הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

3 ביולי 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטות דגימה מהאזורים האופוטיים של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים כדי לבודד ציאנופגים (והמארחים שלהם) ותהליכים שלאחר הדגימה המעשירים גנוטיפים בודדים ומאפיינים את דינמיקת האינטראקציה בין וירוס למארח.

תקציר

דגימה סביבתית של מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים והנגיפים שלהם ממלאת תפקיד קריטי בהבנת המגוון הביולוגי הימי והמים המתוקים העכשוויים והדינמיקה של המערכת האקולוגית, כמו גם ההשפעות של גורמים הקשורים לשינויי אקלים (למשל, עליית טמפרטורות והחמצה) על מסלולים אבולוציוניים של מינים והרכב הקהילה. למרבה הצער, המגוון של הווירוספירה אינו תומך בדגימה אוניברסלית אחת ובזרימת עבודה ניסיונית. ואכן, לכל מערכת וירוסים יש תכונות ייחודיות, הדורשות שינויים בפרוטוקולים סטנדרטיים בווירולוגיה כדי להשיג מטרות מחקר. למרות שגילוי ואפיון הנגיף דורשים גישות ספציפיות למערכת המטרה, עבור כל הנגיפים, מטרות המחקר דומות: לבודד את הנגיף; לקבוע את טווח המארח; לאשר זיהום פרודוקטיבי; ולאפיין את הדינמיקה של הנגיף, המארח והמארח. תיאורים חזקים של מערכות מארח וירוסים מורכבים באופן מינימלי מבירור מורפולוגיה, פיזיולוגיה, ביוכימיה ופרופילי אומיקס. ניתן לקבל מידע נוסף על ידי מניפולציה של המערכת על ידי שינוי גורמים כגון ריבוי זיהום, טמפרטורה, pH, מתג מארח, אבולוציה מכוונת, או יישום תרופות לצפייה בתגובת מערכת הווירוס המארח. המעבדה שלנו חוקרת וירוסים בתחומי חיים שונים (ארכאה, חיידקים ואיקריה). בדוח זה, אנו מפרטים שיטות לדגימת חיידקים פוטוסינתטיים מהאזור האופוטי של סביבות מים מתוקים וימיים תוך התמקדות בבידוד בקטריופאג' (כלומר, ציאנופג') של ציאנובקטריה. ציאנובקטריה הם מינים מרכזיים קריטיים לייצור ראשוני ולמחזור חומרי מזון במערכות אקולוגיות מימיות אלה. זרימת העבודה המתוארת משתרעת מדגימת מים בעומקים שונים ועד לאפיון תכונות מערכת מארח וירוסים באמצעות תרבית מדיה נוזלית ומוצקה, שיטות מולקולריות/גנטיות מתקדמות וגישות אנליטיות. השיטות המתוארות ניתנות להתאמה לגילוי בקטריופאג'ים ווירוסים במערכות מארחות וירוסים בתחומי חיים.

מבוא

אפיון דינמיקת זיהום ויחסים אבולוציוניים של ציאנופגים ומארחיהם הוא המפתח להבנת המצב הנוכחי והעתידי של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים. טכניקות ריצוף מתקדמות בתפוקה גבוהה ושיטות אנליטיות מודרניות מאפשרות ריצוף מהיר של גנום ציאנופג' (ומארח) כדי לחקור יחסי וירוס-מארח 1,2. עם זאת, זרימות עבודה מתחילות בדגימה סביבתית כדי לבודד ולזהות וירוסים ומארחיהם 3,4,5. בשל המגוון של הווירוספירה, אין פרוטוקול יחיד לדגימה ואפיון של כל הנגיפים והבקטריופאג'ים. ואכן, לכל מערכת מארחת וירוס יש את המאפיינים הייחודיים שלה. עם זאת, יעדי הבסיס דומים ללא קשר למערכת הנגיף הנחקרת: לבודד את הנגיף; לקבוע את טווח המארח; להפגין זיהום פרודוקטיבי במארח אחד או יותר; לאפיין את דינמיקת ההדבקה של הנגיף, המארח והמארח באמצעות גישות איכותיות וכמותיות. ניתן לבחון הבנה מתקדמת של מערכת הווירוסים על ידי שיבוש המערכת. שינוי פרמטרים כגון ריבוי זיהום (MOI)6, טמפרטורה, pH, זן המארח, או על ידי יישום תרופות כדי לקבוע כיצד המערכת מגיבה, מספק תובנה נוספת לגבי אופי הדינמיקה של וירוס-מארח. מניפולציה מתקדמת יותר, כגון אבולוציה מכוונת, יכולה לספק מידע נוסף על המסלול האבולוציוני הפוטנציאלי של המערכת וכיצד נקודות קצה אבולוציוניות עשויות להשפיע על הקהילה המיקרוביאלית הגדולה יותר ועל המערכת האקולוגית.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מודל (אך ניתן להתאמה בקלות) לדגימה סביבתית של חיידקים פוטוסינתטיים כגון ציאנובקטריה ומיקרו-אצות, הממלאים תפקיד קריטי במחזור חומרי מזון וייצור ראשוני במערכות אקולוגיות ימיות, מים מתוקים ומערכות אקולוגיות ימיות אחרות 7,8,9,10,11 . זרימת העבודה מתמקדת בבידוד מארחים מהאזורים האופוטיים של סביבות ימיות ומים מתוקים והווירוסים והבקטריופאג'ים שלהם, שהם מניעי מפתח במערכות אקולוגיות אלה12. גם וירוסים וגם בקטריופאג'ים משפיעים על מבני אוכלוסייה אוקריוטיים ופרוקריוטיים כאחד ומשפיעים מאוד על המגוון והפרודוקטיביות של המערכת האקולוגית13. לפיכך, המטרה כאן היא לספק פרוטוקול דגימה וזרימת עבודה לאחר הדגימה המאפשרים העשרה של מארחים ווירוסים לחקירה: דינמיקה של וירוס יחיד/מארח יחיד, ריבוי וירוסים/מארח יחיד, וירוס יחיד/ריבוי מארח וריבוי וירוסים/ריבוי מארחים; -מצעי אומיקס העומדים בבסיס דינמיקת זיהום וירוס-מארח; ומסלולים אבולוציוניים פוטנציאליים ונקודות קצה אבולוציוניות המשפיעות על מערכת המארח של הנגיף הנחקרת ועל המערכת האקולוגית הגדולה יותר שממנה חולצו הנגיפים והמארח.

