מאמר שיטה

ייצור ניתן לשחזור של SPOT כפלטפורמת תרבות מבוססת פיגומים בתפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/68405

⸱

29 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתעד את הייצור וההרכבה של SPOT, פלטפורמת תרבית מבוססת פיגומים בתפוקה גבוהה, בפורמטים של 96 ו-384 בארות. הוא גם מפרט את תהליך הזריעה של SPOT, הן ידני והן באמצעות מטפל בנוזלים זמין מסחרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הופכים בשימוש הולך וגובר בתחום חקר הסרטן למידול גידולים. הם משלבים את היתרונות של מודלים in vivo ומודלים מסורתיים במבחנה , מסכמים את מורכבות הרקמות וההטרוגניות תוך שהם עדיין מורכבים מתאים אנושיים. עלייתם של מודלים מייצגים פיזיולוגית של PDO עוררה צורך במכשירים המאפשרים ניתוח ישיר של התנהגות אורגנואידים. פרוטוקול זה מסביר כיצד להרכיב ולהשתמש בפלטפורמה הנתמכת על ידי פיגומים עבור רקמות מבוססות אורגנואיד (SPOT), מכשיר תרבית אורגנואידים תלת מימדית (3D) בעל תפוקה גבוהה. פלטפורמה זו מבטלת את המניסקוס שנוצר בדרך כלל על ידי הידרוג'לים זרעים כדי לאפשר הדמיה מדויקת ומהירה, בדומה לתהליך ההדמיה של תרביות דו-ממדיות (2D). כתוצאה מכך, ניתן בקלות לדמות אורגנואידים ותרביות משותפות שנזרעו ב-SPOT באמצעות מיקרוסקופיה בעלת תפוקה גבוהה. מיועד לשימוש מהמדף, SPOT נגיש לחוקרים בעלי ניסיון בסיסי בתרביות רקמות ותואם לתהליכי עבודה ידניים ואוטומטיים כאחד. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של SPOT בפורמטים של 96 ו-384 בארות, כולל הוראות שלב אחר שלב להרכבה, זריעה, בקרת איכות ופתרון בעיות. בעוד שהייצור דורש 3-4 שעות, לא כולל זמן סרק, ניתן לייצר לוחות מרובים בו-זמנית, מה שמשפר את יכולת ההרחבה. על ידי ייעול התרבות והניתוח של PDO, SPOT מספקת כלי חזק לסינון תרופות בתפוקה גבוהה ומחקר סרטן תרגומי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ההתקדמות במחקר הביו-רפואי, פיתוח בדיקות מבחנה רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית נותר מאתגר. בדיקה אידיאלית צריכה להתאים למגוון רחב של סוגי תאים, פורמולציות טיפול, טווחי זמן, מכשור מסחרי וקריאות אנליטיות כדי לענות על הצרכים של חוקרים בדיסציפלינות שונות. עם זאת, בשל היעדר כלים מתאימים, חוקרים מסתמכים לעתים קרובות על מודלים פשטניים, כגון חד-שכבות דו-ממדיות של קווי תאים אימורטליים, שאינם מצליחים לסכם את המורכבות והרלוונטיות הקלינית, במיוחד בחקר הסרטן 1,2. כדי לטפל בכך, בנקאות ביולוגית בקנה מידה גדול של גידולים ושיתוף פעולה קליני הניעו את הפיתוח של מודלים נאמנות גבוהה במבחנה כגון אורגנואידים של גידול שמקורם בחולה (PDOs), השומרים על פרופילים גנטיים וטיפוליים ספציפיים יותר למטופל בהשוואה לקווי תאים 3,4,5. בינתיים, התקדמות באוטומציה של מעבדות וגילוי תרופות דורשת פלטפורמות המשתלבות בצורה חלקה בתהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה. בעוד שהפלטפורמות הקיימות מתייחסות לנאמנות ביולוגית או למדרגיות, מעטות הצליחו לפתור את שני האתגרים בו זמנית 6,7,8. פיתוח מודלים אוטומטיים בעלי תפוקה גבוהה המשכפלים תכונות מחלה מרכזיות הוא חיוני לקידום המחקר הביו-רפואי ולהאצת יצירת נתונים עבור יישומים תרגומיים.

מודלים מתפתחים רבים שואפים להתמודד עם האתגרים הקשורים לתרבית סוגי תאים מיוחדים, כגון PDOs, עם תפוקה גבוהה (איור 1). פלטפורמות סטנדרטיות, שבהן אורגנואידים מעורבבים עם הידרוג'ל בצלחות של 96 או 384 בארות, מציגות מספר מגבלות: (i) נפח תאים-ג'ל גבוה מוביל לגישה לא עקבית לחומרים מזינים, (ii) עקמומיות מניסקוס באר יוצרת חפצי הדמיה ושיפועים תאיים, (iii) זריעת הידרוג'ל חסרה אחידות בין קבוצות וכוח אדם, (iv) חוסר תאימות לייצור אוטומטי ומיקרוסקופיה אוטומטית, ו-(v) שימוש במטריצה חוץ-תאית (ECM) שהיא בדרך כלל דגימת סיכונים רכה ושברירית הרס בצפיפות רקמות פיזיולוגיות או שילוב של סוגי תאים מתכווצים 1,9. נכון לעכשיו, רוב מחקרי ה-PDO מבוססי הצלחת נערכים על ידי זריעה ידנית של ג'ל התא לתוך הצלחת10,11, או בשיטת כיסוי ג'ל, שבה ההידרוג'ל מדולל בתווך פחות צמיג, והתאים עוברים צנטריפוגה לתחתית הבאר כדי למקם אותם במישור האופטי המתאים12,13. שתי הגישות אינן מצליחות לספק תמיכה מכנית לתרבות ארוכת טווח. בהתבסס על התצפיות הקודמות שלנו (נתונים שלא פורסמו), הידרוג'ל מסחרי מעורבב עם תאים בצלחות באר סטנדרטיות מתכווץ מפני השטח של הבאר במשך 9 מתוך 12 בארות במשך 12 ימים, בעוד ששיטת כיסוי הג'ל חסרה אינטראקציות פיזיולוגיות בין תא למטריצה. בנוסף, לא ניתן לשמור על התרביות המתקבלות לאורך תקופות ארוכות עקב מגבלות מקום בתוך הבאר ואינן תואמות לבדיקות הדורשות יחס גבוה של מגיב לתא-בינוני 14,15,16. חסמים מעשיים אלה מעכבים את אימוץ מודלים תלת מימדיים ומגבילים את יכולת השחזור הניסויי בשטח.

