את השליש הדיסטלי של הזנב באמבט המים והפעל את הטיימר בו זמנית.
      4. רשום את ההשהיה לנסיגת הזנב (בשניות), המוגדרת כתנועה רפלקסיבית של הזנב.
      5. הגדר זמן ניתוק מקסימלי של 10 שניות כדי למנוע נזק לרקמות ואי נוחות.
      6. חזור על המדידה פעמיים עבור כל עכבר בכל נקודת זמן (במקרה זה, 60, 180 ו-300 דקות לאחר הזרקת THC), עם מרווח של 5 דקות בין הניסויים.
      7. ממוצע של שתי מדידות ההשהיה לניתוח נתונים.
      8. מדד תוצאה: חשב את ההשהיה לנסיגה מזנב, נמדד בשניות, כמשתנה התוצאה העיקרי להערכת השפעות נוגדות כאב.
  5. ניתוחים סטטיסטיים
    1. בטא תוצאות כאמצעים ± SEM. קבע מובהקות באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Šídák או ANOVA תלת-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Tukey. קחו בחשבון את ההבדלים המשמעותיים אם P < 0.05.
      הערה: GraphPad Prism גרסה 10.4 שימשה לביצוע הניתוח.

תוצאות

כדי להמחיש את הפרוטוקול המתואר לעיל, אנו מציגים תוצאות על ההשפעות הפרמקולוגיות החריפות של THC. ארבע קבוצות של עכברים (8 בכל קבוצה), זכר מתבגר, זכר בוגר, נקבה מתבגרת ונקבה בוגרת, קיבלו שלוש מנות של THC - 1, 5 ו-10 מ"ג/ק"ג - יחד עם רכב כביקורת. לאחר מכן, הוערכו קטלפסיה, פעילות תנועתית וכאבים, תוך התמקדות בתלות במינון של ההשפעות וההבדלים בין המינים והגילאים.

ראשית, עבור ההשפעות הקטלפטיות החריפות THC ייצר קטלפסיה תלוית מינון בעכברים זכרים מתבגרים ובוגרים (איור 4A וטבלה 1). משך התגובה היה תלוי מינון (P<0.0001, ANOVA דו-כיווני), כאשר 5 ו-10 מ"ג/ק"ג יצרו השפעות מובהקות סטטיסטית בשתי קבוצות הגיל, בהשוואה לביקורת הרכב בכל קבוצה (P < 0.0001 על ידי מבחן ההשוואות המרובות של Šídák). במינון של 10 מ"ג/ק"ג, THC ייצר קטלפסיה הן בעכברים מתבגרים והן בעכברים נקבות בוגרות (איור 4B וטבלה 2), כאשר נקבות בוגרות הראו תגובה פחות בולטת בהשוואה לנקבות מתבגרות (P < 0.0001 על ידי מבחן ההשוואות המרובות של Šídák). מערכי הנתונים נותחו עוד כדי לקבוע אם סקס השפיע על קטלפסיה הנגרמת על ידי THC. תגובה מינית דו-צורתית צנועה אך משמעותית נצפתה אצל מתבגרות בהשוואה לגברים (P = 0.0204) (איור 4C וטבלה 3). השפעה חזקה משמעותית של מין נמצאה אצל נקבות בוגרות, שהיו פחות רגישות באופן משמעותי להשפעות הקטלפטיות של THC בהשוואה לעכברים בוגרים זכרים (P < 0.0001) (איור 4D וטבלה 4).

שנית, עבור ההשפעות התנועתיות החריפות THC הפחית את הפעילות התנועתית בעכברים זכרים (איור 5A וטבלה 5). השפעה זו הייתה תלויה הן במינון THC והן בגיל בעלי החיים (P < 0.0001 ו-P = 0.0042, בהתאמה), כאשר עכברים מתבגרים היו רגישים יותר להשפעת THC בהשוואה לעכברים בוגרים. בדיקות השוואה מרובות לאחר הוק הצביעו על כך שבמינון THC של 5 מ"ג/ק"ג, עכברים מתבגרים נעו פחות באופן משמעותי מעכברים בוגרים (P < 0.0001). THC הפחית את הפעילות התנועתית גם בעכברים נקבות (איור 5B וטבלה 6). ANOVA דו-כיווני הראה השפעות משמעותיות הן של מינון והן של גיל גם בעכברים נקבות (P < 0.0001 ו-P = 0.0103, בהתאמה) (איור 5B וטבלה 6). עם זאת, מבחני השוואה מרובים לאחר הוק לא חשפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין עכברים מתבגרים ועכברים נקבות בוגרות במינונים של 0 או 10 מ"ג/ק"ג THC (איור 5B). מערכי נתונים אלה נותחו עוד יותר כדי לקבוע אם סקס השפיע על היפו-תנועה הנגרמת על ידי THC. דימורפיזם מיני לא נצפה בעכברים מתבגרים (איור 5C וטבלה 7); עם זאת, עכברים בוגרים הפגינו דימורפיזם מיני מובהק סטטיסטית (P = 0.0046), כאשר נקבות בוגרות הראו תנועה גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לזכרים בוגרים. עם זאת, מבחני השוואה מרובים לאחר הוק לא חשפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין המינים במינונים של 0 או 10 מ"ג/ק"ג THC (איור 5D וטבלה 8).