באופן ספציפי, אנו מתארים זרימת עבודה לדגימה סביבתית, עיבוד מקדים בשטח של דגימות (כלומר, לפני הגעה למעבדה), עיבוד לאחר לבידוד בקטריופאג'ים (ווירוסים), העשרה של תרביות מינים מעורבים של מיקרואורגניזמים לזיהוי פונדקאים מתירניים, פיתוח מבודדים חד-מושבתיים של מארחים משוערים, אישור תום לב יחסי וירוס-מארח (כלומר, זיהום פרודוקטיבי), ואפיון תכונות זיהום בסיסיות (למשל, אלימות). בדיקות זיהום לא רק מאפשרות חישוב של אלימות יחסית (VR)14 ועמידות המארח (RR)15 אלא גם כוללות שלבים לחילוץ דגימות תרבית בנקודות זמן מרכזיות לחקירת מצעי אומיקס העומדים בבסיס הפיזיולוגיה הנצפית (כלומר, דינמיקת האינטראקציה בין הנגיף למארח). לבסוף, אנו דנים במלכודות פוטנציאליות, פתרון בעיות ופתרונות, כמו גם דרכים לשנות שלבים נבחרים כדי להתמקד בטקסונים ספציפיים. זרימת העבודה ישימה לציאנופג'ים-ציאנובקטריה, פיקודנה-וירוס-מיקרו-אצות ומערכות תרמופיליות של פוסלו-וירוס-ארכאיות16,17, ומדגים את התועלת שלה באפיון וירוסים בכל שלושת תחומי החיים: חיידקים, אאוקריה וארכאיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דגימה סביבתית

הערה: פרוטוקול זה מתאר דגימה ימית של חיידקים פוטוסינתטיים מהאזור האופוטי בטווח של 8 מייל מקו החוף מול חופי דרום קליפורניה. אולם הפרוטוקול הותאם לדגימה מאגמים, אגמים קפואים או מעיינות חמים גיאותרמיים (איור 1).