figure-introduction-1
איור 1: הערכת מודלים של תרבית המבוססת על מדרגיות ורלוונטיות ביולוגית. המיקום היחסי של מערכות תרבית שונות במבחנה וב-vivo לאורך מדרגיות (ציר y), המוגדרת על ידי תפוקת לוחות, ורלוונטיות ביולוגית (ציר x), תוך הדגשת פשרות בין פוטנציאל תפוקה לנאמנות פיזיולוגית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מונעים על ידי אתגרים אלה, הנקבוביות הגבוהה והחיזוק המכני של פיגום תאית דק מונפו לפיתוח הפלטפורמה הנתמכת בפיגומים לרקמות מבוססות אורגנואיד (SPOT), הזמינה בפורמטים של 96 ו-384 בארות. SPOT משלב פיגום פולימרי מעוצב מראש בשיטת חדירהשפותחה בעבר 17 התואמת את פריסת הצלחת, מאפשרת מיקום מדויק של טיפות ג'ל תאים ומספקת תמיכה מבנית לשלב ההידרוג'ל (איור 2A). נידוף נימי לתוך הפיגום מנחה את תמיסת ג'ל התא, ויוצרת רשת ביו-מרוכבת הנאכפת מכנית (איור 2B). בשל המבנה הנקבובי של הפיגום, ג'ל התא חודר ויוצר שכבה דקה (בעובי של כ-70 מיקרומטר), הדורשת פי עשרה פחות ג'ל תאים כדי לכסות את קרקעית הבאר14. התאימות של SPOT עם זרעי PDOs של אדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) הודגמה גם על ידי הערכת צמיחתם באמצעות מבחנים מטבוליים ומדידות מבוססות תמונה. מאז פיתוחו, SPOT הוכיח צדדיות ושימושיות משמעותית עבור חוקרים העוסקים בתרבית אורגנואידים. בנוסף, העיצוב של SPOT מתאים למדרגיות ידידותית למשתמש, עם נפחי ריאגנטים מופחתים ויכולות הדמיה משופרות באמצעות גיאומטריית המיקרוג'ל השטוחה ונטולת המניסקוס, מה שמבטיח חדירת אור אחידה והדמיה מדויקת בתוכן גבוה14 (איור 2C,D). SPOT תומך גם בתרבית משותפת עם סוגי תאים רלוונטיים אחרים, כגון פיברובלסטים, כדי לסכם טוב יותר את המיקרו-סביבה של הגידול18.

figure-introduction-2
איור 2: סקירה כללית של התקן 96-SPOT וזרימת העבודה של ניתוח תמונה. (A) ייצוג סכמטי של ייצור לוחות SPOT: ההתקן מורכב על ידי איסוף לוחית באר מסחרית ללא תחתית (למעלה), פיגום בדוגמת PMMA (מוצג בכחול) וסרט פוליקרבונט (למטה) באמצעות שכבות של דבק פוליאקרילי דו-צדדי (מוצג בצהוב). (B) זריעת תאים לתוך באר פיגום: תאים תלויים בהידרוג'ל לא מפולימר (מוצג בוורוד) ומוזרמים לתוך כל באר שבה הוא חודר לפיגום. לאחר מכן נותנים להידרוג'ל לג'ל כדי לעטוף את התאים בתוך ההידרוג'ל הנתמך על ידי פיגומים. (C) מיקרוסקופיה: ניתן לדמות את המיקרו-רקמה המתקבלת באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית של שדה רחב. (ד) ניתוח מבוסס תמונה: ניתן לנתח תמונות נרכשות של תאים פלואורסצנטיים (ירוקים) תלויים בג'ל באמצעות צינורות ניתוח תמונה סטנדרטיים. תמונת מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית מייצגת של תאי KP4 המבטאים GFP בבאר אחת של 96 נקודות. סרגל קנה המידה הוא 500 מיקרומטר. נתון זה שונהמ-14. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

יתרון נוסף של SPOT הוא שניתן לשלב את המערכת עם מטפל בנוזלים בקוד פתוח, מה שמקל על ייצור אוטומטי וניתן לשחזור של תרביות PDO. התקדמות זו מפחיתה את השונות של המשתמש ותומכת בעיצובים ניסויים מורכבים, כולל סינון תרופות בתפוקה גבוהה וגישות רפואה מותאמת אישית18. SPOT הוכח בעבר גם כתואם לאפיון מרובה מבוסס תא יחיד של פנוטיפים תאיים בסביבות גידול הטרוגניות ואחזור התאים לפי דרישה מ-SPOT על ידי עיכול18. תכונות אלה ממקמות את SPOT ככלי רב-תכליתי לסינון יישומים, כאשר נתונים אורכיים ברזולוציה גבוהה חיוניים להערכת יעילות התרופות וההתנהגות התאית בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית14,18. על ידי שילוב החידושים הטכניים הללו, SPOT מטפלת במגבלות קריטיות במערכות תרבות תלת מימד מסורתיות.

פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לייצור רכיבי SPOT, הרכבת לוחות ושיטות זריעה עבור תרביות אורגנואידים תלת מימדיות חזקות וניתנות לשחזור. הוא כולל הוראות מפורטות לזריעת צלחות ידנית באמצעות מיקרופיפטה ותהליכי זריעה אוטומטיים עם מטפל בנוזלים, התומך בפורמטים של 96 ו-384 בארות. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר אמצעי בקרת איכות חיוניים, כגון אימות פיזור ג'ל אחיד ותקינות פיגומים, כדי לשמור על סטנדרטים ניסיוניים גבוהים. אסטרטגיות פתרון בעיות ניתנות גם כדי לטפל בבעיות נפוצות, כגון חדירת ג'ל לא שלמה, אידוי במהלך הזריעה וניתוק פיגומים, מה שמצייד את החוקרים בפתרונות מעשיים כדי לייעל את זרימות העבודה שלהם ולהשיג תוצאות אמינות.

SPOT נועד למלא את הפערים העומדים בפני בדיקות אורגנואידים מסורתיות, כולל אתגרים הקשורים לביצוע בדיקות ושינוי מדיה תוך שמירה על שלמות הג'ל 10,11,12,13. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר פלטפורמה הנתמכת בפיגומים התומכת בתרבית אורגנואידים לאורך תקופה של 12 יום. בנוסף, שיטה זו מכסה גם יצירת מערכי רקמות ב-SPOT באמצעות זריעה ידנית או בעזרת מטפל בנוזל כדי לאפשר למשתמשים לבצע כל הפרעה במורד הזרם, כולל בדיקות תרופות IC50 וסינון מולקולות קטנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש באורגנואידים של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) כדוגמה. אורגנואידים אלה הוקמו מחולי PDAC, שנרכשו מהבנק הביולוגי UHN במרכז הסרטן הנסיכה מרגרט (מזהה PMLB PPTO.46 מרשת הבריאות האוניברסיטאית, קנדה) תחת פרוטוקול בהתאם להנחיות מועצת האתיקה של המחקר של אוניברסיטת טורונטו (פרוטוקול #36107). אנא ראה את כל החומרים, הריאגנטים והציוד הנדרשים בטבלת החומרים.