שלישית, עבור ההשפעות האנטי-נוציספטיביות החריפות THC הפחית את הכאב בטבילת הזנב בעכברים זכרים (מתבגרים, איור 6A וטבלה 9; מבוגרים, איור 6C וטבלה 11). בגברים מתבגרים, THC הביא להשפעות נוגדות כאב משמעותיות ב-5 ו-10 מ"ג/ק"ג, שנבדקו ב-60, 180 ו-360 דקות לאחר מתן (P < 0.0001 על ידי מבחן ההשוואות המרובות של Šídák, ביחס לחביון הזנב של עכברי בקרת רכב) (איור 6A וטבלה 9). ANOVA דו-כיווני אישר את ההשפעות החזקות של מינון THC על חביון הזנב (P < 0.0001) והראה ירידה תלוית זמן בהשפעות נוגדות כאב, במיוחד במינון הגבוה ביותר (P = 0.0133) (איור 6A וטבלה 9). השפעה דומה תלוית מינון THC, אך לא השפעת הזמן, נצפתה בעכברים מתבגרים נקבות (P < 0.0001 ו-P = 0.9923, בהתאמה) (איור 6B וטבלה 10). אצל גברים בוגרים, THC הביא להשפעות נוגדות כאב משמעותיות רק במינון הגבוה ביותר (10 מ"ג/ק"ג) ובנקודת הזמן המוקדמת ביותר (60 דקות לאחר מתן השירות) (P < 0.0001 על ידי מבחן ההשוואות המרובות של Šídák, בהשוואה לבקרות רכב) (איור 6C וטבלה 11). ANOVA דו-כיווני הראה השפעה משמעותית הן של המינון והן של הזמן (מינון, P < 0.0001; זמן, P = 0.0007) (טבלה 11). בנקבות בוגרות, השפעה נוגדת כאבים משמעותית נצפתה רק במינון הגבוה ביותר (10 מ"ג/ק"ג) ובנקודת הזמן המוקדמת ביותר (60 דקות לאחר מתן השירות) (P < 0.0012 על ידי מבחן ההשוואות המרובות של Šídák, ביחס לבקרות הרכב) (איור 6D וטבלה 12). לגבי ההשפעות של מין וגיל על נוגדי כאב הנגרמת על ידי THC, ANOVA דו-כיווני גילה שההשפעות של THC על חביון תנועת הזנב הושפעו הן מהגיל והן מהמין (איור 6E,F, טבלה 13 וטבלה14). ההשפעה החזקה ביותר נצפתה בזכרים מתבגרים 60 דקות לאחר מתן THC, אם כי כל ארבע קבוצות העכברים הראו נוגדי כאב משמעותיים הנגרמת על ידי THC בהשוואה לבקרות הרכב המתאימות בנקודת זמן זו (איור 6E). מעניין לציין כי השפעה משמעותית של מין נצפתה בעכברים מתבגרים אך לא בעכברים בוגרים בנקודת הזמן של 60 דקות לאחר ה-THC (מתבגרים, P = 0.0083; מבוגרים, P = 0.9919 על ידי מבחן ההשוואות המרובות של Šídák) (איור 6E וטבלה 13). בנקודת הזמן של 300 הדקות שלאחר ה-THC, השפעות נוגדות כאב משמעותיות נמצאו רק בעכברים מתבגרים, זכרים ונקבות כאחד, אך לא בעכברים בוגרים (איור 6F וטבלה 14). ANOVA תלת-כיווני בדק את שלושת המשתנים, מינון, גיל ומין, בו זמנית וחשף השפעות משמעותיות הן של הזמן והן של המינון (P = 0.0007 ו- P < 0.0001, בהתאמה) והאינטראקציה המשמעותית בין זמן למינון (P = 0.0022) (טבלה 15).