  1. דגימה סביבתית לאורך קו החוף הדרומי של קליפורניה
    הערה: ספינה באורך 6 מ', V עמוק, קונסולה מרכזית (כלומר, סירה) עם מנועים חיצוניים כפולים של 150 כ"ס הייתה עמוסה בציוד מחקר (טבלת חומרים). נבחרו שלושה אתרים לדגימת אזור אופוטי: (א) אתר 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; (ב) אתר 2: צפון 33° 12.521, מערב 117° 25.275; ו-(ג) אתר 3: צפון 32° 59.914, מערב 117° 17.058. בכל אתר נלקחו 20 ליטר דגימות מים בצהריים משלושה עומקים שונים בכל אתר: < 3 מ' (דגימת פני השטח), 6 מ' ו-14 מ'.
    1. מכלול משאבת העברה: עם ההגעה לכל אתר דגימה, פרוס את עוגן הסירה ורשום קואורדינטות GPS ממערכת הניווט. הרכיבו את מערכת הדגימה.
      1. בקצרה, התקן קצה אחד של צינורות PVC כחולים גמישים בגודל 2.54 ס"מ (50 רגל) למסננת יניקה של 2.54 ס"מ כדי למנוע כניסת פסולת גדולה למערכת המשאבה. אבטח את צומת צינור המסננת בעזרת סרט דביק. התקן את הקצה הנגדי של הצינור לסעפת היניקה של משאבת ההעברה מנירוסטה 1 כ"ס.
      2. חבר קטע של 10 רגל של צינור גמיש גומי עמיד בפני קריסה בגודל 2.54 ס"מ לשקע המשאבה. חבר את כבל החשמל של משאבת ההעברה לגנרטור המהפך המופעל על ידי גז 3800 וואט. לאחר ההרכבה, יש להפעיל את משאבת ההעברה ולבדוק כדי לוודא שמערכת המשאבה פועלת (איור 1, שורה עליונה).
    2. שקלול צינור ההעברה: הצמידו קצה אחד של חבל ניילון ימי באורך 25 מ' ובקוטר 1.25 ס"מ לעינית של עוגן פטריות במשקל 14 ק"ג. השתמש בנייר דבק כדי להדק את החבל לצינור ה-PVC הכחול כל 3 מ' כאשר מסננת היניקה מוגדרת כ-1 מ' מעל העוגן כדי למנוע מהמסננת להתמקם בחול או לפגוע בסלעים מתחת למים. השתמש בעוגן כדי להטביע את צינור ההעברה (צינור PVC כחול) וכדי למנוע מזרמים תת-קרקעיים חזקים ליצור זווית גדולה בין הסירה לצינור, מה שייתן עומק דגימה לא מדויק. הורד את מכלול העוגן/חבל והצינור לעומק.
    3. חילוץ דגימות מי ים: לאחר שקצה הצינור עם המסננת נמצא בעומק הרצוי, הפעל את הגנרטור והמשאבה. הפעילו מחדש את המשאבה או נערו את צינור ההעברה כדי שהמים יתחילו לשאוב מהעומק. ברגע שזרימה קבועה של מים הועברה מעומק, שחררו 1-2 נפחי צינורות בחזרה לאוקיינוס כדי להבטיח שמים מהעומק הרצוי זורמים דרך המשאבה. אספו דגימות מים בקנקני מים של 20 ליטר (איור 1, שורה עליונה, קיצוני מימין).
    4. הובלת דגימה לתחנת שדה: מלא קנקני מים של 20 ליטר לכ-18 ליטר כדי לאפשר חילופי גז (למשל, O2/CO2) בין דגימות מים למרווח הראש במהלך ההובלה. לפני סגירת קנקני מים, רשום טמפרטורה, pH ומליחות מדגימות מים גולמיים. לאחר מכן, כסו והניחו קנקני מים על מצע קרח באחסון תת-סיפון וכסו בסדין קל כדי למנוע חשיפת יתר לאור השמש ולטמפרטורות גבוהות.
  2. עיבוד מקדים בשטח של דגימות מים
    הערה: עם ההגעה למתקן יבשתי (למשל, חדר מלון/חדר ישיבות/תחנת שדה), בוצעה סדרה של שלבי עיבוד מקדים כדי להגן על התוכן המיקרוביאלי בתוך דגימות המים ולהפריד בין שברים שונים של דגימות מי הים על סמך גודל החלקיקים.
    1. מכלול מערכת סינון: אבטח קצה אחד של חתיכה באורך 1 מ' של צינור ויניל שקוף בקוטר 9.525 מ"מ לכניסת דוקרני הצינור ביציאת הוואקום של משאבת ואקום דיאפרגמת אוויר ניידת. אבטח את הקצה הנגדי של אותו צינור למכלול ואקום מסנן של 1.0 ליטר, 0.45 מיקרומטר. השתמש במכלולי כוסות סינון של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר ברצף כדי להפריד בין שברים שונים של דגימת מי הים כמתואר להלן.
    2. כדי לבדוק את המערכת לאיתור נזילות או מסננים פגומים/קרועים, סנן 0.25 ליטר מי ים דרך מסנן הממברנה של 0.45 מיקרומטר פוליאתרסולפון (PES). מערכת שאינה דולפת תציג יניקה בין המסנן לסורג לאחר סינון מלא של דגימת מי הים.
    3. סינון דרך מכלול מסנן ממברנה PES של 0.45 מיקרומטר: כדי לבודד מיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים (למשל, מיקרו-אצות וציאנובקטריה), המטרה היא לסנן 2 ליטר של דגימת מי ים דרך מסנן הממברנה PES של 0.45 מיקרומטר באמצעות שתי כוסות סינון של 1 ליטר (או ארבע כוסות סינון של 500 מ"ל). סמן כראוי את כל בקבוקי הסינון עם גודל המסנן, העומק שממנו נלקחה הדגימה, התאריך ומציין אתר הדגימה. לבסוף, מכסה הברגים ובקבוקי כיסוי המכילים 0.45 מיקרומטר מסננים עם מטלית או שרוול שקוף למחצה כדי למנוע אור שמש מוגזם.
      הערה: אל תאפשר למסנן בכוס המסנן להתייבש. שמור תמיד שכבה דקה של נוזל על המסנן. המסנן יצבור פסולת ביולוגית (למשל, תאים). אם המסנן נסתם בפסולת, הברג בזהירות את מכלול הכוס והנח את המסנן המשומשת בצד, אך אל תשליך את הכוס הסתומה. חבר מסנן חדש של 0.45 מיקרומטר והמשך.
    4. סינון דרך מכלול מסנן ממברנה PES של 0.22 מיקרומטר: כדי לבודד וירוסים אוקריוטיים גדולים, השתמש ב-1 ליטר של תסנין 0.45 מיקרומטר מהשלב הקודם (שלב 1.2.3) וסנן דרך סינון של 0.22 מיקרומטר. סמן כראוי את בקבוק האולטרה-פילטראט עם גודל המסנן, העומק שממנו נלקחה הדגימה, התאריך ומציין אתר הדגימה. לבסוף, הברג את המכסה וכסה את הבקבוק המכיל 0.22 מיקרומטר אולטרה-פילטראט (מסינון 0.45 מיקרומטר).
      הערה: אל תאפשר למסנן בכוס המסנן להתייבש. שמור תמיד שכבה דקה של נוזל על המסנן. המסנן יצבור פסולת ביולוגית, המכילה דגימות ביולוגיות. אם המסנן נסתם, הברג את מכלול הכוס והנח בצד את המסנן המשומשת. אין להשליך את הכוס הסתומה. חבר מסנן חדש של 0.22 מיקרומטר והמשך.
    5. תרכיז ביומסה ממסנן 0.45 מיקרומטר: יוצקים 48 מ"ל של תסנין (מסינון של 0.22 מיקרומטר) לכל אחד משני צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן חרוטי של 50 מ"ל. השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך באופן אחיד לאורך הקצה החיצוני ביותר של מסנן 0.45 מיקרומטר המושקע בתוך מכלול הכוסות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את המסנן העמוס בביומסה והלח. חותכים אותו לשניים. מגלגלים מחצית מנייר הסינון לצינור חרוטי אחד של 50 מ"ל. חזור על הפעולה עם המחצית השנייה של קרום המסנן והצינור השני. הברג את מכסי הצינור ואבטח בעזרת סרט שקוף. סמן את הצינור.
    6. תרכז ביומסה גדולה של נגיף ממסנן 0.22 מיקרומטר: יוצקים 14 מ"ל של אולטרה-פילטראט לכל אחד משני צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן חרוטי של 15 מ"ל. השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך לאורך השפה החיצונית של מסנן 0.22 מיקרומטר המשומש בתוך מכלול הכוס. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את המסנן העמוס בביומסה והלח. חותכים אותו לשניים. מגלגלים ומכניסים מחצית מנייר הסינון לאחד מהצינורות החרוטיים של 15 מ"ל. חזור על הפעולה עבור המחצית השנייה של קרום המסנן והצינור החרוטי השני של 15 מ"ל. הברג את מכסי הצינור ואבטח בעזרת סרט שקוף (למשל, Parafilm). סמן כל צינור עם גודל המסנן (כלומר, 0.22 מיקרומטר), אתר, עומק ותאריך.
    7. שמור את התסנין הנותר של 0.45 מיקרומטר וכן את התסנין הנותר של 0.22 מיקרומטר למשלוח בחזרה למעבדה. חזור על כל תהליך הסינון הזה (שלבים 1.2.2 עד 1.2.6) עבור כל עומק ואתר דגימה.
      הערה: Ultrafiltrate משמש במעבדה כבסיס מדיה (עם מינרלים טבעיים וחומרים מזינים אחרים).
      מיקרוסקופ דגימה גולמי (אופציונלי): קח צינור חרוטי אחד של 50 מ"ל עם מסנן של 0.45 מיקרומטר בתוכו ונער בעדינות. השתמש בטפטפת פלסטיק (או פיפטטור) כדי לקחת 30-50 מ"ל מי ים מהצינור החרוטי של 50 מ"ל והכין שקופית מיקרוסקופ זכוכית עם הדגימה ותלוש כיסוי. באמצעות מיקרוסקופ שדה ומחשב, צפו בתוכן שקופית המיקרוסקופ כדי לזהות ולתעד מאפיינים של מיקרואורגניזמים שנצפו (איור 2D).

2. עיבוד דגימות לריכוז וירוסים/בקטריופאג'ים והעשרת מארחים

הערה: פרוטוקול זה מתאר את שלבי העיבוד הראשונים הנדרשים לאחר שהדגימות מגיעות למעבדה מאתר השדה. הובלה במטוס לעומת רכב כביש עשויה לדרוש שיקולים שונים. כדאיות הדגימה הסביבתית תפחת עם שינויים פתאומיים בטמפרטורה, pH, מליחות, חשיפה או חוסר חשיפה לאור, ריכוז גז מומס (למשל, CO2 ו-O2) והזמן בין מיצוי סביבתי לעיבוד מעבדה.

  1. ספין ריכוז ואחסון וירוסים ובקטריופאג'ים
    הערה: לאחר שהדגימות מגיעות למעבדה, עיבוד תוך 8 שעות לאחר ההגעה עשוי למזער אובדן של חיידקים ברי קיימא עקב חלוף הזמן בין מיצוי אתר הדגימה להגעה למעבדה. השלבים המפורטים להלן יספקו ציטוטים של תרחיף בקטריופאג'ים (או וירוס) מרוכז (כלומר, מלאי עבודה) לאחסון ושימוש לטווח ארוך.
    1. ריכוז אולטרה-פילטראט: עבור כל עומק דגימה לפי אתר, שלח את ~800 מ"ל הנותרים של אולטרה-פילטראט למעבדה. השתמש במסנן ספין צנטריפוגלי 3K NMWL 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-6000 x g למשך 10-20 דקות כדי לרכז 50-100 מ"ל של אולטרה-פילטראט עד 1.0-1.5 מ"ל. הכן רשתות להדמיית TEM כפי שתואר קודם לכן16 כדי להעריך אם יש חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) באולטרה-פילטראט המרוכז שנוצר. אם מתגלים VLPs, חלקו את התרכיז ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (או -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך יותר).
    2. ריכוז חלקיקים ממסנן 0.22 מיקרומטר: השתמש באזמל סטרילי כדי לגרד בעדינות פסולת ממסנני 0.22 מיקרומטר לתוך האולטרה-פילטראט בתוך צינורות 50 מ"ל שבהם הועברו המסננים. השתמש במכלול ריכוז ספין 10K NMWL כדי לרכז 50-200 מ"ל של מתלה עד לנפח של ~3 מ"ל של שמירת דגימה. הכן רשתות להדמיית TEM כפי שתואר קודם לכן16 כדי לקבוע אם יש VLPs מהמסנן של 0.45 מיקרומטר שאולי נלכדו על פני המסנן של 0.22 מיקרומטר. אם מתגלים VLPs, חלקו את התרכיז ל-100 מ"ל ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס (או -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך יותר).
  2. ריכוז והעשרה של ספין ממסנני 0.45 מיקרומטר.
    הערה: תרביות מעורבות של מיקרואורגניזמים עשויות להכיל מארחים עבור הנגיפים והבקטריופאג'ים שבודדו לעיל (שלבים 2.1.1 ו-2.1.2). ריכוז ספין והעשרה של תרבויות מעורבות מספקים מלאי עבודה שממנו ניתן לפתח תרבויות טהורות של פונדקאים משוערים (ראה שלב 3).
    1. ריכוז מתלים מעורבים: עבור כל עומק דגימה לפי אתר, שלח בחזרה ~100 מ"ל של אולטרה-פילטראט עם מסנן עמוס בפסולת תאים של 0.45 מיקרומטר למעבדה. השתמש באזמל סטרילי כדי לגרד פסולת ממסנן 0.45 מיקרומטר לתוך האולטרה-פילטראט בצינורות של 50 מ"ל שבהם הם הועברו. צנטריפוגה את הדגימה ב-2000 x גרם למשך 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את הביומסה. השעו את הגלולה ב-5 מ"ל של 1:8 מדלל BG-11מדיה 18 על ידי טריטורציה עדינה עם פיפטה.
    2. העשרה ממסנן 0.45 מיקרומטר: הכן שש תרביות מקבילות בצלוחיות ארלנמאייר מבולבלות של 250 מ"ל המכילות: 50 מ"ל של מדיה BG-11 (3 צלוחות) ותערובת של אולטרה-פילטראט מאתר הדגימה (40 מ"ל) בתוספת BG-11 (10 מ"ל). חסנו כל בקבוק ב-0.5 מ"ל תרכיז תאים (משלב 2.2.1). דגירה עם רעידות קלות בפוטו-ביו-ריאקטור למשך מינימום של 7-10 ימים ב-25 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור מוגדרת ל-20-40 מילימול פוטונים/מ"ק לשנייה.19 ברגע שהצמיחה חזקה (למשל, OD730nm = 0.8), צנטריפוגה ב-2000 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס לגלולה. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מדיה מדוללת 1:8 BG-11 על ידי טריטורציה עדינה עם פיפטה. הכן 10-20 מנות של 0.5 מ"ל של מתלה תאים בצינורות קריו-פקק עם מכסה בורג לאחסון של -80 מעלות צלזיוס.

3. פיתוח תרביות טהורות חד-גנוטיפיות של פונדקאים מיקרוביאליים

הערה: פרוטוקול זה מתאר נהלים לבידוד וטיהור מארחים מיקרוביאליים משוערים עבור וירוסים ובקטריופאג'ים מתרביות מעורבות שעובדו מדגימות סביבתיות שנאספו. ניתן לבודד ולטהר פנוטיפים מרובים של מארחים, ובכך להגדיל את ההסתברות לאיתור פונדקאים מתירניים עבור הנגיפים והבקטריופאג'ים הקיימים בדגימות מים מאוחסנות (שלבים 2.1.1-2.1.2).

