מאמר שיטה

מדידת גואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP) ברקמות מוצקות באמצעות בדיקת אימונוסורבנט תחרותית מקושרת לאנזים (ELISA)

DOI:

10.3791/68432

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Molecular Biology and Genetics Section, Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מודד ריכוזי גואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP) ברקמות מוצקות באמצעות בדיקת אימונוסורבנט תחרותית מקושרת לאנזים (ELISA). הפרוטוקול מתאר כיצד לעבד רקמה מוצקה, לבצע ELISA תחרותי, להמיר ספיגה לריכוזי cGMP בפיקומולים למיליליטר, ולחשב את הריכוזים הסופיים כננומול של cGMP לגרם רקמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסלול עיקרי המייצר גואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP) הוא מסלול תחמוצת החנקן (NO)-cGMP. במסלול זה, NO ממריץ את הפעילות הקטליטית של גואניליל ציקלאז מסיס (sGC), הממיר גואנוזין טריפוספט ל-cGMP. NO מעניין מכיוון שאצל יונקים הוא פועל כמרחיב כלי הדם העיקרי, מעכב צבירת טסיות דם, מתווך של תפקוד מערכת החיסון, נוירוטרנסמיטר ושיפור הסיבולת במהלך פעילות גופנית, בין תפקידים פיזיולוגיים אחרים. מדידת השפע של NO ברקמות שונות יכולה לעזור להבהיר את תפקידיו. עם זאת, לא ניתן למדוד NO ישירות בשל זמן מחצית החיים שלו שאורכו פחות משניות. בדרך כלל, המטבוליטים של NO, חנקות וניטריט, נמדדים כדי להעריך את השפע של NO. הסיבה לכך היא שניתן להמיר את המולקולות הללו in vivo באמצעות תגובות חמצון חיזור. שיטה פחות נפוצה להערכת שכיחות ה-NO דורשת מדידת ריכוז cGMP, מולקולת איתות במורד הזרם של NO. עם זאת, מדידת cGMP ברקמות נעשית לעתים רחוקות, למרות יצירת האפשרות להבין טוב יותר את תפקודי ה-NO באיברים. לכן, קיים צורך בפרוטוקול למדידת ריכוזי cGMP באיברים ורקמות מוצקים. בפרוטוקול זה, רקמות חזיר שנאספו הומוגניות, ELISA תחרותי בוצע על דגימות מעובדות, והספיגה הומרו לננומול של cGMP לגרם של רקמה מקורית. בקצרה, פרוטוקול זה מתאר שיטה פשטנית למדידת ריכוזי cGMP ברקמות מוצקות באמצעות ערכת GMP ELISA מחזורית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP) היא מולקולת איתות המסוגלת לגרום לשינויים פיזיולוגיים דרך מסלול תחמוצת החנקן (NO)-cGMP. במסלול NO-cGMP, NO נקשר לגואניליל ציקלאז מסיס, אנזים ציטוזולי הממיר גואנוזין טריפוספט ל-cGMP, ומגביר את פעילותו הקטליטית 1,2. העלייה שלאחר מכן בריכוזי cGMP מפעילה מסלולי איתות המקדמים הרחבת כלי דם3, מה שמוביל לירידה בלחץ הדם 4,5, התגובה הפיזיולוגית העיקרית האופיינית לנוכחות NO in vivo. בנוסף, NO ידוע כמשפיע על תפקוד מערכת החיסון6, משפר את הסיבולת במהלך פעילות גופנית4 ומונע קרישת דם על ידי עיכוב הצטברות טסיות דם7.

מדידה ישירה של NO נעשית קשה בגלל זמן מחצית החיים שלו in vivo8 ברוב הרקמות הביולוגיות. כתוצאה מכך, הבהרת ההשפעות הפיזיולוגיות של NO דורשת שיטה למדידת השפע שלו ex vivo. לכן, שיטות כמותיות שימושיות נמנעות ממדידה ישירה של NO. שיטה נפוצה להערכת ריכוזי NO ברקמות היא למדוד את המטבוליטים היציבים יותר של NO: ניטריט וניטראט 4,5,9,10,11. הסיבוך העיקרי של שימוש בריכוזי ניטריט וחנקות כמדדים לשפע של NO הוא ששני המטבוליטים משמשים גם כמבשר NO ומולקולת אחסון, בהתאמה. מטבוליטים של NO, במיוחד ניטראט, נמצאים בשפע במזונות מסוימים. לכן, שינויים בריכוזי cGMP, cGMP במורד הזרם של NO, שימושיים להערכת כמויות ה-NO הפעיל, וניתן לקבוע את השפע של NO ללא הפרעה של ניטריט וחנקות שהיו בעבר.

מחקרים קודמים הסתמכו על מדידת ריכוזי cGMP בפלזמה12 ובטסיות13, אך פחות נפוץ הוא מדידת ריכוזי cGMP ברקמות מוצקות. היכולת למדוד ריכוזי cGMP ברקמות מוצקות תאפשר לאפיין את פעילות ה-NO באיברים ספציפיים. המטרה הייתה לזהות שיטה פשטנית למדידת cGMP ברקמות מוצקות באמצעות ELISA תחרותית. יתרון אחד בשימוש ב-ELISA תחרותי הוא שהוא דורש ציוד שנמצא בדרך כלל ברוב המעבדות המעוניינות ב-NO, כגון קורא מיקרו-פלטות המשמש לעתים קרובות למטרות אחרות. לשם השוואה, כמה שיטות מדידה אחרות דורשות ציוד המשמש לעתים רחוקות במהלך ניסויים המתמקדים ב-NO, כגון מיקרוסקופים14,15, מונה נצנוץ16 או לייזר17. בנוסף לנגישות שלו, מדידת cGMP עם ELISA תחרותית היא רגישה; ניתן לזהות ריכוזי cGMP עד 0.1 פיקומול (PMOL) של cGMP/mL18. עם שינויים קלים בפרוטוקול18 של ערכת cGMP ELISA (טבלת חומרים), נקבעה שיטה למדידת cGMP ברקמות מוצקות באמצעות ELISA תחרותי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול המחקר בבעלי חיים של ענף הרפואה המולקולרית שאושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIDDK (ASP K049-MMB-23). איסוף הרקמות פעל בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון המחקר לבריאות MedStar (מספר פרוטוקול: 2006001373 2020-017). במחקר נעשה שימוש בחזירי יורקשייר צעירים (שני זכרים ושתי נקבות), בני 3 חודשים ובמשקל של בין 30-35 ק"ג. איור 1 מדגים סכימה המציגה את השלבים של פרוטוקול ערכת ELISA cGMP. הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