figure-results-1
איור 1: מבנים כימיים של פיטוקנבינואידים, THC ו-CBD, ואנדוקנבינואידים, אננדמיד ו-2-AG. דלתא-9-טטרה-הידרוקנבינול (THC) מיוצר בתפרחת של צמח הקנאביס הנקבי ואחראי להשפעות הפסיכוטרופיות שלו; THC פועל על ידי קשירה לקולטני CB1 ו-CB2 המצומדים לחלבון G במוח וברקמות אחרות בגוף. קנבידיול (CBD) הוא קנבינואיד לא פסיכוטרופי בעל תכונות אנטי אפילפטיות ואולי אנטי פסיכוטיות ואנטי דלקתיות. שני מפעילים אנדוגניים עיקריים של קולטני CB, אננדמיד ו-2-arachidonoyl-sn-glycerol (2-AG), הם שליחים שמקורם בשומנים במוח וברקמות ההיקפיות, המיוצרים לפי דרישה, ומעורבים בתהליכי איתות שונים לטווח קצר כגון כוונון עדין של פלסטיות סינפטית במערכת העצבים המרכזית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דוגמה ליומן שימוש בחומרים מבוקרים I. כל שימוש ב-THC צריך להיות מתועד ביומן שימוש אד-הוק בחומרים מבוקרים I, הנשמר בקלסר החומרים המבוקרים המאוחסן בארון נעול או בחלל משרדי מאובטח. טופס זה צריך לכלול את השם והשיוך של החוקר הראשי שחייב להיות רשום לרישיון Schedule 1, מידע על התרופה המתוכננת והאצווה המדויקת, מספר פרוטוקול, האדם המורשה שמשתמש בתרופה עם הכמות והיתרה לכל שימוש. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: סכמטי המציג את סדר ניסויי הבדיקות ההתנהגותיות. סדר ההליכים היה: תנועה (30 דקות לאחר THC), קטלפסיה (45 דקות לאחר THC) וטבילת זנב (60, 180 ו-300 דקות לאחר THC). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: קטלפסיה חריפה הנגרמת על ידי THC בעכברים. THC מייצר קטלפסיה בעכברים מתבגרים ובוגרים (A) זכרים ו-(B) נקבות. התגובה הוערכה באמצעות מבחן הבר לאחר הזרקת i.p. של THC במינון המצוין. אותו מערך נתונים נותח עבור השפעות המין על קטלפסיה הנגרמת על ידי THC בעכברים (C) מתבגרים ו-(D) זכרים ונקבות בוגרים. התוצאות מבוטאות כאמצעים ± SEM. המובהקות נקבעה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Šídák. ההבדלים נחשבו משמעותיים אם P < 0.05. P < 0.0001 בהשוואה לבקרת הרכב, ##P < 0.01, ו-####P < 0.0001 בהשוואה לקבוצת המתבגרים של 10 מ"ג/ק"ג בפאנל B או קבוצת גברים 10 מ"ג/ק"ג בפאנלים C ו-D. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: היפו-תנועה חריפה הנגרמת על ידי THC בעכברים. THC מפחית פעילות תנועתית ספונטנית בעכברים זכרים מתבגרים ובוגרים (A) ו-(B) נקבות. התגובה הוערכה באמצעות בדיקת השדה הפתוח לאחר הזרקת i.p. של THC במינון המצוין. אותו מערך נתונים נותח עבור השפעות המין על היפולוקותנועה הנגרמת על ידי THC בעכברים (C) מתבגרים ו-(D) זכרים ונקבות בוגרים. התוצאות מבוטאות כאמצעים ± SEM. המובהקות נקבעה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Šídák. ההבדלים נחשבו משמעותיים אם P < 0.05. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 ו-****P < 0.0001 בהשוואה לבקרת הרכב, ו -####P < 0.0001 בהשוואה לקבוצת המתבגרים של 5 מ"ג/ק"ג בפאנל A. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: משככי כאבים חריפים הנגרמת על ידי THC בעכברים. השפעות אנטי-נוציספטיביות חריפות של THC נמדדו באמצעות מבחן טבילת הזנב ב-(A) זכר מתבגר, (B) נקבה מתבגרת, (C) זכר בוגר ו-(D) עכברים נקבות בוגרות לאחר 60, 180 או 300 דקות מהזרקת ה-i.p. של THC במינון המצוין. אותו מערך נתונים נותח עבור ההשפעות של גיל ומין על נוגדי כאב הנגרמת על ידי THC לאחר (E) 60 דקות או (F) 300 דקות ממתן THC. התוצאות מבוטאות כאמצעים ± SEM. המובהקות נקבעה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Šídák. ההבדלים נחשבו משמעותיים אם P < 0.05. *P < 0.05, ***P < 0.001 ו-****P < 0.0001 בהשוואה לבקרת הרכב, ו -##P < 0.01 בין קבוצת הזכרים המתבגרים והנקבות המתבגרות במינון 10 מ"ג/ק"ג, ו -@P < 0.05 ו- @@P < 0.01 בהשוואה לקבוצת הגברים הבוגרים והנשים הבוגרות של 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC בייצור קטלפסיה בעכברים זכרים מתבגרים ובוגרים (קשור לאיור 4A) (n = 7-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC בייצור קטלפסיה בעכברים נקבות מתבגרות ובוגרות (קשור לאיור 4B) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC בייצור קטלפסיה בעכברים זכרים ונקבות מתבגרים (קשור לאיור 4C) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 4: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC בייצור קטלפסיה בעכברים זכרים ונקבות בוגרים (קשור לאיור 4D) (n = 7-10 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 5: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC על תנועה בעכברים זכרים מתבגרים ובוגרים (קשור לאיור 5A) (n = 7-9 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 6: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC על תנועה בעכברים נקבות מתבגרות ובוגרות (קשור לאיור 5B) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 7: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC על תנועה בעכברים זכרים ונקבות מתבגרים (קשור לאיור 5C) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 8: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות החריפות של THC על תנועה בעכברים זכרים ונקבות בוגרים (קשור לאיור 5D) (n = 7-9 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 9: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים זכרים מתבגרים (קשור לאיור 6A) (n = 7-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 10: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים נקבות מתבגרות (קשור לאיור 6B) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 11: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים זכרים בוגרים (קשור לאיור 6C) (n = 6-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 12: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים נקבות בוגרות (קשור לאיור 6D) (n = 7-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 13: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים מתבגרים ובוגרים, זכרים ונקבות, שנבדק לאחר 60 דקות מהזרקת 10 מ"ג/ק"ג THC (קשור לאיור 6E) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 14: ניתוח ANOVA דו-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים מתבגרים ובוגרים, זכרים ונקבות, נבדק לאחר 300 דקות מהזרקת 10 מ"ג/ק"ג THC (קשור לאיור 6F) (n = 5-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 15: ניתוח ANOVA תלת-כיווני על ההשפעות משככות הכאבים החריפות של THC בעכברים מתבגרים ובוגרים, זכרים ונקבות, נבדק לאחר 60, 180 ו-300 דקות מהזרקת 10 מ"ג/ק"ג THC (קשור לאיור 6E ו-6F) (n = 7-8 לקבוצה). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דיון

מאמר זה מספק סקירה כללית של ההליכים להשגת ואחסון THC בהתאם לתקנות הנוכחיות בארה"ב ומתאר פרוטוקול להכנת THC להזרקה תוך צפקית ונתינתו לעכברים מתבגרים (PND 30-35) ועכברים בוגרים צעירים (PND 70-75). זה קריטי להשיג THC ממקור לגיטימי ולעמוד בכל התקנות החלות. בארצות הברית, חוקרים חייבים לעמוד בדרישות רגולטוריות פדרליות ומדינתיות, אפילו במדינות שבהן קנאביס חוקי לשימוש רפואי ולא רפואי. שימוש במקור מוסמך מבטיח גישה ל-THC בדרגת מחקר, המיוצר תחת בקרה קפדנית המבטיחה עוצמה וטוהר עקביים. לעומת זאת, שימוש במקור לא מפוקח או לא מורשה פוגע ביושרה המדעית, מציג סיכון להסחה וחושף את החוקרים להשלכות משפטיות.

בחנו שלוש תגובות פרמקולוגיות סטנדרטיות ל-THC - קטלפסיה, תנועה מופחתת ומשככי כאבים. שחזרנו נתוני ספרות נרחבים (ראו, למשל, הפניות 27,28,29) המראים כי THC משפיע על תגובות אלה באופן תלוי מינון. בדיקות אלו משמשות במחקר פרה-קליני כדי להעריך את התכונות הפרמקולוגיות של אגוניסטים לקולטני קנבינואידים, אם כי הרלוונטיות שלהן לחוויה האנושית יכולה להשתנות. קטלפסיה מתייחסת למצב שבו הנבדק חווה יכולת מופחתת לנוע או לעסוק בתפקודים מוטוריים תקינים. זה מתבטא בקיבוע פיזי או נוקשות, כאשר הנבדק מחזיק בתנוחות יוצאות דופן. תנועה מופחתת (או היפו-תנועה) מתייחסת לירידה ברמה הכוללת של פעילות מוטורית אופקית, המתבטאת בתנועה מואטת או בתדירות נמוכה יותר. זה יכול לנבוע מהרגעה, ליקוי מוטורי או פשוט חוסר מוטיבציה לזוז. במחקרים בבעלי חיים, זה נצפה לעתים קרובות כירידה בהתנהגות חקרנית או ברמות הפעילות הכללית בסביבה חדשה. הבדיקה השלישית, נוגדת כאבים, מתייחסת ליכולת של THC להגביר את חביון נסיגת הזנב במבחן טבילת זנב. במודלים של בעלי חיים - כאשר הערכת המרכיב הסובייקטיבי של שיכוך כאבים דורשת בדיקות מיוחדות - נוגדי כאב בטבילה בזנב מספקים מבט שימושי, אם כי מוגבל, על האופן שבו תרופות משפיעות על תפקוד הכאב.

התוצאות המוצגות כאן מראות כי מינון THC תלוי בקטלפסיה ללא קשר למין וגיל, במיוחד במינונים של 5 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג. השפעה ספציפית לגיל ומין נצפתה בעכברים נקבות בוגרות, שהראו ייצור קהה משמעותית של קטלפסיה בהשוואה לעכברים זכרים או נקבות מתבגרות. היפולוקותנועה המושרה על ידי THC בסביבה חדשה הייתה חזקה יותר בעכברים מתבגרים בהשוואה לעכברים בוגרים, ללא קשר למין. ניתן היה להבחין בין הבדל זה הקשור לגיל לבין השפעות היפולוקומוטוריות סלקטיביות של THC על ידי מבוגרים בכלוב הביתי שלהם, סביבה מוכרת30. לגבי הפעולות האנטי-נוציספטיביות החריפות של THC, נמצאו השפעות מובהקות סטטיסטית הן במינונים של 5 מ"ג/ק"ג והן במינונים של 10 מ"ג/ק"ג בעכברים זכרים מתבגרים, אך בעכברים זכרים בוגרים, רק המינון של 10 מ"ג/ק"ג היה יעיל. מבין שלוש נקודות הזמן שנבדקו כאן, ההשפעות האנטי-נוציספטיביות של THC היו הגבוהות ביותר ב-60 דקות לאחר ה-THC ודעכו לאחר מכן. זכרים מתבגרים היו הרגישים ביותר להשפעות נוגדות הכאב של THC מבין ארבע קבוצות הגיל-מין, והבדל משמעותי בין המינים נצפה בקבוצות העכברים המתבגרים לאחר 60 דקות מהזרקת 10 מ"ג/ק"ג THC. לאחר 300 דקות של מתן THC, נמצאה השפעה ברורה של הגיל בה נצפו השפעות נוגדות כאב משמעותיות במתבגרים אך לא בעכברים בוגרים, ללא קשר למין. באופן כללי, עכברים מתבגרים הפגינו רגישות מוגברת ל-THC בהשוואה למבוגרים, במיוחד במדדים של תנועה וכאב. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שגיל ההתבגרות הוא תקופה רגישה להשפעות הפרמקולוגיות החריפות של THC, אם כי זה עשוי להיות תלוי בבדיקה30. התוצאות כאן גם מזהות את ההשפעה של גיל ומין על השפעות ה-THC, מה שמצביע על כך שנשים בוגרות הן הכי פחות רגישות ל-THC.

חשיפה ל-THC במהלך גיל ההתבגרות - במיוחד כאשר היא תכופה ובמינונים גבוהים - עלולה לשבש את תפקוד המערכת האנדוקנבינואידית בכל הגוף, כוללהמוח. הפרעה זו עלולה להוביל להשפעות ארוכות טווח על הבריאות הנפשית והפיזית 32,33,34. מחקרים אפידמיולוגיים בשלושת העשורים האחרונים הראו באופן עקבי קשרים בין שימוש בקנאביס בקרב מתבגרים לבין ליקויים ארוכי טווח בקוגניציה, במצב הרוח ובתפקוד הפסיכו-סוציאלי, כאשר השפעות אלה עשויות להימשך לבגרות, גם לאחר הפסקת השימוש 32,33,34,35,36. בנוסף, דווח על שינויים ארוכי טווח במשקל הגוף, בחילוף החומרים ובתפקוד מערכת החיסון. למרות שהאסוציאציות הללו מתועדות היטב, זה קריטי לבסס קשר סיבתי בין שימוש בקנאביס לבין ההשפעות הבריאותיות הפוטנציאליות שלו. ניתן להשתמש בשיטות שונות, כולל ניתוח תאומים לא תואמים, אקראיות מנדליאנית והתערבויות מעין-ניסיוניות, כדי להעריך סיבתיות באוכלוסיות אנושיות. עם זאת, ניסויים בחיות מעבדה ממלאים גם תפקיד חיוני בהבהרת סיבתיות37. ממצאים מהמעבדה שלנו, במימון המכון הלאומי לשימוש בסמים, תוך שימוש במודל מכרסמים של חשיפה מתונה אך תכופה ל- THC במהלך גיל ההתבגרות, תומכים בהשערה שגיל ההתבגרות הוא תקופה פגיעה לחשיפה ל- THC 17,18,25,38,39,40. אפילו מינונים מתונים של התרופה במהלך חלון התפתחותי קריטי זה יכולים להיות בעלי השפעות מתמשכות על מרכיבים שונים של המערכת האנדוקנבינואידית הבוגרת. השפעות אלו קשורות לשינויים נוירו-התנהגותיים, כמו גם לפגיעה בתגובות החיסוניות וביכולת להתמודד עם לחץ פסיכו-סוציאלי. המחקר הקודם שלנו חשף גם שינויים בלתי צפויים בתפקוד רקמת השומן, וסיפק הסבר מולקולרי פוטנציאלי לשינויים המטבוליים ארוכי הטווח שנצפו אצל משתמשי קנאביס קבועים18. על ידי הפעלה לא נכונה של קולטני CB1 במוח במהלך תקופות נוירו-התפתחותיות חשובות כמו גיל ההתבגרות, THC עלול לשבש את האיזון הנדרש להתבגרות המוח, מה שמוביל לשינויים מבניים ותפקודיים שיכולים להימשך עד לבגרות.

בבני אדם, עישון ואידוי הם השיטות הנפוצות ביותר לצריכת קנאביס בכל קבוצות הגיל. הפרוטוקול הנוכחי שלנו מתאר מתן THC באמצעות המסלול התוך-צפקי (i.p), שהוא מעשי, ניתן לשחזור ומייצר תגובות פרמקוקינטיות ופרמקודינמיות במכרסמים אשר, בכמה מובנים, דומות לאלו שנצפו אצל משתמשי קנאביס אנושיים. לדוגמה, מינון של 5 מ"ג/ק"ג THC בעכברים זכרים מתבגרים ובוגרים הוכח כמייצר ריכוזי שיא בדם דומים לאלה שדווחו אצל משתמשים אנושיים בוגרים. אספקת תרסיס של THC (המכונה בשפה המדוברת 'אדים') נחקרת כהשלמה להזרקת i.p. גישה זו מבוססת על ההנחה ששאיפה פסיבית של THC אירוסול, כמו עישון או אידוי, מובילה לספיגה ריאתית, וכתוצאה מכך הופעה מהירה יותר של השפעות, חילוף חומרים מופחת בכבד במעבר ראשון, ותוצאות פסיכואקטיביות פוטנציאליות מובהקות בהשוואה למתן פרנטרלי. יש לציין כי מחקרים קודמים הראו כי חולדות נותנות בעצמן תמציות קנאביס אירוסוליות או תערובות THC/קנבידיול בפרדיגמות התנהגותיות אופרנטיות, מה שמדגיש את הפוטנציאל של שיטה זו לחקר תכונות החיזוק של THC.

לסיכום, פרוטוקול זה מתבסס על שיטות מבוססות להערכת התנהגויות טטראד הנגרמות על ידי קנבינואידים41,42, התלויות בהפעלת קולטני CB1 עצביים43, על ידי הצעת מספר עדכונים ושכלולים מרכזיים. ראשית, אנו מתארים נהלים התואמים את התקנות הנוכחיות של ה-DEA והתקנות המוסדיות להשגה, טיפול וניהול שיקולים קריטיים ל-THC עבור כל מי שאין לו ניסיון מעשי. שנית, אנו מיישמים את פרדיגמת הטטראד על עכברים מתבגרים (PND 30-35) וצעירים (PND 70-75), שני שלבים התפתחותיים הרלוונטיים מאוד לחשיפה מוקדמת לקנאביס במבוגרים בגיל צעיר אך נותרים מיוצגים במחקר פרה-קליני. ממצאי מחקר זה מסכמים את ההשפעות הידועות תלויות המינון של THC על קטלפסיה, תנועה ומשככי כאבים תוך חשיפת רגישות מוגברת ל-THC בעכברים מתבגרים, במיוחד בתחומים נוציספטיביים ותנועתיים. תובנה ספציפית לגיל ויישור רגולטורי זה הופכים את הפרוטוקול הזה לבעל ערך במיוחד עבור מצטרפים חדשים במחקר הקנבינואידים ועבור חוקרים החוקרים את ההשפעה ההתפתחותית של קנבינואידים.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על אינטרסים פיננסיים ביו-רפואיים או ניגודי אינטרסים פוטנציאליים.

תודות

עבודה זו נתמכה על-ידי המכונים הלאומיים לשימוש בסמים (מענק מס' 2P50DA044118 [ל-DP]).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרקים של 1 מ"ל TBב.ד.309659200 למארז; סטרילי, לשימוש חד פעמי.
בקבוקוני זכוכית 8 מ"לפישר סיינטיפיק W224584144/מארז, משמש להכנת תמיסת הזרקת THC.
תוכנת מבוך כלשהומבוך כלשהו6000משמש להקלטת סרטונים של מבחנים התנהגותיים ולכימות אלמנטים של המבחנים לניתוח נתונים.
עכברי C57BL/6Jמעבדות ג'קסון#000664עכברים מסוג בר ששימשו לכל הניסויים; יכול לציין את הגיל והמין המדויקים הרצויים.
סולם מצפן CXאוהאוסCR221משמש לשקילת עכברים כדי לקבוע את כמות ה-THC להזרקה; 220 גרם מקסימום, d = 0.1 גרם.
פלטה חמה של קורנינג פירוצרםפישר סיינטיפיק11500151משמש לחימום אמבט מים למבחן Tail Flick.
דלתא-9-טטרה-הידרוקנבינולקיימן כימיקלים 12068מאוחסן בכספת הנעולה היטב לתרופות בלוח 1 ב-30 & C מקפיא.
כפפות ניטריל של פישרברנדפישר סיינטיפיק19-181-610100/חבילה; כפפות חד פעמיות ללא לטקס המשמשות לציוד מגן אישי מתאים.
פריזמה GraphPad v10.4GraphPadלא ישיםתוכנת ניתוח סטטיסטי המשמשת לניתוח נתונים ניסיוניים וביצוע בדיקות סטטיסטיות.
כבדהפישר סיינטיפיקS81280משמש להחזקת מים חמים למבחן Tail Flick.
גז חנקן בטוהר גבוהאיירגזUN1066  משמש לאידוי אתנול מתמיסת מלאי THC.
מצלמת אינטרנט של Logitech C920לוג'יטק960-001055משמש לתיעוד מבחני התנהגות של בעלי חיים; Carl Zeiss 1080p/30 fps HD USB.
התיבה 'פתח שדה'סטולטינג ושות'60101קופסה עם דפנות אטומות לביצוע בדיקות שדה פתוח; דפנות נשלפות בקלות לניקוי.
רפידות אילוף לחיות מחמדשמחB088G1N2H885/חבילה; 22 אינץ'. וחריף; 22 אינץ'; משמש לעטיפה והחזקה של עכברים למבחן Tail Flick.
מחטי PrecisionGlideב.ד.305109100 למארז; 0.4 מ"מ וחריף; 13 מ"מ; סטרילי, לשימוש חד פעמי.
מלוחיםפישר סיינטיפיק (Cytiva)Z1377בקבוקי 1 ליטר, דרגה סטרילית USP.
סקו 1xBioFOGר-סקתמיסת ניקוי המשמשת לניקוי חומרי בדיקה התנהגותיים.
Tween-80סיגמא אולדריץ'P8074-500 מ"לBioXtra, נוזל צמיג; CAS # 9005-65-6.
אמבט מים אולטרסאונדפישר סיינטיפיק (ברנסון)CPX2800בקרת טמפ'; מנקה אולטרסאונד דיגיטלי.
מערבל מערבולתפישר סיינטיפיק2215365משמש לערבוב תכולת תמיסת הזרקת ה-THC בזמן הכנתו.

מקורות

  1. Patrick, M. E., Miech, R. A., Johnston, L. D., O'Malley, P. M. Monitoring the future panel study annual report: National data on substance use among adults ages 19 to 65, 1976-2023. , At. https://monitoringthefuture.org/wp-content/uploads/2024/07/mtfpanel2024.pdf (2024).
  2. Lopez-Quintero, C., et al. Probability and predictors of transition from first use to dependence on nicotine, alcohol, cannabis, and cocaine: Results of the National Epidemiologic Survey on Alcohol and Related Conditions (NESARC). Drug Alcohol Depend. 115 (1-2), 120-130 (2011).
  3. Cerda, M., et al. Association between recreational marijuana legalization in the United States and changes in marijuana use and cannabis use disorder from 2008 to 2016. JAMA Psychiatry. 77 (2), 165-171 (2020).
  4. Miech, R. A., et al. Monitoring the future national survey results on drug use, 1975-2023: Secondary school students. , https://archive.org/details/mtf2023 (2023).
  5. Pacek, L. R., Mauro, P. M., Martins, S. S. Perceived risk of regular cannabis use in the United States from 2002 to 2012: Differences by sex, age, and race/ethnicity. Drug Alcohol Depend. 149, 232-244 (2015).
  6. Hammond, C. J., Chaney, A., Hendrickson, B., Sharma, P. Cannabis use among U.S. adolescents in the era of marijuana legalization: A review of changing use patterns, comorbidity, and health correlates. Int Rev Psychiatry. 32 (3), 221-234 (2020).
  7. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. The health effects of cannabis and cannabinoids: The current state of evidence and recommendations for research. , Natl Acad Press. (2017).
  8. Health effects of cannabis and cannabinoids and barriers to research: Report to Congress pursuant to requirements of the Medical Marijuana and Cannabidiol Research Expansion Act. Dept Health Hum Serv. , National Institutes of Health. (2023).
  9. Maccarrone, M., et al. Goods and bads of the endocannabinoid system as a therapeutic target: Lessons learned after 30 years. Pharmacol Rev. 75 (5), 885-958 (2023).
  10. Whiting, P. F., et al. Cannabinoids for medical use: A systematic review and meta-analysis. JAMA. 313 (24), 2456-2473 (2015).
  11. Montagner, P., et al. Charting the therapeutic landscape: A comprehensive evidence map on medical cannabis for health outcomes. Front Pharmacol. 15, 1494492(2024).
  12. Manzoni, O. J., Manduca, A., Trezza, V. Therapeutic potential of cannabidiol polypharmacology in neuropsychiatric disorders. Trends Pharmacol Sci. 46 (2), 145-162 (2025).
  13. Kalant, H. Cannabis control policy: No rational basis yet for legalization. Clin Pharmacol Ther. 97 (6), 538-540 (2015).
  14. Huestis, M. A. Pharmacokinetics and metabolism of the plant cannabinoids, delta9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and cannabinol. Handb Exp Pharmacol. 168, 657-690 (2005).
  15. Grotenhermen, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of cannabinoids. Clin Pharmacokinet. 42 (4), 327-360 (2003).
  16. Jung, K. M., Piomelli, D. Cannabinoids and Endocannabinoids. Neuroscience in the 21st Century. , Springer. New York. (2016).
  17. Jung, K. M., Lin, L., Piomelli, D. Overactivation of the endocannabinoid system in adolescence disrupts adult adipose organ function in mice. Cells. 13 (5), 461(2024).
  18. Lin, L., et al. Adolescent exposure to low-dose THC disrupts energy balance and adipose organ homeostasis in adulthood. Cell Metab. 35 (7), 1227-1241.e7 (2023).
  19. Chandra, S., et al. New trends in cannabis potency in USA and Europe during the last decade (2008-2017). Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 269 (1), 5-15 (2019).
  20. Petrilli, K., et al. Association of cannabis potency with mental ill health and addiction: A systematic review. Lancet Psychiatry. 9 (9), 736-750 (2022).
  21. Bara, A., et al. Cannabis and synaptic reprogramming of the developing brain. Nat Rev Neurosci. 22 (7), 423-438 (2021).
  22. Mabou Tagne, A., et al. Delta(9)-tetrahydrocannabinol alleviates hyperalgesia in a humanized mouse model of sickle cell disease. J Pharmacol Exp Ther. 391 (9), 174-181 (2024).
  23. Research advisory panel. , Office of the Attorney General, State of California. At https://oag.ca.gov/research (2024).
  24. NIDA drug supply program. , National Institute on Drug Abuse. At https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program (2024).
  25. Lee, H. L., et al. Frequent low-impact exposure to THC during adolescence causes persistent sexually dimorphic alterations in the response to viral infection in mice. Pharmacol Res. 199, 107049(2024).
  26. Mabou Tagne, A., et al. Persistent exposure to delta(9)-tetrahydrocannabinol during adolescence does not affect nociceptive responding in adult mice. J Pharmacol Exp Ther. 378 (3), 215-221 (2021).
  27. Martin, B. R., et al. molecular modeling evaluations of cannabinoid analogs. Pharmacol Biochem Behav. 40 (3), 471-478 (1991).
  28. Fride, E., Mechoulam, R. Pharmacological activity of the cannabinoid receptor agonist, anandamide, a brain constituent. Eur J Pharmacol. 231 (2), 313-314 (1993).
  29. Pertwee, R. G. The central neuropharmacology of psychotropic cannabinoids. Pharmacol Ther. 36 (2-3), 189-261 (1988).
  30. Torrens, A., et al. Comparative pharmacokinetics of delta(9)-tetrahydrocannabinol in adolescent and adult male mice. J Pharmacol Exp Ther. 374 (1), 151-160 (2020).
  31. Rubino, T., Parolaro, D. Long lasting consequences of cannabis exposure in adolescence. Mol Cell Endocrinol. 286 (1-2 Suppl 1), S108-S113 (2008).
  32. Schneider, M. Puberty as a highly vulnerable developmental period for the consequences of cannabis exposure. Addict Biol. 13 (2), 253-263 (2008).
  33. Chadwick, B., Miller, M. L., Hurd, Y. L. Cannabis use during adolescent development: Susceptibility to psychiatric illness. Front Psychiatry. 4, 129(2013).
  34. Renard, J., et al. Long-term consequences of adolescent cannabinoid exposure in adult psychopathology. Front Neurosci. 8, 361(2014).
  35. Albaugh, M. D., et al. Association of cannabis use during adolescence with neurodevelopment. JAMA Psychiatry. 78 (9), 1-11 (2021).
  36. Schweinsburg, A. D., Brown, S. A., Tapert, S. F. The influence of marijuana use on neurocognitive functioning in adolescents. Curr Drug Abuse Rev. 1 (1), 99-111 (2008).
  37. Rubino, T., Parolaro, D. The impact of exposure to cannabinoids in adolescence: Insights from animal models. Biol Psychiatry. 79 (7), 578-585 (2016).
  38. Lee, H. L., et al. Frequent low-dose delta(9)-tetrahydrocannabinol in adolescence disrupts microglia homeostasis and disables responses to microbial infection and social stress in young adulthood. Biol Psychiatry. 92 (11), 845-860 (2022).
  39. Lim, J., et al. Adolescent exposure to low-dose delta9-tetrahydrocannabinol depletes the ovarian reserve in female mice. Toxicol Sci. 193 (1), 31-47 (2023).
  40. Torrens, A., et al. Comparative pharmacokinetics of delta9-tetrahydrocannabinol in adolescent and adult female mice. Cannabis Cannabinoid Res. 9 (6), 1537-1542 (2024).
  41. Fride, E., et al. Behavioral methods in cannabinoid research. Methods Mol Med. 123, 269-290 (2006).
  42. Metna-Laurent, M., et al. Cannabinoid-induced tetrad in mice. Curr Protoc Neurosci. 80, 9.59.1-9.59.10 (2017).
  43. Monory, K., et al. Genetic dissection of behavioural and autonomic effects of delta(9)-tetrahydrocannabinol in mice. PLoS Biol. 5 (9), e269(2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

THC
מתן Δ 9-Tetrahydrocannabinol (THC) בעכברים מתבגרים ובוגרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.