1. הכנת תמיסת PMMA-אצטון (תזמון: 20 דקות + ~8-16 שעות סרק)

הערה: תמיסת פולימתיל מתאקרילט (PMMA)-אצטון משמשת ב-SPOT לתיחום בארות ומניעת דליפה בין בארות. ההליך הכללי הוא להמיס PMMA מוצק באצטון. בעבר, נעשה שימוש בתמיסת PMMA-אצטון כדי לעצב פיגום נייר דומה כדי לחסום חילופי מדיה וגזים כדי להשיג היפוקסיה במודל תרבית תלת מימד אחר17. כאן, נוסחת PMMA-אצטון מותאמת ליצירת פיגומים שחדרו ל-PMMA לייצור SPOT.

  1. בצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל מסומן, הוסף 1.75 גרם אבקת PMMA. לאחר מכן, במכסה אדים, הוסיפו 7.84 מ"ל אצטון וסגרו את הצינור בחוזקה כדי למנוע אידוי ממס.
  2. אם יש צורך בהדמיה של דפוס הפולימר, הוסף 5-10 טיפות לק לתמיסה. סגור היטב את צינור הצנטריפוגה. נער ידנית את הצינור כדי להתחיל לערבב את הלק עם תמיסת PMMA-אצטון.
    הערה: כדי להיות עקבי על פני קבוצות שרטוט מרובות, יש לדלל כמות ידועה של לק באצטון, ולאחר מכן לפיפטה תמיסה זו כ-7.84 מ"ל של אצטון.
  3. הנח את תמיסת ה-PMMA-אצטון על מערבל המערבולת למשך הלילה כדי להבטיח שהתמיסה תתמוסס. אחסן את תמיסת ה-PMMA-אצטון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לכל היותר, אם לא נפתח.

2. הכנת פיגומים שחדרו ל-PMMA

(תזמון: לדפוס 96 נקודות: 15 דקות התקנה + 6 דקות לכל פיגום; לדפוס 384 נקודות: 15 דקות התקנה + 10 דקות לכל פיגום)

הערה: ייצור פיגומים שחדרו ל-PMMA עבור 96-/384-SPOT מתבצע אך ורק על שולחן עבודה (סביבה לא סטרילית). כדי ליצור פיגומי 96/384-SPOT, אנא ודא שתוכנת הפלוטר לעריכה גרפית או ספריית בקרת פלוטר וקטורי הותקנה בהתאמה. שימו לב שחלק מתתי הסעיפים של הנוהל חלים הן על 96-SPOT והן על 384-SPOT, בעוד שאחרים ספציפיים לגודל צלחת אחת. במקרה האחרון, יוצגו אפשרויות A (עבור 96-SPOT) ו-B (עבור 384-SPOT). עבור תבנית (A) 96-SPOT, ישנן שלוש שכבות; ראשית, קווי ההתחלה יוצרים זרימה עקבית של תמיסת PMMA-אצטון; שנית, מערך של 96 מעגלים; לבסוף, דפוס איש מכירות נודד (TSP) מתווה את החללים בין הבארות. עבור דפוס (B) 384-SPOT, המודול הראשון מכיל קווי תחול; שנית, הגבול המקיף את לוחית הבאר; לבסוף, רשת משורטטת כך שנותרו 384 אזורים. עבור שתי התבניות, ניתן לשלוט בגדלים של הבארות על ידי שינוי קוד המקור, כפי שהודגם על ידי Li et al.14.