figure-protocol-1
איור 1: סכמת פרוטוקול. סכמטית הממחישה את השלבים של פרוטוקול ערכת ELISA cGMP. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת דגימת רקמות

הערה: רקמות הוחדרו בתמיסת נתרן הפרין לפני האיסוף ולאחר מכן אוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש. עיין ב-Park et al.19 לפרטים על איסוף דגימות הרקמה.

  1. עיבוד דגימות רקמות
    1. יש לצנן מרסק רקמות, פינצטה וכף על קרח יבש למשך 10 דקות לפני תחילת ההליך.
    2. שקלו עודף של רקמות, מכיוון שחלקן עלולות ללכת לאיבוד במהלך הריסוק (תשואה בסביבות 90%).
      הערה: בעבר, עודף של 170 מ"ג הניב תוצאות מוצלחות. ניתן להגדיל או להקטין את המסה, אם תרצה. ודא שמסת הרקמה מביאה לנפח דגימה מספיק לשלבי אצטילציה של דגימת הרקמה ודילול דגימת הרקמה.
    3. הוסף את הטישו למרסק על קרח יבש.
    4. הקפיאו את הרקמה בחנקן נוזלי ואפשרו לחנקן הנוזלי להתאדות לחלוטין.
    5. החזר את מכסה המרסס והיכה בו עם פטיש 15 פעמים.
      הערה: אם הגדרת המרסק אינה זמינה או שלא ניתן להשתמש בה, יש לחתוך את הדגימה לחתיכות קטנות ככל האפשר באמצעות מספריים או אזמל כשהיא נשמרת קפואה או לפחות בקירור על קרח. שלב זה מבטיח הומוגניזציה טובה והוא חיוני, במיוחד עבור רקמות קשות יותר.
    6. טרפו צינור הומוגנייזר חרוזים והעבירו את הרקמה המרוסקת לצינור באמצעות הכף המצוננת והפינצטה.
    7. רשום את מסת הרקמה שנוספה לצינור ההומוגנייזר של החרוזים כדי להמיר ריכוזים ממולריות לשומות למסה מאוחר יותר. שמור את הדגימה על קרח.
    8. לצינור ההומוגניזציה, הוסף נפח במיקרוליטר של 0.1 N חומצה הידרוכלורית השווה למכפלה של מסת הרקמה במיליגרם.
      הערה: דילולים מתאימים גורמים לדגימות שנמדדו ליפול על העקומה הסטנדרטית. דילולים אלה נמצאים עבור סוגי רקמות שונים באמצעות ניסוי וטעייה. בניסויים קודמים, יחס דילול של 1:10 לרקמת שריר השלד ויחס דילול של 1:5 לרקמת הכבד הניב תוצאות מוצלחות. לשם השוואה, אם מדללים 100 מ"ג רקמה, יחס דילול של 1:10 ידרוש 1,000 מיקרוליטר של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, ויחס דילול של 1:5 ידרוש 500 מיקרוליטר.
    9. הומוגניזציה של דגימות הרקמה באמצעות הומוגנייזר של טחנת חרוזים או טכניקה דומה.
      הערה: מדי פעם מצננים את הדגימה במהלך הומוגניזציה באמצעות קרח. אם הומוגנייזר טחנת חרוזים אינו זמין, ניתן להחליף שיטות אחרות של הומוגניזציה המשבשות ביעילות תאים ויוצרות הומוגנייזר רקמות, כולל שימוש בהומוגנייזר סיבובי או הומוגנייזר קולי.
    10. צנטריפוגה הומוגנית למשך 30 דקות במהירות של 17,000 x g תוך שמירה על טמפרטורת דגימה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הומוגנטים של רקמת שריר השלד שאינם מדוללים מספיק הופכים לצמיגיים מדי ודמויי ג'ל. ניתן לראות זאת בצורה הטובה ביותר לאחר צנטריפוגה.
    11. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה את הסופרנטנט למשך 10 דקות ב-17,000 x גרם תוך שמירה על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    12. העבירו כמות גדולה של סופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה ושמרו את הדגימה על קרח.
      הערה: אצטילציה של 250 מיקרוליטר של סופרנטנט הניבה תוצאות מוצלחות. כדי להשהות את הפרוטוקול, הקפיאו דגימות אלה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ואחסנו עד 48 שעות. מומלץ למדוד את נפח הסופרנטנט לתהליך האצטילציה ביום האצטילציה.

2. הכנה סטנדרטית

הערה: הכן תקנים ביום הכנת המיקרופלייט של ELISA.

