הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68409

⸱

12 בדצמבר 2025

 , 
1DST/NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council (SAMRC), Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-CTAB לחילוץ DNA איכותי ממיקובקטריה, תוך התמודדות עם האתגרים שמציבים דפנות התאים הקשות והעשירות בחומצה המיקולית. התהליך כולל עיכול אנזימטי, פירוק תאים באמצעות CTAB, וטיהור DNA באמצעות הפקה אורגנית והשקעת אתנול. שיטה זו מייצרת DNA המתאים למחקרים מולקולריים ואמינה למחקר מיקובקטריאלי.

תקציר

חילוץ DNA יעיל ואמין הוא שלב יסודי בביולוגיה מולקולרית, המספק חומר גנטי איכותי ליישומים במורד הזרם כגון PCR, ריצוף וניתוחים גנומיים. עם זאת, הרכב דופן התא הייחודי של מיקובקטריה, העשיר בליפידים וחומצות מיקוליות, מציב אתגרים משמעותיים לבידוד DNA יעיל. שיטת CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) נמצאת בשימוש נרחב בשל יעילותה בהפקת DNA טהור גבוה ממינים מיקובקטריאליים, כולל זנים שגדלים במהירות ואיטית. הטכניקה כוללת שיבוש אנזימטי של תאי חיידק באמצעות ליזוזים ופרוטאינאז K, ולאחר מכן פירוק רכיבי התא באמצעות CTAB, אשר נקשר באופן סלקטיבי ויוצר קומפלקס עם פוליסכרידים וחלבונים. טיהור וריכוז ה-DNA מושגים באמצעות הפקת ממס אורגני והשקעת אתנול. לפי הנתונים שלנו, פרוטוקול CTAB מניב כמויות גבוהות של DNA (200 - 1000 ng/μL) עם איכות גבוהה וזיהום מינימלי כפי שהוכח על ידי אלקטרופורזה ג'ל וניתוח NanoDrop. ה-DNA המופק ממינים מיקובקטריים שונים הוא בעל טוהר גבוה ומתאים למחקרים מולקולריים שונים. מחקר זה מדגים את השלבים הפרוצדורליים של שיטת CTAB, ומדגיש את תועלתה בהתמודדות עם האתגרים הייחודיים הקשורים להפקת DNA מיקובקטריאלי.

מבוא

הפקת DNA איכותי היא שלב יסודי בביולוגיה מולקולרית, חיונית ליישומים בהמשך כמו PCR, ריצוף גנומי מלא ומחקרים גנומיים נוספים. עבור Mycobacterium, סוג הכולל גם מינים פתוגניים, כמו Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), וגם מינים סביבתיים לא פתוגניים כמו Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), הפקת DNA עלולה להיות מאתגרת בשל דפנות התאים העבות, העשירות בשומנים וההידרופוביות 1,2,3. דופן התא הקשה הזו מחייבת שימוש בשיטות פירוק מיוחדות כדי לשבש את התאים ולשחרר DNA גנומי ביעילות.