  1. הגדרה לתהליך חדירת הפיגומים
    1. הניחו לתמיסת PMMA-אצטון (המאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) לנער במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השאירו את מחזיק הצינור עד לתחילת התכנון.
    2. חבר את הפלוטר לחשמל באמצעות כבל החשמל. נורית ירוקה מהבהבת מציינת שההתקן מופעל. חבר את כבל ה-USB של ה-plotter למחשב המיועד להתוויה.
    3. מכסים את כן הציור בפיסת נייר אפייה. ודא שכל פני השטח של כן הציור מכוסים.
      1. כדי להנחות את ההתוויה של דפוסי 96-/384-SPOT, הכן תבנית 96-/384-SPOT על גיליון נייר מדפסת. בצע את שלבים 2.2-2.3 באמצעות עט במקום מזרק, ונייר מדפסת במקום נייר האפייה ומסנן התה. לאחר שהתבנית מוכנה, מקם אותה על כן הקליפס וכסה אותה בנייר אפייה. המשך לשלב 2.2 ופעל לפי הפרוטוקול כדי ליצור פיגומים 96-/384-SPOT.
    4. clamp את נייר האפייה על כן הציור באמצעות קליפס קלסר (איור 3A). קחו דף פיגום (כלומר, נייר סינון תה) וחתכו לאורך הצדדים שבהם שתי השכבות מותכות יחד (איור 3B).
    5. מקם את מסנן התה החתוך - הנקרא להלן פיגום נייר - על כן הציור, כשהצד החלק (הצד החיצוני של מסנן התה) כלפי מעלה. מהדקים אותו משלושה צדדים . ודא שפיגום הנייר שטוח במלואו על כן הציור; אסור שיהיו קמטים באזור התכנון.
  2. התוויית תבנית 96/384-SPOT
    1. כדי להגדיר את תוכנת התווין והקובץ עבור 96-SPOT, עקוב אחר אפשרות 2.2.2; כדי להגדיר את התוכנה ו-file עבור 384-SPOT, עקוב אחר אפשרות 2.2.3.
    2. הגדרת תוכנת הפלוטטר וקובץ התוויית 96-SPOT
      1. באפליקציית התוכנה, פתח את קובץ ה-SVG עבור 96-SPOT (קובץ משלים 1; איור 4A). בשורת התפריטים, נווט אל הרחבות > בקרת פלוטר (איור 4B).
      2. כאשר החלון החדש מופיע, התאם את ההגדרות כך שיתאימו לאיור משלים 1. חזור לכרטיסיה התוויית התוויה של חלון הרחבת בקרת התווין. השאר את זה פתוח למועד מאוחר יותר.
    3. הגדרת ה-API של ספריית בקרת הפלוטר הווקטורי וקובץ התוויית 384-SPOT
      1. פתח את חלון שורת הפקודה (Windows) או את המסוף (Mac). הזן את הפקודה כדי להפעיל את מחברת המחשוב האינטראקטיבית הייעודית. ודא שהמחברת נפתחת בדפדפן.
      2. בחר את קובץ קוד 384-SPOT (קובץ משלים 2) לפתיחה. באמצעות קצה 20G (או קצה 16G עבור תבנית 384-SPOT), שאפו 1 מ"ל של תמיסת PMMA-אצטון עם מזרק התוויית 3 מ"ל (איור 3C).
        הערה: שסתום בקרת הזרימה בין מזרק הטעינה של 10 מ"ל לצינור EVA חייב להיות פתוח (במקביל לקנה). מכיוון שתהליך ההסתננות מונע על ידי כוח הכבידה, ודא שמזרק התכנון של 3 מ"ל מתמלא תמיד בין הסימון של 0.5-1.5 מ"ל כדי לשמור על נפח חלוקה עקבי במהלך התכנון.
    4. בזמן שקצה מזרק התכנון של 3 מ"ל עדיין נמצא בתוך תמיסת ה-PMMA-אצטון, סגור את שסתום בקרת הזרימה בין מזרק הטעינה של 10 מ"ל לצינור ה-EVA (הביאו אותו בניצב לקנה).
    5. סגור במהירות את הצינור של תמיסת PMMA-אצטון. טען את המזרק בנפח 3 מ"ל על מחזיק העט. כוונן את גובה המזרק ביחס למחזיק כדי להשיג את היישור הבא (איור 3D).
    6. התאם את המיקום של כן הציור כך שקצה המזרק של 3 מ"ל מונח במקור התבנית המשורטטת (כלומר, הנקודה הכהה בפינה השמאלית העליונה של תבנית התבנית). הרם את מחזיק עט התווים כשהמזרק מחובר אליו, כדי להחליק את כן הציור שמתחתיו.
    7. נתק במהירות את מזרק ה-10 מ"ל מהצינור כדי לאפשר ללחץ אטמוספרי להפעיל לחץ על תמיסת ה-PMMA-אצטון המאוחסנת במזרק התווים של 3 מ"ל. פתח את שסתום בקרת הזרימה.
    8. כדי להתחיל לשרטט את תבנית 96 הנקודות, בצע את שלבים 2.2.9; כדי להתחיל בתכנון 384-SPOT, בצע את שלב 2.2.10.
    9. התחל התוויה של 96-SPOT בפלוטר המיועד כמתואר להלן.
      1. בתוכנה, לחץ על החל על הרחבות בקרת הפלוטר. הפלוטר יתחיל כעת לרוץ, תוך התוויית דפוס PMMA. אין צורך בפעולות נוספות עד לסיום התכנון, ומחזיק עט הפלוטר חוזר לעמדת הבית שלו.
      2. כדי להשהות את הפלוטר במהלך התכנון, לחץ על כפתור הכסף הקטן בצד שמאל של הפלוטר. לאחר מכן, באמצעות הכרטיסייה הרחבות בקרת פלוטר > קורות חיים בתוכנת הגרפיקה, בחר לחדש את ההתוויה מהמקום שבו הוא נעצר או להחזיר את מחזיק העט למצב הבית (איור משלים 1C(iii)).
    10. התחל התוויה של 384-SPOT בממשק המחשוב הייעודי כמתואר להלן.
      1. בממשק, לחץ על הפעל מחדש את הליבה והפעל מחדש (חץ כפול בסרגל הכלים). הקוד יתחיל כעת לרוץ, תוך התוויית תבנית PMMA. אין צורך בפעולות נוספות עד לסיום התבנית ומחזיק העט חוזר לעמדת הבית שלו.
      2. כדי להשהות את התווין במהלך התוויה, לחץ על לחצן כסף קטן בצד שמאל של התווין. הזז ידנית את ראש ההדפסה עד הסוף אחורה ושמאלה כדי שיגיע למיקום הביתי שלו. חבר מחדש את הקושר לחשמל. בניגוד לתכנון 96-SPOT, אין דרך לחדש את התכנון עבור 384-SPOT מהמקום שבו הוא הושהה; החלף פיגום נייר והתחל את הקוד מההתחלה.
  3. פריקת המזרק וניקוי
    1. לאחר סיום התכנון, חבר מחדש את מזרק 10 מ"ל לצינור. הסר את המזרק בנפח 3 מ"ל ממחזיק עט הפלוטר והעבר כל תמיסת PMMA-אצטון שנותרה בחזרה לבקבוקון המלאי או השליך אם התרחש אידוי משמעותי במהלך השלבים הקודמים.
    2. שטפו את הקנה של מזרק 3 מ"ל על ידי פיפטינג באצטון. השאירו את מערכת צינורות המזרק לייבוש באוויר לפני החזרתה למקום האחסון שלה.
    3. שחרר בזהירות את פיגום ה-SPOT מכן הקליפס.
    4. בדקו את פיגומי ה-SPOT ששורטטו כדי לוודא שהם יכולים לשמש לניסויים (איור 3E,F). עיין בטבלת פתרון הבעיות 1 ובטבלת אבטחת איכות ובקרת איכות 2 וטבלה 3 לקבלת הדרכה.
    5. אחסן את כל הפיגומים בדוגמת PMMA בשקית עם רוכסן במקום קריר ויבש.

3. חיתוך סרט 96/384 באר

(תזמון: לדפוס 96 נקודות: 15 דקות לכל 5 חתיכות סרט; לדפוס 384 נקודות: 30 דקות לכל 5 חתיכות סרט)

הערה: זוהי אחת הדרכים היעילות ביותר לחתוך קלטות בצורה מדויקת ויעילה, במיוחד עבור דפוסי קלטת של 384 בארות. שיטה זו מציעה גם אפשרות לחריטה בלייזר של שכבה אחת של הסרט (פלסטיק כיסוי עליון) כדי לשפר את השימושיות בתהליך ההרכבה. לחלופין, ניתן לחתוך את הקלטות גם באמצעות חותכי נייר בקצב איטי יותר ללא תהליך החריטה.