  1. הכנת חיץ ELISA
    1. הוסיפו תרכיז בופר 10x ELISA מופשר לבקבוק זכוכית המכיל 90 מ"ל מים טהורים במיוחד.
      הערה: הקפד לשטוף שאריות תרכיז חיץ ELISA 10x עם מאגר ELISA המוכן ולהחזיר את המאגר לבקבוק הזכוכית. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים.
  2. הכנת מלאי סטנדרטית
    1. יש להוסיף 1 מ"ל של מאגר ELISA לבקבוקון הסטנדרטי ולנער עד להתמוססות.
      הערה: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שבועות.
  3. דילול טורי סטנדרטי
    1. סמן צינור תקן B ותשעה צינורות סטנדרטיים 0 עד תקן 8.
    2. הוסף 9.9 מ"ל של מאגר ELISA לצינור המסומן בתקן B.
    3. העבירו 100 מיקרוליטר מהמלאי הסטנדרטי (300 pmol/mL של cGMP) לתוך צינור B הסטנדרטי ומערבולת היטב.
    4. העבר 1,000 מיקרוליטר מהתמיסה בצינור B הסטנדרטי לצינור 1 הסטנדרטי.
    5. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ELISA לצינור המסומן בתקן 0 ואת הצינורות המסומנים בתקן 2 לתקן 8.
    6. מערבולת תקן 1 ולאחר מכן להעביר 500 מיקרוליטר של תמיסה מתקן 1 לתקן 2.
    7. מערבולת תקן 2 ולאחר מכן להעביר 500 מיקרוליטר של תמיסה מתקן 2 לתקן 3.
    8. המשיכו להעביר 500 מיקרוליטר מ-n-1 סטנדרטי ל-n סטנדרטי, והקפידו לערבב את התקנים ביסודיות לאחר כל הוספה.
    9. השלך 500 מיקרוליטר של תמיסה מתקן 8.
      הערה: הקפד על תקני מערבולת היכן שצוין עבור עקומה סטנדרטית אופטימלית. תקנים 0 עד 8 הם בנפח של 500 מיקרוליטר. יש לאחסן את התקנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. השתמש בתקנים ביום הדילול שלהם.

3. אצטילציה

הערה: במהלך תגובת האצטילציה, מתווספת קבוצת אצטיל לקבוצת ההידרוקסיל 2' של מולקולת cGMP, המשנה את מבנה ה-cGMP ומובילה לעלייה בזיקת הקישור של הנוגדנים, מה שמשפר את רגישות הבדיקה פי 10~. בדגימות המכילות מעל 1.0 pmol/mL של cGMP, ניתן לבצע מדידות ללא אצטילציה, וניתן להשמיט שלב זה. יש לקבוע את הצורך באצטילציה באופן ניסיוני, על בסיס כל מקרה לגופו.

  1. הכנת אשלגן הידרוקסיד
    1. הוסף 10 מ"ל מים טהורים במיוחד לבקבוק האשלגן הידרוקסיד ליצירת תמיסה של 4 M.
      הערה: אין לסגור את הבקבוק מכיוון שהאשלגן הידרוקסיד מתמוסס. יש לאחסן במשך חודשים בטמפרטורת החדר.
  2. אצטילציה של דגימת רקמות
    1. למנה של 250 מיקרוליטר של הדגימה, הוסף 50 מיקרוליטר (5:1) של 4 M אשלגן הידרוקסיד ועקוב במהירות אחר התוספת עם 12.5 מיקרוליטר (20:1) של אנהידריד אצטי.
    2. מערבולת למשך 15 שניות.
    3. הוסף 12.5 מיקרוליטר של 4 M אשלגן הידרוקסיד לדגימה ומערבולת קצרה.
    4. אופציונלי: אם דגימות שרירי השלד מתמצקות בעקבות שלבי האצטילציה, צנטריפוגה את הדגימות ב-17,000 x גרם למשך 10 דקות.
  3. אצטילציה של תקנים
    1. לצינור המסומן בתקן 0, הוסף 100 מיקרוליטר של 4 M אשלגן הידרוקסיד, ומיד אחריו 25 מיקרוליטר של אנהידריד אצטי.
    2. מערבולת הסטנדרט למשך 15 שניות.
    3. הוסף 25 מיקרוליטר של 4 M אשלגן הידרוקסיד לתקן ומערבולת קצרה.
    4. חזור על שלבים אלה עבור התקנים הממוספרים הנותרים.
      הערה: מערבולת את כל הדגימות והתקנים לאותו משך זמן כדי להבטיח תוצאות עקביות.

4. דילול דגימת רקמות

  1. הוסף יחסים שנקבעו מראש של מאגר ELISA וכמות של דגימה אצטילית לצינור מיקרו-צנטריפוגה.
    הערה: נדרשים שני דילולים שונים עבור כל דגימה. יחסי דילול הגורמים לריכוזי ה-cGMP הנמדדים ליפול על העקומה הסטנדרטית נמצאים באמצעות ניסוי וטעייה. יש לקבוע דילולים באופן ניסיוני עבור כל סוג רקמה על מנת שהאחוז figure-protocol-2 ייפול בין 20% ל-80%. בניסויים קודמים שמדדו רקמות כבד, יחסי דילול של 1:2 ו-1:3 הניבו תוצאות מוצלחות עם ערכי האחוזים figure-protocol-3 המתאימים. יחסים אלה הניבו תוצאות מוצלחות גם עבור שרירי השלד. עם זאת, וריאציות ברקמת שריר השלד עשויות לדרוש דגימות מדוללות יותר.
  2. אופציונלי: אם נוצר משקע כאשר דגימת הרקמה מתווספת למאגר ELISA, צנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות ב-17,000 x גרם.