שיטת CTAB של צטילטרימתילמוניום ברומיד (CTAB) הוכיחה את עצמה כאמינה לבידוד DNA איכותי ממינים מיקובקטריים שונים 4,5. CTAB, חומר פעיל קטיוני, נקשר לפוליסכרידים ולרכיבים תאיים נוספים, ומקל על הסרתם במהלך תהליך החילוץ6. גם עם דגימות קשות, הפרוטוקול המבוסס על CTAB מבטיח בידוד יעיל של DNA שלם וטהור, במיוחד בשילוב עם פירוק אנזימטי, טיפול בחום וחילוץ ממס אורגני 7,8. שיטת ה-CTAB מילאה תפקיד מרכזי בהפקת DNA יעילה ממינים מיקובקטריאליים, במיוחד למחקר הכולל ריצוף גנום מלא, מטגנומיקה ואבחון מולקולרי, הדורש חומר קלט DNA טהור ואיכותי 9,10. בהשוואה לטכניקות חילוץ DNA אחרות כמו הקצאת חרוזים או ערכות מסחריות, פרוטוקול CTAB המוצג כאן מציע יתרון ברור בשמירה על שלמות ה-DNA, גורם חיוני לריצוף ארוך טווח ויישומים אפיגנטיים. בעוד שמחקרים קודמים דיווחו על תפוקות DNA נמוכות יותר ב-CTAB ביחס לשיטות שיבוש מכניות, הם גם מדגישים את יכולתו למזער את גזיזת ה-DNA ולשמור על שלמות ה-DNA11,12. כדי להתמודד עם מגבלות טוהר ותפוקה, הפרוטוקול הנוכחי אופטימלי עם זמני דגירה מופחתים ועקביות משופרת בין סוגי דגימות מגוונים. שיפור זה נתמך בממצאים של Opperman ואחרים, שהוכיחו כי DNA שהופק על ידי CTAB מתרבויות Mycobacterium avium היה בעל ריכוז ואיכות מספקים ליישומים במורד הזרם כגון ריצוף 16S rRNA ובדיקות גלאי קווים, מה שתומך עוד יותר ביישום פרוטוקול CTAB ככלי רב-שימושי וניתן להרחבה למחקר מיקובקטריאלי, במיוחד במחקרים הדורשים DNA גנומי שלם לניתוחים מולקולריים מתקדמים13. בנוסף, ריצוף מהדור הבא (NGS) דורש בדרך כלל 100-1000 ng של DNA גנומי איכותי14, ובמקרה של ריצוף קריאה ארוכה, כמו ריצוף PacBio, דורש ≥5 מיקרוגרם DNA איכותי15, ולכן כאשר נדרשות כמויות גדולות של DNA איכותי ושלם, CTAB נשאר שיטה יעילה16.

הקמת שיטות חילוץ DNA יעילות, עקביות ויעילות ממיקרואורגניזמים הקשים לניתוח היא הכרחית כדי להבטיח שחזוריות ואמינות במעבדות, במיוחד לזיהוי זנים ומחקרים אפידמיולוגיים 5,7. פרוטוקול זה מספק פרטים להפקת DNA גנום מלא ממיקובקטריה באמצעות שיטת CTAB. הפרוטוקול הנוכחי נועד לאפשר לחוקרים להשיג תוצאות עקביות ואמינות בתהליכי הביולוגיה המולקולרית שלהם על ידי התמודדות עם המכשולים והתגברות על האתגרים שמציבה דופן התא המיובקטריאלית הייחודית17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

התוצאות המייצגות התקבלו באישור ועדת האתיקה של REC: BES, אוניברסיטת סטלנבוש (BES-2024-22504). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת תליית תרבית מיקובקטריאלית

הערה: בהתאם למין הנבדק, שלב זה חייב להתבצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) או במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3). זמן הדגירה ותנאי התרבית תלויים גם בדרישות הגדילה של מיני המיקובקטריאליים בשל קצב הגדילה הייחודי שלהם ובתכונות הפיזיולוגיות שלהם.

  1. הכינו 5 מ"ל או 8 מ"ל תרבית חיידקים במדיה נוזלית Middlebrook 7H9 או MGIT, בהתאמה, בתוספת OADC ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לתקופה הנדרשת כדי לאפשר צמיחת חיידקים. מיקובקטריות שגדלות לאט דורשות 10-14 ימים, בעוד מיקובקטריות שגדלות במהירות דורשות כ-2-5 ימים.
    הערה: ניתן להכין תלייה של תאי מיקובקטריאליים על ידי גירוד לולאה מלאה של מושבות למים סטריליים עם זיקוק כפול אם התרבית ההתחלתית היא מלוחות אגר מוצקים (למשל, אגר Middlebrook 7H10).
  2. שפוך את התרבית הנוזלית לצינורות של 15 מ"ל.
  3. הרג את התרבית בחום בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה באינקובטור.
  4. במקרה של Mycobacterium tuberculosis או מינים פתוגניים אחרים שזקוקים ל-BSL-3, העבר את התרביות המתות בחום למעבדת BSL-2.

2. עיכול דופן התא וחילוץ DNA

הערה: לאחר שהתרבית מושבתת בחום, ניתן לבצע את השלבים הבאים בבטחה במעבדת בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2). אם המטרה היא חילוץ עבור ריצוף קריאה ארוכה או יישומים חלופיים הדורשים DNA במשקל מולקולרי גבוה, הקפידו להשתמש בקצות פיפטות רחבי קינה, ובשלבי מערבולת, החליפו את המערבולת בהיפוך או ערבוב פיפטות.

  1. צנטריפוגה את צינור ה-15 מ"ל ב-3220 x g למשך 15-30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט השקוף (ודאו שכל המדיה מוסרת).
  2. החזירו היטב את כדור הגידול ב-300 מיקרוליטר של בופר Tris-EDTA (TE).
  3. העבר את הכדור התלוי מחדש לצינור של 2 מ"ל.
  4. הוסיפו 100 מיקרוליטר ליזוזים (10 מ"ג/מ"ל) וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 5 פעמים, ואז טפחו בעדינות על הצינור כדי להבטיח פיזור אחיד.
  5. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על אינקובטור סיבובי במהלך הלילה (~16 שעות; זמן דגירה נמוך יותר עלול להוריד את יעילות הליזה וכך להוביל לתפוקת DNA נמוכה).
  6. ביום הבא, יש להכין תערובת של 5 מיקרוליטר של פרוטנאאז K (10 מ"ג/מ"ל) ו-70 מיקרוליטר של 10% SDS. לדוגמה, אם יש חמש דגימות, יש להכין 350 מיקרוליטר של 10% SDS ו-25 מיקרוליטר פרוטינאז K. ערבבו על ידי הפיכת הצינור כדי למנוע היווצרות קצף.
  7. הוסף 75 מיקרו-ליטר מהתערובת לכל דגימה.
  8. ערבבו על ידי נקישה ודגרו בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות בתנור או בבלוק חימום, עם ערבוב לסירוגין על ידי היפוך.
  9. הוסף 100 מיקרוליטר של 5 מטר NaCl.
  10. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת CTAB/NaCl מחוממת מראש בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
    הערה: חממו את תמיסת CTAB/NaCl ל-65 מעלות צלזיוס לפני הבטחת דיוק הפיפטרינג, תוך התחשבות בצמיגות החומר ב-RT.
  11. מערבבים על ידי טפיחה עד שהתמיסה הופכת לחלב.
  12. דגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתנור או בלוק חימום, עם ערבוב לסירוגין על ידי היפוך.
  13. הוסף נפח שווה (~ 675 מיקרוליטר) של תמיסת כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (24:1) לכל דגימה וערבב על ידי טפיחה.
    הערה: בצע את השלב הזה במכסה אדים כי כלורופורם רעיל אם נשאף ודורש טיפול זהיר.
  14. צנטריפוגה את הדגימות בעוצמה של 12000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. שאפו בזהירות 550-600 מיקרוליטר של הפאזה המימית (העליונה) לצינורות סטריליים בנפח 1.5 מ"ל ותייגו אותם כראוי.
    הערה: היזהרו לא להפריע לשכבות האחרות. אם שכבות כלשהן מופרעות בטעות, יש לצנטריפוגה את הצינור שוב.

3. משקעים והסרת DNA

  1. הוסיפו נפח שווה (550-600 מיקרוליטר) של איזופרופנול קר ומערבבים על ידי הפיכת הצינורות.
    הערה: אם ריכוז ה-DNA גבוה, עלולות להיווצר משקעים לבנים במהלך הערבוב.
  2. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך 30 דקות עד שעה.
    הערה: זמני דגירה ארוכים יותר יכולים לשפר את משקעי ה-DNA18 אך גם להוביל לשילוב מלחים. לכן, ניתן לבצע דגירה במהלך הלילה אם צפוי ריכוז DNA נמוך.
  3. צנטריפוגה במהירות הגבוהה ביותר (~21130 x g) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחרר את ה-DNA הבלתי מסיס.
    הערה: ודא שהצד הקדמי של צינורות ה-1.5 פונה פנימה בתוך רוטור הצנטריפוגה. בשלב זה, ה-DNA משקע בתחתית ולאורך גב הצינורות. זה חשוב כדי למנוע הפרעה לכדור הבלתי נראה בשלב הבא. משקע לבן או כדור עשוי להיות נראה אם ריכוז ה-DNA גבוה. היעדר כדור לא מעיד על כישלון בהוצאה; המשך עם השלבים הנותרים.
  4. שאפו את הסופרנטנט מהצד הקדמי של הצינור מבלי להפריע לכדור ה-DNA או להוציא אותו במהירות, תוך שמירה על שהכדור נשאר ללא הפרעה.
    הערה: עדיף לשאוף את הסופרנטנט אם התרבית ההתחלתית קטנה וצפוי ריכוז DNA נמוך.
  5. הוסיפו 1000 מיקרוליטר של אתנול קר ו-75%.
  6. ערבב על ידי הפיכת הצינורות כמה פעמים.
  7. צנטריפוגה ב-12000 × גרם למשך 30 דקות (באותו כיוון כמו בשלב 3).
  8. שואף או דקט את כל האתנול מבלי להפריע לכדור.
    הערה: ניתן לחזור על שלבים 5-8 אם צפויים קופרסיפיטציה גבוהה במלח.
  9. תן לצינורות להתייבש באוויר ב-RT בלילה או לפחות 30 דקות.
  10. הוסף 25-50 מיקרוליטר של בופר TE (pH 8) לכל צינור כדי להחזיר את ה-DNA.
    הערה: ה-DNA יכול להיות מושהה מחדש במים של טריס (10 מ"מ, pH 8) או במים ללא נוקלאז אם יישומים במורד הזרם רגישים ל-EDTA.
  11. אפשר לכדור ה-DNA להיתלות מחדש במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  12. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך 2-3 ימים לפני ביצוע הערכת בקרת איכות.
  13. אחסן בטמפרטורה של -80°C לטווח ארוך.

4. כימות DNA ובקרת איכות

הערה: בקרת איכות DNA מתבצעת בדרך כלל באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרוווליום ואלקטרופורזה ג'לית. מערכת כימות מבוססת פלואורסצנציה יכולה לשמש גם לכימות DNA שנחצא.

  1. שיטת ספקטרופוטומטר
    1. מדדו את ריכוז ה-DNA וקבעו את האיכות בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: לדגימת DNA יש יחס אידיאלי של 260/280 בין 1.7 ל-2.0. ערך של 1.8 נחשב בדרך כלל טהור ל-DNA. ערכים מתחת לטווח זה מצביעים על זיהום מחלבון שאריתי, גואנידין או מגיבים אחרים שסופגים בעוצמה ב-280 ננומטר או סמוך. יחס של 260/230 בין 2.0 ל-2.2 הוא אידיאלי. אם היחס נמוך מהצפוי, הדבר עשוי להעיד על נוכחות מזהמים שסופגים ב-230 ננומטר, כגון EDTA, פנול ופחמימות. בדוק גם את גרפים הספיגה שהתקבלו עבור הדגימה.
  2. אלקטרופורזה בג'ל
    1. לבצע אלקטרופורזה בג'ל אגרוז19 להערכת שלמות ה-DNA ולקבוע האם התרחש פיצול או התדרדרות.
    2. כדי להמחיש DNA תחת מערכת תיעוד ג'ל UV, השתמש בג'ל אגרוז 1.0% המכיל צבע SYBR Safe. הרץ את הג'ל ב-80 וולט במשך 45 דקות.
      הערה: המטרה היא שיהיו רצועות ברורות, מובחנות ובעלות משקל מולקולרי גבוה מעל הרצועה הגבוהה ביותר בסולם ה-DNA. השתמש בבופר TAE חדש של 1× בכל פעם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול חילוץ ה-DNA הזה באמצעות שיטת CTAB (איור 1) הוערך על פני מינים שונים של מיקובקטריאליים כגון M. tuberculosis, M. abscessus ו-M. chelonea. ה-DNA הופק והושווה מבחינת תפוקה, טוהר ושלמות ה-DNA המופק בין הדגימות.

ריכוז ה-DNA השתנה בין מיני המיקובקטריאליים ונע בין 190-600 ng/μL ו->1000 ng/μL במקרים מסוימים, מה שמעיד ש-CTAB מפיקה DNA בעל תפוקה גבוהה. היחסים של 260/280 ו-260/230 נעו בין 1.9-2.0 ו-1.8-2.2,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תוצאות מייצגות מדגימות את השימושיות של שיטת CTAB בהפקת DNA ממינים מיקובקטריאליים ובהתמודדות עם האתגרים הכרוכים בהפקת DNA מאורגניזמים אלו. מיקובקטריות ידועות בדפנות התאים המורכבות והעשירות בשומניםשלהן. התוצאות הנוכחיות מדגישות מספר היבטים קריטיים התורמים להצלחת הטכניקה הזו, שכן היא מספקת DNA שלם בריכוז גבוה ואיכותי, שצריך להתאים ליישומים בהמשך כמו PCR, ריצוף ומחקרים גנומיים נוספים.

פרוטוקול חילוץ ה-CTAB-DNA הוכח כשיטה יעילה ואמינה להשגת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים מביעים את תודתם הכנה לצוות הגנומיקה של שחפת: נבילה איסמעיל, מלני גרובלאר, אמילין קוסטה ורוב מ. וורן, על תרומתם לפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול זה, וכן על תמיכתם היקרה לאורך כל המחקר. עבודה זו והאנשים המעורבים נתמכו במענקים ומימון מהמועצה למחקר רפואי של דרום אפריקה (SAMRC), הקרן הלאומית למחקר (NRF) ואוניברסיטת סטלנבוש (SU). למממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים, הניתוח או הכנת המאמרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קצות פיפטה של 1 מ"לכל ספק
10 ומיקרו; קצות פיפטה Lכל ספק
10% נתרן דודציל סולפט (SDS)מרק (סיגמא-אלדריץ')71736-100 ML
צינורות פוליפרופילן בנפח 15 מ"לכל ספק
צינורות של 2 מ"ל וצינורות של 1.5 מ"לכל ספק
200 ומיקרו; קצות פיפטה Lכל ספק
2-פרופנול, ביוריאגנט, עבור מולקולרי B &מרק (סיגמא-אלדריץ')I9516-1L חנות ב-20-20 ומדרגות; C
37&g; חממת Cכל ספק
5 מיליון NaClמרק (סיגמא-אלדריץ')S6546 - 100 ML
65&00; חממת Cכל ספק
ג'ל אגרוזמרק (סיגמא-אלדריץ')
מערכת תיעוד ג'ל UV של Bio-Rad,BioRad
צנטריפוגה (לצינורות 15 מ"ל של 50 מ"ל) ומיקרופוגה (לצינורות של 2 מ"ל)כל ספק
כלורופורם לניתוח EMPARTA® ACSמרק (סיגמא-אלדריץ')1070242500
כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (24:1)במכסה אדים, ערבב 384 מ"ל כלורופורם ו-16 מ"ל אלכוהול איזואמיל
פתרון CTAB/NaClמרק (סיגמא-אלדריץ')52370-100 Gהמיס 4.1 גרם NaCl ב-80 מ"ל מים מזוקקים. בזמן הערבוב, הוסף 10 גרם CTAB. תמיסת חום ב-65 מעלות; אינקובטור C. כוון את הנפח ל-100 מ"ל עם מים מזוקקים. אחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
סולם DNA 1 קילובייטתרמו פישר סיינטיפיק
אלכוהול אתילי, טהור, 200 proof, עבור MOL &מרק (סיגמא-אלדריץ')E7023-500MLמערבבים 75 מ"ל אתנול מוחלט ו-25 מ"ל מים מזוקקים
ליזוזים (10 מ"ג/מ"ל)מרק (סיגמא-אלדריץ')10837059001לשחזר ליזוזים ליופילי (מובא לטמפרטורת החדר) עם מים מזוקקים ל-10 מ"ג/מ"ל
מדיית מידלברוק 7H9מרק (סיגמא-אלדריץ')M0178פעלו לפי הנחיות היצרן להכנת המדיה הנוזלית
MIDDLEBROOK OADC ENRICHMENT 6 x 100 מ"ל F BD212240
מדיום צינור מד גדילה של מיקובקטריה (MGIT)BD245122
מערכת NanoDropתרמו פישר סיינטיפיק
פיפטת P10כל ספק
פיפטת P1000כל ספק
פיפטת P200כל ספק
פרוטאינאז K, רקומב, PCR grd 2x250mg מרק (סיגמא-אלדריץ')3115801001שחזור בקבוקון של פרוטינאז K ליופיליז עם מים מזוקקים ל-10 מ"ג/מ"ל. הקפיא אליקווטים בצינורות של 2 מ"ל בטמפרטורה של -20 ° C
SYBR-safeתרמו פישר סיינטיפיק
בופר Tris/EDTA (TE) pH 8.0מרק (סיגמא-אלדריץ')8890-OP או 382499997
מערבולתכל ספק

מקורות

  1. FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
  2. Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
  3. Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
  4. Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
  5. Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
  6. Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
  7. Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
  8. Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
  9. Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
  10. Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
  11. Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
  12. Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
  13. Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
  14. Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
  15. Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
  16. Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
  17. Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  18. Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
  20. Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
  21. Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  22. Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
  23. Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
  24. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
  25. Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNACTABDNAProteinase KTris EDTA
הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.