אספקת תאי גזע מונחית אולטרסאונד מדויקת לתיקון כלי דם במחלות אבי העורקים

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול להעברה מדויקת מונחית אולטרסאונד של תאי גזע וסקולריים לדופן כלי העורקים. הטכניקה מכוונת ביעילות לדופן כלי הדם ומקדמת תיקון כלי דם במפרצות ודיסקציות של אבי העורקים.

תקציר

מפרצת אבי העורקים וקרע בדיסקציה הם מצבי חירום קרדיווסקולריים מסכני חיים. מניעה ובקרה מוקדמת של התקדמות המחלה חיוניות לשיפור תוצאות המטופלים. תאי גזע וסקולריים ממלאים תפקיד מכריע בתיקון פציעות כלי דם במחלות כלי דם שונות. עם זאת, טיפולי הזרקת תאי גזע תוך-וסקולריים נתקלים באתגרים בהבטחת השתלה יעילה של תאי גזע אקסוגניים בתוך דופן כלי הדם.

כדי לחקור גישה יעילה יותר וזעיר פולשנית להעברת תאי גזע במחלות אבי העורקים, פיתחנו טכנולוגיית העברת תאי גזע ממוקדת מדויקת מונחית אולטרסאונד. באופן ספציפי, הטכניקה השתמשה במערכת הדמיית אולטרסאונד דופלר ברזולוציה גבוהה במיוחד כדי לאתר במדויק את דופן כלי הדם של אבי העורקים העולה במודלים של עכברים עם מחלת אבי העורקים. לאחר מכן, 1 ×^{10 תאי} גזע וסקולריים עם תווית דובדבן מעורבבים בתוך 25 מיקרוליטר של מטריג'ל הוזרקו באמצעות מחט 29 גרם. התקדמות המחלה נוטרה על ידי אולטרסאונד של בעלי חיים קטנים. לבסוף, אבי העורקים נקצר ונותח באמצעות הדמיה תלת מימדית עם מיקרוסקופ יריעת אור כדי לעקוב אחר תאי גזע וסקולריים מוזרקים.

התוצאות לעיל מדגימות כי תאי הגזע של כלי הדם שהוזרקו הועברו במדויק לדופן כלי הדם של אבי העורקים העולה עם פולשניות מינימלית, ובכך קידמו ביעילות את תיקון כלי הדם במפרצות ודיסקציות של אבי העורקים. טכנולוגיית אספקת תאי גזע מונחית אולטרסאונד זו מציעה שיטה מבטיחה וזעיר פולשנית להשתלת תאי גזע, שעלולה לשלוט בהתקדמות של מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים ומחלות לב וכלי דם קשורות אחרות במרפאות בעתיד.

מבוא

מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים (AAD) הן מחלות לב וכלי דם שכיחות וקטלניות ביותר, המאופיינות בדרך כלל בהופעה ערמומית והתקדמות מהירה. שכיחות AAD נעה בין 1.3% ל-8%, עם הערכה של 150,000 עד 200,000 מקרי מוות ברחבי העולם בכל שנה ^1,2. בשל ההופעה החריפה והתסמינים הקליניים העדינים, חולים רבים נמצאים במצב קריטי בזמן האבחון, ומפספסים את חלון ההזדמנויות האופטימלי לטיפול. למרות שטיפולים תרופתיים, כגון חוסמי β-אדרנרגיים וחוסמי קולטני אנגיוטנסין, יכולים להאט את התפשטות המפרצת במידה מסוימת, טיפולים אלה מספקים בעיקר הקלה סימפטומטית ולא הוכחו כמונעים ביעילות את הופעתו או התקדמותו של AAD³.

נכון לעכשיו, הניהול הקליני מסתמך בעיקר על התערבויות כירורגיות, כולל שחזור שורש אבי העורקים, החלפת אבי העורקים העולה, ניתוח בנטל ותיקון אנדווסקולרי של מפרצת אבי העורקים ^4,5. עם זאת, עבור חולים עם AAD גנטי, במיוחד אלה שעדיין לא הגיעו לאינדיקציות כירורגיות, חסרים טיפולים אטיולוגיים יעילים, וגישות פרמקולוגיות מתקשות לשלוט בהתקדמות המחלה לטווח ארוך. בחולים עם תסמונת מרפן (MFS), למרות שטיפול רפואי יכול לעכב את התרחבות אבי העורקים, מחקרים מצביעים על כך שחלק מהאנשים חווים קצב מהיר יותר של התרחבות אבי העורקים ומתמודדים עם סיכון גבוה יותר לדיסקציה של אבי העורקים⁵. לכן, מתן התערבויות יעילות לחולים אלה, שעדיין אינם עומדים בקריטריונים כירורגיים, נותר אתגר קליני משמעותי. פיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות יותר הפך לנושא מרכזי שיש לטפל בו בטיפול במחלות אבי העורקים.

הפתוגנזה של AAD כרוכה בעיקר באפופטוזיס נרחב של תאי שריר חלק (SMCs) ודילול המדיה, מה שמוביל לשבריריות מבנית של דופן אבי העורקים. באופן ספציפי, אובדן מתקדם של SMCs אבי העורקים הוא סימן היכר של AAD, המתבטא באפופטוזיס של SMCs, פירוק מטריצה חוץ-תאית (ECM), חדירת תאי חיסון ומתח חמצוני מוגבר². תאי גזע וסקולריים הם סוג של תאי גזע בוגרים השוכנים בדופן כלי הדם, המסוגלים להתמיין ל-SMCs או לתאי אנדותל. בתנאים פיזיולוגיים רגילים, תאי גזע נשארים שקטים, אך בתנאים פתולוגיים הם מופעלים, עוברים התחדשות עצמית והתמיינות כדי לתרום לתיקון רקמות⁶. מחקרים אחרונים הדגישו את התפקיד הקריטי של תאי גזע בדופן כלי הדם בפגיעה בכלי הדם, במיוחד בעיצוב מחדש של שתלי ורידים, טרשת עורקים, רסטנוזיס, יתר לחץ דם, ובמחלות או מצבים פתולוגיים כגון AAD 7,8,9,10,11,12,13.

בעוד שהטכנולוגיות הקיימות להעברת תאי גזע - כגון הזרקה מקומית ספציפית לרקמה ועירוי תוך ורידי מערכתי - מתקדמות יחסית, העברת תאי גזע לדופן אבי העורקים מציבה אתגרים משמעותיים^14,15. זרימת הדם המהירה באבי העורקים, יחד עם ההתכווצות וההרפיה הדינמית של דופן כלי הדם, מקשה על השגת אספקת תאים יעילה ומבטיחה הישרדות ארוכת טווח של תאים מושתלים ברקמת כלי הדם.

במחקר זה, אנו מתארים טכניקת הזרקת ממברנה אפי חדשה וסגורה המאפשרת אספקה זעיר פולשנית וממוקדת במדויק של תאי גזע בדופן כלי הדם בהנחיית אולטרסאונד. גישה זו מציעה את היתרון בכך שהיא קלה לביצוע, ללא צורך בכריתת בית החזה או לפרוטומיה, ומונעת את הסיבוכים הנלווים. היא גם מאפשרת גמישות רבה יותר בתהליך ההזרקה, ומאפשרת ריכוז ממוקד של תאי גזע באזור הרצוי תוך מזעור תגובות חיסוניות ותופעות לוואי אחרות. יתר על כן, ההתקדמות בטכנולוגיית פינוי אופטי של רקמות מאפשרת כעת הדמיה ברזולוציה תת-תאית של כל גוף העכברים, ומציעה יישומים נרחבים בשחזור תלת מימדי ברזולוציה גבוהה של מבני רקמות, חקירת מנגנונים פתולוגיים, מידול מחלות וסינון תרופות. בשילוב עם מיקרוסקופ גיליון אור, טכנולוגיה זו מספקת הדמיה תלת מימדית ברזולוציה מרחבית גבוהה¹⁶. באמצעות גישה זו, אנו יכולים לעקוב אחר תאי הגזע של כלי הדם המוזרקים ולצפות ביכולת הנדידה שלהם. לפיכך, אספקת תאי גזע מונחית אולטרסאונד מייצגת שיטה זעיר פולשנית מבטיחה להשתלת תאי גזע.

פרוטוקול

כל הליכי הניסוי מבוצעים בהתאם לתקנות הוועדה למחקר בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל ומאושרים על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים ואתיקה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל.

1. הכנת תאי גזע וסקולריים מוזרקים

הערה: כדי לאמת את המצב וההשפעות שלאחר ההזרקה של תאי גזע וסקולריים, תאי Sca1⁺ מבודדים באמצעות בחירת חרוזים אימונומגנטיים כפי שתואר קודם לכן 17,18,19, מועברים עם lentivirus הנושא את מדווח mCherry לתצפית לאחר מכן על מיקום התא ותפוצתו, ולאחר מכן מתורבתים. תאים ממעברים 5 ומעלה עם תנאי גידול טובים וביטוי Sca1⁺ עם תווית mCherry משמשים לניסויים הבאים²⁰.

1. קצרו את אבי העורקים מעכברי C57BL/6J בני 6-8 שבועות, הפרידו את הרקמה האדוונטיציאלית במיקרוסקופ וטחנו עד כ-0.5 מ"מ. מרחו 0.04% ג'לטין על תחתית בקבוק התרבית ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂ כדי לקדם התקשרות והתפשטות תאים. לאחר 20 דקות שואבים את הג'לטין ומניחים את הרקמה הטחונה בתחתית בקבוק התרבית^17,21, כשהחלק התחתון פונה כלפי מעלה למשך 2-3 שעות. לאחר שהרקמה מחוברת היטב לתחתית בקבוק התרבית, הניחו את החלק התחתון של בקבוק התרבות כלפי מטה, הוסיפו מדיום תרבית לבקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂.
2. לאחר 3 שעות, הסר את בקבוק התרבית, והוסף מדיום DMEM המכיל 20% סרום בקר עוברי, 10 ננוגרם/מ"ל LIF, 100 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין.
3. לאחר 3 ימים, לאחר שהתאים נדדו מהרקמה והגיעו למפגש של 80%-90%, הוסיפו 0.05% טריפסין ותת-תרבית ביחס של 1:3.
4. למעבר 3, החלף את המדיום ב-DMEM המכיל 15% סרום בקר עוברי; עבור מעבר 5, החלף את המדיום ב-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (רכיבים אחרים נשארים ללא שינוי).
5. עכל את תאי כלי הדם האדוונטיציאליים ודגר אותם על קרח עם מיקרו-חרוזים נגד Sca1⁺ . הוסף את מתלה התאים לעמודה המצוידת במערכת מיון תאים מגנטית ואסוף אותם¹⁸. השתמש בתאים עם תנאי גידול טובים ממעברים 5 ומעלה לניסויים הבאים.
   הערה: כדי להבטיח את חיוניות התאים, מומלץ שתאים להזרקה in vivo יהיו בעלי כדאיות של ≥90% , כפי שנקבע על ידי צביעה כחולה של טריפאן.
6. שעה לפני ההזרקה, הוסף 0.05% טריפסין לתאים, ספר אותם באמצעות המוציטומטר והסר את הסופרנטנט על ידי צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-200 × גרם למשך 5 דקות.
7. השעיית התאים במטריג'ל (מופשר מראש ב-4 מעלות צלזיוס) בריכוז של 4 × 10⁷ תאים/מ"ל כנשא להשתלת תאי גזע, כדי לחקות את סביבת הגידול in vivo. מערבלים בעדינות את התערובת ושומרים אותה על קרח עד שהיא מוכנה להזרקה.

2. הכנה טרום ניתוחית של עכברים

1. הכניסו את העכברים לצום 12 שעות לפני ההזרקה מבלי להגביל מים.
2. נגב היטב את תא האינדוקציה של ההרדמה ופלטפורמת האולטרסאונד עם 75% אתנול.
3. מרחו משחת עיניים והניחו את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה, כאשר זרימת החמצן מוגדרת ל-1 ליטר לדקה וריכוז האיזופלורן מותאם ל-2-3%. המתן עד שרפלקס הכאב ייעלם, מה שמעיד על הרדמה מוצלחת, ואז הסר בזהירות את העכבר מהחדר.
4. הניחו את האף והפה של העכבר מתחת למסכת הרדמה, והתאימו את ריכוז האיזופלורן ל-1.5-2%. מקם את העכבר בגב על פלטפורמה של 37 מעלות צלזיוס כדי למקסם את החשיפה לבטן.
5. מרחו ג'ל מוליך על ארבע האלקטרודות על הפלטפורמה, והשתמשו בסרט רפואי כדי לקבע את ארבע כפות העכבר לאלקטרודות לניטור המצב הפיזיולוגי.
   הערה: המפעיל לובש כפפות סטריליות, מסכה, כובע כירורגי וחלוק כירורגי סטרילי.
6. השתמש בצמר גפן סטרילי כדי למרוח קרם אפילציה על מקום ההזרקה, השאיר למשך דקה אחת ולאחר מכן נגב בעדינות עם ספוגית חדשה. חיטוי מקום ההזרקה באמצעות תמיסת יוד פי 3.
7. לעטוף את אתר הניתוח, להכין באופן אספטי מזרק סטרילי ולשמור על השדה הסטרילי.

3. הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי דופן כלי דם

הערה: כל הליכי האולטרסאונד מבוצעים באמצעות מערכת ותוכנה להדמיית אולטרסאונד (עיין בטבלת החומרים). השתמש בבדיקות עם תדר מרכזי של 40 מגה-הרץ ומשתמשים במחטים של 29 G .

1. כוונן את פלטפורמת האולטרסאונד לזווית של כ-30 מעלות ביחס לרצפה. בקש מהמפעיל לפנות לצד ימין של בעל החיים, כאשר ראשו של בעל החיים מופנה שמאלה. מרחו ג'ל אולטרסאונד על האזור המנופח והמחוטא.
2. מקם את הגשושית בצד ימין של עצם החזה כדי להציג את הציר הארוך של קשת אבי העורקים.
3. טען 25 מיקרוליטר מהתרחיף של 1 × 10⁶ תאי גזע של דופן כלי הדם במטריג'ל לתוך מחט 29 גרם. נגב את קצה המחט באלכוהול סטרילי לפני ההזרקה כדי למזער השתלה חוץ רחמית של תאי גזע.
4. אבטח את המזרק המכיל את מתלה התא למנגנון ההזרקה מונחה האולטרסאונד, וודא שכיוון המחט מיושר עם הגשושית ובזווית של 45° ביחס לדופן החזה.
5. הנח לאט את מחט ההזרקה לתוך שדה הראייה של האולטרסאונד, התאם אותה למישור המוקד ויישר אותה עם קו הסימון של נתיב ההזרקה.
6. כאשר המחט מתקרבת לקצה העור, השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס את העור ודופן הבטן, וקדם במהירות את המחט דרך דופן החזה.
7. בהנחיית אולטרסאונד, כוון את המחט לאזור האדוונטיציאלי בין העורק האינומינטי לקשת אבי העורקים. הסר בעדינות את המזרק למעלה ולמטה כדי לאשר את מיקום המחט.
8. לחץ על המזרק כדי להזריק את מתלה התאים לאזור המטרה.
9. משוך את מחט ההזרקה באיטיות, וחטא את אתר הניקוב על פי נהלים סטנדרטיים.
   הערה: לאחר הליכים כירורגיים, יש להניח עכברים על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס עד שהם בהכרה מלאה ומסוגלים לשמור על שכיבה עצם החזה, ויש לעקוב אחריהם באופן רציף בזמן שהם על כרית החימום. לאחר מכן, העבירו את בעלי החיים לכלובים נקיים עם מצעים טריים. יש לבצע ניטור רציף מדי שעה במשך 24 שעות כדי להעריך סיבוכים פוטנציאליים לאחר הניתוח, כולל יציבה כפופה וירידה בפעילות.

4. הבהרת רקמות כלי דם

1. הזרקו תאי גזע Sca1⁺ עם תווית mCherry לאזור האדוונטיציאלי בצומת העורק האינומינטי וקשת אבי העורקים. לאחר 4 שבועות, המתת חסד של העכברים באמצעות CO₂, ולאחר מכן אסוף את רקמת אבי העורקים לאחר הזלוף.
2. יש לתקן את רקמת אבי העורקים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפות PBS למשך 3 שעות העבירו את הרקמה לתמיסת ניקוי רקמות ודגרו על משטח ניעור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי להשיג שקיפות.
   הערה: תמיסת ניקוי הרקמות המוזכרת היא תערובת של 10% N-butyldiethanolamine ו-10% Triton-X-100 מומס ב-ddH₂O¹¹.
3. שטפו את הטישו במשך 3 x 2 שעות עם PBS בטמפרטורת החדר. העבירו את הרקמה ל-PBS המכיל נוגדן ראשוני CD31 (1:100) ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
4. לאחר שטיפה של 3 x 1 שעות עם PBS, דגרו את הטישו עם החמור נגד עזים (1:800) בטמפרטורת החדר למשך 3-4 שעות, ולאחר מכן שטיפת PBS למשך 3 x 1 שעה.
5. העבירו את הרקמה לתמיסה התואמת את מקדם השבירה ודגרו למשך יומיים נוספים לפחות להמשך שקיפות.
   הערה: תמיסת התאמת מקדם השבירה המוזכרת היא תערובת של 45% אנטיפירין, 30% ניקוטינאמיד ו-0.5% N-בוטילדיאתנולמין מומס ב-ddH₂O¹¹.
6. מכינים ג'ל אגרוז 2%, מחממים וממיסים אותו, מטמיעים את הרקמה השקופה בג'ל אגרוז ונותנים לו להתקרר כדי לשמור על צורתו כגליל בקוטר 5 מ"מ. תקן אותו על הבמה של מיקרוסקופ גיליון אור, וסרוק אותו בתלת מימד. תחת המפרט הבא: מטרת תאורה: 2 יחידות של עדשות טבילה במים 10x 0.3 צמצם מספרי (NA); מטרת זיהוי: יחידה אחת של עדשה מרובת טבילה 10x 0.5 NA; מחליף הגדלה: 1x/0.75x, בוצעה הדמיה.

תוצאות

אספקה מונחית אולטרסאונד של תאי גזע וסקולריים
במחקר זה, הזרקה מונחית אולטרסאונד בוצעה באמצעות מערכת דימות אולטרסאונד דופלר צבעונית של בעלי חיים קטנים (איור 1A,B). במהלך ההליך, עכברים היו משותקים על פלטפורמת אולטרסאונד מחוממת, עם התאמות שנעשו לפלטפורמה ולבדיקת האולטרסאונד לפי הצורך (איור 1C).

דיון

AADs הנגרמים על ידי מוטציות גנטיות מסווגים כ-AAD תורשתי, ביניהם MFS הוא הנפוץ ביותר. AAD מייצג את הסיבוך מסכן החיים ביותר של MFS²². כדי לחקור מצב זה, השתמשנו במודל עכבר מבוסס היטב של MFS (עכברי Fbn1^C1041G/+), אשר מפתח באופן ספונטני מפרצת אבי העורקים, מה שהופך אותו לאידיאלי למחקרי התערבות מוקדמת. מודל זה גם עוקף את הנזק הנוסף לרקמות ואת השונות הניסיונית הקשורה לגישות מידול אחרות. במחקר זה, תאי גזע וסקולריים Sca1⁺ המסומנים על ידי mCher...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת ג'לטין 0.1%	אורי סל	GLT-11301
1.5 מ"ל מיקרו-צינורות	אקסיג'ן	MCT-150-C
10 μ קצות פיפטה L	מעבדה	ט-001-10
1000 μ קצות פיפטה L	מעבדה	T-001-1000
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	מעבדה	CT-002-15A
200 μ קצות פיפטה L	מעבדה	T-001-200
צינור מיקרו-צנטריפוגה 5 מ"ל	ביושארפ	BS-50-M
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	מעבדה	CT-002-50A
אנטיפירין	מקלין	A800873
ערכת אנטי-SCA-1 MicroBead	Miltenyi Biotec	130-123-124
מערכת Bruker Luxendo MuVi -SPIM
תקליטור 31	מו"פ D	AF3628	יחס דילול 1:100
קוביק-ל			פתרון לניקוי רקמות
קוביק-RA			מקדם שבירה - פתרון תואם
DMEM	ATCC	30-2002
נוגדן משני נגד עזים לחמור, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11055	יחס דילול 1:800
FBS	קורנינג	35-076-קורות חיים
HBLV-mcherry-PURO	האנביו
צינורות הומוגנייזר	מעבדה	HGT-003-200
מכשיר הזרקת מחט מונחה תמונה	ויז'ואלסוניקס
מזרק אינסולין	ב.ד.	328421
איזופלורן	אמישין	LAT-YFW
מיקרוסקופים של גיליון אור	ברוקר לוקסנדו	MuVi-SPIM
מטריגל	קורנינג	356234
מתמר Microscan MS400	ויז'ואלסוניקס
פלטפורמת טיפול בעכבר וניטור פיזיולוגי	ויז'ואלסוניקס
N-בוטילדיאתנולמין	מקלין	N802391
ניקוטינאמיד	מקלין	N814605
PBS	ביושארפ	BL302א
משחת עיניים Puralube	אקוול	1703321138
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T9284
תמיסת כתמים כחולים של Trypan	סולארביו	ג0040
טריפסין-EDTA	ג'יבקו	25200-072
מערכת lmaging Vevo 2100	ייסוולסוניקס
מערכת מסילות משולבת Vevo II	איסוולסנים