5. הכנת מיקרופלייט ELISA

  1. הכנת עוקב אצטילכולין אסטראז (AChE)
    1. יש להוסיף 6 מ"ל של מאגר ELISA לבקבוקון המעקב AChE ולנער בעדינות עד להתמוססות.
      הערה: אחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים. אין מערבולת.
  2. הכנת אנטי-סרום
    1. יש להוסיף 6 מ"ל של חוצץ ELISA לבקבוקון האנטי-סרום ולנער בעדינות עד להתמוססות.
      הערה: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות לפחות. אין מערבולת.
  3. דגירה לדוגמא וסטנדרטית
    1. תקן מערבולת 0.
    2. למיקרו-פלטת ELISA, הוסף 50 מיקרוליטר של 0 עד 5 בארות סטנדרטיות (NSB ו-B0; איור 2).
    3. לשתיים מהבארות (NSB; איור 2) המכיל 0 סטנדרטי, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ELISA.
    4. השתמש בקצה פיפטה אחד כדי להוסיף 50 מיקרוליטר של תקנים 1 עד 8 למיקרו-פלטת ELISA בשכפול. התחל עם התקן המדולל ביותר (תקן 8) ולאחר מכן המשך לתקן המדולל הבא עד שכל התקנים מתווספים.
      הערה: שאפו והוציאו כל תקן מספר פעמים לפני הוספתו לבאר. תקני מערבולת לפני הוספתם לבארות.
    5. מערבולת כל דגימה לפני הוספת 50 מיקרוליטר אליקוטים לבארות בשכפול או משולש.
    6. הוסף 50 μL של עוקב AChE לכל NSB , B0 סטנדרטי ובאר דגימה (איור 2).
    7. הוסף 50 μL של אנטי-סרום לכל B0, סטנדרטי ובאר דגימה (איור 2).
    8. מכסים את המיקרו-פלטה של ELISA ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
      הערה: הקפד למערבולת בכל פעם שאתה מקבל הוראה להפיק תוצאות עקביות.
  4. הכנת מאגר כביסה
    1. לבקבוק זכוכית מוסיפים 200 מ"ל מים טהורים במיוחד ו-500 מיקרוליטר תרכיז חיץ כביסה פי 400.
    2. בעזרת מזרק מוסיפים לבקבוק הזכוכית 100 מיקרוליטר פוליסורבט 20.
    3. יש לנער בעדינות את הבקבוק כדי לערבב.
      הערה: אחסן את מאגר הכביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודשיים. הכפילו את נפחי המים האולטרה-טהורים, תרכיז חיץ כביסה פי 400 ופוליסורבט 20 למיקרו-פלטה מלאה של 96 בארות של דגימות.
    4. העבירו את מאגר הכביסה לבקבוק כביסה לפני השימוש.
  5. הכנת ריאגנטים של אלמן
    הערה: הכן את יום פיתוח המיקרו-צלחת של ELISA.
    1. למיכל מוגן אור, הוסף 20 מ"ל מים טהורים במיוחד.
    2. השתמש בכמות גדולה של המים האולטרה-טהורים כדי להמיס את המגיב של אלמן.
    3. העבר את המגיב של אלמן למיכל המוגן באור.
    4. השתמש במגיב של אלמן כדי לשטוף את הבקבוק שבו הוא הגיע.
    5. העבירו את כל התמיסה בחזרה למיכל המוגן באור באמצעות פיפטה.
  6. שטיפת מיקרופלייט ELISA
    1. השלך את תכולת המיקרו-לוחית ELISA על ידי היפוכה. ודא שהבארות מתרוקנות על ידי הקשה על המיקרופלייט ההפוך של ELISA על מגבת נייר.
    2. מלאו את הבארות במאגר כביסה באמצעות בקבוק הכביסה.
    3. ערבבו בעדינות את המיקרופלייט של ELISA למשך 5 שניות ולאחר מכן זרקו את מאגר הכביסה והקישו את הנוזל הנותר על מגבת נייר.
    4. מלאו את המיקרופלייט של ELISA במאגר כביסה, ערבבו בעדינות את המיקרופלייט של ELISA למשך 30 שניות והשליכו את תכולתו. חזור על פעולה זו ארבע פעמים, הקש על המיקרופלייט של ELISA על מגבת נייר לאחר כל השלכה כדי להסיר את הנוזל שנותר.
      הערה: מנע קריאות ספיגה לא מדויקות על ידי שטיפה יסודית של המיקרופלייט של ELISA.
  7. פיתוח וקריאה של מיקרו-פלטות ELISA
    1. העבר את המגיב של אלמן למאגר.
    2. בעבודה מהירה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 200 מיקרוליטר מהמגיב של אלמן לבארות הריקות, NSB, B0, TA, סטנדרטיות ובארות דגימה.
    3. הוסף 5 μL של עוקב AChE לבאר TA.
    4. מכסים את המיקרופלייט של ELISA בפרפילם, מניחים אותו בכלי מוגן אור ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 60-90 דקות עם תסיסה.
      הערה: השתמש בבארות B0 כאינדיקטורים לזמן הדגירה המתאים. בארות B0 אידיאליות נראות צהובות בעליל אך לא כהות.
    5. הסר את סרט הפרפין וקרא את המיקרו-פלטת ELISA בצפיפות אופטית של 412 ננומטר.
      הערה: בארות B0 עם ספיגה בין 0.3 AU ל-1.0 AU, עם הפחתת החסר, מצביעות על כך שהמיקרו-פלטת ELISA מפותחת כראוי.
    6. אופציונלי: אם המיקרו-פלטת ELISA אינה מפותחת, החלף את סרט הפרפין ואפשר לו לדגור במיכל מוגן אור לתקופה נוספת. אם המיקרו-צלחת ELISA מפותחת יתר על המידה, זרוק את המגיב של אלמן, שטוף פעם אחת עם מאגר כביסה ופתח מחדש את המיקרו-צלחת ELISA עם המגיב של אלמן.

figure-protocol-4
איור 2: פריסת Microplate. דוגמה לפריסת מיקרו-פלטות עבור ELISA התחרותית. NSB מציין באר קשירה לא ספציפית. B0 מציין באר כריכה מקסימלית. TA מציין פעילות כוללת היטב. Std. מציין באר סטנדרטית עם המספר המתאים לה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. המרה לריכוז