  1. לוחות פסים ובחירת מבודדים של מושבה אחת
    הערה: תרביות טהורות מרובות של גנוטיפ יחיד מפותחות מתרבויות מעורבות כדי להגדיל את ההסתברות לבידוד מארח רגיש ומתירני של וירוסים או בקטריופאג'ים שנלכדו במהלך דגימה סביבתית וכדי לחקור את מגוון המארח של וירוסים ובקטריופאג'ים.
    1. פתח מבודדים של מושבה בודדת (SCI) כמתואר להלן.
      1. הכן צלחות אגר BG-1120. הפשרה על קרח, מנה אחת של התרחיף המעורב שנאגר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (משלב 2.2.2). השתמש בלולאה סטרילית כדי לפספס תרכיזי תאים על לוחות אגר BG-11 באמצעות טכניקות סטנדרטיות20. דגירה של צלחות מפוספסות בפוטו-ביו-ריאקטור למשך ~10 ימים ב-25 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור ב-20-40 מילימול פוטון/מ"ק לשנייה או עד להופעת מושבות על צלחות.
      2. הכן ~10 תרביות זרעים בצינורות תרבית של 20 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיה BG-11 ו/או 5 מ"ל של תערובת של אולטרה-פילטראט מאתר הדגימה ו-BG-11. בחר SCI מהצלחת בעזרת קיסם סטרילי וחסן כל צינור בנפרד על ידי הטלת קיסם אחד לכל צינור. דגירה עם רעידות קלות בפוטו-ביו-ריאקטור למשך 10-15 ימים לפחות ב-25 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור מוגדרת ל-20-40 מילימול פוטון/מ"ר לשנייה או עד לזיהוי צמיחה (למשל, OD730nm = 0.4-0.8).
        הערה: אם ישנם פנוטיפים מרובים של מושבות (למשל, מורפולוגיה, שקיפות, צבע) על לוחית הפס הראשונה, בחר מושבות בודדות לחיסון מתוך מגוון פנוטיפים של מושבות.
    2. פיתוח תרביות טהורות של מלאי עבודה: ברגע שמתגלה גידול חיובי בתרבית זרעים, חזור על הליכי פס עד שמופיע רק פנוטיפ מושבה יחיד על צלחות (איור 3B ואיור 4B). שדרגו תרביות זרעים ל-50 מ"ל בצלוחיות מבולבלות של 250 מ"ל (איורים 3C ואיור 4C) כמתואר לעיל (שלב 2.2.2). הכן ~20 מנות של 0.5 מ"ל של מתלה תאי SCI ופיפטה לתוך צינורות קריו-פקק הברגה של 1.0 מ"ל לאחסון של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: לפיתוח תרביות טהורות של ציאנובקטריה, ייתכן שיהיה צורך באנטיביוטיקה או תרופות אנטי-פטרייתיות (למשל, אימיפנם, ציקלוהקסימיד) כדי להפחית את זיהום התרבית21. הליך הציפוי הוא נקודת ציר שבה ניתן למקד בידוד של ציאנובקטריה או מיקרו-אצות. פרמטרי האור במהלך הדגירה עשויים להשתנות מבחינת עוצמת האור או מחזורי הדלקה-כיבוי.
  2. אפיון גנוטיפ יחיד ואחסון מלאי עבודה
    הערה: כדי לאשר את הבידוד וההעשרה של גנוטיפים מארחים משוערים בודדים, תרביות טהורות מאופיינות מבחינה מורפולוגית וגנטית.
    1. אפיון מורפולוגי: ברגע שמחזורים של תרבית נוזלית ועבודת לוחית מדיה מוצקה מביאים לפנוטיפ של תא בודד, אפיינו מורפוטיפים מיקרוביאליים הן על ידי מיקרוסקופ אור (איור 2A-C) ואם קיים, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) ו/או מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM; איור 3A ואיור 4A). תחת מיקרוסקופ אור (למשל, הגדלה של 60x-100x) ניתן להבחין בארגון תאי ירוק, חום בהיר או שקוף חד תאי, קולוניאלי, חוטים, ספירלי, מסועף או טריכומה. זה יצביע על הקצאה טקסונומית אפשרית.
    2. אפיון גנטי: אמת את הבידוד של גנוטיפ מיקרואורגניזם יחיד על ידי מיצוי DNA מהתרביות הטהורות המשוערות, ולאחר מכן ריצוף גנום חלקי. בציאנובקטריה, הגן 16S rRNA הוא לעתים קרובות מטרה (איור 5A)22. ניתוח פילוגנטי של 16S יכול לזהות קיבוץ טקסונומי22. במיקרו-אצות, 18S rRNA מכוון לעתים קרובותל-23. עבור מבודדים מעניינים או מבודדים חדשים, ניתן להמשיך בריצוף גנום שלם.

4. פיתוח תרחיפי וירוס/בקטריופאג'ים חד-גנוטיפיים

הערה: פרוטוקול זה מתאר נהלים לבידוד וטיהור תרחיפים נגיפיים ובקטריופאג'ים מרובים של גנוטיפ יחיד מדגימות סביבתיות.