  1. פתח את קובץ חיתוך הלייזר בתבנית קלטת 96/384 בארות (קובץ משלים 3, קובץ משלים 4) וטען את תבנית ההדפסה המקודדת בשלושה צבעים שונים לתוכנת חיתוך לייזר על ידי לחיצה על עלילה עם ההגדרות הבאות באיור משלים 2A.
  2. טען פיסת סרט על משטח חותך הלייזר וודא שהסרט שטוח בצורה חלקה על פני השטח. השתמש בסרטי נייר או במשקולות כבדות כדי להחזיק קלטות במהלך החיתוך.
    הערה: ודא שהסרט שטוח על משטח חותך הלייזר. כל בליטה עלולה להשפיע על איכות הסרטים החתוכים, במיוחד סרטים של 384 בארות.
  3. התאם את מיקום דפוס ההדפסה כך שיתאים למיקום הקלטת בהתבסס על מדריך חותך הלייזר.
  4. חותכים את שתי הקלטות של 96/384 בארות באמצעות אותה הגדרת חותך לייזר כפי שמוצג באיור משלים 2B. סדר הקווים עם צבעים ספציפיים חשוב. חותכים את הקו האדום קודם לפני הקו הירוק. חותכים את הכחול בסוף.
    קו אדום: מצב Rast/Vest עם 45% עוצמת לייזר, 80% מהירות, 1000 PPI וציר Z של 0.50 מ"מ.
    קו ירוק: מצב Rast/Vest עם 7% עוצמת לייזר, 100% מהירות, 1000 PPI וציר Z של 0.50 מ"מ.
    קו כחול: מצב Rast/Vest עם 50% עוצמת לייזר, 80% מהירות, 1000 PPI וציר Z של 0.50 מ"מ.
  5. אחסן קלטות מעוצבות כראוי עד להרכבת SPOT.

4. מכלול 96/384-SPOT (תזמון: 1 שעה)

הערה: סעיף זה מפרט את הנוהל להרכבת התקני 96-/384-SPOT בסביבה סטרילית כגון ארון בטיחות ביולוגית (BSC). לחלופין, ניתן להרכיב מראש את התקני 96-/384-SPOT בסביבה לא סטרילית ולאחר מכן לעקר אותם באמצעות תהליך עיקור גז אתילן.

  1. הכנת פיגום SPOT להרכבה
    1. קח פיגום בדוגמת PMMA עבור 96 או 384 נקודות. חותכים את עודפי הנייר סביב האזור הכחול של הפיגום. השאירו 5 מ"מ של שטח לבן סביב היקף האזור הכחול. הגיליון המתקבל יהיה כ- 760 מ"מ על 1300 מ"מ.
      הערה: אין לחתוך את קו ההתחלה. זה שימושי בקביעה איזה צד של הפיגום מחוספס/חלק (איור 3E,F).
    2. להכנת פיגום 96 נקודות להרכבה, בצע את שלב 4.1.3. להכנת פיגום 384 נקודות, בצע את שלב 4.1.4.
    3. בצע ניקוב של חללים בין בארות על פיגום 96-SPOT.
      1. הניחו חתיכת סרט פוליאתילן (1000 מ"מ x 1500 מ"מ) על תומך אקרילי קשיח (2700 מ"מ x 2700 מ"מ). הניחו את התמיכה המכוסה בסרט פוליאתילן על משטח העבודה והניחו את הפיגום מעל סרט הפוליאתילן (איור 5A).
      2. יישר קצה של הסרגל בין שתי השורות הראשונות כך שהעקיבה לצד קצה זה לא תיכנס לבאר.
      3. הנח את גלגל העקיבה כנגד הסרגל בתחתית הפיגום. גלגל את גלגל המעקב כלפי מעלה לחלק העליון של הפיגום, באמצעות הסרגל כדי להנחות את נתיב הלהב. חזור על פעולה זו עבור כל הרווחים בין השורות בפיגום (כלומר, 7x).
      4. חזור על שלבים 4.1.3.2 ו- 4.1.3.3 עבור כל רווח אחר בין עמודות, החל מהרווח בין שתי העמודות הראשונות.
    4. אין לבצע ניקוב של חללים בין בארות בפיגום 384-SPOT לפי השלבים הבאים.
      1. אין לנקב את החללים בין הבארות של פיגום 384-SPOT. המשך ישירות לשלב 4.2.
  2. עיקור חומרי SPOT וציוד הרכבה
    1. הנח את הפיגום המודפס, שני סרטים עם 96 בארות (או קלטות של 384 בארות), צלחת ללא תחתית עם 96 בארות (או צלחת ללא תחתית של 384 בארות), כיסוי צלחת של 96 בארות (או כיסוי צלחת של 384 בארות), סרט פוליקרבונט, לוח פולידימתילסילוקסן (PDMS), שקית ניילון הניתנת לסגירה חוזרת, פינצטה וסכין מדויקת לתוך ה-BSC, UV למשך 20 דקות בצד אחד (איור 5B).
    2. הפוך את כל החומרים וציוד ההרכבה לצד השני ו-UV למשך 20 דקות נוספות.
  3. הצמדת פיגום לסרט ראשון עם 96/384 בארות
    1. הנח את הפיגום עם הצד המחוספס כלפי מעלה (איור 3F) על לוח ה-PDMS, כך שהשורות עוברות אופקית. השתמש בקו ההתחלה כדי לקבוע איזה צד מחוספס (קו הכנה ראשונית מיושר לימין מציין צד מחוספס כלפי מעלה).
    2. החלק את הפיגום על לוח ה-PDMS כך שלא יהיו קמטים או בועות על (או מתחתי) הפיגום. הסר את שכבת המגן מהצד הלא חרוט של הקלטת הדו-צדדית. חגרו מעט את אמצע הקלטת ויישרו את שני העמודים האמצעיים של הקלטת עם הפיגום.
    3. לאחר היישור, לחץ על אמצע הסרט כלפי מטה. החלק את הקלטת על הפיגום, החל מהאמצע ונע כלפי חוץ.
      הערה: לפיגום מיושר בצורה לא נכונה יהיה דפוס PMMA ברור החופף לאזור הזריעה של הבאר.
    4. השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את הפיגום מלוח ה- PDMS ולאחסן את הלוח לייצור עתידי.
  4. חיבור פיגום לסרט 96/384 באר שני
    1. הנח את הפיגום על שולחן העבודה. הפוך את הפיגום כך שהצד החלק (הצד הלא מודבק) פונה כלפי מעלה.
    2. הסר את שכבת המגן האמצעית מהצד החרוט של הקלטת השנייה. ודא ששני העמודים האמצעיים של הקלטת חשופים. אם נעשה שימוש בעיצוב הקלטת שאינו חרוט, הסר לחלוטין את שכבת המגן מצד אחד.
    3. חגרו מעט את אמצע הקלטת ויישרו את שני העמודים האמצעיים של הקלטת עם הפיגום.
    4. לאחר שהסרט מיושר לפיגום, לחץ על אמצע הסרט כלפי מטה. אם נעשה שימוש בעיצוב הקלטת החרוטה, הסר את שתי שכבות המגן האחרות הסמוכות לחלק האמצעי החשוף של הקלטת. החלק את הקלטת על הפיגום, החל מהאמצע ונע כלפי חוץ.
  5. הצמדת הפיגום לצלחת ללא תחתית
    1. הסר את שכבת המגן של הקלטת מהצד המחוספס של הפיגום. אם אתה משתמש בעיצוב הסרט החרוט, הסר רק את שכבת המגן האמצעית.
    2. יישר את הפיגום לצד התחתון של הצלחת ללא תחתית (עם מכסה). לאחר היישור, לחץ על אמצע הפיגום על הצד התחתון של הצלחת. אם אתה משתמש בעיצוב החרוט, הסר את שכבות המגן הסמוכות לאמצע החשוף. החלק את הפיגום על הצלחת מהאמצע כלפי חוץ.
  6. הצמדת הפיגום לסרט הפוליקרבונט
    1. בעזרת פינצטה, שחרר בזהירות את שכבת המגן של סרט הפוליקרבונט. לאחר שהשתחרר, קלף לאט את שכבת המגן מהסרט. אל תיצור חריצים בסרט, מכיוון שזה ישפיע על התכונות האופטיות שלו להדמיית מיקרוסקופיה.
    2. חזור על שלב 4.6.1 עם הצד השני של סרט הפוליקרבונט. לאחר הסרת שתי שכבות המגן, הנח את הסרט בצד על שולחן העבודה.
    3. הסר את שכבת המגן מהסרט המחובר לתחתית הצלחת. לחץ על סרט הפוליקרבונט על הפיגום, החל מהאמצע כלפי חוץ.
    4. לחץ בחוזקה על סרט הפוליקרבונט על תחתית הצלחת כך שכל הבארות יקבלו גבול בולט היטב.
    5. בעזרת סכין מדויקת חותכים בזהירות את עודפי החומר מתחתית הצלחת.
      הערה: שימו לב במיוחד לא לחתוך לצלחת או לאף אחת מהבארות. אם הסכין לא חותכת בקלות, בדוק אם היא חותכת לצלחת.
  7. אחסון 96/384-SPOT לאחר ההרכבה
    1. לאחר הרכבה מלאה של 96-SPOT, הנח אותו בשקית ניילון שקופה הניתנת לסגירה חוזרת. הביאו את התיק מחוץ ל-BSC.
    2. הניחו תמיכה אקרילית קשיחה בצד התחתון של הצלחת. clamp את התמיכה האקרילית לצלחת בפינות מנוגדות (איור 5C). שמור clamp לפחות 30 דקות על כל פינה לפני השימוש.
    3. אחסן את הצלחת במקום נקי ויבש עד לשימוש.