  1. חישובי מעקב AChE מאוגדים
    1. ממוצע את הספיגה של שני החסר והחסר את הממוצע מהספיגה של כל באר.
      הערה: השתמש בספיגות החסרות הריקות למשך שארית החישובים.
    2. חשב את הספיגה הממוצעת של ה-NSB, B0 ובארות ריקות.
    3. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הספיגה המתוקנת B0 :
      figure-protocol-5
      הערה: Corr. מייצג מתוקן, Abs. מייצג ספיגה, ו-Avg. מייצג ממוצע. אם הספיגה הממוצעת של הבארות הריקות (עם הפחתת הממוצע הריק) היא מספר שלילי, השתמש באפס לחישוב.
    4. חשב את היחס figure-protocol-6 עבור כל תקן ומדגם באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-7
    5. הכפל את היחס figure-protocol-8 של כל דגימה ב-100 כדי לחשב את האחוז.figure-protocol-9
      הערה: דגימות בין 20% ל-80% נופלות על העקומה הסטנדרטית.
  2. חישובי עקומה סטנדרטיים
    1. ממוצע היחס figure-protocol-10 בין הבארות הכפולות של כל תקן (1 עד 8).
    2. חשב את הלוגיט של היחס הממוצע figure-protocol-11 של כל תקן באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-12
    3. באמצעות הריכוזים הידועים של כל תקן (טבלה 1) כערכי X והלוגיט figure-protocol-13 של כל תקן כערכי Y, חשב את השיפוע ואת יירוט ה-Y.
    4. חשב את מקדם הקביעה על ידי שימושב-log 10 של ריכוזי תקן cGMP הידועים כערכי X והלוגיטfigure-protocol-14 של כל תקן כערכי Y.
      הערה: ודא שמקדם הקביעה קרוב ל-1.
  3. חישובי ריכוז cGMP ב-pmol/mL
    1. חשב את הלוגיט figure-protocol-15 של כל דגימה באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-16
    2. כדי לחשב את ריכוז ה-cGMP בכל דגימה (בפיקומולים של cGMP למיליליטר דגימה), השתמש במשוואה הבאה:
      figure-protocol-17
      הערה: DR מייצג יחס דילול. סכום ה-D.R. ההומוגני עבור דגימות כבד מדוללות ביחס דילול של 1:5 של חומצה הידרוכלורית שווה ל-6. סכום ה-D.R. עבור דגימות כבד מדוללות ביחס דילול של 1:2 של בופר ELISA שווה ל-3. לכן, המונחים המקובצים לפי סוגריים מוכפלים ב- 18.
  4. חישובי ריכוז cGMP ב-nmol/g
    1. חשב את הננומול של cGMP לבאר עם המשוואה הבאה:
      figure-protocol-18
    2. חשב את גרמי הרקמה בכל דגימה אצטילית באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-19
      הערה: "מ"ג רקמה" היא מסת הרקמה המתווספת לצינור ההומוגניזציה במיליגרם. "נפח HCl בשימוש" הוא נפח של 0.1 N חומצה הידרוכלורית המשמשת לדילול הדגימות להומוגניזציה.
    3. חשב את גרמי הרקמה בכל דגימה מדוללת עם מאגר ELISA באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-20
      הערה: "נפח הדגימה המדולל" הוא נפח הדגימה המדולל על ידי מאגר ELISA. "250 מיקרוליטר" הוא נפח הדגימה האצילית. ה"ריאגנטים" שהוזכרו הם ריאגנטים לאצטילציה 4 M KOH ואנהידריד אצטי.
    4. חשב את גרם הרקמה לבאר בעזרת המשוואה הבאה:
      figure-protocol-21
      הערה: "נפח חיץ" הוא נפח מאגר ELISA המשמש לדילול דגימות הרקמה לפני הוספת הדגימות לבארות.
    5. חלקו את הננומול של cGMP לבאר בגרמים של רקמה לבאר כדי לחשב את ריכוז ה-cGMP ב-nmol/g.
מספר סטנדרטיריכוזי cGMP (תנאי ייצור נאותים) (pmol/mL)
חדר סטנדרט 1 (Standard 1)3.0
חדר סטנדרט 21.5
חדר סטנדרט 30.75
חדר סטנדרט 40.375
חדר סטנדרט 50.1875
חדר סטנדרט 60.09375
חדר סטנדרט 70.046875
חדר סטנדרט 80.0234375

טבלה 1: ריכוזים סטנדרטיים. הריכוזים הידועים של תקנים 1 עד 8.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חזירי בית ביורקשייר שטופלו בנתרן כלורי תזונתי (0.15 ממול/ק"ג) או 15ניטראט עם תווית N (0.15 ממול/ק"ג) שניתנו פעם ביום במשך חמישה ימים רצופים כבולוס בצ'או הוחדרו בתמיסת נתרן הפרין (0.9% נתרן כלורי) לפני איסוף הרקמות; כל פרטי האוסף פורסמו בעבר19. ריכוזי cGMP בשרירי העכוז ובכבד של ארבעה חזירי בית ביורקשייר נמדדו בהתאם לפרוטוקול ELISA המתואר. רקמות הכבד דוללו ביחס דילול של 1:5, ושרירי העכוז ביחס דילול של 1:10, עם 0.1 N חומצה הידרוכלורית (HCl) כדי לזרז חלבונים. ההומוגנטים המדוללים ב-HCl עברו אצטילציה ולאחר מכן דוללו עם בופר ELISA ביחס דילול של 1:2 ו-1:3 עבור דגימות שריר הכבד והעכוז. ריכוזי cGMP נמדדו כמתואר לעיל. הספיגה הומרו לפיקומולים של cGMP למיליליטר של דגימה מוכנה ולאחר מכן לננומול של cGMP לגרם רקמה (nmol/g של רקמה) כאמור בפרוטוקול לעיל.

