דגימה יעילה של מרחב תכנון חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מתאפשרת עם תכנון ניסויים וזרימת עבודה של אוטומציה

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה לאופטימיזציה גלובלית שיטתית של חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית באמצעות יצירה והערכה של ספריות גנטיות בסיוע אוטומציה. זה משולב עם מתודולוגיות תכנון ניסוי כדי לייעל את הניסויים ולאפשר בחירת רכיבים גנטיים כדי לכוונן את החיישנים הביולוגיים לתוצאות תכנון ספציפיות.

Abstract

חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית הם כלים רבי עוצמה לעיבוד מידע בתפוקה גבוהה, המאפשרים התמרה של אותות קלט סביבתיים או כימיים למגוון יציאות. זה מאפשר חישה דינמית, בקרה ישירה וויסות מכוון של ביטוי גנים במגוון רחב של יישומים ביוטכנולוגיים, כולל אופטימיזציה של אנזימים, פיתוח זנים ובקרת תהליכים מיקרוביאליים. כדי להתאים אותם למטרה, ניתן לחדד את ביצועי החיישנים הביולוגיים על ידי שינוי הסטויכיומטריה של רכיבי מעגל חיישנים ביולוגיים (למשל, טרנספורטרים, מודולי קלט ויציאה), ו/או כוונון אינטראקציות בין-מולקולריות הקשורות למארח-חיישן ביולוגי (למשל, חלבון-DNA, חלבון-חלבון). עם זאת, כאן, המספר העצום של תמורות חיישנים ביולוגיות אפשריות יוצר מרחב תכנון קומבינטורי מורכב, המחייב אופטימיזציה זהירה של אסטרטגיות סינון כדי לזהות תצורות המספקות את הביצועים הפנוטיפיים הרצויים. מורכבות זו מורכבת עוד יותר על ידי תכונות ביצועי חיישנים ביולוגיים, כגון כוונון, הדורשות ניתוח טיטרציה של אפקטור בתנאי סינון חד-שבטיים. כתוצאה מכך, הצורך לחקור רצפים מגוונים ומרחב ניסוי הופך את שיטות הדגימה החלקיות למתאימות במיוחד למטרה זו. בבסיס זרימת עבודה זו עומדים אלגוריתמים של עיצוב ניסוי (DoE), הממוקמים היטב כדי לאפשר מיפוי מובנה יעיל מבוסס סטטיסטיקה ודגימה חלקית של מרחב התכנון הניסיוני הקומבינטורי הזה.

מדווח בפנים הוא שילוב של אוטומציה בתפוקה גבוהה וגישה חישובית כדי לדגום ביעילות את מרחב העיצוב של חיישנים ביולוגיים מבוססי גורם שעתוק אלוסטרי כדי לאפשר תצורות שונות עם עקומות מינון-תגובה דיגיטליות ואנלוגיות כאחד. הפרוטוקול מתחיל ביצירה ובחירה אוטומטית של ספריות אתרים מחייבות מקדם וריבוזום. ספריות אלה, ונתוני הביטוי המתאימים להן, הופכים לקלטים מובנים חסרי מימד, המאפשרים מיפוי חישובי של מרחב התכנון הניסיוני המלא. לאחר מכן מתבצעת דגימה חלקית באמצעות אלגוריתם DoE ויחד עם ניתוח טיטרציה של אפקטור באמצעות פלטפורמת אוטומציה בעלת תפוקה גבוהה. זרימת עבודה זו מספקת מסגרת אגנוסטית לפיתוח ואופטימיזציה של מערכות חיישנים ביולוגיים ומעגלים גנטיים עתידיים, ומספקת ערכת כלים רגולטורית לקהילת הביולוגיה הסינתטית.

Introduction

היכולת לווסת את ביטוי הגנים היא פונקציה חיונית בכל צורות החיים, המאפשרת תגובות דינמיות בזמן אמת להשפעות פנימיות וחיצוניות כאחד, החל מאפקטורים כימיים ועד לגירויים ביופיזיים¹. למספר העצום של מערכות ויסות שעתוק הנמצאות ברחבי הטבע יש פוטנציאל עצום בהגדלה והאצה של הנדסה מטבולית ומחקר ביוטכנולוגי המתאפשר על ידי ביולוגיה סינתטית. בפרוקריוטים, חלק ניכר מהוויסות המתרחש בתא נשלט באמצעות מנגנוני ויסות חד-רכיביים המונעים על ידי אינטראקציות של גורמי שעתוק אלוסטריים (aTFs) עם מספר אפקטורים של מולקולות קטנות². בדרך כלל מורכבים מתחום קשירת אפקטור (EBD) ותחום קשירת DNA (DBD), aTFs פועלים כמתגים מולקולריים בעת קשירה לאפקטורים ספציפיים של מולקולות קטנות, ומווסתים את הזיקה של ה-DBD שלהם לרצפי אופרטור DNA ספציפיים הממוקמים באזורי המקדם של הגנום, וכתוצאה מכך הפעלה או דיכוי של שעתוק³. מנגנון פשוט להפליא זה הוליד מספר אסטרטגיות רגולציה מגוונות, החל ממערכות דיכוי/דה-דיכוי ועד לאקטיבטור המסוגל לזהות ולהגיב למספר מדהים של אפקטורים של מולקולות קטנות או גירויים^{סביבתיים.} כתוצאה מכך, הביולוגיה הסינתטית מינפה את המגוון הזה על מנת לבנות חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית המסוגלים לחבר שפע של אותות קלט לפלטים מותאמים אישית, כלומר, ייצור חלבון מדווח פלואורסצנטי וויסות מסלולים סינתטיים. כאשר מיושמות בתהליכי עבודה ביוטכנולוגיים, מערכות כאלה מאפשרות ניטור בזמן אמת של ריכוזים תוך-תאיים של מטבוליטים, ויסות דינמי של מסלולים וקריאות קלות המסייעות בפיתוח מסלולים, זנים ותהליכים ביולוגיים יעילים יותר 5,6,7,8.

ביסודו של דבר, חיישנים ביולוגיים מאופיינים על פי מספר פרמטרים, כולל ספציפיות, טווח פעולה, טווח דינמי, רגישות ושיפוע, כאשר עקומת תגובת המינון של חיישן ביולוגי מתארת פרמטרים אלה באמצעות אות הפלט כפונקציה של ריכוז הליגנד (איור 1)9,10,11,12 . ניתן להשתמש במשוואת היל כדי להתאים למאפייני הביצועים של חיישן ביולוגי, ולספק ראיות חצי אמפיריות לכל אחד מהפרמטרים שתוארו לעיל, ובכך לספק אמצעי לאפיון מערכת החיישנים הביולוגיים תוך מתן אפשרות להערכת המאמצים הנדרשים לכוונון המערכת לתוצאות מונעות יישום. ניתן להגדיר ספציפיות כהבדלים היחסיים בתפוקת האות המושרה על ידי אפקטור אחד בהשוואה למערך של מולקולות אפקטור פוטנציאליות אחרות והיא מווסתת בדרך כלל ברמת ה-EBD של ה-aTF. טווח הפעולה מוגדר כטווח ריכוזי הליגנד שהחיישן הביולוגי מסוגל לחוש, ומכתיב את טווח הריכוזים שאליהם החיישן הביולוגי יוכל להגיב. טווח דינמי, לעומת זאת, מתאר את היחס בין מצב ההפעלה המדיד (ON) הגבוה ביותר למצב המושבת (OFF) ומהווה פרמטר חשוב להבטחת החיישן הביולוגי מדווח באופן אמין על ריכוזי אפקטורים מעל פלואורסצנציה אוטומטית^{ברקע 10}. הרגישות למולקולת האפקטור מתוארת כריכוז הנדרש כדי להפיק אות פלט מסוים, הנמדד על ידי חצי הריכוז המקסימלי (EC₅₀) של האפקטור¹³. לבסוף, שיפוע העקומה מסומן על ידי שיתוף הפעולה (n_H) של ה-aTF עבור אתר המפעיל שלו במקדם ומביא לפרופיל פלט תגובה דיגיטלי או אנלוגי יותר. שיתוף פעולה נובע מאינטראקציות חלבון-חלבון בין aTFs הקשורים לליגנד היוצרים קומפלקסים מולטימריים המחזקים את הזיקה לאתר המפעיל, וכתוצאה מכך עליות חדות בהיענות המעגל עם ריכוזי ליגנד רוויים ופרופיל תגובה דיגיטלי יותר¹⁴.

מאפייני תגובת המינון של חיישן ביולוגי יכולים להשפיע באופן משמעותי על התאמת היישומים שלו, ולעתים קרובות הם נקודת 'הצלחה או שבירה' עבור כל יישום קונספטואלי. ביצועי החיישנים הביולוגיים יכולים להשתנות מאוד ממערכת למערכת, כאשר הטווח התפעולי נע בדרך כלל בין 0.1nM-10mM¹³, בעוד שהטווחים הדינמיים יכולים להיות בין 1.4-2000 פי¹⁵. יתר על כן, בעוד שמספר תרכובות האפקטור המדווחות עבור aTFs הוא רחב (מוצרים מטבוליים, חומצות אמינו, מתכות, אנטיביוטיקה, חישת מניין וכו')¹¹, לא הכל מקיף, ומציב אתגרים לחוקרים כאשר חיישן ביולוגי מתאים לאפקטור שלהם עדיין לא קיים בספרות. ביולוגיה סינתטית אפשרה הנדסה של חיישנים ביולוגיים המתמודדים עם אתגרים כאלה, ואפשרה כוונון של היקף האפקטור ומאפייני מינון-תגובה כדי ליישר קו עם תוצאות המחקר של היישום, ושימשה לטיפול בשתי הבעיות הנ"ל, בהתאמה^16,17. שני תחומי מפתח להנדסה ניתנים למטרה באמצעות ביולוגיה סינתטית, אזור המקדם של החיישן הביולוגי וה-aTF עצמו, המתווך את השפעותיהם ברמת השעתוק והחלבון. גישות המתמקדות באלמנטים הגנטיים של החיישן הביולוגי על מנת לווסת את הביצועים ברמת המקדם, כוללות הנדסה של ה-RBS, אתרי מפעילים ו-35, -10 (hexbox) על מנת לכוונן את הרגישות, הטווחים התפעוליים והדינמיים, והן המוקד של המתודולוגיה המתוארת בכתב יד זה (איור 1). לחלופין, שינוי הסלקטיביות והרגישות של החיישן הביולוגי באמצעות ניתוח תחום קשירת האפקטור שלו ומוטציה של שאריות המעורבות בתיאום אפקטור (באמצעות הומולוגיה של רצף ו/או ביולוגיה מבנית) יכול לווסת את תגובתו לאפקטור קוגנטי 18,19,20 או לשנות אותה לחלוטין לכיוון אפקטור לא קוגנטי מעניין 16,17,21. מאמצי כוונון כאלה יכולים לכוון את החיישנים הביולוגיים ליישומים ספציפיים, כאשר אלה הם בדרך כלל בקרים מטבוליים (לולאות משוב, מעגלי בקרה), כלי סינון ראשוניים (גילוי אנזים או זן), כלי סינון משניים (סינון וריאנטים של אנזימים, הנדסה מטבולית) וביו-פרוספקטיבינג^{טרנספורטר} 22,23,24 . דוגמה אחת כזו כוללת שימוש ב-aTF מגיב לחומצה מוקונית, CatM, בשילוב עם רצף מקדם מהונדס לשיפור הטווח הדינמי והתפעולי. מערכת זו שולבה עם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי כדי לבודד את זני ייצור החומצה המוקונית היעילים ביותר המבוססים על פלואורסצנטי GFP בעקבות אבולוציה מעבדתית אדפטיבית²⁵.