5. זריעה 96/384-SPOT (תזמון: 2 שעות 45 דקות)

הערה: סעיף זה מפרט את הנוהל לזריעת התקני 96-/384-SPOT ליצירת מיקרו-רקמות תלת מימדיות אחידות. תהליך הזריעה כולל חלוקה זהירה של נפח ג'ל תאים מוגדר (למשל, 5 מיקרוליטר עבור 96-SPOT או 2 מיקרוליטר עבור 384-SPOT) על פיגום ה-SPOT שהורכב מראש. כדי להבטיח חדירה אחידה ופיזור ג'ל, טיפת ג'ל התא מונחית לאורך המבנה הנקבובי של הפיגום באמצעות פתילה נימית. שלב זה יכול להתבצע באופן ידני באמצעות מיקרופיפטה או אוטומטי עם טיפול בנוזלים. לאחר הזריעה, הלוחות מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר פילמור ג'ל ואנקפסולציה של תאים.

  1. הכנת צלחת 96/384-SPOT
    1. הסר מהדק 96-/384-SPOT והסר את התמיכה האקרילית מלמטה.
    2. ב-BSC, הסר את SPOT משקית הניילון. הפעל את ה-UV כדי לעקר את החלק הפנימי של הצלחת ולכסות למשך 20 דקות לפני סגירת המכסה והפיכה לתחתית הצלחת למשך 20 דקות נוספות של טיפול ב-UV.
    3. פיפטה 70 מיקרוליטר של PBS לכל חלל בין בארות של לוחית 96-SPOT. אין להכניס פיפטה PBS לתוך צלחת 384 SPOT. מצננים את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני הזריעה.
  2. הכנת תאים
    1. נתק תאים מצלוחיות תרבית או אורגנואידים מכיפות ג'ל על סמך טיפול מומלץ וספרו את כמות התאים באמצעות ההמוציטומטר לפי הוראות היצרן. שימו לב לצפיפות התאים של תרחיף התא (כלומר מספר התאים למ"ל) כדי לחשב את נפח תרחיף התאים הנדרש לשלבים 5.4.1-5.4.2 בהתבסס על צפיפות הזריעה הרצויה.
  3. הכנת ג'ל
    1. בהתאם להוראות הכנת ההידרוג'ל שעברו אופטימיזציה בעבר 17,19,20,21, צור את ההידרוג'ל על ידי הוצאת 1 מ"ל של קולגן בקר מסוג 3 מ"ג/מ"ל לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      הערה: יש לשמור את הרכיבים והתערובת המתקבלת על קרח לאורך כל תקופת ההכנה.
    2. יש להוציא 125 מיקרוליטר של מדיום חיוני מינימלי מרוכז פי 10 (MEM) לתוך הקולגן מבקר. פיפטה לאט למעלה ולמטה כדי לערבב עד שהתערובת הופכת מוורוד לצהוב.
    3. יש להוציא 8 מיקרוליטר של 0.8 M נתרן ביקרבונט לתערובת הקולגן של הבקר. פיפטה לאט למעלה ולמטה כדי לערבב עד שהתערובת הופכת לוורוד בהיר. השתמש בתמיסה המעורבת תוך 30 דקות מההכנה כדי להבטיח ג'לציה עקבית על פני מספר ניסויים.
      הערה: אם התערובת נשארת צהובה, יש לטטר את התמיסה ל-pH 7 על ידי הוספת 0.8 מ' ב-0.5 מיקרוליטר עד לקבלת צבע ורוד בהיר. אופציונלי: לאחר אותו הליך, ניתן להכין ג'ל לתרביות הדורשות ריכוז קולגן גבוה יותר. לגידול אורגנואידים, השתמש בתערובת ההידרוג'ל המאופיינת על ידי Landon-Brace et al.17.
  4. השעיית תאים בג'ל
    1. הוצא את נפח תרחיף התאים הנדרש לצפיפות תא המטרה לג'ל לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות.
    2. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בג'ל (הנפח משתנה בהתאם לריכוז המטרה)
  5. זריעה של צלחת 96-/384-SPOT באופן ידני
    1. הניחו את צלחת 96-/384-SPOT על שקית קרח קפואה. כדי לזרוע 96-SPOT, בצע את שלבים 5.5.2. כדי לזרוע 384-SPOT, בצע את שלבים 5.5.3.
    2. זריעה ידנית של 96 נקודות
      1. מצפים מראש קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בתערובת ג'ל התא. שואבים 5 מיקרוליטר ג'ל בעזרת פיפטה של 20 מיקרוליטר ומוציאים לתחנה הראשונה עד שנוצרת טיפה בקצה. גע בטיפה באמצע באר.
        הערה: הוצאת הג'ל על ידי לחיצה על הפיפטה לתחנה השנייה עלולה להכניס בועות אוויר. יש לזרוע את כל הבארות תוך 5 דקות לג'לציה עקבית בין הבארות.
      2. לאחר זריעת כל הבארות הרצויות, מכסים את הצלחת ודוגרים בחום של 37 מעלות למשך 45 דקות לפי הוראות היצרן לפילמור הג'ל. יש להוציא 200 מיקרוליטר של מדיה לכל באר זרועה ולדגור למשך שעה רצופה לפחות לפני כל הדמיה או הפרעה נדרשת.
    3. זריעה ידנית של 384 נקודות
      1. מצפים מראש קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בתערובת ג'ל התא. שואבים 2 מיקרוליטר ג'ל בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר ומוציאים לתחנה הראשונה עד שנוצרת טיפה בקצה.
        הערה: פיפטה רב-ערוצית של 10 מיקרוליטר מומלצת בחום.