ריכוזי cGMP שנמדדו ברקמות הכבד הניבו תוצאות ניסיוניות מיטביות בתנאים לעיל. ריכוזי ה-cGMP בקבוצת הביקורת ובקבוצה שטופלה בחנקות בכבד חזירי הם 0.0202 ננומול/גרם ±-0.003 ננומול/גרם רקמה ו-0.0364 ננומול/גרם ±-0.011 ננומול/גרם רקמה, בהתאמה (איור 3). מספר ערכים מאשרים את מהימנות התוצאות. הספיגה של בארות B0 עם הפחתת החסר, שנעה בין 0.466 ל-0.475, נופלת בטווח של 0.3 AU עד 1.0 AU, ומאמתת התפתחות מספקת של מיקרו-לוחות עם המגיב של אלמן. האיכות הגבוהה של העקומה הסטנדרטית מוצגת הן על ידי עלייה מצטברת בספיגה מתקן 1 לתקן 8 והן על ידי הליניאריות של העקומה הסטנדרטית, המאומתת על ידי מקדם קביעה של 0.99. האחוז figure-results-1 עבור כל באר שנמדדה (31.5%-71.2%) הוא בין 20% ל-80%, מה שמאמת שכל הדגימות נופלות על העקומה הסטנדרטית. דוגמאות בעלות המאפיינים המוצהרים מתאימות לפרשנות.

ריכוזי cGMP שנמדדו ברקמות שריר העכוז הניבו תוצאות ניסיוניות לא אופטימליות. התווית התת-אופטימלית מוקצית לתוצאות שרירי העכוז מכיוון שרוב ערכי האחוזים figure-results-2 של בארות שרירי העכוז (3.69%-27.3%) ירדו מתחת ל-20%, מה שמצביע על כך שנדרשו דגימות מדוללות יותר כדי שהספיגה תיפול על העקומה הסטנדרטית. ריכוזי ה-cGMP בקבוצת הביקורת ובקבוצה שטופלה בחנקות בשריר העכוז החזירי הם 1.22 ננומול/גרם ±-0.49 ננומול/גרם רקמה ו-0.732 ננומול/גרם ±-0.18 ננומול/גרם רקמה, בהתאמה (הגרף לא מוצג). דגימות שריר העכוז חולקות את הספיגה של בארות B0 ותקני דגימות הכבד. שימוש בדגימות תת-אופטימליות אלה עלול להוביל למסקנות שגויות; לכן, יש צורך בהכנת דגימות מדוללות יותר ומדידה מחדש של ריכוזי ה-cGMP.

figure-results-3
איור 3: ריכוז cGMP ברקמת הכבד. ריכוז cGMP ממוצע של כבד חזיר שטופל בנתרן כלורי (0.15 ממול/ק"ג) או 15ניטראט עם תווית N (0.15 ממול/ק"ג) ב-nmol/g של רקמה. n = 4; פסי השגיאה מצביעים על סטיית תקן; הנתונים נותחו על ידי מבחן ה-t של וולש; אין משמעות ל-NS. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מספק הנחיות לגבי השלבים הנדרשים למדידת ריכוזי cGMP ברקמות מוצקות באמצעות ELISA תחרותי. שינויים בריכוזי cGMP יכולים להצביע על הבדלים בשפע של NO ברקמות. על ידי חקירת ההבדלים הללו ברקמות מוצקות, ניתן להבהיר מידע על NO באיברים שונים.

בפרוטוקול, דגימות רקמה הומוגניות לראשונה כהכנה ל-ELISA. זה התחיל בהקפאת בזק של מסה של רקמה מוצקה ולאחר מכן ריסוקה. פירוק רקמות לפני שלב ההומוגניזציה נועד לעזור להומוגניזטור החרוזים ליז את התאים. רקמות הומוגניות בחומצה הידרוכלורית 0.1 N כדי לזרז חלבונים, טכניקה המשמשת בשיטות אחרות20,21. לבסוף, המוצקים והמשקעים הופרדו מהרכיבים המסיסים באמצעות צנטריפוגה. כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית, מלאי של cGMP (300 pmol של cGMP/mL) דולל באופן סדרתי כדי ליצור שמונה תקנים שונים. תקנים ודגימות הואצטו כדי לשפר את רגישות הבדיקה על ידי זיהוי ריכוזים של עד 0.1 pmol של cGMP/mL. העלייה הזו ברגישות מושגת כאשר קבוצת האצטיל יוצרת קשר עם cGMP, מה שמשפר את היכולת של כל נוגדן (הקיים בסרום) להיקשר ל-cGMP18 שעבר אצטילציה. אצטילציה הן של התקנים והן של הדגימות מבטיחה אחידות בקשירת cGMP בין הבארות. ניתן להשמיט את שלב האצטילציה הן עבור תקנים והן עבור דגימות אם ריכוז ה-cGMP בבארות המיקרופלייט צפוי לעלות על 1.0 pmol/mL18.

כהכנה להוספת דגימות לבארות, הדגימות דוללו עוד יותר עם מאגר ELISA. הדילול הנוסף איפשר לדגימות ליפול על העקומה הסטנדרטית ולהידמות יותר לתכולת ה-NSB, B0 ובארות סטנדרטיות, וליצור אחידות. יחד עם הדגימות והתקנים, כמה פתרונות נוספים מעורבבים בבארות. בבארות NSB, מאגר ELISA (עם ובלי ריאגנטים לאצטילציה) מתווסף בזמן מניעת אנטי-סרום. זאת כדי לקבוע את כמות עוקב ה-AChE (אצטילכולין אסטראז הקשור ל-cGMP) שנקשר ל-IgG של העכבר שנדבק לבאר בהיעדר הנוגדן הספציפי המרכיב את האנטיסרום. בארות B0 הכילו מאגר ELISA (עם ריאגנטים לאצטילציה), עוקב AChE ואנטי-סרום; לכן, בארות B0 מציגות את יכולת הקישור של עוקב AChE ללא תחרות של cGMP. לאחר מילוי כל הבארות כראוי, המיקרופלייט מודגר ואז נשטף. המגיב של אלמן נוסף לבארות. לבסוף, עוקב AChE נוסף ל-TA הרבה לאחר הוספת המגיב של אלמן. באר זו מייצגת את הפעילות הקטליטית של עוקב AChE ללא קשר לכמות העוקב שנקשר למיקרו-לוח על ידי הנוגדנים. המיקרו-פלטה פותחה בטמפרטורת החדר, ומאפשרת לעוקב AChE לזרז תגובה קולורימטרית.