בעוד שההצלחה של האסטרטגיות ההנדסיות שתוארו לעיל מובנת מאליה, התלות ההדדית של המנופים הזמינים לביולוג סינתטי לכוונון חיישנים ביולוגיים יכולה לסבך את תהליך התכנון ולהאריך את התקופה המושקעת בפיתוח חיישנים ביולוגיים, מה שעלול להניא חוקרים מסוימים מהטמעת חיישנים ביולוגיים בתהליכי העבודה שלהם. כפי שמוצג באיור 1, ניסיונות לכוון חיישן ביולוגי לתוצאה מסוימת באמצעות שינוי המשושים עלולים להחליש בטעות פרמטרים אחרים, תלות הדדית זו היא אתגר מוכר בהנדסת חיישנים ביולוגיים¹². גישות נפוצות של כוונון חיישנים ביולוגיים מורכבות מתכנון רציונלי והנדסת אבולוציה מכוונת, כאשר הראשונה מסתמכת על הבנה אפריורית של המאפיינים המבניים והמכניסטיים של המערכת כדי למקד את הניסויים ברכיבים בעלי סבירות גבוהה להצלחה; ואילו האחרון מסתמך על מוטגנזה אקראית ואבולוציה טבעית יחד עם מסך תפוקה גבוה כדי לבחור גרסאות המציגות מאפיינים אופטימליים 26,27,28,29,30. למרות יעילותן, שתי הטכניקות סובלות גם מכמה חסרונות: הנדסה ממוקדת, למשל, באמצעות התמקדותה באלמנטים מבניים או פונקציונליים ספציפיים, נוטה לחקירה מוגבלת של מרחב הניסוי המלא ועלולה להתעלם מהשפעות אלוסטריות או משניות³⁰. יצירה וסינון ספריות לא ממוקדים, למרות שהם אידיאליים לאופטימיזציה של עיצובים בצורה לא מודרכת, הדורשת מעט בדרך של עבודת עיצוב מראש (כלומר, עיצוב ויצירת ספריות), דורשים הטיה לכיוון מוטציה שימושית. ללא הטיה כזו, צפוי שאחוז גדול בהרבה של מוטציות עלול להיות מזיק, ולדרוש יותר בדיקות סקר³¹. ככזה, גישות הוליסטיות הלוקחות בחשבון לא רק את ההשפעה העיקרית של החלקים המרכיבים את החיישן הביולוגי (aTF, RBS, אתרי מפעילים ומשושים) אלא גם כיצד רכיבים אלה מתקשרים זה עם זה כדי להשפיע על פרמטרים של חיישנים ביולוגיים הן אטרקטיביות ביותר.

ניסויים מובנים רב-משתנים ומתודולוגיות מודלים סטטיסטיים אומצו באופן נרחב בתהליכי עבודה של הנדסת תהליכים על מנת לחקור מרחב ניסוי רב-ממדי תוך שימוש במספר המינימלי האפשרי של ניסויים. גישה זו, המשלבת ניסויים ומידול, המכונה תכנון ניסויים (DoE), מאפשרת באופן מכריע לחוקרים לייעל תהליכים מורכבים מרובי משתנים לקראת תוצאות מוגדרות מבלי לדרוש ידע אפריורי ^{נרחב 23,30}. בעוד שבדרך כלל מיושם על אופטימיזציה של משתנים רציפים שעבורם חקירה ניסויית מובנית קלה יותר, DoE שימש גם באופטימיזציה של מסלולים מטבוליים ברמה הגנטית 31,32,33. זה כולל שלב סינון ראשוני שבו נבחרים הגורמים הנחשבים החשובים ביותר לתוצאה הרצויה, ואחריו שלב אופטימיזציה לפיו הגורמים שנבחרו מותאמים כדי להשיג את התפוקה הרצויה, במקרה זה כדי לייעל פרמטרים ספציפיים של חיישנים ביולוגיים על מנת להגדיל את היקף היישום שלהם. באופן קריטי, ניתן לחבר טכניקה זו לפלטפורמות אוטומטיות לטיפול בנוזלים כדי להגדיל את תפוקת הסינון עד לספריות בגודל בינוני של 10³ - 10⁴ כדי לייעל באופן גלובלי את ביצועי החיישנים הביולוגיים על בסיס מונחה נתונים²³. להלן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום גישה מונעת DoE לאופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים, בסיוע רובוטיקה לטיפול בנוזלים כדי לייעל את יצירת הספרייה, הסינון ואיסוף הנתונים עבור אופטימיזציה גלובלית של רגישות חיישנים ביולוגיים.

Protocol

1. עיצוב חלקי RBS/מקדם

1. זהה אלמנטים רגולטוריים ספציפיים לחיישנים ביולוגיים שניתן לכוונן באופן שיטתי כמשתנים רציפים בתהליך DoE. קבץ את האלמנטים הרגולטוריים הללו למודולים נפרדים. זה יכול לכלול מודולים המווסתים את הובלת האפקטור, ביטוי גורם שעתוק ו/או ביטוי גנים פלט. ודא שכל מודול מתכוונן ברמת התמלול ו/או התרגום על ידי מקדם או RBS (למשל,_{RBS trans}, P_reg, RBS_out ו-P_out, בהתאמה).
2. קבע אתרים פונקציונליים מרכזיים באזורי מקדם ו-RBS נבחרים, כגון תיבות משושה, אתרי מפעילים ורצפי RBS.
   הערה: מקדמים ו-RBS מאופיינים רבים קיימים בספרות ליצירת ספריות מ-34,35,36. עם זאת, עבור רצפי מקדם לא מאופיינים (בדרך כלל מקדם P_reg), ראה להלן לשלבים נוספים לאיתור רכיבי רצף גנטי הניתנים לכוונון אם אף אחד מהם אינו זמין בספרות.
   1. אתר אופרון אחרים המכילים את רצפי החיישנים הביולוגיים המעניינים באמצעות חיפושי BlastP של ה-aTF עם כניסת החישה הרצויה. חלץ את האזור הבין-גני של ה-aTF והגנים המווסתים שלו כדי להשיג רצפי מקדם.
      הערה: המיקום ומספר רצפי המקדם ישתנו בהתאם לסוג ה-aTF בו נעשה שימוש.
3. השתמש בכלי יישור רצפים מרובים ובתוכנות מוטיבים אחרות כדי לחפש במקדמים המשוערים מוטיבים משומרים כגון תיבות משושה ואתרי מפעילים. בהתבסס על ניתוח רצף מקדם, בחר רצפי נוקלאוטידים לאקראיות עם בסיסים מנוונים, למשל, N = כל דבר, R = כל פורין, Y = כל פירימידין וכו'.
   הערה: הקוראים מופנים לפרסום המקור לקבלת פרטים נוספים על ניתוח מקדמים ואקראיות בסיס²³.

2. הרכבה ואימות של ספריית חלקים

1. תכנן וסדר פריימרים שיגבירו באופן ספציפי את וקטור הביטוי הרצוי כדי לאפשר הכנסת גרסאות רצף מקדם/RBS במעלה הזרם של סמן פלואורסצנטי (למשל, GFP). דילול פריימרים ליופיליים עם הגעתם לריכוז סופי של 100 מיקרומטר ב-H₂O סטרילי נטול יונים.
   1. הרכיבו את תערובת תגובת ה-PCR על קרח בצינורות PCR בהתאם לפרמטרים של הפולימראז הספציפי. ודא שנעשה שימוש בפולימראז בעל נאמנות גבוהה כדי למנוע העברת מוטציות לעמוד השדרה של וקטור הביטוי. התאם את טמפרטורת החישול וזמן ההארכה בהתאם לצרכי הפריימרים ואורך מוצר ה-PCR הרצוי.
   2. נתח את מוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל וטהר את הווקטור הליניארי באמצעות טיהור PCR או ערכת מיצוי ג'ל. למדוד את ריכוז ה-DNA הווקטורי הליניארי ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
2. הזמינו את ספריות הגרסאות המתוכננות (RBS או מקדמים) להכנסה לווקטור הליניארי כאוליגונוקלאוטידים מנוונים חד-גדיליים עם זרועות הומולוגיה של פלסמיד של 30 bp הן בקצוות 5' ו-3' עבור רקומבינציה הומולוגית ממוקדת לתוך וקטור הביטוי.
   1. עם ההגעה, השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים הליופיליים לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרוליטר ב-H₂O סטרילי נטול יונים.
3. קבע נפחים עבור כמויות שוות ערך של ספריית הווקטור והגרסאות הליניאריות באמצעות מחשבונים מקוונים. ודא שהנפח הסופי של התגובה יסתכם ב-20 מיקרוליטר וכי נעשה שימוש ביחס מולרי של 2:1 של הכנסה לווקטור.
   1. הפשירו כמות גדולה של תערובת מאסטר הרכבה מסחרית של גיבסון (X2) על קרח והרכיבו את התגובה בצינור PCR בהתאם לנפחים המסופקים על ידי המחשבון הנבחר.
      הערה: ניתן להכין תערובת מאסטר של גיבסון גם במעבדה^37,38.
   2. הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר גיבסון 2x לשברי ה-DNA ודגירה למשך שעה ב-50 מעלות צלזיוס בתרמו-סייקלר או דומה.
   3. החל את כל 20 מיקרוליטר של תוצר קשירה על 200 מיקרוליטר של E. coli מוכשר בצינור מיקרוצנטריפוגה. דגירה על קרח למשך 30 דקות ואחריה הלם חום למשך 45 שניות ב-42 מעלות צלזיוס.
   4. החזירו את התאים לקרח למשך 2 דקות, הוסיפו 800 מיקרוליטר של מרק סופר אופטימלי עם מדיה לדיכוי קטבוליט (SOC) לשפופרת, ואפשרו לתאים להתאושש למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד.
   5. מורחים 50 מיקרוליטר של תאים שעברו טרנספורמציה על מספר צלחות אגר לוריא-ברטאני (LB) בגודל 60 מ"מ עם מבחר אנטיביוטיקה רלוונטי. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
4. בדוק אם יש טרנספורמציות בלוחות הנתונים, חשב את מספר המושבות המייצגות פי 3 ממגוון הספרייה התיאורטי כדי ללכוד ייצוג מספיק של כל גרסה. בצע אופטימיזציה של המכלול האיזותרמי אם מספר המושבות נמוך/אפס.
   הערה: נדרשת דגימת יתר כאשר שוקלים ספרייה אידיאלית שנוצרה מריאגנטים או סינתזה בנאמנות גבוהה. זה בדרך כלל גדול פי 3 מהגודל הכולל של הספריה. לדוגמה, 4 מיקומים של ניוון (NNNN) = 4⁴ = 256 רצפים ייחודיים. לכן, מגרדים ~ 768 מושבות.
   1. מגרדים את המספר הנדרש של מושבות לבקבוק סטרילי יחיד של 125 מ"ל המכיל 25 מ"ל של חומר LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות באינקובטור רועד (180 סל"ד), וודא שהתרבית צפופה באופן ניכר לאחר שחלף זמן זה.
   2. השתמש בערכת טיהור הכנה של פלסמיד כדי לטהר את ספריית הגרסאות מתרבית הטרנספורמציה המוכנה. קבע את ריכוז ה-DNA של ספריית הפלסמיד; 1-10 מיקרוגרם נדרש למדרגות במורד הזרם. ודא שה-DNA של הספרייה נפלט באמצעות H₂O סטרילי נטול יונים.
      הערה: צעדים מעבר לנקודה זו יתמקדו בשיבוט ואימות של ספריות וריאנטים במארח הביטוי Pseudomonas putida (P. putida); התאמת הפרוטוקול למארחים אחרים עשויה לדרוש שינוי של זמני הדגירה, טמפרטורות הדגירה ושיטות הטרנספורמציה.
5. הכן צלחת אגר LB של מארח הביטוי הרצוי P. putida על ידי פסים ממלאי גליצרול ודגירה של הצלחת ב-30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
   1. בחר מושבה אחת של P. putida מצלחת אגר LB, חסן 10 מ"ל של מדיה LB, וגדל ב-30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות, ב-180 סל"ד רועד.
   2. הכן את התאים ליכולת חשמלית על ידי צנטריפוגה של התרבית הגדלה ב-4000 x גרם ב-18 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. שפכו את הסופרנטנט, השעו מחדש ב-1 מ"ל של H₂O סטרילי נטול יונים, והעבירו את התאים המרחפים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי.
      הערה: תאי P. putida צריכים להיראות ורדרדים כאשר הם מגולגלים.
   3. צנטריפוגה את התאים למשך דקה אחת ב-4 x g במיקרו-צנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש ב-1 מ"ל של H₂O סטרילי נטול יונים. חזור על שלבי הצנטריפוגה וההשעיה מחדש 4 פעמים נוספות.
      הערה: אובדן תאים עלול להתרחש בעת שפיכת סופרנטנט במהלך הכביסה; זה נורמלי ולא אמור להשפיע על התשואות.
   4. העבירו 100 מיקרוליטר של תאים שטופים לקובטה אלקטרופורציה של 0.2 ס"מ, הוסיפו 1-10 מיקרוגרם של DNA של ספריית פלסמיד לקובט וערבבו.
   5. הפעל את האלקטרופורטור, ודא שהמתח מוגדר ל-2.5 קילו וולט עבור הקובט בגודל 0.2 ס"מ, הכנס את הקובט לתא האלקטרופורציה ודפק.
   6. הוסף 900 מיקרוליטר של מדיית SOC לקובטה, ערבב והעביר תאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי. אפשר לתאים להתאושש במשך שעתיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד.
6. מורחים 50 מיקרוליטר של תאים שעברו טרנספורמציה על צלחות פטרי מרובעות גדולות (230 מ"מ) של אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
   הערה: הקפידו על צפיפות מושבה בינונית על לוחות הספרייה (2-3 CFU/cm²). זה יהיה תלוי ביכולת החיידקים ובנפח הציפוי. אם נמוך מדי, ניתן להשתמש באופטימיזציה של הטרנספורמציה, או בסבבים עוקבים של טרנספורמציה, כדי להגדיל את מספר המושבות.
7. בחר בין 25-50 מושבות מכל לוחות הטרנספורמציה לאימות רצף. השתמש בפריימרים המגבירים על פני הרצף המנוון, מגבירים את האזור על ידי PCR ושלח אותו לריצוף סנגר כדי להעריך את מגוון הרצפים, כמו גם את הפוליקלונליות.
   הערה: אם פוליקלונליות הופכת לבעייתית, פיזור טרנספורמציות על פני קבוצות מרובות של קובטות עם 1 מיקרוגרם DNA יכול לעזור להפחית את ההשפעה הזו.

3. סינון שיבוטים של ספריית חלקים - אוטומציה

1. הגדרת מטפל בנוזלים
   1. צור 7 תוכניות על פלטפורמת טיפול בנוזלים כדי להבטיח שצעדים עתירי פיפטינג יהיו טריוויאליים.
   2. צור תוכנית "העברת נוזלים MTP", ודא שהמטפל בנוזלים מוגדר להעברת נפח מתכוונן ממאגר מוכן לתוך לוחות מיקרוטיטר ריקים (MTP) בפריסה שלו.
   3. צור תוכנית "הוסף גליצרול ל-MTP", ודא שהמטפל בנוזלים מתוכנת לפיפטה בנפח 100 מיקרוליטר של 50% גליצרול לצלחות, ודא שמהירות החלוקה והשאיפה היא 5-20 מיקרוליטר לשנייה.
      הערה: נוצרת תוכנית נפרדת כדי להסביר את הצמיגות הגבוהה יותר של 50% גליצרול, מה שעלול להוביל להיווצרות בועות, שאיפה לא שלמה או זיהום צולב של בארות שכנות עקב התזה אם לא נשלט.
   4. צור תוכנית "העברת נוזלים DWB", הגדר את המטפל בנוזלים לפיפטה לתוך גושי באר עמוקים (DWB) עם הגדרת נפח מתכווננת, וודא שהפיפטות של המטפל בנוזלים יוצאות ממאגר מלא מראש.
   5. צור תוכנית "חיסון מ-MTP מופשר", ודא שהמטפל בנוזלים מתוכנת לשאוב 5 מיקרוליטר מ-MTP מופשר המכיל את המושבות שנבחרו ולהעביר זאת ללוחות ה-DWB המתאימים בפריסה.
      הערה: שימו לב היטב לסידור MTP ו-DWB בפריסה, והבטיחו סדר הגיוני של אירועים כדי למנוע חיסון כפול בשוגג או צלחות שהוחמצו.
   6. צור תוכנית "העברה לבדיקת DWB", ודא שהמטפל בנוזלים מוגדר להעביר 5 מיקרוליטר של תאים ממיקום צלחת DWB אחד למיקום צלחת DWB אחר. לאחר מכן על התוכנית לחזור על פעולה זו 4 פעמים כאשר כל העברה מחסנת מיקום צלחת שונה, כלומר, P1 -> P2, P1 -> P3 וכו'.
      הערה: תוכנית זו מבטיחה תת-תרבות חלקה של 96 גרסאות לריכוזי בדיקה שונים.
   7. צור תוכנית "הגדרת בדיקה - השעיית PBS (DWB)", ודא שהמטפל בנוזלים מבצע כל DWB בפריסה עם 500 מיקרוליטר של PBS, התוכנית חייבת לכלול גם שלב ערבוב כדי להבטיח שכדורי התא מושעים כראוי.
   8. צור תוכנית "הגדרת בדיקה - הוספת תאים ו-PBS (MTP)", ודא שתוכנית זו כוללת שלב להעברת 200 מיקרוליטר של התאים המרחפים ממיקום לוחית DWB אחד למצב MTP ריק.
      הערה: עבור כל השלבים של 3.1, פריסות התכנות והמטפל בנוזלים ישתנו; על החוקרים לעיין במדריכים של מטפלים בנוזלים מסחריים ספציפיים כדי לשנות את התוכניות לעיל כך שיתאימו לקיבולת ולצרכים של הניסוי.
2. תרבות וברקוד של ספריות שונות
   1. קבע את גודל הספרייה התיאורטית וחשב את מספר הגרסאות הבודדות כדי להבטיח כיסוי ספרייה > 95% (מומלץ גודל ספרייה פי 3) (ראה הערה לשלב 2.5.).
   2. חשב את הנפח הנדרש של מדיה LB בתוספת אנטיביוטיקה בהתאם למספר המושבות שיש לסנן (200 מיקרוליטר למושבה + 10% מעל).
   3. פתח את תוכנת המטפל בנוזלים ולחץ על הפעל ליד תוכנית MTP Liquid Transfer (ראה קובץ משלים 1). הנח את המדיה המוכנה במיקום המאגר המתאים ומלא את הסיפון ב-MTPs ריקים בהתאם לפריסה. הגדר את התוכנית להוציא 200 מיקרוליטר של מדיה. לחץ על אישור כדי לאשר את הפעלת התוכנית.
      הערה: ודא תמיד שהמאגרים והטיפים מסופקים כראוי לפלטפורמת המטפל בנוזלים לפני אישור תחילת התוכנית כדי למנוע הפרעה.
   4. חזור על התוכנית כמה פעמים שנדרש, אטום את ה-MTPs המלאים בקרום נושם כדי לשמור על סטריליות.
   5. העבירו לוחות MTP מלאים לפלטפורמת בורר מושבות ופתחו, העבירו גם את הלוחות המרובעים של P. putida שעברו טרנספורמציה עם DNA של ספריית וריאנט פלסמיד לפלטפורמת בורר המושבות. השתמש בבורר המושבות כדי לחסן כל אחת מבארות לוחות המיקרוטיטר הממולאות מראש במושבה אחת מלוחות הספרייה הטרנספורמטיביים.
      הערה: ודא שהעומק המינימלי של אגר הוא 25 מ"ל כדי למנוע נזק לראש בורר המושבה.
   6. אטמו מחדש והעבירו את הצלחות המחוסנות לחממה לא מקוונת רועדת ב-30 מעלות צלזיוס (800 סל"ד), תוך הבטחת בקרת לחות ב-75% כדי למנוע אידוי תרבית. השאירו אותם לגדול במשך 16 שעות.
      הערה: לאחר הדגירה, התרביות ייראו צפופות לעין, אם זה לא המקרה, בדוק שוב את דרישות המדיה והאנטיביוטיקה.
   7. לאחר 16 שעות של צמיחה, החזירו את הצלחות הגדלות לפלטפורמת המטפל בנוזלים ופתחו את האטם. לחץ על הפעל ליד הוסף גליצרול לפרוטוקול MTP (ראה משלים file 1), ודא שפריסת הצלחת על המסך תואמת לזו של תחנת העגינה של המטפל בנוזלים. לחץ על אישור ואפשר לפרוטוקול לפעול.
   8. בסיום, אטמו שוב את הצלחות וערבבו בקצרה בחממת טלטול לא מקוונת (800 סל"ד) למשך 5 דקות לפני ברקוד ואחסון ב-80 מעלות צלזיוס.
   9. חזור על שלבים 3.2.7. ו-3.2.8. עד שלכל MTPs נוספו גליצרול, עורבבו, ברקודים ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה כדי להתכונן לשלבי האפיון שלהלן. יתר על כן, ניתן לתכנן חסימת הלוחות לריצות ניסיוניות שונות כך שתתאים לקיבולת של פלטפורמת המטפל בנוזלים בשימוש או כדי להפחית את עומס העבודה בישיבה אחת.
3. סינון ספריית וריאנטים
   1. חשב את הנפח הנדרש של מדיה בתוספת אנטיביוטיקה עבור מספר ה-DWB שיש למלא (~495 מיקרוליטר לבאר + 10% מעל).
   2. לחץ על הפעל ליד תוכנית העברת הנוזלים DWB (ראה קובץ משלים 1), ודא שהמדיה נוספה למאגר הנכון בפריסת התוכנית. ודא ש-DWB ריק מתווסף למיקומי הפריסה המתאימים וכי אספקה מספקת של טיפים זמינה. הגדר את התוכנית להוציא 495 מיקרוליטר של מדיה. כשתהיה מוכן, לחץ על אישור כדי להפעיל את התוכנית.
   3. אטום את ה-DWB הממולא עם ממברנה נושמת והעביר לאחסון זמני ב-4 מעלות צלזיוס, חזור על שלב 3.3.2. עד שהמספר הנדרש של DWB ימולא במדיה.
   4. לחץ על הפעל ליד תוכנית Incoculate from Thawed MTP (ראה קובץ משלים 1), ודא ש-MTP cryostocks ו-DWB מלאים מועברים לפלטפורמת המטפל בנוזלים בהתאם לפריסה. ודא שמסופקת אספקה מספקת של טיפים. לחץ על אישור כדי לאתחל את התוכנית.
      הערה: הפשירו צלחות מלאי על קרח למשך 30 דקות, רק כאשר הוכנו תוכניות וצלחות דרישות מוקדמות כדי להבטיח כדאיות אופטימלית של תאים.
   5. בסיום התוכנית, אטמו DWBs מחוסנים למשך הלילה עם ממברנה נושמת, והעבירו לחממת שייקר צלחות לא מקוונת עם בקרת לחות של 75% ואפשרו לגדול למשך הלילה למשך 16 שעות ב-30 מעלות צלזיוס (180 סל"ד).
   6. אטום מחדש, ערבב והחזיר MTPs cryostock למקפיא -80 מעלות צלזיוס לפי שלב 3.2.8.
   7. חזור על שלבים 3.3.4. עד 3.3.6. כמה פעמים נדרשות עד שהמספר הנדרש של DWBs למשך הלילה חוסנו והועברו לאינקובטור.
      הערה: מומלץ לתעד מתי כל אצווה של צלחות מתווספת לחממה כדי לקחת בחשבון את פער הזמן בין ריצות במהלך החיסון ולהשתמש באותו סדר לשלבים במורד הזרם.
   8. חשב את הנפח הנדרש של מדיה בתוספת ריכוזים שונים של אפקטור ואנטיביוטיקה בהתאם למספר ה-DWB ללילה שיש להקרין (495 מיקרוליטר לבאר + 10% מעל). כל ריכוז אפקטור דורש מאגר נפרד משלו במטפל בנוזלים.
      הערה: לאפיון ראשוני, כגון הקרנת הפעלה/כיבוי, מספיקים שני ריכוזי אפקטור (למשל, ריכוז סופי של 0 ו-1000 מיקרומטר). על מנת ליצור נתוני מינון-תגובה לאפיון חזק יותר, טווח זה גדל למינימום של ארבעה ריכוזים (למשל, 0, 1, 25 ו-1000 מיקרומטר ריכוז סופי). מערכות מדכא אינן דורשות תוספת של אפקטור כדי לוודא את התפקוד, בעוד שעבור מפעילים, כמו המערכת המתוארת, נדרש אפקטור.
   9. לחץ על הפעל ליד תוכנית העברת הנוזלים DWB (ראה קובץ משלים 1). ודא שמאגרים המכילים מדיה בתוספת אפקטור נמצאים במיקומים הנכונים, בהתאם לפריסה. הוסף DWBs ריקים לפלטפורמת המטפל בנוזלים. ודא שיש מספיק טיפים זמינים לפלטפורמה. כשתהיה מוכן, לחץ על אישור כדי להפעיל את הפרוטוקול ליצירת קובצי DWB של הבדיקה.
   10. לאחר המילוי, אטמו את ה-DWBs של הבדיקה עם קרום נושם והעבירו לאחסון זמני ב-4 מעלות צלזיוס, ומלאו מחדש את פלטפורמת המטפל בנוזלים בצלחות ריקות יותר.
   11. חזור על שלבים 3.3.9 ו- 3.3.10 כמה פעמים שצריך עד למילוי המספר הנדרש של DWB.
   12. לחץ על הפעל ליד התוכנית העברה לבדיקה DWB (ראה קובץ משלים 1). ודא שקובצי DWB לבדיקה לא אטומים המכילים מדיה בתוספת אפקטור מתווספים למיקומים הנכונים בפריסת המטפל בנוזלים.
   13. העבירו ופתחו את ה-DWBs הלילה המכילים P. putida שחוסנו בשלב 3.3.4. לפלטפורמת המטפל בנוזלים, שוב מבטיח שהפריסה נצמדת בקפדנות. ודא שיש מספיק טיפים זמינים לפלטפורמה. כשתהיה מוכן, לחץ על אישור כדי להפעיל את הפרוטוקול.
       הערה: העברה וסידור של תת-תרבויות לתוך לוחות הבדיקה יצטרכו להיעשות בדרך כלל בקבוצות בהתאם לגודל פלטפורמת המטפל בנוזלים.
   14. לאחר סיום התוכנית, יש להחיל אטמים ולהעביר את לוחות הבדיקה לחממה לא מקוונת ב-30 מעלות צלזיוס, עם 75% לחות למשך 16 שעות (180 סל"ד), נפח הבדיקה הסופי יהיה 500 מיקרוליטר בשלב זה.
   15. השליכו את ה-DWB למשך הלילה לאחר החיסון וחזרו על שלבים 3.3.12 עד 3.3.14 כנדרש עד שכל הבדיקות הנדרשות DWB חוסנו וגדלים בחממות לא מקוונות.
   16. מוציאים DWBs מהחממה, מעבירים לצנטריפוגה ותאי גלולה בטמפרטורה של 4000 x גרם, 18 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שפכו את הסופרנטנט והניחו את ה-DWB הצנטריפוגה על פלטפורמת המטפל בנוזלים.
       הערה: נפחי כדורי התאים עשויים להשתנות בהתאם לריכוז האפקטור או לגרסאות, בנוסף כדורים מסוימים עשויים להיראות פלואורסצנטיים יותר לעין מאחרים.
   17. חשב את הנפח של 1x PBS הנדרש על סמך מספר ה-DWB שיש להקרין (500 מיקרוליטר לבאר + 10% מעל).
   18. לחץ על הפעל לצד תוכנית הגדרת הבדיקה - השעיית PBS (DWB) (ראה קובץ משלים 1), הגדר את נפח החלוקה ל-500 מיקרוליטר, ודא ש-1x PBS נוסף למאגר הנכון, ולאחר מכן סדר את הלוחות הצנטריפוגים בהתאם לפריסת המטפל בנוזלים. ודא שיש מספיק טיפים זמינים. לחץ על אישור כדי להפעיל את התוכנית.
       הערה: שטיפת התאים מתבצעת כדי להסיר אמצעי גידול שיוריים, שעלולים לייצר אוטופלואורסצנטיות מסוימת.
   19. אטום מחדש והסר צלחות תלויות מהמטפל בנוזלים. ודא שהכדורים מושעים לחלוטין על ידי בדיקת הצד התחתון של הצלחת. המשך להעביר DWB עם כדורים למטפל בנוזלים וחזור על שלב 3.3.18. עד שכל הלוחות יושעו מחדש.
   20. לחץ על הפעל לצד התוכנית הגדרת בדיקה - הוספת תאים ו-PBS (MTP) (ראה קובץ משלים 1). העבר את קובצי ה-DWB המושעיים משלב 3.3.18. לתוך המטפל בנוזלים בהתאם לפריסה המוצעת. העבר MTPs ריקים למטפל בנוזלים בהתאם לפריסה. ודא שנפח החלוקה מוגדר ל-200 מיקרוליטר וכי יש מספיק טיפים זמינים. לחץ על אישור כדי להפעיל את התוכנית.
   21. העבירו MTPs מלאים (נפח בדיקה סופי 200 מיקרוליטר) לקורא צלחות רב-מצבי לא מקוון, מודדים פלואורסצנטיות יחסית באורך גל פליטת עירור מתאים (למשל, sfGFP lEx/lEm = 488/520) ו-OD₆₀₀ עבור כל באר בצלחת.
       הערה: הגדרות אורך הגל של פליטת עירור יהיו תלויות בבחירת הגן הפלואורסצנטי המקודד בווקטור הביטוי. ודא שהגדרות הרווח בקורא הלוחות עקביות לאורך כל הדרך ומאפשרות הבחנה בין גרסאות נמוכות וגבוהות מבלי להרוות את הגלאי.
   22. חזור על שלבים 3.3.20. ו-3.3.21. עד שכל ה-DWPs של הבדיקה הועברו ל-MTPs ונמדדו.

4. עיבוד נתונים/טרנספורמציה ודירוג דיפרנציאלי

1. בצע נורמליזציה של הנתונים שנאספו על ידי חלוקת הקרינה המוקלטת של GFP (RFU) במדידת OD₆₀₀ המוקלטת עבור כל וריאנט עבור כל אחד מריכוזי האפקטור המוערכים (0 ו-1000 מיקרומטר).
   הערה: ניתן לתכנת את רוב קוראי הלוחות לנרמל אוטומטית את הקרינה על ידי OD₆₀₀ במהלך איסוף הנתונים.
2. חשב ON/OFF כדי לקבל את הטווח הדינמי של כל וריאנט על ידי חלוקת ה-RFU/OD₆₀₀ ב-1000 μM (ON) ב-RFU/OD₆₀₀ ב-0 μM (OFF). התווה את כל ערכי ההפעלה/כיבוי של הגרסאות כעלילת פיזור באמצעות ההפעלה/כיבוי של מבנה החיישן הביולוגי הבסיסי כדי לקבוע גרסאות המציגות פעילות מעל רמת הבסיס.
   הערה: ההפעלה/כיבוי של מבנה החיישן הביולוגי הראשוני המשמש בפרוטוקול נקבע פי 3.6 בהתבסס על אפיון ראשוני של רצף²³ מסוג פראי.
3. לאפיון מעמיק, התאם את נתוני תגובת המינון באמצעות פונקציית Hill עם שיפוע משתנה כדי לחלץ ערכי EC50 ו/או שיפוע Hill באמצעות תוכנה אנליטית.
   הערה: כדי להעריך את הרגישות ואת EC₅₀, אסוף לפחות ארבע נקודות נתונים המשתרעות על פני הטווח שבו התגובה עוברת מהפעלה נמוכה לגבוהה, בדרך כלל החלק התלול ביותר של העקומה. בעוד שיותר נקודות נתונים משפרות את הרזולוציה והדיוק, ארבע נקודות מספיקות להערכת דירוג הרגישות.
4. מתוך מערך הגרסאות המלא, בחר תת-קבוצה של גרסאות (למשל, N = 100) המבטיח כיסוי מאוזן של הדירוגים הרצויים, במקרה זה EC₅₀. לשם כך, זהה וריאנטים המשתרעים על טווח רחב ב-EC₅₀, וודא שגרסאות בדירוג גבוה ובדירוג נמוך מיוצגות באופן יחסי. להסיר גרסאות מיותרות (למשל, כאלה עם דירוגים דומים והשפעה מינימלית על כיסוי ההפצה).
5. לאחר בחירת ספריית הדוגמאות של הגרסאות הסופיות (למשל, N = 100), שנה את הנתונים באמצעות משוואת הטרנספורמציה הליניארית-לוגריתמית (lin-log) הבאה (Eq.1).
   Eq.1:
   
   איפה
   
   
   
6. עבור ערכי EC50, הקצה +1 עבור הגבוה ביותר (הכי פחות רגיש) ו-1 עבור הנמוך ביותר (הרגיש ביותר). ממוצע גיאומטרי של 0 מתאים לרמות ביטוי ביניים.

5. יצירת עיצוב סינון סופי / DoE

1. כדי לחקור באופן שיטתי את מרחב תכנון החיישנים הביולוגיים, השתמש בעיצוב סינון סופי (DSD). עיצוב זה מועדף בשל יכולתו לחקור את חלל העיצוב ביעילות תוך התאמת המחקר לצרכי המערכת הספציפיים.
2. לחץ על קטגוריית DOE ולאחר מכן בחר בלחצן עיצוב סינון סופי בתוכנה הסטטיסטית (ראה קובץ משלים 2).
3. הגדר את גורמי הניסוי (למשל,_{RBS trans} , P_reg , RBS_out ו-P_out) כמשתנים רציפים על ידי לחיצה על כפתור רציף ומתן שמות, תוך הקפדה על הגדרת הערכים ל-+1 ו-1 (ראה קובץ משלים 3).
4. הגדר את התגובות הרצויות (למשל, ON, OFF, ON/OFF, EC50, Slope) על ידי לחיצה על כפתור הוסף תגובה והתאמה אישית של השם (ראה קובץ משלים 4).
   הערה: הגדר את מטרת התגובה על ידי לחיצה על התפריט הנפתח של המטרה, בחר ללא או הגדל בהתאם למטרת העיצוב (לדוגמה, ניתוח לעומת אופטימיזציה).
5. לאחר הגדרת הגורמים והתגובות, לחץ על המשך כדי לפתוח את לשונית אפשרויות העיצוב. בחר No Blocks Required ולאחר מכן לחץ על הלחצן Make design (ראה קובץ משלים 5).
   הערה: ניתן להוסיף בלוקים כדי לבודד את העיצוב מגורמים מטרידים (גורמים שאינם בעלי עניין עיקרי). זה יכול להוסיף מורכבות לניסויים; עם זאת, הוא משמש לפי שיקול דעתו של החוקר.
6. התוכנה תייצר טבלת עיצוב ניסיוני המתארת את השילובים הספציפיים של הגורמים שייבדקו. החלקים הגנטיים מספריות הלין-לוג המתאימות ישמשו ליצירת 17 המבנים המתאימים. שמור וייצא את טבלת העיצוב על ידי לחיצה על צור טבלה (ראה קובץ משלים 6).

6. חזור על שלב 2 - תכנון והרכבה של עיצובים גנטיים מבוססי DoE

1. התחל לבנות את הפלסמידים הרב-משתנים על פי תוכנית תכנון הסינון הסופי (DSD).
   1. זהה משתנה ראשוני (למשל, מקדם, RBS וכו'). תכנן וסדר פריימרים כדי להפוך את וקטור הביטוי לליניארי, ודא שהפריימרים מאגפים את אזור המשתנה הממוקד, ומבטיחים הסרה של כל רכיבי הרצף הקיימים.
   2. תכנן וסדר פריימרים שיגבירו באופן ספציפי רצפי וריאנטים המתאימים לרמות הספרייה המוגדרות מראש (למשל, -1, 0, +1) עבור כל צומת רגולטורי (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). ודא שכל פריימר כולל זרועות הומולוגיה של 30 bp המשלימות לאתר הכנסת וקטור הביטוי.
   3. טהר את ה-DNA של הפלסמיד מתרבית ה-cryo-stock הרלוונטית המתאימה לרמות הספרייה +1, 0 ו-1 עבור המשתנה המזוהה באמצעות miniprep.
2. הגדר את תגובות ה-PCR עבור וקטור הביטוי הליניארי ושברי הספרייה על קרח וקבע את ריכוז המוצר כמתואר בשלבים 2.1.1 ו-2.1.2.
   1. חזור על שלבים 2.3 עד 2.4 של הפרוטוקול כדי לבצע הרכבת גיבסון של וקטור הביטוי הליניארי וקטעי הספרייה. ודא שנעשה שימוש בצלחות פטרי בגודל סטנדרטי בשלב זה.
   2. מושבות מסך המשתמשות ברצף Sanger כדי לאשר את הרכבת המבנה הנכונה עבור כל אחד מעיצובי ה-DSD המוצעים, ולאחר מכן המשך לטרנספורמציה של P. putida (שלבים 2.5 - 2.6).
   3. באמצעות PCR, אשר את נוכחותו של הפלסמיד הנכון במושבות שעברו טרנספורמציה. בחרו טרנספורמציות מאושרות וחסנו אותם ל-10 מ"ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה לגידול לילה ב-30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות (180 סל"ד). צור קריוסטוקים (25% גליצרול סופי) ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

7. סינון ורציונליזציה של נתונים

1. ממלאי קריו, פס ה- P. putida השתנה עם מבני העיצוב הרלוונטיים של DSD על אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה, דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות למשך הלילה לגידול מושבות.
   1. בחר שלוש מושבות בודדות מכל צלחת המתאימות לעיצובים ולתרבית ה-DSD המוצעים למשך הלילה ב-10 מ"ל של מדיה LB בתוספת אנטיביוטיקה ב-30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
   2. למחרת, טען DWB עם שיפוע ריכוז של אפקטור שנע בין 0 מ"מ ל-1 מ"מ (ריכוז סופי) לשורה לנפח כולל של 50 מיקרוליטר לבאר. יש לדלל את תרביות הלילה 1/100 ל-LB טרי ולהוסיף 450 מיקרוליטר של תרבית ל-DWB על פני שיפוע הריכוז.
   3. חזור באופן ידני על שלבים 3.3.14 ו- 3.3.16 כדי להשיג קובצי DWB מגודלים, ולאחר מכן דלג אל שלבים 3.3.18 ו- 3.3.20 ובצע אותם באופן ידני. ו-3.3.21. כדי להשיג נתוני RFU/OD עבור כל גרסה מוצעת.
2. התאם את נתוני תגובת המינון (RFU/OD) באמצעות פונקציית Hill (עם שיפוע משתנה), תוך חילוץ פרמטרים (גורמים) מתאימים לאופטימיזציה, כגון EC₅₀, שיפוע גבעה, טווח דינמי או טווח פעולתי. הפוך את הנתונים המתקבלים ל-log10 והזן את הפרמטרים שחולצו לטבלת ה-DSD עבור כל אחד מהעיצובים שנבדקו.
   1. בצע ניתוח סינון דו-מפלסי כדי לזהות גורמים משמעותיים המשפיעים על ביצועי החיישן הביולוגי. השתמש בניתוח יחס t וחצי נורמלי של Lenth^{23, 30} כדי לקבוע איזה גורם חורג מההתפלגות הצפויה ולשמור במודל. שמור על השפעת התורשה, וודא שכל גורם משמעותי רק באינטראקציה נכלל גם בנפרד.
   2. בצע מודלים סטנדרטיים של רגרסיה מינימלית (SLSR)³⁰ עבור כל משתנה תגובה בנפרד, תוך שילוב רק הגורמים המשמעותיים שזוהו. הערך את אבחון מודל הרגרסיה, כולל עלילות שיוריות, מבחני חוסר התאמה וערכי R², כדי להבטיח התאמת נתונים נכונה.
   3. השתמש בפרופיל תגובה כדי לקבוע הגדרות גורם אופטימלי על סמך מאפייני החיישן הביולוגי הרצויים. הגדר פונקציות מטרה עבור כל תגובה (למשל, מקסום הטווח הדינמי תוך מזעור EC₅₀) כדי ליצור הגדרות גורם המשיגות את האיזון הטוב ביותר בכל התגובות תוך התחשבות באילוצי המערכת ופשרות.
3. חזור לספריות הגרסאות ובנה את החיישן הביולוגי האופטימלי בהתאם למודולים שהוצעו על ידי פרופיל התגובה, לפי שלבים 6.1 עד 6.2 של הפרוטוקול. אמת את הביצועים של המבנה האופטימלי באמצעות אפיון מינון-תגובה.

Results

בתחילה, יש לבחור מודולים הנחשבים כמשפיעים על תפקוד החיישן הביולוגי לצורך וריאציה; זה יכול לכלול ויסות של חלבוני הובלה, שיכולים להשפיע על הריכוז התוך-תאי של ליגנדים ובכך על פלט החיישן הביולוגי, אך כולל גם רמות שעתוק ותרגום יחסיות של ה-aTF עצמו, כמו גם המדווח הפלואורסצנטי או גן הפלט (איור 1). איור 2 מדגים זרימת עבודה טיפוסית המשמשת בפיתוח ניסוי מבוסס DoE לאופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים; החל מארגון אלמנטים רגולטוריים למודולים נפרדים הניתנים למניפולציה באמצעות ביולוגיה סינתטית באמצעות שינויים ברמת הרצף, במיוחד באתרי מפעילים, משושים או RBS (איור 2A). ככזה, השלב הבא בזרימת העבודה של DoE הוא אקראיות של אתרי רצף על מנת ליצור ספריות של וריאנטים (איור 2B). יש לשקול בזהירות את מידת האקראיות, מכיוון שמספר המושבות שנבדקו צריך להתאים למידת האקראיות 4^N, כאשר N שווה למספר מיקומי הבסיס האקראיים. התייחסות לכל מקדם ייחודי או רצף RBS כמשתנה קטגורי ייחודי ב-DoE תגדיל את מספר המבנים הנדרשים לרמות בלתי אפשריות מבחינה ניסויית, שכן המרה כזו למשתנים רציפים באמצעות אפיון הספריות היא צעד טריאז' הכרחי כדי לאמוד את טווח הפונקציות הנרכשות באמצעות אקראיות ולהגדיר את העליון, האמצעי, וגבולות תחתונים של פונקציונליות. זה מושג לראשונה באמצעות ניתוח תפוקת הספריות כמדד לחוזק ה-RBS או וריאנט המקדם באמצעות גן מדווח (איור 2C). טרנספורמציה של לין-לוג מתבצעת, כפי שמוצג, כדי להפריד את המשתנים הרציפים לרמות שיכולות לשמש את משרד האנרגיה כדי לחקור שילובים שונים ולפתח מודל המתאר את ההשפעות של גרסאות אלה. לאחר מכן מיושם עיצוב סינון באמצעות 3 רמות המתארות את טווח הפעילות של כל גורם באופן קומבינטורי (איור 2D). באמצעות הרכבה ובדיקה של העיצובים המוצעים, מרחב הניסוי נחקר ביעילות ונחשפים האינטראקציות בין הגורמים. ניתוח סטטיסטי של הנתונים המתקבלים משמש כדי לקבוע לאיזה שילוב של גורמים יש את ההשפעה המשמעותית ביותר על תפוקת החיישן הביולוגי, ו-SLSR משמש לחיזוי התנהגות המערכת תחת קריטריונים שונים, מה שמקל על אופטימיזציה של החיישן הביולוגי לקראת תוצאות ספציפיות כגון טווח דינמי מוגבר או רגישות (איור 2D).

איור 3 מדגים את ההרכבה וההקרנה של ספריית מקדמים המוסדרת על ידי aTF. הרכבה איזותרמית באמצעות אוליגונוקלאוטיד מנוון בוצעה ליצירת ספרייה מקודדת פלסמיד, לפיה כל פלסמיד מחולק באופן אקראי באופן ייחודי במיקומים ספציפיים. מידת הגיוון בספריות תקבע בסופו של דבר את מספר המושבות שיסוננו, כאשר ספריות תיאורטיות גדולות יותר יפיקו תועלת רבה מהאוטומציה. ניתוח רצף מקדם של אופרון הומולוגי ל-TphR סיפק מפה של שימור בסיסים ששימשה למידע על מיקומי הקצאה אקראיים, במיוחד בסיסים שהראו מידה מסוימת של שונות ולכן עשויים לווסת את הפעילות מבלי להיות חיוניים לחלוטין²³. שלושה בסיסים בכל אחת מתיבות המשושה -35 ו-10 היו מיועדים לאקראיות מלאה בנוסף לשישה בסיסים באתר המפעיל (איור 3א), וכתוצאה מכך ספריית מקדמים תיאורטית של ~500,000. ספריית הפלסמיד שימשה לאחר מכן לשינוי זן המארח. בשלב זה, יעילות טרנספורמציה טובה היא חיונית על מנת להשיג כיסוי ספרייה מספיק עם גישות נפוצות לפתרון בעיות המוצגות ב איור 3ב. אופטימיזציה של ריכוזי ה-DNA, שיטת הטרנספורמציה ועיצוב השיבוט יכולים לשפר משמעותית את תפוקות הטרנספורמציה. איור 3ג מדגים זרימת עבודה טיפוסית עם השגת טרנספורמציה, יש לגדל תחילה מושבות בודדות המתאימות לגרסאות ייחודיות במדיה לפני שניתן להתחיל בעבודת אפיון כלשהי. על מנת לכסות את גודל הספרייה התיאורטית, יהיה צורך לבחור מספר עצום של גרסאות ולסדר אותן בלוחות. מינוף מערכות אוטומטיות כמו מטפלים בנוזלים וקוטפי מושבות יכול לזלזל בצעד עתיר העבודה הזה. שלב 1 של איור 3ג ממחיש את העברת אמצעי הגידול ל-MTPs שנטענו ידנית לרציף המטפל בנוזלים, ולאחר מכן חיסון אוטומטי על ידי קוטף מושבות. שלבים מסוימים, כגון איטום הלוחות והעברתם לחממות לא מקוונות, הם ידניים אך ניתן גם להפוך לאוטומטיים במידת הצורך. בעקבות צמיחת התרביות, ניתן להשתמש במטפלים בנוזלים גם ליצירת מלאי קריו באמצעות תוספת גליצרול, כפי שמוצג ב איור 3ג. בשלב זה, ברקוד של הלוחות יבטיח שכל גרסה שנבחרה תקושר למיקום ספציפי של צלחת ובאר, מה שיאפשר התייחסות קלה לאפיון נוסף במורד הזרם. אחד היתרונות העיקריים של גישות אוטומטיות, מלבד הפחתת העבודה, הוא הפחתת טעויות אנוש, כאשר טעויות בשלב הכנת הספרייה נוטות פחות להתקדם. שלב 2 של איור 3ג ממחיש את שלב האפיון האוטומטי של הכנת הספרייה. זה מתחיל via מילוי DWBs במדיה באמצעות פלטפורמת המטפל בנוזלים, ולאחר מכן חיסון באמצעות מלאי הקריו הברקוד. אוטומציה בשלב זה מבטיחה שוב שגיאות פיפטינג ועבודה ממוזערות. לאחר מכן הלוחות נאטמים ומועברים ידנית לחממות לא מקוונות לצמיחה, ובשלב זה ניתן להתחיל בסידור של תרכובות אפקטור ללוחות באר עמוקים טריים. למטרות מסך ראשוני של ספריות חלקים, מסך הפעלה/כיבוי פשוט יכול להיות רצוי מכיוון שניתן להשתמש בו כדי לסנן מראש גרסאות לא פונקציונליות המציגות פעילות שווה או גרועה יותר ממבנה הבסיס ולהעשיר את מאגר הגרסאות עבור אלה המציגים פעילות משופרת. יש לכך יתרון נוסף של הפחתת עלויות החומר של טיפים וצלחות שיכולים להפוך לבלתי אפשריים בפרוטוקולי סינון של ספריות גדולות. עם זאת, כאשר נדרשת אופטימיזציה של מדדי ביצועים מורכבים יותר של חיישנים ביולוגיים (למשל, EC₅₀), יידרשו ריכוזי אפקטור נוספים. לאחר גידול התרביות, הצלחות מוחזרות לפלטפורמת המטפל בנוזלים, שמתחילה לחסן את הצלחות המכילות תרכובות אפקטור לפני שהן מוחזרות ידנית לחממה פעם נוספת למשך הבדיקה. איור תלת מימד מדגים את שלב האוטומציה הסופי לפני איסוף הנתונים. לאחר התקופה שחלפה לצמיחה והפעלת חיישן ביולוגי, הלוחות מוסרים מהחממה הלא מקוונת ומוחזרים לפלטפורמת המטפל בנוזלים. כדי להסיר אמצעי גידול שיורי, שעלולים להפריע לאיסוף נתוני הקרינה, יש צורך בצנטריפוגה, הסרת סופרנטנט ושטיפת התאים עם PBS 1x. השימוש במטפלים בנוזלים יכול שוב לזלזל בתהליך זה, עם השעיה אוטומטית של תרביות המאפשרת עיבוד מהיר של הלוחות, כולל העברת התאים השטופים ל-MTPs בפורמט 96 בארות להקרנה. איסוף נתונים יכול להתבצע בצורה ידנית או אוטומטית, כאשר חלק מהקוראים כוללים ערימות צלחות שיכולות להתממשק עם מטפלים בנוזלים כדי להפוך את תהליך איסוף הנתונים לאוטומטי עוד יותר. על ידי השוואת היחס בין הפעלת חיישן ביולוגי בנוכחות אפקטור (ON) להיעדרו (OFF), הוערכו 5,000 גרסאות באמצעות מידת הפעלת חיישן ביולוגי (שינוי קיפול) כדי לקבוע את תפקוד החיישן הביולוגי; רק הגרסאות עם פעילות מעל זו של מבנה הבסיס (פי 3.6) נלקחו קדימה לאפיון נוסף כפי שמצוין על ידי האזור המוצלל באדום-ורוד של חלקת הפיזור (איור תלת מימד). בהתבסס על מיקומי הצלחת והבאר של מאגר הגרסאות המועשר, ניתן לבצע אפיון חזק באמצעות שכפולים ביולוגיים או ריכוזי אפקטורים שונים על ידי התייחסות חזרה ללוחות ה-cryo-stock המקוריים הברקודים שנוצרו בשלב 1 של זרימת העבודה.

איור 4 מדגים את סינון הגרסאות הטריאז'יות מהסינון הראשוני של הספרייה במטרה לפתח ספריית מקדם לאופטימיזציה של הרגישות. באמצעות הנתונים מ-5,000 הגרסאות שנבדקו בתהליך העבודה הקודם, מאגר של 226 גרסאות ממסך ההפעלה/כיבוי הראשוני, שנקבע כפעיל יותר מהרצף ההורי, אופיינו ודורגו על פי רגישותן, על מנת לשמש כרמות שסביבן ניתן לתכנן DSD. כצעד ראשון יש להמיר את המשתנים הקטגוריים, במקרה זה הגרסאות העליונות_P , למשתנים רציפים המשתרעים על טווח רגישות רחב. כדי לסנן רגישות, נדרשות עקומות תגובת מינון כדי לקבל נתוני EC₅₀ מפונקציית Hill משורטטת; זה מגדיל את עבודת הציפוי באופן דרמטי ומתאים היטב לאוטומציה באמצעות מטפלים בנוזלים כדי לפשט את תהליך הגדרת הבדיקה והסינון כפי שמוצג באיור 4A. בעקבות זרימת העבודה שנקבעה בשלב 2 של איור 3C, נעשה שימוש בברקודי צלחות ומיקומי בארות המתאימים למאגר הגרסאות המועשר לחיסון DWBs מלאים במצעי גדילה ואנטיביוטיקה. כדי לשפר את החוסן הניסיוני, הווריאנטים הוקרנו במשולש ביולוגי. לאחר העברת הצלחות לחממה הלא מקוונת לגידול, DWBs טריים מולאו באמצעי גידול בתוספת אפקטור של 0, 1, 25 ו-1000 מיקרומטר באמצעות מטפלי הנוזלים כדי להפחית את העבודה. כדי להפחית את מספר הלוחות הנדרשים לבדיקה, נבחר טווח ריכוז המקיף את החלק התחתון, האמצעי והחלק העליון של העקומה, כאשר ריכוזי נקודת האמצע חושפים את הרגישויות היחסיות של כל וריאנט כפי שמוצג באיור 4A. לאחר חיסון מאגרי הגרסאות בכל ריכוז אפקטור וניתוח הקרינה ו-OD₆₀₀, שורטטו עקומות תגובת מינון, עם ניתוח רגרסיה לא ליניארית ששימש לקביעת EC₅₀. בשלב זה, נוצרה ספרייה גולמית של כל גרסה עם ערך EC₅₀ ייחודי, כאשר 100 הגרסאות החזקות ביותר נלקחו קדימה כפי שמוצג באיור 4B על מנת להקטין עוד יותר את גודל הספרייה. עם זאת, לפני שניתן יהיה להשתמש בספרייה זו ב-DoE, יש ליצור המרה של הגרסאות הייחודיות לספרייה מדורגת, המייצגת את טווח הרגישות הכלול בתוכה. זה הושג על ידי ביצוע טרנספורמציה של לין-לוג של הנתונים, המדרגת ומשנה את קנה המידה של הנתונים כך שכל וריאנט מדורג מהרגיש ביותר (-1) לפחות רגיש (+1), כמו גם הגדרת ערך נקודת אמצע (0), המייצג את הממוצע הגיאומטרי של מערך הנתונים איור 4C. הטרנספורמציה של הנתונים הגולמיים ייצרה את העלילה הכחולה המוצגת באיור 4D, שממנה נלקחו רצפי P_{נפרדים המתאימים} ל-+1, 0 ו-1 לעיצוב הסינון הסופי כרמות גורם_{P out} .

איור 5 מדגים את זרימת העבודה המלאה לאחר יצירת ספרייה מיצירת DSD ועד למידול ואופטימיזציה גלובלית של חיישן ביולוגי המבוסס על למידה בסיוע DoE. איור 5א כולל פירוט של חיישן ביולוגי טיפוסי ל-3 מודולים עם צמתי ייצוב 1 (מודולי הובלה ומייצב) או 2 (מודול יציאה). בעקבות הדוגמה של איור 4ספריות RBS או מקדמים יפותחו, ורמות הנעות בין +1, 0 ו-1 ייבחרו כדי להקיף את השונות הגדולה ביותר של כל גורם., גודל הספריות המוקרנות יקבע בדרך כלל את מספר הניסויים הנדרשים כדי לחקור את מרחב העיצוב במלואו, לדוגמה, אם כל ספרייה הייתה בגודל 22, זה היה שווה ערך ל-22⁴ (234,256) צירופים. משרד האנרגיה שואף לפשט את עומס העבודה הניסיוני על ידי הפחתת מספר השילובים באמצעות עיצובי סינון מובנים. בעוד שמתודולוגיות רבות אפשריות, DSD אידיאלי לפיתוח חיישנים ביולוגיים מכיוון שהוא מאפשר זיהוי של גורמים עיקריים ואינטראקציות דו-גורמיות תוך הימנעות מהשפעות מסדר שני מבלבלות. בנוסף, מכיוון שתכני DSD משתמשים ב-3 רמות, ניתן להעריך עקמומיות (לא ליניאריות). איור 5א מדגים פלט DSD טיפוסי שבו כל אחד מארבעת המודולים מוגדר לרמות שונות; מכיוון שכל רמה מתאימה למקדם מסוים או לגרסה RBS, הרכבה איזותרמית משמשת ליצירת המבנים הגנטיים המתאימים לעיצובים המומלצים של ה-DSD. לאחר הרכבה וטרנספורמציה של זן המארח עם המבנים המומלצים, מתקבלות עקומות תגובת מינון באמצעות טווח שלם של ריכוזי אפקטורים כדי לספק ביטחון רב יותר בביצועים של כל אחד מהמבנים איור 5ב. מכיוון ש-DSD מפחית באופן דרמטי את מספר המבנים, שלב זה יכול להתבצע לעתים קרובות ביד או באמצעות מטפלים אוטומטיים בנוזלים אם מעדיפים. איור 5ג מציג את הפלט של פרופיל החיזוי שהתקבל לאחר בנייה ובדיקה של השילובים המוצעים ממסך DSD ובניית מודלים חיזויים המבוססים על מקדם היל (n_H) ו-EC₅₀ תפוקה של כל שילוב שנבדק. מטרת הניסוי הייתה לפתח מבנה חיישן ביולוגי שמותאם באופן גלובלי לשני הצדדים_H ו-EC₅₀ באמצעות אפנון הביטוי של 4 הצמתים הרגולטוריים כדי למקסם את שני הפרמטרים. כל גורם רגולטורי מוצג בעמודה משלו עם מידת הביטוי המצוינת לאורך ציר ה-x המתאימה למקדם הטרנספורמציה של lin-log ולספריות החלקים של RBS (-1 עד +1). ההשפעה של שינוי הביטוי של צמתים על שני EC₅₀ ו-n_H מסומן על ידי העקומות בעלילות המשנה. עלילות הפרופיל מדגישות את האופי הלא אינטואיטיבי לעתים קרובות של אופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים, לפיו לכוונון של צומת רגולטורי אחד יכולות להיות השפעות מנוגדות על פרמטרי הפלט. לדוגמה, RBS_טרנס הוכח שאין לו מתאם חזק עם n_H,_{עם זאת, זה מתאם חיובי עם EC50} בצורה לא ליניארית. אינטראקציות מסדר גבוה יותר (לא ליניאריות) משתמעות גם כן, במקרה של RBS_החוצה עלייה בחוזק תגדיל את השיפוע (n גבוה יותר_H) עם עלייה ברגישות במקביל (EC נמוך יותר₅₀), וכתוצאה מכך עקומה עם שיפוע דיגיטלי יותר ותגובה חדה יותר לעלייה בריכוז האפקטור. ממודלים אלה, ניתן לעבד היבטים לא אינטואיטיביים של כוונון חיישנים ביולוגיים בצורה ברורה יותר המאפשרת אופטימיזציה של צמתי הוויסות לקראת אופטימום גלובלי. המודלים שימשו לחיזוי האופטימום הגלובלי עבור שני ה-EC₅₀ ו-n_H כאשר הקווים האדומים בתרשים מציינים את הרמות האופטימליות של כל צומת רגולטורי (איור 5ג). איור 5D מדגים את פרופיל המינון-תגובה של מבנה החיישן הביולוגי ההורי הראשוני (כחול) בהשוואה לעיצוב ה-DSD בעל הביצועים הטובים ביותר (ירוק) והמבנה האופטימלי הגלובלי (Lilac). שימוש במודל כדי לחזות את חוזקות המודול האידיאליות למקסום EC₅₀ ו-n_Hאוריאנט המתאים ל-RBS,_טרנס (-1), פ_רג (-0.7), P_החוצה (-0.3) ו-RBS_החוצה (+1) חוזקות הורכבו ואופיינו עם המבנה האופטימלי המציג שיפורים ב-EC₅₀ ו-n_H (איור 5D). בעוד שגם ה-DSD וגם החיישנים הביולוגיים הממוטבים בעולם מציגים EC דומה₅₀ (0.8 מול 0.7 מיקרומטר), n_H שופרה באופן משמעותי מבלי לפגוע ב-EC₅₀ הישגים שכבר הושגו. התוצאות מדגימות בבירור את היתרונות של תכנון מונחה-נתונים על פני גישות מבוססות אינטואיציה ומשמשות לאימות DoE כאמצעי לייעול ופישוט תהליך כוונון החיישנים הביולוגיים.

איור 1: כוונון של פרמטרים של חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית. פריסת מודולים גנטיים של חיישן ביולוגי מקודד גנטית, כולל aTF, אתרי מפעיל (OS), תיבות משושה (-35, -10) ורכיבי RBS. קופסאות צבעוניות תואמות לאינטראקציות המשפיעות בדרך כלל על פרמטרים של חיישנים ביולוגיים כגון: זיקה של Ligand-aTF (אפור), מפעיל aTF (ורוד), RNAP-Hexbox (ירוק) ו-RBS (כתום). ההשפעות של כל פרמטר על מאפייני מינון-תגובה מצוינות בגרפים המייצגים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סקירה כללית של זרימת עבודה טיפוסית של אופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים של DoE. (A) סקירה כללית של מודולריזציה של רכיבי חיישן ביולוגי המציגה מודול הובלה המקודד חלבון הובלה לייבוא אפקטור המטרה, מודול רגולטור המתייחס ל-aTF ומודול פלט המקודד לחלבון מדווח כגון sfGFP. מוצגים גם צמתים של רגולציה, כגון RBS_trans, P_reg, P_out ו-RBS_out, התואמים לצמתים הגנטיים שיהיו נתונים לאקראיות על מנת לחקור פרמטרים של חיישנים ביולוגיים. (B) מבחר של רכיבי רצף הניתנים לאקראיות בסיסית, כולל מקדמים ו-RBS'. הרצף ההורי של המקדם מוצג בשורה העליונה, כאשר רצף המוטנטים הסופי מוצג להלן, כוכבים מציינים בסיסים ללא שינוי, בעוד ש-K, M ו-N מתייחסים לגואנין/תימין, אדנין/ציטוזין, או כל נוקלאוטיד, בהתאמה. מקדמים מציעים פוטנציאל אקראיות גדול יותר באמצעות מיקוד לתיבות משושה או אתרי מפעילים ויכולים לכלול גם שכפול או שינוי המרווח של רצפים. ספריות RBS מציעות אפשרויות אקראיות מוגבלות יותר, עם זאת, קל יותר לסנן אותן בשל המגוון המרבי הקטן שלהן. (C) רמות הביטוי של הגרסאות מאופיינות ולאחר מכן מומרות לספריית לין-לוג מדורגת כדי להמיר את גורמי המשתנים הקטגוריים ל-3 רמות נפרדות הניתנות יותר לניתוח באמצעות DoE. (ד) מיפוי מרחב הניסוי מבוצע באמצעות שילובים מרובים של שלוש הרמות של כל מודול כדי ליצור מודל שניתן להשתמש בו כדי ליידע על בחירות תכנון לכוונון ביצועי החיישן הביולוגי לתוצאות הרצויות, זה יכול להיות לכיוון טווח דינמי, או לכיוון רגישות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מודולריזציה של חיישנים ביולוגיים, בניית ספריית מקדמים וזרימת עבודה אוטומטית. (A) דוגמה לאקראיות של רצפים ספציפיים במקדם aTF והכנסה למבנה החיישן הביולוגי באמצעות הרכבה איזותרמית. אותיות מודגשות מציינות מיקומים שחולקו באופן אקראי באתר המפעיל או בתיבות משושה בהתאם למפתח שסופק במהלך סינתזת אוליגונוקלאוטידים מנוונת. (B) פאנל המתאר את הטרנספורמציה של ספריית גרסאות החיישנים הביולוגיים המתקבלת למארח שיבוט כגון E. coli, והשלבים הבאים בהתאם לתפוקת הטרנספורמציה. יעילות טרנספורמציה נמוכה עלולה לגרום לכיסוי ספרייה תיאורטי גרוע ולחקירה לא מספקת של מרחב העיצוב. פתרון בעיות בשלב זה הוא הכרחי כדי להבטיח שחלק משמעותי מהגרסאות יהיה זמין לאפיון, עם אמצעים נפוצים לפתרון בעיות. (ג) זרימת עבודה של שלבים 1 ו-2 כמתואר בפרוטוקול, כאשר סמל היד האדומה מציין צעדים ידניים וגלגל השיניים מציין צעדים אוטומטיים. זרימת העבודה של שלב 1 מדגישה את השלבים העיקריים בפרוטוקול מבחירת מושבה ועד ליצירת מלאי קריו. זרימת העבודה של שלב 2 מדגימה תחייה וסידור מחדש של מלאי קריו לבדיקה לפי עקומת תגובת מינון. (ד) הפאנל המדגים את ההליך הסופי לפני ההקרנה, כולל שטיפת התאים והעברה ללוחות בדיקה לפני מדידת הקרינה וה-OD. מאגר גרסאות מוקרן של 5000 מוצג בפאנל, כאשר הגרסאות המדגימות הפעלה/כיבוי מעבר לרצף מקדם ההורים (פי 3.6) מודגשות בתיבה הכתומה. ניתן לראות רבות מהגרסאות מתקבצות סביב 1, מה שמעיד על ביצועים גרועים ושונות נמוכה, ככל הנראה בשל האקראיות ברמת הרצף הגורמת לאובדן תפקוד. 226 הגרסאות המוצגות בקופסה בתרשים נלקחו קדימה לאפיון חזק. הנתונים אומצו מהפרסום המקורי של Alvarez Gonzalez et^{al 23}. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סינון ודיסקרטיזציה של גרסאות עליונות של ספריית המקדם באמצעות טרנספורמציה של לין-לוג. (א) מתווה הנוהל הסטנדרטי להפקת נתוני ביטוי עבור ספריית RBS או מקדם. באמצעות גרסאות הטריאז' המייצגות טווח טוב של רמות ביטוי, מטפלים בנוזלים משמשים ליצירת לוחות בדיקה מלאים מראש בריכוז קבוע מראש של אפקטור שממנו ניתן לגזור עקומות תגובת מינון של 226 גרסאות הטריאז'. (ב) לאחר קביעת EC₅₀ וצמצום נוסף של הספרייה המאופיינת ל-100 גרסאות, הנתונים משורטטים כתרשים עמודות המציג את התמהיל של רגישויות שונות שנוצרו מהאקראיות של המקדם. (ג)נתוני EC₅₀ עוברים טרנספורמציה באמצעות משוואת קצב הלין-לוג כדי להמיר את מערך הנתונים הרציף לקטגוריה המתאימה יותר לפקטוריזציה ב-DSD. (D) נתוני גרסת EC₅₀ שעברו טרנספורמציה מוצגים כעת מופחתים לסולם פשוט ומדורגים מפעילות EC₅₀ גבוהה לנמוכה. מתוך זה, נבחרו 3 רמות המתאימות לממוצע הגיאומטרי העליון (+1) (0) ולגרסאות התחתונות (-1) ויועברו קדימה לתוך ה-DSD כדי לחקור את מרחב הניסוי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תכנון ניסויי DSD, בדיקות ותוצאות למידה מבוססות מודלים. (A) זרימת עבודה סכמטית המציגה את היצירה של טבלת עיצוב DSD המבוססת על הספריות המדורגות שעברו טרנספורמציה של המודולים RBS_trans, P_reg, P_{out ו-RBSout} . טבלת העיצוב של DSD מציעה את המספר הקטן ביותר של שילובים למיפוי יעיל של מרחב הניסוי. ניתן פלט לדוגמה שבו +1, 0 ו-1 מתייחסים לגרסאות בעלות ביצועים עליונים, אמצעיים ותחתונים עבור כל צומת רגולטורי כמתואר על ידי טרנספורמציות לין-לוג. אלה נבנים באמצעות הרכבה איזותרמית ומאושרים על ידי ריצוף לפני שהם הופכים למארח הביטוי לאפיון. (B) לאחר הטרנספורמציה, תאים גדלים ונבדקים כנגד טווח רחב של ריכוזי אפקטור, והפלט הפלואורסצנטי נמדד כדי ליצור עקומות מינון-תגובה. פרמטרים שונים, כגון nH ו-EC50, מופקים מעקומות המינון-תגובה ומוזנים ל-DSD כדי ליצור מודלים חיזויים עבור כל גורם. (ג) באמצעות המודלים ניתן לבצע תחזיות לגבי ההשפעה של אפנון פרמטר ביו-חיישן אחד באמצעות שינוי רמת הביטוי של כל מודול רגולטורי. חשוב לציין, כוונון גלובלי של הצמתים הרגולטוריים הופך לאפשרי, ומאפשר מקסום של פרמטר ביו-חיישן אחד או יותר בו זמנית, המסומנים על ידי הקווים האדומים המקווקווים בכל תת-חלקה. (D) אופטימיזציה של המודל לקראת רגישות מקסימלית מביאה למבנה האופטימלי הגלובלי (לילך), שעקומת תגובת המינון שלו משורטטת כנגד מבנה ה-DSD בעל הביצועים הטובים ביותר (ירוק) ומבנה החיישן הביולוגי ההורי (כחול). פרמטרים שחולצו n_H ו-EC₅₀ מוצגים מתחת לתרשים, ומדגימים את השיפור של שני הפרמטרים מעל מבנה ה-DSD בעל הביצועים הטובים ביותר, ומאמתים את היעילות של מודלי החיזוי שנוצרו מה-DSD. הנתונים אומצו מהפרסום המקורי של Alvarez Gonzalez et^{al 23}. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: שלבי פרוטוקול טיפול בנוזלים אוטומטיים המשמשים להכנת ספריית חיישנים ביולוגיים והגדרת בדיקה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2 לאיור משלים 6: יצירה צעד-אחר-צעד של תכן סינון סופי (DSD). אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

ספריות של אלמנטים גנטיים המקיפות שונות גנטית רחבה הן חיוניות להצלחת מתודולוגיה מבוססת DoE. כפי שמודגם באיור 2A, מספר הגרסאות התיאורטיות גדל עם מספר המיקומים המיועדים למוטגנזה כמו גם מידת האקראיות, כאשר גודל הספרייה ההולך וגדל יוצר צווארי בקבוק משמעותיים. הפחתת מספר המיקומים הממוקדים או מידת האקראיות יכולה להפחית את מספר הגרסאות שיש לסנן והיא גישה אטרקטיבית אם נדרשת גישה ממוקדת יותר לכוונון או אם קיים ידע אפריורי משמעותי של המערכת כמדריך. עם זאת, במקרה של מערכות כמו חיישנים ביולוגיים, הכוללות תכונות חופפות רבות או שאולי אין להן אלמנטים גנטיים מאופיינים היטב, קשה לעקוף את דרישת גודל הספרייה. השימוש במטפלים אוטומטיים בנוזלים יכול לזלזל בעבודה של בחירת מושבות וטיפוח גרסאות, במיוחד כאשר נדרש איסוף מוגבר של נקודות נתונים לצורך התוויית פונקציות מתקדמות יותר כמו עקומות תגובת מינון לעומת שני משווני נקודות נתונים, כגון ON/OFF. אמנם קשה לכמת באופן ספציפי את הזמן שנחסך מהכללת זרימות עבודה אוטומטיות, היתרון העיקרי של יישומו הוא בזמן שניתן להקדיש לניסויים מקבילים אחרים³⁸.

למרות זאת, במקרים רבים שבהם גודל הספרייה עולה על 10⁴, אפילו מתודולוגיות בסיוע מטפל בנוזלים הופכות לבלתי מעשיות³⁹. במקרים כאלה, סינון ראשוני של וריאנטים באמצעות ציטומטרים זרימה הוא גישה אטרקטיבית ביותר, עם יכולת מיון גדולה בהרבה של עד 10⁷ תאים לשעה⁴⁰. שימוש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) עם שני סבבים של ברירה חיובית ולפחות סבב אחד של ברירה שלילית שימש באופן שגרתי במיון של הגרסאות בעלות הביצועים הטובים ביותר של חיישנים ביולוגיים לפני אפיון נרחב יותר 16,26,42. הפיתוח והביצוע של פרוטוקולים כאלה המשתמשים ב-FACS נסקרו בפירוט במקום אחר³¹. מסכי טריאז' ראשוניים אפשריים באמצעות מבחני מטפל בנוזלים מבוססי צלחת, כמתואר בפרוטוקול לעיל; על ידי השוואת נתוני ON/OFF באמצעות ריכוז אפקטור יחיד כפי שמוצג באיור 3D, ניתן לבחור רק חיישנים ביולוגיים וריאנטים עם רווח תפקודי ניכר (פי 3.6 כפי שנקבע בשיטות) לאפיון מפורט יותר, ייעול פיתוח הספרייה וזמן ריצה ניסיוני. עם זאת, גם פלטפורמות FACS וגם פלטפורמות טיפול בנוזלים מגיעות עם השקעת הון משמעותית עבור המעבדה ולעתים קרובות דורשות רמה של מומחיות טכנית לתפעול ותחזוקה. מסכים מבוססי לוחות אגר מספקים מחסום כניסה טכני ופיננסי נמוך יותר, ונעשה בהם שימוש בשילוב עם gfp או סינון מושבה כחולה-לבן כדי לבחור גרסאות ספריית RBS כמו גם מוטציות אנזימים המבוססות על עוצמת הקרינה^43,44. עם זאת, גם אלה מוגבלים במספר הגרסאות שניתן לסנן ביעילות, אך גם דורשים הבדל משמעותי בפלואורסצנטיות כדי שניתן יהיה לזהות⁴⁴. כפשרה בין מוטציה סימולטנית קומבינטורית מלאה של מספר אלמנטים בו זמנית, מתודולוגיית "הפרד ומשול" שואפת במקום זאת לפצל ספריות וריאנטים גדולות לבלוקי סינון הניתנים לניהול⁴¹. בעוד שגישה מודולרית עשויה להיות פרגמטית, היא אינה חוקרת ביעילות את מרחב העיצוב הקומבינטורי, שכן הביצועים של רכיבים ביולוגיים ידועים כתלויי הקשר מאוד, במיוחד בחיידקים, שבהם צימוד שעתוק ותרגום נפוץ. יש לכך פוטנציאל לגרום לבחירות עיצוב המכוונות למקסימום המקומי במקום לאופטימום הגלובלי.

הובלה והכרה של גורמים ספציפיים מייצגים תכונה חשובה נוספת בפיתוח חיישנים ביולוגיים שראויה לאזכור, למרות שאינה המוקד העיקרי של הפרוטוקול המתואר. היעדר aTF מתאים למולקולת המטרה מהווה אתגר משמעותי לחוקרים. בחירה רציונלית של aTF קיים הקושר אנלוגי מבני של אפקטור המטרה יכולה לספק תבנית אידיאלית שעליה ניתן ליישם אקראיות קודון על מנת לכוונן את הספציפיות של ה-aTF לאפקטור הרצוי¹⁷. יישור רצף המטרה למבנים שנפתרו או תחזיות אלפפולד יכול לאפשר זיהוי של אתרי קשירת אפקטורים עם שאריות חשודות של חומצות אמינו הכפופות לאקראיות ודירוג רציונליים למחצה, הניתנים להתאמה לפרוטוקול¹⁷. באופן דומה, בחירה ואפנון של מובילים האחראים לייבוא/יצוא של אפקטורים יכולים לשנות באופן משמעותי את מאפייני התגובה למינון החיישנים הביולוגיים. ביטוי גנים של טרנספורטר נמצא כשחקן משמעותי בתגובת חיישן ביולוגי, עם ספרייה מגוונת של מקדמי P_tac ו-RBS השולטים בביטוי של טרנספורטר MucK המשמש לייצוב ביטויו על פני מספר סבבים של FACS, ומשפר את החוסן של תגובת החיישן הביולוגי¹⁷. באופן דומה, סינון של חלבוני טרנספורטר שונים עצמם יכול לווסת את הספציפיות של חיישנים ביולוגיים, עם סינון של קבוצה משוערת של טרנספורטרים PcaK באמצעות חיישן ביולוגי מגיב ל-PCA המוביל לזיהוי של שני טרנספורטרים המסוגלים באופן ייחודי לקלוט מצעים 3,5-הידרוקסיליים, ולהרחיב את מערך התרכובות הניתנות לזיהוי על ידי מערכת זו²⁴.

פלטפורמות אוטומטיות יכולות להפוך לכלים חזקים עוד יותר לאפיון וחקירה כאשר משלבים עקרונות DoE עם מודלים של למידה עמוקה^46,47. לאחר שחקרו לראשונה את מרחב התכנון של חיישן ביולוגי עם פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה, אלגוריתמים של למידת מכונה מונפו כדי לחזות את התפקוד של רצפים לא מאופיינים בדיוק טוב ⁴⁷. השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות בקלות בבדיקת מודלים חדשים ללימוד שפה לתכנון מקדם, בדומה למודלים שפותחו על בסיס חיזוי רצף חוצה RBS⁴⁸. יתר על כן, שילוב של מודלים כאלה יכול לנצל את נתוני פונקציית הרצף הכלולים בעיצובי המקדם הלא פונקציונליים ולספק תובנה קריטית לגבי הפונקציונליות הרחבה יותר של החיישן הביולוגי בכללותו. כלומר, יש לכך פוטנציאל לטפל במגבלה מכרעת של זרימת העבודה של DoE, שתוצאות חיוביות כוזבות, למשל, מקדם לא פונקציונלי, אינן בהכרח שוות ערך לפלט מדוד של אפס, עם תופעות כמו שעתוק מזויף או הכנסת אלמנט של רעש לנתוני DoE, שקשה לזהות ולשלוט בו. באופן מכריע, על מנת להקיף את מרחב העיצוב הניסיוני הכולל, כל ספרייה שנוצרה חייבת להציג מגוון רחב של פעילויות, שכן טווח פעילות לא מספיק יגרום לתפוקות עיצוב מוטות וייצור חוסר אמינות בכל המודלים הסטטיסטיים שנוצרו ממערך הנתונים³⁰. אם שונות ספרייה נמוכה הופכת לבעיה, ניתן ליישם חקירת רכיבי רצף אחרים או הגדלת מידת האקראיות, ולהשוות את השונות בין הספריות עד להשגת מאגר וריאנטים מתאים.

היבט מכריע של תהליך ה-DoE כרוך בהערכה נכונה ובחירה של השפעות ראשוניות ומשניות המתקבלות מה-DSD שישולבו לאחר מכן בניתוח סטטיסטי. DoE, בהיותה גישה מבוססת מודלים, נוטה מאוד להתאמת יתר ולהטיה, מה שיכול לסבך במהירות את תהליך האופטימיזציה באמצעות הנחיית מאמצי הנדסה איטרטיביים לחלקים לא אופטימליים של מרחב התכנון⁴⁹. ככזה, זה קריטי להבטיח שכל עיצוב מבודד היטב מהשפעות כאלה, הן בשלב הקונספט והן בניתוח הנתונים. בשלב תכנון הסינון הראשוני, ריצות ממורכזות שבהן כל הגורמים מוגדרים לממוצע הגיאומטרי (כלומר, 0,0,0,0) יכולות לעזור להפחית את הטיית המודל על ידי התחשבות טובה יותר באינטראקציות לא ליניאריות, תוך אי הוספת עומס ניסיוני משמעותי (1-3 ריצות נוספות)⁴⁹. בנוסף, הכללת עיצובים אקראיים יכולה לעזור להסביר משתנים זרים שאינם כלולים בתכנון הניסוי אך עדיין יכולים להשפיע על משתני התגובה הנמדדים. בהקשר ביולוגי, אקראיות מטפלת בנושאים כמו השפעות מרחביות-זמניות, כגון מיקום צלחת, או שונות מאצווה לאצווה, ומונעת מהשפעות כאלה להשפיע באופן משמעותי על פירוש הנתונים. תשומת לב לפרטים כאלה בשלב מוקדם זה יכולה לשפר את חוסן הדגמים ולהוביל למסקנות אמינות יותר. לאחר ביצוע הניסויים שהוצעו על ידי DSD, נדרש ניתוח סטטיסטי של הנתונים כדי להבהיר את הגורמים שהייתה להם השפעה משמעותית על פרמטרי התפוקה. עלילות חצי נורמליות מציעות ייצוג ויזואלי אינטואיטיבי של עוצמות האפקט, כאשר אפקטים חסרי משמעות נופלים בדרך כלל לאורך קו ישר, בעוד שאפקטים בעלי השפעה משמעותית יחרגו מקו זה, מה שיאפשר בחירה פשוטה של הגורמים החשובים ביותר באופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים. עם זאת בחשבון, יש לנקוט בגישה שמרנית לבחירת אפקטים, כמו בכל מודל, כדי להפחית את הסיכון להתאמת יתר של המודל.

היכולת לתכנן ולבצע אופטימיזציה מהירה של חיישנים ביולוגיים ומעגלים גנטיים אחרים תאיץ מאוד את קצב המחקר בתחום הביוטכנולוגיה, כגון בפיתוח זנים ואנזימים, אך גם באבחון בזמן אמת. הופעתן של מתודולוגיות סינון מבוססות DoE בתחום זה מבטיחה במיוחד, ומאפשרת שימוש יעיל בזמן ובמשאבים תוך בחינת מרחב התכנון המקסימלי האפשרי, וכבר נעשה בה שימוש רב באופטימיזציה של מעגלים גנטיים עבור מסלולים מטבוליים ועבור חיישנים ביולוגיים 31,33,34,51. DoE מתאים במיוחד לבעיות אופטימיזציה רב-גורמיות שבהן פועלות אינטראקציות רבות מסדר ראשון, שני או אפילו שלישי שאחרת יהיה קשה לחקור עם גישת תכנון ניסוי טיפוסית של גורם אחד בכל פעם. יתר על כן, מאמצים להנדס היבט אחד של חיישן ביולוגי מביאים לעתים קרובות בטעות להקרבה של פרמטר אחר, כגון שיפור הרגישות על חשבון הטווח הדינמי⁵¹. באמצעות היכולת של DoE למפות אינטראקציות נסתרות כאלה כמו גם ליצור מודלים המנבאים התנהגות חיישנים ביולוגיים, מחזור הלמידה של בדיקת הבנייה מואץ מאוד.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 ומיקרו; L CO-RE טיפים, סטרילי ללא פילטר	המילטון	235939
2.2 מ"ל 96 צלחת Deepwell, בארות מרובעות עם תחתית בצורת V	תרמו	11594754
300 ומיקרו; L טיפים משותפים, NTRs מוערמים, סטריליים	המילטון	235985
96 תחתית שקופה היטב, לוחות מיקרוטיטר שחורים	גריינר	655097
אגרוז	Invitrogen	16500100
DNA פלסמיד מורכב	מסופק על ידי משתמש	נה
קורא ClarioStar Plus Microplate	BMG	נה
תערובת תמיסות Dexynucloetide (dNTP)	נב	N0447L
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	פישר ביו-רייג'נטס	BP231-100
סולם DNA 100bp	נב	N3231L
סולם DNA 1KB	נב	N3232L
ריצוף DNA	מקור: Bioscience	נה
סינתזת DNA	IDT	נה
Escherichia coli DH5α תאים תפוטנטיים	נב	C2987H
צבע לטעינת ג'ל, סגול X6 ללא SDS	נב	B7025S
דופק גנים/מיקרופולסר אלקטרופורציה קובטים, מרווח של 0.2 ס"מ	ביורד	1652082
מנסרת לוח גרף 10	GraphPad	נה
מטפל נוזלי המילטון סטאר	המילטון	נה
חממת שייקר צלחות HT multitron	מידע HT	נה
חבילת הניתוח הסטטיסטי של JMP	JMP	נה
מרק LB (מילר)	מילר	L3522
מרק LB (מילר) עם אגר	סיגמא	L3147
מיקרופולסר אלקטרופורטור	ביורד	1652100
NEBuilder HiFi DNA הרכבה מאסטר מיקס	נב	E2621S
Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה	נב	M0491S
ערכת QIAprep ספין Midiprep	קיאג'ן	12143
ערכת QIAprep Spin Miniprep	קיאג'ן	27104
ערכת מיצוי ג'ל QIAquick	קיאג'ן	28706X4
ערכת טיהור PCR מהירה	קיאג'ן	28104
Qpix 420 בורר מושבות	מכשירים מולקולריים בריטניה	נה
SOC צמיחה בינונית	נב	B9020S
כתם ג'ל DNA בטוח של SYBR	Invitrogen	S33102
חוצץ TAE (Tris-אצטט-EDTA, 50X)	תרמו פישר	ב49
UltraPureTM מים מזוקקים ללא דנאז/רנאז	Invitrogen	10977015