      2. גע בטיפה באמצע באר. לאחר זריעת כל הבארות הרצויות, מכסים את הצלחת ודוגרים בחום של 37 מעלות למשך 45 דקות לפי הוראות היצרן לפילמור הג'ל.
      3. יש להוציא 60 מיקרוליטר של מדיה לכל באר זרעים ולדגור למשך שעה אחת לפחות ללא הפרעה לפני כל הדמיה או הפרעה נדרשת.
    4. זריעה 96/384-SPOT באמצעות מטפל בנוזלים
      1. במהלך הכנת תערובת ג'ל תאים, הפעל את המטפל בנוזלים ואת מודול מסנן ה-HEPA שלו לגבוה. רססו בזהירות 70% אתנול בתוך המטפל בנוזלים ונגבו אותו במגבות נייר ספוגות אתנול.
      2. טען פרוטוקול זריעה של 96-SPOT או 384-SPOT (משלים file 5 או משלים file 6) לפני ביצוע כיול ראש פיפטה. התקן מודולי טמפרטורה בחריצים 1 ו-4 (איור 6A).
      3. למטרות כיול, השתמש בקופסאות ייעודיות של קצות מסנן P20 ו-P200. טען אותם בחריצים 5 ו-6, בהתאמה (איור 6B). כייל את ראש הפיפטה על סמך ההנחיות המוצגות בתוכנה. לאחר הכיול, עבור לקופסת קצות המסנן הסטרילית P20 ו-P200 לזריעה על חריצים 5 ו-6. ריססו מחדש את המשטח ב-70% אתנול וסגרו את הדלת עד לזריעה.
        הערה: חיוני לכייל את הקצוות לחלק העליון של לוחית 96-/384-SPOT בצורה מדויקת. מומלץ להשתמש בסרט איטום צלחות כדי לעזור לדמיין את ציר ה-z של הקצוות ביחס לחלק העליון של הצלחת. המיקום האידיאלי הוא כאשר הקצוות על הראש הרב-ערוצי נוגעים כולם בסרט איטום הצלחת ויוצרים שקע זעיר.
    5. הפעל את שני מודולי הטמפרטורה והגדר אותם ל-4 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים נמצאים בשלב הסיבוב האחרון במהלך הכנת תערובת ג'ל תאים. לאחר השלמת שלב 5.4, טען את הכמות הרצויה של תערובת ג'ל תאים לכל צינור של צינורות PCR של 8 רצועות 0.2 מ"ל בתוך ה-BSC.
      הערה: הנפח המינימלי של תערובת ג'ל תאים שיש לטעון לכל צינור הוא: 96-SPOT: 5 מיקרוליטר כפול מספר העמודות שצריך לזרוע בתוספת הנפח המת; 384-נקודה: 2 כפול 2 מיקרוליטר כפול מספר העמודות שצריך לזרוע פעמים ואז בתוספת הנפח המת. הנפח המת מומלץ להיות בסביבות 10 - 20 מיקרוליטר לצינור כדי למנוע בועות ועמודות לא שלמות לקראת הסוף.
    6. סגור את צינורות ה-PCR של 8 הרצועות בנפח 0.2 מ"ל באמצעות המכסים השטוחים של 8 הרצועות לפני העברת תערובת התא-ג'ל מה-BSC על קרח.
    7. טען את לוחית ה-SPOT המצוננת מראש על מודול הטמפרטורה בחריץ 4 עם בלוק פורמט הצלחת התחתונה השטוחה (איור 6B).
    8. טען את צינורות ה-PCR עם 8 רצועות 0.2 מ"ל עם תערובת ג'ל תאים על מודול הטמפרטורה בחריץ 3 עם בלוק בפורמט 96 בארות.
    9. פתח את המכסים השטוחים ואת מכסה לוחית ה-SPOT ואחסן אותם בתוך המטפל בנוזלים אך הרחק מהחריצים המשומשים. פתח את המכסה של קופסת קצה המסנן P20 ו-P200.
    10. הפעל את הפרוטוקול. לאחר זריעת כל הבארות הרצויות, מכסים את הצלחת ודוגרים בחום של 37 מעלות למשך 45 דקות לפי הוראות היצרן לפילמור הג'ל.
    11. הוצא 200 מיקרוליטר או 60 מיקרוליטר (96-/384-SPOT) של מדיה לכל באר זרועה ודגר למשך שעה אחת לפחות ללא הפרעה לפני כל הדמיה או הפרעה נדרשת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דפוס PMMA של פיגום הנייר משמש כמחסום פיזי למניעת חילופי תוכן בין בארות. תכנון זה הוא קריטי להבטחת בידוד כימי וביולוגי של בארות סמוכות, ומניעת דיפוזיה לא מכוונת של מדיה, תרופות, גורמים מופרשים או אפילו תאים14. השילוב של PMMA מאפשר מידור מדויק, מה שהופך את SPOT לפלטפורמה אמינה למחקרי סינון בתפוקה גבוהה ומחקרי תרבות משותפת שבהם יש למזער זיהום צולב14,18. ניסויי אבטחת איכות ובקרת איכות מומלצים מתוארים בטבלה 3 ובטבלה 4<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, מסופק מדריך מפורט לייצור ושימוש ב-96 ו-384 בארות SPOT, המכסה הרכבה, ידנית וזריעת ג'ל תאים בסיוע מטפל בנוזלים. בניגוד למערכות פקקי הידרוג'ל מסורתיות, SPOT מבטל חפצים הקשורים למניסקוס, ומאפשר הדמיה לא הרסנית באתרה של אורגנואידים כפי שתואר קודם לכן 14,16,22. בנוסף, הפיגום מספק תמיכה מבנית, ומבטיח יציבות תרבותית לטווח ארוך. SPOT מאפשר לחוקרים לעקוב אחר דינמיקת האוכלוסייה באמצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לעזרתה של ג'ניפר לאם ברכישת תמונות. איור 1, איור 2 ואיור 7A נוצרו עם BioRender.com. עבודה זו נתמכה על ידי מענק דיסקברי של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (מענק #RGPIN-2021-03488) ל-A.P.M.; תוכנית השאלות הגדולות של קנדה למצוינות במחקר ראשון (CFREF) ל-A.P.M.; מלגות NSERC קנדה לתארים מתקדמים - תוכנית דוקטורט ל-R.C.; פרס קרן הצדקה של פיטרבורו ק.מ. האנטר ל-R.C.; מלגת CRAFT של המועצה הלאומית למחקר (NRC) שהוענקה ל-N.T.L.; ה-NSERC CREATE TOeP ל-N.T.L.; פרס המחקר לסטודנטים לתואר ראשון של NSERC לז.ק.; ופרס המצוינות של אוניברסיטת טורונטו ל-C.M.T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות PCR של 0.2 מ"ל (רצועות של 8) סרשטדט72.985.002