  1. דילול ו-TEM של תרכיזי VLP
    הערה: באמצעות TEM ומבחני פלאק מבוססי צלחת24, מושג אישור לכך ש-VLPs הם בקטריופאג'ים (או וירוסים) בתום לב המדביקים תאי מארח.
    1. מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה של תסנינים (0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר): השתמש בתרכיזים מסינון של 0.45 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר של דגימות מים גולמיים (ראה שלב 2.1) להכנת רשתות TEM16 ותמונה לבחינת הטרוגניות חלקיקי הנגיף (כלומר, מגוון של מורפוטיפים). לדלל דגימות המביאות לרשתות עם מפגש גבוה (למשל, 90%) לפני השלמת השלבים הבאים להשגת מפגש של 30%-50%. ניתן להשתמש בספירת חלקיקים ידנית או בתוכנת הדמיה כדי להעריך את מפגש התאים ברשתות.
      הערה: מפגש גבוה ברשתות יכול לגרום לפינוי מדשאות מארחות על לוחות מדיה מוצקים במקום הופעת לוחות בודדים שניתן לבחור. לפיכך, דילול דגימות לפני בדיקות פלאק עשוי לחסוך זמן. לחלופין, ניתן לבדוק מספר לוחות דשא מארחים לאינטראקציות בין וירוס מארח באמצעות דילול סדרתי של תרכיזי VLP.
    2. זיהוי פעילות בקטריופאג' (או וירוס) על מדשאות מארח: על צלחות אגר BG-11, גדל מדשאות מארח משוערות של ציאנובקטריה (או מיקרו-אצות) ממלאי עובד (שלב 3.1.2). פיפטה 0.5 מ"ל של מתלה VLP ב-4.5 מ"ל מדיה על מדשאות (איור 6A, משמאל) ומערבבת בעדינות עד שכל שטח הדשא מצופה בתרחיף. דגירה בפוטו-ביו-ריאקטור למשך 3-10 ימים ב-25 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור ב-20-40 מילימול פוטון/מ"ר 2/שנייה או עד שהפלאק נראה על הלוחות (איור 6A, מימין).
  2. גירוד פלאק ופיתוח וירוס גנוטיפ יחיד או תרחיפי בקטריופאג'ים
    הערה: על ידי גירוד פנוטיפים בודדים של פלאק והפצת בקטריופאג' בתרביות נוזליות של המארח, אינטראקציות מארח-בקטריופאג' (או וירוס מארח) מאושרות בתום לב, מה שמאפשר לפתח מלאי עבודה של בקטריופאג' (או וירוס) לבדיקות זיהום. מלאי עבודה של בקטריופאג'ים (או נגיף) חייב להיות מסומן באחת מכמה שיטות (למשל, qPCR, מבחני פלאק) כדי להמשיך בבדיקות זיהום בריבוי מוגדר של זיהום (MOI).
    1. בידוד והפצה של גנוטיפ בקטריופאג' (או נגיף) אחד: ברגע שניתן לראות פלאק בודד על צלחות (עקב דילול הולם של תרכיז VLP), השתמש בלולאה סטרילית כדי לגרד רובד בודד. סובבו את הלולאה בתרבית זרעים של 10 מ"ל של המארח (איור 6B, משמאל). דגירה עם רעידות קלות (למשל, 70-120 סל"ד) בפוטו-ביו-ריאקטור למשך 3-10 ימים ב-25 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור מוגדרת ל-20-40 מילימול פוטון/מ"ר 2/שנייה או עד לירידות OD730 ננומטר או זיהוי פסולת תאים בתחתית הצינור, מה שמעיד על מוות/ליזה של תאים (איור 6B, מימין)25.
      הערה: אם נוצרים פלאק על מדשאות מארחות אך אין סימני זיהום בתרבית נוזלית, ייתכן שהפלאק נוצר על ידי בקטריוצין26 ולא על ידי בקטריופאג' (או וירוס). TEM יכול לתמוך בבדיקות צלחת על ידי הצבעה על מוות תאים על ידי זיהום בקטריופאג'י (או ויראלי).
    2. כימות טיטר עבור מניות עבודה של בקטריופאג'ים (או נגיף): בידוד בקטריופאג' (או נגיף) מושג באמצעות שיטות הסינון וריכוז הספין שתוארו לעיל. כימות טיטרים עבור תרחיפי בקטריופאג'ים (או וירוסים) על ידי מבחני פלאק דילול סדרתי27. לחלופין, בצע מיצוי DNA וריצוף גנום של נגיף שלם ופילוגנטיקה (איור 5B) כדי לפתח פריימרים לביצוע טיטרינג מבוסס qPCR של בקטריופאג' כדי ליצור מלאי עבודה לבדיקות זיהום עוקבות.
      הערה: ניתן להגדיל את התפשטות הגנוטיפים של בקטריופאג'ים בודדים (או וירוסים) ל-50 מ"ל או 100 מ"ל תרביות אם נפחי הטיטר או מלאי העבודה נמוכים מדי לצרכים ניסיוניים. שקול את אופי מערכת המארח של הנגיף (למשל, אלימות גבוהה או אלימות נמוכה), ריבוי הזיהום (MOI) המתוכנן לבדיקות זיהום, וכמה בדיקות זיהום יושלמו עבור פרויקט בעת פיתוח מלאי עבודה של בקטריופאג'ים (או וירוסים). לא מומלץ להפשיר ולהקפיא מחדש את מלאי הנגיף. הפשירו והשתמשו במלאי וירוס מלא אחד משכפולים של אותו תכשיר באותו טיטר עבור כל ניסוי. טכניקות טיטר אחרות עשויות להשלים את השיטות המתוארות, כולל יינון אלקטרו-ספריי/ספקטרומטריית מסה (ESI/MS)28.

5. בדיקות זיהום

הערה: פרוטוקול זה מתאר מבחני זיהום של פאג'ים מארחים (או וירוס מארח) המשמשים ל: אפיון איכותי של אלימות, טווח מארח ופנוטיפ זיהום (אינדיקטור לאסטרטגיית שכפול) על מדיה מוצקה; ולהעריך כמותית קינטיקה של גדילה, אלימות הנגיף14 ועמידות המארח15 בתרבית נוזלית.

  1. קביעת אלימות יחסית של בקטריופאג' (או וירוס) וטווח המארח על מדיה מוצקה
    הערה: כל מבחני המדיה המוצקה, כולל בדיקות נקודתיות על הדשא, מבחני רובד דילול סדרתי בצלחת אחת ובדיקות לוחית התנגדות מארח, מספקות נתונים איכותיים על פרמטרים של זיהום בקטריופאג'-מארח כגון אלימות הנגיף, טווח המארח ואסטרטגיית השכפול. מבחני גידול תרבית נוזלית מאפשרים מדדים כמותיים יותר ומידול של דינמיקת וירוס-מארח.
    1. בדיקות נקודתיות על הדשא: כדי לקבוע את טווח המארח, הכינו מדשאות של מארחים משוערים מרובים המבודדים מדגימות סביבתיות או מזנים שנרכשו ממעבדות אחרות או מאוספי תרביות. על מדשאות, הבחין ב-2 מיקרוליטר של תרחיף בקטריופאג' (או וירוס) על הדשא בעזרת פיפטה. באזור נפרד של אותה צלחת, אתר את אותו נפח של Triton X-100 ומים ננו-טהורים (18MW) כבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה16. בצע בדיקות נקודתיות מרובות על הדשא עם בקטריופאג' (או וירוס) נתון על מספר מארחים כדי להעריך את טווח הפונדקאי של הבקטריופאג'16. פנוטיפים של פלאק מציעים תובנות לגבי אסטרטגיית השכפול של הבקטריופאג'ים (או הנגיף). לוחות בעלי גבולות חדים וברורים עד לאגר מצביעים על שכפול ליטי, בעוד שלוחות עם גבולות מפוזרים או הילה עשויים להצביע על שכפול לא-ליטי16,17.
      הערה: לחלופין, מבחני רובד דילול סדרתי של צלחת אחת מצביעים על קשר ליניארי בין גודל הפלאק לטיטר הבקטריופאג'ים. השתמש בטוש בצד האחורי של הצלחת כדי לחלק את הצלחת לרשת או לחלקי פאי. לאחר מכן, תוך שימוש באותו נפח (כלומר, 2 מ"ל) אך עם דילולים של תרחיף בקטריופאג'ים (למשל, 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), בצע את הבדיקה הנקודתית על הדשא על צלחת מארח יחידה.
    2. מבחני עמידות למארח: כדי לקבוע אם קבוצה של בקטריופאג'ים עלולה לייצר זיהום במארח נתון, הכינו מדשאה מארחת על צלחת כמתואר לעיל. בעזרת טוש בצד האחורי של הצלחת, מחלקים את הצלחת לרשת או לקטעי פאי. לאחר מכן, אתר 2 מ"ל מכל תרחיף בקטריופאג' (או וירוס) לחלק אחד של הרשת (או העוגה), תוך שימוש בטריטון X-100 ומים ננו-טהורים כבקרות. אם כל תרחיפי הבקטריופאג'ים (או הנגיף) מתווספים בטיטרים שווים, אז העריכו את האלימות היחסית בין זני בקטריופאג'ים (או וירוסים) על המארח באופן איכותי (כלומר, רובד גדול יותר = וירוס אלים יותר).
  2. כימות אלימות, חוסן וצמיחה במבחני זיהום בתרבית נוזלית
    הערה: תוצאות איכותניות ראשוניות מספקות בסיס להתמקדות בזוגות ספציפיים של בקטריופאג'ים-מארחים וביצוע ניתוחים כמותיים יותר של דינמיקת אינטראקציות בין וירוס למארח. בתרבית נוזלית, נוצרת עקומת צמיחה של מארח נגוע ומושווה לצמיחת מארח לא נגוע (בקרה).
    1. בצע בדיקת זיהום של וירוס יחיד/מארח יחיד בתרבית נוזלית כמתואר להלן.
      1. הקמת תרביות נוזליות מקבילות (~6-12) של מיקרואורגניזם (למשל, ציאנובקטריום) שהוכח כרגיש ומתירני על ידי מבחני לוחית מדיה מוצקה (שלב 5.1) באחד מהם: 1.0 ליטר (320 מ"ל תרבית), 500 מ"ל (160 מ"ל תרבית), או 250 מ"ל (80 מ"ל תרבית) - צלוחיות תרבית מבולבלות, כפי שתואר קודם לכן17. בנקודת זמן מוגדרת מראש (בדרך כלל 0.5 או 1 זמן הכפלת מארח), חסנו תת-קבוצה של תרביות מקבילות בצפיפות תאים שקולה (למשל, OD730nm = 0.08) בשלוש פעמים עם תרחיף בקטריופאג'ים באמצעות הנפח המתאים הנדרש כדי להניב ריבוי זיהום שנבחר מראש (MOI) עם טיטר מלאי עבודה זמין.
      2. השאירו תרביות מקבילות אחרות (גם הן בשלוש פעמים) לא מחוסנות (כלומר, לא נגועות) כבקרות. לחלופין, לחסן קבוצה שלישית של תרביות מקבילות עם זן בקטריופאג'ים (או נגיף) שונה לצורך השוואה בין זיווגים נבחרים של בקטריופאג'ים-מארחים. אפשר לתרביות לגדול בפוטו-ביו-ריאקטור במשך 3-10 ימים ב-25 מעלות צלזיוס עם עוצמת אור מוגדרת ל-20-40 מילימול פוטונים/מ"ר לשנייה.
      3. צור עקומות גדילה של מארח על ידי לקיחת קריאות OD730nm במרווחי זמן קבועים (למשל, 8 שעות) מתרביות נגועות בבקטריופאג'ים ולא נגועות (ביקורת) (איור 7A). השתמש באימות TEM של תרביות בקרה לא נגועות (איור 7C) וזיהום פרודוקטיבי בתרביות תאים מארחים (איור 7D). השפעות ציטופתיות29,30 ניכרות בקלות ברוב התאים הנגועים, בעוד שתאים לא נגועים אינם מראים סימנים של טרנספורמציה מורפולוגית או מתח.
    2. ניתוח בסיסי עבור מבחני זיהום בתרבית נוזלית: ממבחני זיהום בתרבית נוזלית של וירוס יחיד/מארח יחיד (SVSH), ניתן לגזור מספר מדדים בסיסיים, כגון: קצב גדילה ספציפי מקסימלי (μמקסימום)31, אלימות יחסית של בקטריופאג' (או וירוס)14, ועמידות מארח יחסית15- לתיאור כמותי יותר של דינמיקת בקטריופאג'-מארח או וירוס-מארח (איור 7B). מדדים סטנדרטיים הניתנים לדיווח כוללים קצב גדילה (מדווח לעתים קרובות כקצב גדילה ספציפי מקסימלי, או μמקסימום) ואלימות יחסית (VR)14 בהשוואה לבקרת מארח לא נגועה ו/או בקטריופאג' נפרד על אותו מארח. ניתן לדווח גם על מדדים אחרים כגון יכולת נשיאה של המערכת (Nasymptote) וחוסן יחסי של המארח (RR)15 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השימוש בגנרטור חשמלי נייד המופעל על ידי בנזין, משאבת העברת מים וצינורות עמידים בפני קריסה משמש כדרך יעילה לחלץ דגימות מים מהאוקיינוס, אגמים, אגמים קפואים וסביבות מימיות אחרות (למשל, לגונות) בעומקים נבחרים (איור 1, שלוש השורות העליונות). ציוד חלופי נדרש למים חומציים בטמפרטורה גבוהה של מעיינות חמים גיאותרמיים, בריכות ועציצי בוץ, שיכולים להכיל pH < 4 וטמפרטורות גבוהות מ-90 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש במוט במבוק ארוך או מוט ניקוי בריכת שחייה טלסקופית מאלומיניום ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הווירוספירה עצומה ומגוונת, ולכן דורשת גישות ניסיוניות שונות לחקר מערכות וירוסים שונות. זה כולל אסטרטגיות שונות לבידוד וירוסים ומארחיהם מסביבות שונות ושיטות עיבוד שונות כדי להבטיח שניתן יהיה לייצר תרביות טהורות של מארחים והווירוסים שלהם מדגימות גולמיות. ניתן להשתמש בתרביות טהורות אלה במבחני זיהום SVSH, הן על מדיה מוצקה והן בתרבית נוזלית, כך שניתן להשיג תכונות מערכת וניתוחים כמותיים של דינמיקת וירוס-מארח. בדוח זה, אנו מתארים זרימת עבודה סטנדרטית אך ניתנת לשינוי לדגימה מהאוקיינוס, אגמים, מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק OISE מס' 1856091 של הקרן הלאומית למדע של ארה"ב (NSF) ומענק NSF DBI מס' 2119968 (PI-Ceballos). המחברים מכירים בתרומתם של ד"ר צ'ינאפונג וואנגנאי וד"ר צ'קריט טצ'אפאיקון מהאוניברסיטה הטכנולוגית של המלך מונגקוט תונבורי (תאילנד), שסיפקו צילום וידאו ותמיכה בשטח לדגימה סביבתית, בהתאמה. המחברים מודים גם לד"ר חורחה ארמנדו לייבה סנבריה מאוניברסיטת קוסטה ריקה - גואנקסטה על עזרתו בהשגת אישורי דגימה מהפארקים הלאומיים בקוסטה ריקה וסיוע באיסוף דגימות מהבריכות הגיאותרמיות. המחברים מודים גם למר אנריקה מרוקין ג'וניור (אוניברסיטת קליפורניה מרסד) ולגב' אלכסיה מסדה (אוניברסיטת מיין, אורונו, מיין, ארה"ב), שסייעו בדגימה מול חופי דרום קליפורניה ואגמים בצפון מינסוטה, בהתאמה. המחברים מודים ומודים לתמיכה הטכנית של גב' סוצ'אטה הור, שחישבה את פרמטרי ההדבקה עבור מערך הנתונים φSBL14-SWII.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 משאבת העברה מפלדת אל-חלד של HP Utilitech, שארלוט, קרוליינה הצפונית, ארה"בלא ישים
צינורות 1.5 מ"לwww.eppendorf.com30123611
10K NMWL Centricon Plus 70 רכז סיבוב www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer מבולבלות www.sigmaaldrich.comCLS4450250
מחולל אינוורטר 3800 וואט WEN Products, ווסט דנדי, אילינוי, ארה"בWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 מ"ל www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer מבולבלות www.sigmaaldrich.comCLS4450500
קנקני מים בנפח 5 ליטר www.homedepot.comלא ישים
אורך 80 רגל, 0.5 אינץ' קוטר, ניילון https://facomex.mx/producto/combo/לא ישים
קונסולה מרכזית בעומק V 26 רגל Sailfish 2660 עם שני מנועים חיצוניים של ימאהה 150 כ"ס https://yamahaoutboards.com/לא ישים
אמוניום אצטט (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
חומצה בורית (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
צנטריפוגה 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
חומצת לימון (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
קובלט (II) ניטראט הקסהידרט [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
צינור גמיש מגומי עמיד בפני התמוטטות swanhose.comCELTF58050
נחושת (II) סולפט פנטהידראט (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
צינורות צנטריפוגה קורנינג 50 מ"ל www.sigmaaldrich.comCLS430291
דיפוטסיום פוספט (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
דיסודיום אתילנדיאמין-חומצה טראצטית (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume וספקטרופוטומטר ופלורומטרwww.denovix.comלא ישים
סרט דביק www.homedepot.comלא ישים
צינורות אפנדורףwww.sigmaaldrich.comEP022364120
אתנולwww.sigmaaldrich.com64175
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
אמוניום ציטראט ברזלי (C6H8O7· xFe3+· yNH<תת>3)www.sigmaaldrich.com1185575
צינורות PVC כחולים גמישים פלוס www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - שייקר אינקובטור הניתן לגיבובwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 מיקרוסקופ אלקטרונים Microscope_Transmission אלקטרונים שולחניים (TEM)delongamerica.comלא ישים
מגנזיום גופרתי הפטהידרט (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
מנגן (II) כלוריד טטרהידרט (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
עוגן פטריות שחור מצופה ויניל/30 פאונדwww.homedepot.comלא ישים
צלחות פטרי, פוליסטירןwww.sigmaaldrich.comעמ' 5481
מסנן ממברנה Polyethersulfone (PES) עם 0.22 מ"מwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
מסנן ממברנה Polyethersulfone (PES) עם 0.45 מ"מwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
אשלגן אתיל קסנטוגנאט (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
נתרן פחמתי (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
נתרן דודציל סולפט [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
נתרן מוליבדט דיהידראט (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
נתרן חנקתי (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
טריס(הידרוקסימתיל)מתיל]-2-אמינואתן-סולפוניק אצי (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
טריטון X-100 www.sigmaaldrich.comT8787
טריזמה הידרוכלוריד (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
משאבת ואקום/לחץ קול-פארמר; ורנון הילס, אילינוי, ארה"בEW-79204-00
צינורות ויניל www.homedepot.comלא ישים
אבץ גופרתי הפטהידראט (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

מקורות

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

High Throughput Sequencing
דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.