מספר שלבים בפרוטוקול עשויים לשנות את תוצאות הבדיקה; יש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע השלבים הבאים לקבלת תוצאות מיטביות. יש צורך בזיהוי דילולים מתאימים לכל סוג רקמה לשלב ההומוגניזציה ולאחר אצטילציה כדי להבטיח שהדגימות נופלות על העקומה הסטנדרטית. בעת הכנת התקנים, יש לערבב היטב או לערבב את הפתרונות לפני הסרת ה-aliquot או לאחר הוספת aliquot. שלב זה חשוב כדי להגיע לריכוזי cGMP הצפויים של כל תקן. במהלך שלבי האצטילציה, יש לערבב כל תקן ודגימה לאותו משך זמן כדי להשיג קריאות ספיגה עקביות. יש גם לערבב תקנים ודגימות מיד לפני הוספת אליקוט לבאר המתאימה. נוהג זה מביא לריכוזי cGMP מדויקים יותר. שטיפה יסודית של המיקרופלייט משפרת גם את דיוק ערכי הספיגה, מכיוון שהיא מסירה את כל עוקב ה-AChE הבלתי קשור מהבאר. לאחר הוספת המגיב של אלמן, יש לאפשר זמן מספיק להתפתחות המיקרופלייט, תוך מתן תשומת לב לצבע והכי חשוב, לספיגה של בארות B0 . חשוב להכיר בכך שריכוז ה-cGMP בין כפילויות או משולשות עשוי להשתנות יותר בדגימות עם רמות cGMP נמוכות יותר בהשוואה לאלו עם ריכוזים גבוהים יותר. מדידת מדגם מרוכז יותר עשויה לעזור לטפל בבעיה זו. בנוסף, כדי לקחת בחשבון כל שונות בין מיקרו-לוחות, יש למדוד דגימות מאותו סוג רקמה על אותה צלחת, במידת האפשר. הקפדה על הנחיות אלה צפויה לשפר את איכות הנתונים המתקבלים מהבדיקה.

ניתן להוציא את הפרוטוקול הנ"ל לרקמות רכות ומוצקות אחרות. פיתוח נוסף של תת-סעיף הכנת הרקמות בפרוטוקול הנ"ל עשוי להביא לשיטה המתאימה לעיבוד רקמות קשות, כולל עצם, שעשויה להיות מעניינת בשל כלי הדם שלה. המשך הפיתוח של טכניקה זו עשוי להוביל לשיטה המתאימה למדידת ריכוזי cGMP במגוון רחב של רקמות מוצקות, וכתוצאה מכך שיטה שימושית לאיסוף מידע נוסף על שפע ה-NO כמעט בכל רקמה. בעוד שפרוטוקול ELISA התחרותי שצוין לעיל הוא טכניקה שימושית למדידת cGMP ולהערכת השפע של NO, יש לו שתי מגבלות בולטות: (1) בדיקה זו אינה מבחינה בין cGMP המסונתז על ידי גואניליל ציקלאז מסיס לבין cGMP המסונתז על ידי חלקיקי גואניליל ציקלאז (pGC). פפטידים נטריאורטיים מעוררים את פעילות pGC22 ולכן, שינויים ב-cGMP דרך מסלול זה אינם מצביעים על שינויים בשפע של NO; (2) בנוסף, אנזימי פוספודיאסטראז (PDE) משפיעים על תוצאות בדיקת ELISA. מספר PDEs עוברים הידרוליזה של cGMP, ומפחיתים את ריכוזו בעקבות גירוי ה-sGC ב-NO23. לכן, הפעילות הקטליטית של PDEs עלולה לטשטש את הקשר בין ריכוזי cGMP לשפע של NO. תוספת של מעכב PDE5, כגון סילדנאפיל, למניעת אובדן cGMP מומלצת לניסויים המתמקדים בעיקר בהשגת ריכוזי cGMP מדויקים, בניגוד להשגת מדידות לצפייה במגמות בריכוזי cGMP. ניתן לתת מעכבי PDE5 כסילדנפיל לבעלי חיים כשעה לפני איסוף הדגימה (ההשפעות נמשכות עד 4 שעות24) או, אם מתן כזה אינו בר ביצוע, ניתן להוסיף סילדנפיל לדגימות שנאספו. בעת עיכוב PDEs לאחר איסוף רקמות, הוסף סילדנפיל לחומצה ההידרוכלורית 0.1 N כך שהרקמות יהיו הומוגניות בנוכחות סילדנאפיל. יש לבצע מדידות עם ובלי סילדנפיל כדי להבטיח שאין דיבור צולב בין הטיפול בבעלי חיים לסילדנאפיל.

אפילו עם מגבלותיו, הבדיקה משמשת כתובנה אינפורמטיבית לגבי השידור במורד הזרם של אות ה-NO. לסיכום, צימוד מדידת ריכוזי cGMP ברקמות מוצקות עם שיטות אחרות למדידת NO מאפשר הבנה טובה יותר של השפעות ה-NO באיברים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק 1ZIADK025104-18 שהוענק לאלן נ. שכטר על ידי NIDDK/NIH.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל BD מזרק אוראלי שקוףבקטון דיקינסון50382903052177
מבחנה תחתונה עגולה 14 מ"לבז352059
2.0 מ"ל מיקרו-צינורות, מגווןאולימפוס פלסטיק24-283 א
30-300 ומיקרו; L פיפטה רב-ערוצית אפנדורף3125000052
אנהידריד אצטי (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים40003198% טהור
<חזק>סכנה: דליק, קורוזיבי: כוויות קשות בעור, נזק לעיניים, רעלן חריף
<חזק>טיפול בטוח: יש להרחיק ממקורות הצתה, לעבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות
עוקב אצטילכולין אסטראז cGMP (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים481020אשלגן פוספט דו-בסיסי, נתרן כלורי,  אשלגן פוספט מונו-בסיסי, אלבומין בקר, נתרן אזיד, EDTA, cGMP AChE tracer
<חזק>סכנה: סכנה בריאותית: רעילות איברים מחשיפה חוזרת,
קורוזיבי: נזק לעיניים,
גירוי בעור ובנשימה
<חזק>טיפול בטוח: עבודה באזור מאוורר, ללבוש כפפות
cGMP ELISA AntiSerum (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים481022אשלגן פוספט דו-בסיסי, נתרן כלורי,  אשלגן פוספט מונובסיסי, אלבומין בקר,  נתרן אזיד, EDTA, ארנב אנטי-cGMP פוליקלונלי אנטיסרום
<חזק>סכנה: סכנה בריאותית: רעילות איברים מחשיפה חוזרת,
קורוזיבי: נזק לעיניים,
מגרה עור ונשימה, רעילות חריפה
<חזק>טיפול בטוח: לעבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות
תקן cGMP ELISA (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים481024אשלגן פוספט דו-בסיסי, נתרן כלורי,  אשלגן פוספט מונובסיסי, אלבומין בקר,  נתרן אזיד, EDTA, cGMP סטנדרטי
<חזק>סכנה: סכנה בריאותית: רעילות איברים מחשיפה חוזרת,
מאכל: נזק לעיניים,
גירוי בעור ובנשימה
<חזק>טיפול בטוח: עבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות
ערכת GMP ELISA מחזוריתחברת קיימן כימיקלים581021
תרכיז בופר ELISA 10X (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים4000601 M פוספט, 1% BSA, 4 M נתרן כלורי, 10 מ"מ EDTA, 0.1% נתרן אזיד
<חזק>סכנה: סכנה בריאותית: רעילות איברים מחשיפה חוזרת,
קורוזיבי: נזק לעיניים,
גירוי בעור ובנשימה
<חזק>טיפול בטוח: עבדו באזור מאוורר, אחסן במיכל עם מכסה הניתן לסגירה, ללבוש כפפות
מאגר ריאגנטים ELISAפירס (כיום תרמו פישר סיינטיפיק)15075
המגיב של אלמן (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים400050אשלגן פוספט דו-בסיסי, סודיום כלוריד, אשלגן פוספט מונו-בסיסי, אצטילתיוכולין (יודיד), 5,5'-דיתיוביס (2-חומצה ניטרובנזואית)
<חזק>סכנה: רעילות חריפה, סכנה בריאותית: רעילות איברים, קורוזיבי: נזק לעיניים, מגרה את העור, מגרה חוזר
<חזק>טיפול בטוח: יש לעבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ'320331<חזק>סכנה: קורוזיבי: מאכל מתכת, שורף עור קשות, נזק לעיניים, מגרה בדרכי הנשימה
<חזק>טיפול בטוח: עבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות
חנקן נוזליהחמצן של רוברטחנקן
<חזק>סכנה: גז דחוס: סכנת כוויות קריוגניות, פרוסביט, חנק
<חזק>טיפול בטוח: עבודה באזור מאוורר, ללבוש כפפות
עכבר נגד ארנב צלחת מצופה IgG (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים400006
סכנה: אין
איזון MF קלאסי חדשמטלר טולדו
שייקר מסלולי סטובל לייף סיינס בע"מ (כיום IBI Scientific)15-453-211 (משתנה)
פרפילםחברת Bemis, Inc.3023-4526 (משתנה)
פוליסורבט 20 (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים400035
סכנה: אין
אשלגן הידרוקסיד (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים40002985% טהור
<חזק>סכנה: קורוזיבי: מאכל מתכות ועור,
נזק לעיניים, רעילות חריפה
<חזק>טיפול בטוח: לעבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות
Precellys אבולוציה הומוגנייזרברטין טכנולוגיותPE000062-PEVO0-A
ערכת ליזינג של Precellys הומוגניזציה של רקמות קשותברטין טכנולוגיותP000911-ליסק0-א
קורא מיקרו-פלטות Senseהידקס425-301
צנטריפוגה Sorvall Legend Micro 17Rתרמו פישר סיינטיפיק75002441
מרסק רקמותסלקרושרערכת Cellcrusher
מערבולת ג'יני 2תעשיות מדעיות ת"י 0246
בקבוק כביסהסיגמא-אולדריץ'Z423092
תרכיז חוצץ כביסה 400X (בערכת cGMP)חברת קיימן כימיקלים400062אשלגן פוספט דו-בסיסי, אשלגן פוספט מונובסיסי, מים
<חזק>סכנה: קורוזיבי: נזק לעיניים, רעילות חריפה, מגרה בעור, רעילות איברים
<חזק>טיפול בטוח: לעבוד באזור מאוורר, ללבוש כפפות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dierks, E. A., Burstyn, J. N. Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase. Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).
  2. Koglin, M., Behrends, S. A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding. J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).
  3. Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation. Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).
  4. Bailey, S. J., et al. Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans. J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).
  5. Vanhatalo, A., et al. Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).
  6. Qin, X., et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice. Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).
  7. Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).
  8. Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2. PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).
  9. Park, J. W., et al. Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements. J Vis Exp. (173), e62427(2021).
  10. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).
  11. Srihirun, S., et al. Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures. Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).
  12. Montoliu, C., et al. Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis. Liver Int. 25, 787-795 (2005).
  13. Origlia, C., et al. Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects. J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).
  14. Calamera, G., et al. Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons. Commun Biol. 2, 394(2019).
  15. Rutkowski, N., et al. Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes. Sci Rep. 14, 26099(2024).
  16. Straub, A. C., Beuve, A. A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation. Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).
  17. Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber. Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).
  18. Cyclic gmp elisa kit. , https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf (2024).
  19. Park, J. W., et al. Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation. Nutrients. 16 (8), 1154(2024).
  20. Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V (2025).
  21. Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf (2025).
  22. Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle. Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).
  23. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).
  24. Corbin, J. D., et al. [3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP. Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GMPELISA

מאמרים קשורים