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לפרוגה ביוLMCT1.7B
1000-μ קצות פיפטה Lליקוי מאורות4-1019-260-000
פיפטות סרולוגיות של 10 מ"לפרוגה ביו394010
מזרק 10 מ"לBD, קנדה302995
10x בינוני חיוני מינימלי (MEM 10x)ג'יבקו11430030
צלחת 150 מ"מקורנינג430599
טיפים לחלוקה בגודל 16 עם חיבור מנעול Luerמקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב6699א2
20 ומיקרו; L מתלים לקצוות סינוןאופנטרון999-00099
200 ומיקרו; L מתלים לקצוות סינוןאופנטרון999-00081
200-μ קצות פיפטה Lליקוי מאורות4-1030-260-000
טיפים לחלוקה בגודל 20 עם חיבור מנעול Luerמקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב6699א4
צלחת באר ללא תחתית 384 בארות (שחור)גריינר82051-544
מזרק 3 מ"ל BD, קנדה309657
צינור צנטריפוגה חרוטי מפוליפרופילן 50 מ"לVWRCA21008-940
צינור צנטריפוגה חרוטי מפוליפרופילן 50 מ"לVWRCA21008-940
צלחת באר 96 באר ללא תחתית (שחור)גריינר82050-714
אצטוןפישר סיינטיפיקא18-1
איזון אנליטילא ישיםלא ישים
הרחבת AxiDraw עבור Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)לא ישיםלא ישים
AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) לא ישיםלא ישים
AxiDraw V3 מכונת כתיבה וציור אישית בעלת ביצועים גבוהיםמדענים מטורפים מרושעים, ארה"בלא ישים
קולגן בקר (PureCol 3 מ"ג/מ"ל)ביומטריקס מתקדם5005
קו תאים לבחירהלא ישיםלא ישים
כן ציור קליפ (כלול בחבילת AxiDraw V3)מדענים מטורפים מרושעים, ארה"בלא ישים
מדיה תרבותית לבחירהלא ישיםלא ישים
סרט הגנה מפני לכידת לכלוך3 דקות6851 PN36851
סרט דבק פוליאקרילי דו צדדי (800 מ"מ x 1200 מ"מ)מחקר דבק, ARcareברקוד 90106NB
סרום בקר עוברי (FBS)ג'יבקו12483-020
מסנני תה פינום XL ריינש & Held GmbH & Co. KG, המבורג, גרמניה420.69.00
מכסים שטוחים לצינורות PCR של 0.2 מ"ל (רצועות של 8)סרשטדט65.989.002
מהדקי קפיצי פלסטיק כבדיםבנצ'מרק1024-554
מודול HEPA – דגם 110-130V 60Hzאופנטרון999-00109
שקית קרח (קפואה, 1400 מ"מ x 1800 מ"מ)לא ישיםלא ישים
תוכנת Inkscapeלא ישיםלא ישים
חותך לייזרמערכת לייזר אוניברסליתVLS3.75
צינורות אתיל ויניל אצטט מיניאטוריים (EVA) בקוטר חיצוני של 0.07 אינץ'מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב1883ט3
פיפטה אלקטרונית רב ערוצית P20 (Gen2)אופנטרון999-00005
פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית P300 (Gen2)אופנטרון999-00006
לקסאלי הנסןSBS-006861אופציונלי, לפיגמנטציה של דיו PMMA
Opentrons OT-2אופנטרון999-00111
פיפטה P1000גילסוןFA10006M
P200 פיפטה 8 ערוציםגילסוןF144072
פיפטה P200גילסוןFA10005M
מגבות ניירלא ישיםלא ישים
פרפילםחברת Bemis, Inc.52859-079
נייר אפייה   לא ישיםלא ישים
פיפטות פסטרVWR14672-380
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)סיגמא-אולדריץ'עמ' 4333
פולי (מתיל מתקרילט) (PMMA)סיגמא-אולדריץ'182230
סרט פוליקרבונט (760 מ"מ x 1300 מ"מ)מקמאסטר-קארברקוד 85585K102
מונומר פולידימתילסילוקסן ומקשר צולב (PDMS, 1500 מ"מ x 2700 מ"מ)דבקים של אלסוורת'4019862
סכין דיוקלא ישיםלא ישים
תמיכה אקרילית קשיחה (גודל מותאם לתחתית צלחת הבאר)מקמאסטר-קארברקוד 8560K239
תמיכה בקרטון קשיחלא ישיםלא ישים
סרגללא ישיםלא ישים
מספריים לא ישיםלא ישים
נתרן ביקרבונט (0.8M במים מזוקקים)סיגמא-אולדריץ'S6014
סיפון טמפרטורה עם בלוקים מאלומיניום (Gen2)אופנטרון999-00097
גלגל מעקב HEEPDD (אמזון)B07YQWB284
סרט שקוף לא ישיםלא ישים
טריפן כחולג'יבקו15250-061
טריפסיןג'יבקו25200-056
פינצטהלא ישיםלא ישים
מערבל וורטקס לא ישיםלא ישים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים