כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תפקיד הגליה בגלאוקומה הוא נושא מחקר בולט יותר ויותר, אך הרבה עדיין לא ידוע על האופן שבו אוכלוסיות של תאי תמיכה אלה - כלומר אסטרוציטים ומיקרוגליה - משפיעות על הישרדות תאי הגנגליון ברשתית. בעוד שמודלים in vivo ו-in vitro מספקים מידה של תובנה, לשתי הגישות יש מגבלות משמעותיות, כגון ההשפעה של תגובה חיסונית היקפית בראשונה ושינויים בתפקוד הפיזיולוגי הנגרמים על ידי בידוד תאים ותרבית במקרה של האחרון. כדי למזער את הגורמים המבלבלים הללו, פיתחנו מערכת ex vivo retinal ex vivo שבה ניתן לשמור על אסטרוציטים, מיקרוגליה וסוגי תאי רשתית אחרים באתרם לתקופות של לפחות 3 ימים, מה שמאפשר חקירה ממוקדת בתפוקה גבוהה יותר ממה שבדרך כלל אפשרי במודלים in vivo . באופן מכריע, גישה זו מתאימה מאוד למתודולוגיות שיהיו מאתגרות או בלתי אפשריות בבעל חיים חי אך נשארת תואמת לבדיקות נפוצות במורד הזרם של רקמת עצבים שלמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאים לבידוד ותרבות של אקספלנטים שלמים ברשתית, יחד עם תוצאות מייצגות של מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית המתעדת את השינויים שעוברים תאי גליה וגנגליון רשתית ברשתית ex vivo .
מבוא
הרשתית הרגישה לאור, שלוחה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הממוקמת בחלק האחורי של העין, חיונית לראייה אך פגיעה הן לפציעה חריפה והן למחלות כרוניות. כמו באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, נוירונים ברשתית הבוגרת אינם מוחלפים כאשר הם הולכים לאיבוד, ותאי הגנגליון ברשתית (RGCs) שצוברים ומעבירים מידע חזותי למוח פגיעים במיוחד לתפקוד לקוי ולמוות בגלאוקומה, וכתוצאה מכך לאובדן ראייה בלתי הפיך 1,2. גלאוקומה היא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם3, אך למרות ההשפעה ההרסנית על אנשים שנפגעו והעלויות הכוללות לחברה, עדיין לא ידוע הרבה על האופן שבו השלבים המוקדמים של המחלה תורמים לאובדן RGC4. תפקיד הגליה הוא תחום מחקר עיקרי בפתופיזיולוגיה של גלאוקומה, שכן תאי תמיכה לא עצביים אלה חיוניים להישרדות RGC5 אך עוברים שינויים פנוטיפיים במחלה שעלולים להפחית התנהגות מועילה6 או אפילו להניע אימוץ של פנוטיפים מזיקים7. למרות שהמונח גליה מקיף מגוון סוגי תאים מיוחדים ברחבי מערכת העצבים המרכזית8, ניתן לחלק אותם באופן כללי לשתי קטגוריות - אלה החולקים שושלת התפתחותית עם נוירונים ומספקים תמיכה טרופית, אנרגטית ומבנית9, ואלה ממוצא מיאלואידי, המבצעים משימות מעקב ותגובה חיסוניות מיוחדות10. נציגי שתי הקטגוריות - אסטרוציטים ותאי מולר בראשון, מיקרוגליה באחרון - מאכלסים את הרשתית5 ועוברים שינויים גדולים בגלאוקומה המעלים שאלות משמעותיות לגבי תפקידם בהתקדמות המחלה ובהישרדות RGC11.
המאמצים לענות על שאלות אלה מעוכבים בחלקם על ידי מאפיינים מהותיים של גליה ברשתית המהווים אתגרים הן לחקירה in vivo והן לחקירה חוץ גופית. בניגוד לנוירונים, הם שקטים יחסית מבחינה חשמלית, מה שהופך גישות כמו ERG המאפשרות הערכה תפקודית של RGCs ופוטורצפטורים in vivo לא מתאימות לחקירת שינויים בתפקוד והתנהגות גליה. ובעוד שקיימים מודלים12 ו-13 ספונטניים של גלאוקומה, עדיין לא ידוע הרבה על שינויים בגליה בנקודות הזמן המוקדמות ביותר של המחלה, שעשויים להקדים אובדן RGC שניתן לזהות, בעיה שהוחרפה על ידי החדירה המשתנה של מצב המחלה ברבים מהמודלים הללו. יתר על כן, עדויות מגלאוקומה קלינית וניסיונית מצביעות על תרומות של תאי חיסון היקפיים שקשה להבדיל מאלה של מיקרוגליה, למרות אינדיקטורים לכך שהם עשויים לפעול ב'כיוונים' שונים כדי להשפיע על התקדמות המחלה14,15.
אתגרים רבים גם בחקר גליה ברשתית במבחנה. למרות שבידוד ותרבית של אסטרוציטים16,17 ומיקרוגליה18 מהמוח מבוססים היטב, מחקרים עדכניים מדגישים הטרוגניות גליאלית נרחבת בין אזורי מערכת העצבים המרכזית, במיוחד באסטרוציטים19, ופנוטיפים הנמצאים באזור אחד עשויים שלא להיות נוכחים בגליה מאזור אחר, כגון הרשתית20,21. עם זאת, בידוד ישיר של אסטרוציטים ברשתית ומיקרוגליה למחקר הוא מאתגר במיוחד, מכיוון ששני סוגי התאים דלילים יחסית - כל אחד מהם מהווה פחות מ-1% מ-6.5 מיליון התאים המוערכים ברשתית העכבר 22,23,24. יתר על כן, בניגוד לנוירונים, גליה הם פלסטיים מאוד ומסתגלים במהירות לשינויים דרמטיים בסביבתם 16,18,25; כתוצאה מכך, התנהגויות שנצפו בתאים אלה במבחנה עשויות לייצג התאמות ספציפיות לסביבתם החדשה ולא דפוסים פנוטיפיים שנראים בדרך כלל בבריאות או במחלה. בהתחשב במגבלות של ניסויים in vivo ותרבית ראשונית של גליה ברשתית, חיפשנו גישת ביניים - explants של הרשתית - שבה גליה, RGCs ואלמנטים אחרים של הרשתית נשמרים באתרם בהקשר ex vivo. יחסית למודלים in vivo, גישה זו מציעה מהלך זמן ניסיוני מקוצר26, מאפשרת מניפולציה ניסויית ישירה של גליה27 ברשתית ומונעת את ההשפעה המבלבלת הפוטנציאלית של חדירת תאי חיסון היקפיים14. לעומת זאת, בניגוד לתרבית תאים ראשונית, יש הפרעה מינימלית של הסביבה החוץ-תאית, וגליה נשארת שלמה וניתנת לזיהוי מורפולוגית, מה שמבטל את האתגרים הקשורים לצמיחה מחדש וזיהוי תאים אלה לאחר שיבוש אנזימטי ומכני16,25.
יחסית למתודולוגיות של נטיעת רשתית שתוארו בעבר, גישה זו מדגישה התמקדות באמינות טכנית, שחזור ומקסום 'ידידותיות למשתמש' של הגישה לשיפור הנגישות 26,28. בתקשורת אישית עם חוקרים אחרים, מצאנו שהאתגרים הטכניים הקשורים לטיפול ברשתית החיה מהווים מכשול גדול לרבים המעוניינים להשתמש בצמחים, בעוד שתחזוקת הרשתית המושתל בתרבית הייתה פשוטה יחסית עבור קבוצות עם מתקני תרבית תאים מתאימים. לכן, פרוטוקול זה כולל מספר חידושים שנועדו להפחית את עקומת הלמידה הקשורה לבידוד הרשתית ולאפשר לחוקרים להתחיל לאסוף נתונים ניסיוניים במהירות רבה יותר. לבסוף, למרות ששמנו דגש מיוחד על הפוטנציאל של מודל אקספלנט זה לחקור את התנהגות גליה ברשתית ולאפיין אותה בעיקר במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, סוגים ומבנים אחרים של תאי הרשתית נשמרים גם הם במידה רבה, והרשתית המושתל נשארת פתוחה למגוון רחב של טכניקות חקירה נוספות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכון לחקר העיניים של שפנס (פרוטוקול # 2022N000030, אושר ב-3/4/2025). בעלי חיים טופלו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.
הערה: איור 1 מציג את השלבים העיקריים בבידוד הרשתית החיה מעין העכבר הגרעינית.
איור 1: ייצוג דיאגרמטי של שלבי מפתח בבידוד רשתית חיה מעין העכבר הגרעינית. מספרי השלבים המתאימים של שלבי המפתח מסופקים במעגלים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
1. הכנה
- חיטוי פיפט של 1 מ"ל וזוג מלקחיים זוויתיים והנח אותם בארון הבטיחות הביולוגית. אלה יידרשו בסעיף 3 של הפרוטוקול.
- שנה צינור העברה על ידי חיתוך בניצב לרוחב הפיר כ -2 ס"מ מתחת למאגר, שם הקדח רחב ביותר, כדי לקצר את הצינור ולהרחיב את הפתח. הקפידו על חתך נקי שהרשתית לא תיתקע עליו.
הערה: ניתן לשמור כלי זה לשימוש חוזר אם הוא נקי ושוטף במים סטריליים בין השימושים. - הכן 50 מ"ל של חומר חיצוני באופן אספטי בארון בטיחות ביולוגית על ידי השלמת 47.5 מ"ל של מדיה נוירובזלית עם 500 מיקרוליטר של תוסף N-2, 1 מ"ל של תוסף B-27, 500 מיקרוליטר של גלוטמקס ו-500 מיקרוליטר של תערובת פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי של 100 U/mL של פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין).
הערה: הכן מדיית אקספלנט טרייה לכל סדרת בידודים; ניתן לשמור את חומרי ההדפסה העודפים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד ולהשתמש בהם להחלפת מדיה במידת הצורך. לאחר הפתיחה, יש להחליף את המדיום הנוירובזאלי שאינו בשימוש לאחר חודש אחד. יש לשמור על N-2 ו-B-27 קפואים כמזונות חד-פעמיים, ולהימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה. - בארון בטיחות ביולוגית, הכינו באופן אספטי צלחות תרבית על ידי הוספת תוספת לכל באר לשימוש, טיפול באמצעות 'שיניים' היוצאות משפת ההכנסה כדי למנוע נגיעה במשטחים שיגעו באמצעי התרבית.
- הוסף 1 מ"ל של מדיה אקספלנט לתוספת, ואחריו 3 מ"ל נוספים שנוספו לבאר עצמה. הוסף 2-3 מ"ל מים סטריליים לכל בארות שאינן בשימוש כדי לשלוט באידוי.
- העבירו את הצלחות לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי לאזן כ-30 דקות לפני בידוד הרקמות.
- הכן ריבועי סינון ליצירת מצע לייצוב והעברת רקמות. חלץ את המסנן מערכת סינון על גבי בקבוק על ידי חיתוך סביב היקף החומר בעזרת סכין גילוח או אזמל. הקפד להימנע מפציעה או נזק למסנן באמצעות קיפול או קריעה.
הערה: הסרת מאגר הפלסטיק השקוף באמצעות סכין גילוח יציב כדי לחתוך את הפלסטיק האטום הגמיש יותר במקום שבו מתאם הברגה פוגש את המאגר מפשטת את תהליך החילוץ, אך יש לנקוט בזהירות נוספת כדי למנוע פציעה.- לאחר ניתוק המסנן על ידי חיתוך, השתמש במלקחיים כדי לחלץ אותו. שימו לב לכיוון המסנן במהלך החילוץ ואחריו; הצד המט (הפונה למאגר) צריך להיות זקוף להרכבת הרשתית בשלב 2.16 להעברה.
- חותכים את המסנן לריבועים קטנים כ -7 מ"מ × 7 מ"מ; כל הוצאת רשתית תדרוש ריבוע אחד. משרים מראש את הריבועים במים סטריליים בצלחת פטרי 100 מ"מ למשך 20 דקות לפחות.
הערה: ריבועי סינון יכולים להישאר שקועים במים סטריליים עד שבוע לפני השימוש. בשל הנטייה של ריבועי המסנן לפתח רמות גבוהות של מטען סטטי לפני הטבילה, הכינו רק כמה ריבועים שצריך. ניתן לשמור את חומר המסנן היבש הנותר ללא הגבלת זמן בצלחת פטרי סטרילית 100 מ"מ לשימוש מאוחר יותר.
2. בידוד והרכבה
- המתת חסד של העכבר בשיטה מאושרת לפני אישור בגישה משנית; מחקר זה השתמש בחנק CO2 ואחריו נקע צוואר הרחם. הסר את שתי העיניים עם מלקחיים מעוקלים ובעלי קצה קהה והנח אותן ב-PBS סטרילי.
- הכן את סביבת העבודה על ידי מילוי צלחת פטרי 100 מ"מ ב- PBS סטרילי והנחתה על הבמה של טווח החיתוך המשקפת.
- חותכים רצועה ברוחב 1 ס"מ של מגבון מעבדה וטובלים אותה בכלי כדי לשמש כמצע מייצב.
- מעבירים עין אחת לצלחת החיתוך, משאירים את השנייה ב-PBS ומניחים על קרח או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: בשל רגישות הרשתית למרווח ממושך לאחר המוות, מומלץ לבצע המתת חסד של עכבר אחד בכל פעם.
- מקם ושתק את העין. השתמש במלקחיים כדי לתמרן את העין על מגבון המעבדה השקוע, מה שיסייע לייצב.
- זהה נקודת אחיזה מתאימה, אחוז בה עם מלקחיים זוויתיים וגלגל בעדינות את העין כך שהיא תוחזק מהצד או, באופן אידיאלי, מלמטה. ודא שהציר הקדמי-אחורי (כלומר, מהקרנית לעצב הראייה) הוא אופקי. כיוון זה משפר את הראות וממזער את הלחץ על העין במהלך דיסקציה.
הערה: במידת האפשר, אחוז ברקמה חוץ-אורביטלית כדי למנוע ניקוב או סחיטה של העין, והעדפת שריר או לחמית על פני עצב הראייה או שומן.
- זהה נקודת אחיזה מתאימה, אחוז בה עם מלקחיים זוויתיים וגלגל בעדינות את העין כך שהיא תוחזק מהצד או, באופן אידיאלי, מלמטה. ודא שהציר הקדמי-אחורי (כלומר, מהקרנית לעצב הראייה) הוא אופקי. כיוון זה משפר את הראות וממזער את הלחץ על העין במהלך דיסקציה.
- תוך שמירה על אחיזה עם המלקחיים הזוויתיים, ודא שהעין שקועה לחלוטין ומשותקת היטב. בצע חתך עם קצה האזמל #11 מקביל וכ-0.5 מ"מ אחורי הלימבוס, שם הקרנית עוברת לסקלרה.
הערה: חתך זה צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים לקצה להב אחד של המספריים הקפיציים. מכיוון שהחדות של קצה האזמל חיונית לניקוב הגלובוס בצורה נקייה, החלף את הלהב לאחר כל שתי רשתיות.- הכנס להב אחד של המספריים הקפיציים לתוך הגלובוס והתחל לחתוך סביב העין, תוך מיקום מחדש בעדינות של העין לפי הצורך באמצעות מלקחיים.
הערה: חתך זה צריך להיות ישר ומקביל ללימבוס ככל האפשר; מיקום מחדש של העין עשוי לדרוש הנחת המספריים ושימוש בזוג מלקחיים אחד בכל יד. לאחר החשיפה, שמור את הרשתית שקועה לאורך כל הדיסקציה.
- הכנס להב אחד של המספריים הקפיציים לתוך הגלובוס והתחל לחתוך סביב העין, תוך מיקום מחדש בעדינות של העין לפי הצורך באמצעות מלקחיים.
- לאחר שהחתך הקיף את העין, הסר בזהירות את המקטע הקדמי והעדשה, ולאחר מכן סובב את העין כך שפניה כלפי מעלה כדי להקל על הבדיקה החזותית והסרת הזגוגית. אם נותרה חתיכה מורחבת של עצב הראייה מחוברת, חתוך אותה לאורך קצר יותר (1-2 מ"מ) כדי להקל על כך.
- בדוק את הרשתית לאיתור נזק גלוי ואת תא הזגוגית לאיתור פסולת, כגון תאים פיגמנטיים מה-RPE או הכורואיד שאולי נכנסו במהלך הסרת המקטע הקדמי. השתמש במלקחיים זוויתיים כדי לשתק את העין במצב זה.
הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יש להסיר פסולת בתא הזגוגית, ולמזער שאריות זגוגיות ודביקות של הגוף הריסי בפריפריה של הרשתית. זה יכול להיות תהליך מאתגר, וניתן למצוא הערות נוספות בסעיפים 'זיהוי ופתרון בעיות של פגיעה מכנית' ו'פגיעה מטבולית' של התוצאות המייצגות.- השתמש בצינור ההעברה שהשתנה כדי לשטוף את תא הזגוגית עם PBS כדי להסיר פסולת חלקיקים קטנה, הימנעות מבועות אוויר על ידי שמירה על קצה הצינור מתחת לפני השטח של הנוזל ושמירה על כמות מספקת של PBS בנורת המאגר.
- הסר פסולת גדולה יותר בעזרת מברשת צבעי מים עדינה, תוך מזעור המגע עם פני הרשתית. במידת הצורך, הסר פסולת מתמשכת יותר בעזרת מלקחיים עדינים; עם זאת, הימנע ממגע ישיר של קצות כלי מתכת עם הרשתית כדי למנוע נזק.
- לאחר פינוי פסולת גלויה, יש לשטוף את תא הזגוגית עם PBS מצינור ההעברה שוב ושוב (3-5 פעמים), כמתואר לעיל. זה יסיר זגוגית דבוקה באופן רופף שעלול להישאר לאחר הסרת הפסולת. השתמש במברשת העדינה כדי לחקור בעדינות את החדר, במיוחד ליד הפריפריה אם נותרו אלמנטים של הגוף הריסי. בעוד שהזגוגית שקופה אופטית, היא תשמש כגרירה על סיבי המברשת וניתן לזהות אותה בדרך זו.
הערה: נראה כי שכבה שיורית דקה של זגוגית על הרשתית אינה משפיעה לרעה על בידוד או שמירה על הרשתית ex vivo, אך נוכחות של כמויות משמעותיות בפריפריה של הרשתית, הקשורה לעתים קרובות למבנים שיוריים מהגוף הריסי, עלולה לגרום לקיפול הרשתית ולאובדן דגימה אם לא מוסרת.- אם נותרו כיסים משמעותיים של זגוגית, השתמש במברשת כדי להסיר אותה על ידי טאטוא עדין החוצה לכיוון הפריפריה, וודא שאם סיבי המברשת נוגעים ברשתית, הם עושים זאת מזווית רדודה ונגררים אחר המברשת, מושכים במקום לדחוף את הזגוגית מהתא.
הערה: הסרת הזגוגית דורשת טיפול זהיר במיוחד כדי למנוע נזק לרשתית שאולי לא נראה במקרוסקופיה; עצות לזיהוי והימנעות מנזק זה נמצאות בסעיפים 'זיהוי ופתרון בעיות של פגיעה מכנית' ו'פגיעה מטבולית' של התוצאות המייצגות.
- אם נותרו כיסים משמעותיים של זגוגית, השתמש במברשת כדי להסיר אותה על ידי טאטוא עדין החוצה לכיוון הפריפריה, וודא שאם סיבי המברשת נוגעים ברשתית, הם עושים זאת מזווית רדודה ונגררים אחר המברשת, מושכים במקום לדחוף את הזגוגית מהתא.
- לאחר שתא הזגוגית נוקה מפסולת ונשארו רק זגוגיות מינימליות, הפרד בעדינות את הרשתית החיצונית מכוס העין תוך המשך ייצוב הדגימה עם מלקחיים זוויתיים. הימנע מפגיעה בראש עצב הראייה והשאיר מבנה זה שלם כדי לעגן את הרשתית.
- קח זוג מלקחיים, שמור אותם במצב סגור עם קצוות נוגעים, והכנס אותם בעדינות בין הרשתית לכורואיד, תוך שימוש ברווח קיים מראש מטיפול קודם במידת האפשר. השתמש בזרועות השטוחות של המלקחיים, ולא בקצוות, כדי להגדיל את הכיס בין הרשתית לכורואיד עד שניתן יהיה להפריד את המבנים הללו לחלוטין.
הערה: הדגש תנועות רוחביות, במקום לדחוף את הקצוות, כדי להרחיב את הפער בין הרשתית לכורואיד. סיבוב עדין של המלקחיים במהלך תנועות אלו יכול לשפר את ההפרדה תוך הפחתת הלחץ המוחלט מחיכוך בין מלקחיים לרקמות.
- קח זוג מלקחיים, שמור אותם במצב סגור עם קצוות נוגעים, והכנס אותם בעדינות בין הרשתית לכורואיד, תוך שימוש ברווח קיים מראש מטיפול קודם במידת האפשר. השתמש בזרועות השטוחות של המלקחיים, ולא בקצוות, כדי להגדיל את הכיס בין הרשתית לכורואיד עד שניתן יהיה להפריד את המבנים הללו לחלוטין.
- לאחר הפרדת הרשתית החיצונית מהכורואיד, המשך לייצב את הדגימה תוך שימוש בזוג מלקחיים שני כדי למשוך את העין - סקלרה, כורואיד וכו '- כלפי מטה. אם הרשתית הופרדה בהצלחה, היא צריכה להישאר במקומה, קשורה בראש עצב הראייה, בעוד שגביע העין יכול להיות מוחזק על ידי זוג מלקחיים בודד. אם הרשתית לוחצת כלפי מטה עם העין, המשך לחקור בעדינות ולהפריד נקודות חיבור אחרות מלבד ראש עצב הראייה.
- כשהרשתית מעוגנת בראש עצב הראייה, המשיכו לשתק את הרקמה והשתמשו בזוג המלקחיים השני כדי לקבץ את העין מתחת לראש עצב הראייה.
- בדוק כדי לוודא שאף אחד מהיקף הרשתית אינו תקוע במצב מקופל עקב עודף זגוגית בזווית שבין הרשתית לכל גוף ריסי שנותר. במידת הצורך, שטפו את החדר עם PBS באמצעות צינור ההעברה כדי להסיר פסולת נוספת, והשתמשו בעדינות במברשת כדי להתיר את הרקמה ולסלק עודפי זגוגית, תוך הקפדה לא למשוך את הרקמה יתר על המידה.
- כאשר הרשתית חשופה משני הצדדים, השתמש במספריים הקפיציים כדי לבצע סדרה של חתכים מקלים, המרוחקים כ-90 מעלות זה מזה, הנמשכים בקו ישר מהפריפריה לכיוון ראש עצב הראייה, ונעצרים כ-1 מ"מ מהמרכז. זה ממזער את המעבר של אקסונים של תאי גנגליון ברשתית ברשתית, ומשפר את איכות הצמחים המתורבתים.
- תוך כדי החזקת הרקמה השקועה במקומה, הסר בעדינות את מגבון המעבדה באמצעות מלקחיים כדי למשוך אותו מהרקמה לרוחב לפני הוצאתו מהצלחת. הימנע ממגע עם הרשתית כדי למנוע הידבקות למגבון ואובדן דגימה אפשרי.
- לאחר מכן, המשיכו להחזיק את הרקמה והשתמשו במספריים הקפיציים כדי לנתק את עצב הראייה ישירות מתחת לרשתית, ואז הסירו את שארית העין מהצלחת.
- לאחר שהרשתית מבודדת משאר העין, מלאו צלחת פטרי 35 מ"מ ב-PBS והשתמשו במלקחיים כדי למקם ריבוע מסנן בתחתית כשהצד המט המחוספס יותר פונה כלפי מעלה. הקפד להימנע מקמט המסנן, מכיוון שהוא עלול להפריע לשימוש במסנן כמצע להזזת הרשתית.
- שואבים בעדינות את הרשתית בעזרת צינור ההעברה ומעבירים אותה בזהירות לתבנית 35 מ"מ. תמרן את הרשתית עם המברשת כדי להבטיח שהמשטח הפנימי של הרשתית זקוף, והרקמה מונחת ישירות מעל ריבוע המסנן.
- שאפו לאט PBS מהצלחת עם צינור ההעברה כדי להוריד את הרשתית על המסנן. השהה, במידת הצורך, כדי להתאים מחדש את הרקמה לפני שתמשיך עד שהרשתית תתייצב על המסנן.
הערה: שאיפה מהירה עלולה להניע תנועה רוחבית פתאומית של הרשתית, וכתוצאה מכך נזק או אובדן רקמות. כל הרשתית חייבת לנוח על הריבוע כדי למנוע נזק; עם זאת, אם הרשתית מתייצבת במצב בעייתי, ניתן להוסיף PBS בחזרה לצלחת עד להשעיית הרשתית מחדש, וניתן לנסות הרכבה מחדש. - לאחר שהרשתית התייצבה על המסנן, השתמש במברשת כדי לפרוש את הרשתית ההיקפית שאולי התקפלה. אזנו בזהירות את רמת ה-PBS כך שהרשתית לא תזוז בקלות מהפילטר תוך הקפדה על שיישאר מספיק כדי שהדגימה לא תתייבש והמברשת תוכל לנוע בצורה חלקה מבלי לפגוע ברשתית הפנימית.
- בדוק שוב את הרשתית לאיתור פסולת. כדי למנוע נזק, נקה את הרשתית ללא טיפול ישיר באמצעות צינור ההעברה כדי לטפטף PBS על הרשתית מגובה של כ-1 ס"מ מעל הרקמה. זה אמור לשטוף את כל הפסולת שנותרה, אך אם מוסיפים יותר מדי PBS למנה, הרשתית עלולה לצוף בחזרה למעלה. אם זה קורה, בצע שאיפה שוב כדי להרכיב מחדש את הרקמה.
הערה: ניתן ליצור דגימות 'דמה' על ידי העברת רשתית לצלחת של 24 בארות לקיבוע, חסימה/חדירות וצביעת נוגדנים כמתואר במקום אחר21. בקרות דמה אלה שימושיות לפתרון בעיות של פגיעה מכנית ברשתית שעלולה להתרחש במהלך הבידוד.
3. העברה למדיה תרבותית ותחזוקה
- סגור את המכסה של צלחת ה-35 מ"מ להובלה לארון הבטיחות הביולוגית, תוך שמירה על מפלס הכלי כדי למנוע עקירת הרשתית מהמסנן. אם זה קורה, טען מחדש כמפורט לעיל.
- הנח את צלחת ה-35 מ"מ הסגורה המכילה את הרשתית בארון הבטיחות הביולוגית, הקפד לא לגעת בציוד או במשטחים בתוך הארון לפני חיטוי או החלפת כפפות.
- טהר כפפות באתנול ו/או החלף אותן, ולאחר מכן העבר את צלחת 6 הבארות הטעונה מראש במדיה explant מהחממה לארון הבטיחות הביולוגית. בצע את שלבים 3.4 ו-3.5 בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, באמצעות הכלים שהוצבו שם במהלך שלב 1.1.
- הסר את המכסה של צלחת 35 מ"מ המכילה את הרשתית והשתמש במלקחיים זוויתיים כדי להרים בזהירות את ריבוע המסנן מבלי לגעת ישירות ברשתית. הסר את המכסה של צלחת 6 הבארות ומקם את המסנן מעל מרכז התוספת של באר מתאימה, ולאחר מכן הורד אותו לאט לתוך המדיה. הרשתית תתנתק מהפילטר במהלך שלב זה ותצוף ממש מתחת לממשק האוויר-נוזל.
- לאחר שהרשתית והמסנן נפרדו, הרחיקו לאט את המסנן מהרשתית והוציאו אותו מהמדיה. בעזרת פיפט של 1 מ"ל, הסר 500 מיקרוליטר של מדיה מהתוסף כדי להבטיח שהרשתית שוכבת שטוחה על ידי לכידתה בין רצפת התוסף לממשק האוויר-נוזל.
- החזר את המכסה על הצלחת והחזיר אותו לחממה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2, תוך הקפדה על שמירה על הרשתית ליד מרכז הבאר. ניתן לשמור עד 6 רשתית בצלחת אחת.
הערה: אם שומרים צמחים למשך 24 שעות או פחות, ניתן להשאיר אותם בחממה עד סוף הניסוי. אם נשמרים לפרקי זמן ארוכים יותר, מומלץ להחליף 50% במדיה לאחר יום אחד במבחנה ובימים לסירוגין לאחר מכן.
4. קיבוע לצביעה חיסונית (אופציונלי)
- אם מבצעים צביעה חיסונית, עיין בשלבים הבאים לקיבוע; בעוד שניתן לבצע צביעה חיסונית באמצעות פרמטרים שפורטו קודם לכן עבור רשתית21 שטוחה, קיבוע הרשתית המושתלת דורש שיקולים ספציפיים.
- הסר את תוספות תרבית התאים עם צמחים ומדיה מצלחת התרבות בת 6 הבארות והנח אותם על משטח לא נקבובי (כגון מכסה הפלסטיק של צלחת התרבית) שניתן להיפטר ממנו כראוי לאחר הקיבוע, מכיוון שהתוספות נקבוביות מעט וכמויות קטנות של קיבוע יעברו למשטח הבסיסי הזה.
- הסר בעדינות את אמצעי התרבית מהתוספות, ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לכל אחד. תן לרשתית לתקן במשך 15 דקות במכסה אדים, ואז הסר PFA והשליך אותו בהתאם למדיניות המוסדית.
זהירות: פרפורמלדהיד מסוכן וקודמן לפורמלדהיד, מסרטן ידוע. היזהר ובצע קיבוע במכסה אדים עם אמצעי זהירות מתאימים. - שטפו את הרשתית 3 פעמים (למשך 5 דקות כל אחת) עם PBS כדי להסיר PFA, ולאחר מכן השתמשו בצינור העברה שונה כדי להעביר את הרשתית ב-PBS לבארות בודדות בצלחת של 24 בארות לחסימה, חדירות וצביעה חיסונית כמתואר במקום אחר21. השלך פלסטיק מזוהם ב-PFA (קצות פיפט, תוספות והמשטח הלא נקבובי המשמש במהלך הקיבוע) בהתאם למדיניות המוסדית.
הערה: ניתן לשמור את צינור ההעברה להעברת רשתית קבועה ומוכתמת למגלשה להרכבה והדמיה. למרות שלא היה אמור להיות לו מגע ישיר עם PFA, מומלץ להשתמש בצנרת העברה שונה לטיפול ברקמות חיות וקבועות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בקנה מידה מאקרוסקופי, הרשתית המושתל נותר ללא שינוי בנקודות זמן של יום אחד ושלושה, אם כי בפעם האחרונה הן הופכות לשבריריות יחסית, מה שמחייב טיפול זהיר לפני קיבוע או נקודות קצה ניסיוניות אחרות. הרשתית צריכה להיות שטוחה יחסית, ללא קיפול (מה שעלול לגרום להפרעה מקומית לדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים), וצריכה להיות תלויה במדיה בין ממשק האוויר-נוזל לתוספת תרבית התא. ביום השלישי עלול להיווצר פס קלוש בתחתית התוסף מתחת לרקמה התלויה; בדיקה עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ברייטפילד מצביעה על כמות מתונה של נשירה של פסולת תאית, ככל הנראה המ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גישות תרבית אורגנוטיפית32 כגון אקספלנטים ברשתית רותמות את הגמישות הניסיונית וזמן האספקה המהיר של תרבית תאים תוך שמירה על חלק ניכר מההקשר באתרו של מחקרי in vivo , מה שהופך אותם לדרך רבת עוצמה לחקירת אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים. אנו מציגים פרוטוקול זה כנקודת כניסה לחוקרים שעשויים להיות בעלי ניסיון משמעותי עם העין ומרגישים בנוח לתפעל רשתית קבועה אך לא חדשה; לכן, התמקדנו בהפחתת האתגרים הטכניים והשונות הקשורים לבידוד וטיפול, שהניסיון שלנו חשף כמ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
M.A.M. נתמך על ידי NIH/NEI R01EY035312, פרס זרז לריפוי של הקרן לחקר גלאוקומה, קרן מלזה מ. ופרנק תיאודור בר, קרן רוברט מ. סינסקי, קרן הצדקה של משפחת רוטגרס וקרן ב.ל. מאנגר. P.F.C. נתמך על ידי NIH/NEI 2T32EY007145. עבודה זו התאפשרה גם על ידי מענק ליבה של NIH למחקר ראייה P30 EY003176. איור 1 נוצר עם Biorender. המחברים רוצים להודות לד"ר נאסיר אודין על המשוב על כתב היד ולד"ר צ'יורונג ג'ו על הסיוע והתמיכה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #11 להבי אזמל | בארד-פרקר | 3,71,311 | |
| 1 מ"ל פיפט ('Pipetman P1000') | גילסון | F144059M | |
| צלחת פטרי 100 מ"מ | פלקון | 351029 | |
| 16% פרפורמלדהיד | טד פלה בע" | 18,505 | מדולל ל-4% לקיבוע |
| 24 באר פלקון פלקון | 353047 | לקיבוע, חסימה ו דגירה של נוגדנים | |
| 35 מ"מ צלחת פטרי | Falcon | 351008 | |
| צלחת 6 בארות וערכת הכנסה | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-545-152 | 1:800 דילול |
| Alexa Fluor 594 חמור נגד חולדות IgG (H+L) נספג מאוד | Invitrogen | A-21209 | 1:800 דילול |
| Alexa Fluor 594-F(ab')2 חמור נגד עכבר IgG (H+L) | מעבדות ג'קסון למחקר חיסוני, בע"מ | 715-586-150 | 1:800 דילול |
| Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | 1:800 דילול |
| Alexa Fluor 647-F(ab')2 חמור נגד עוף IgY (IgG) (H+L) | מעבדות ג'קסון למחקר חיסוני, בע"מ | 703-606-155 | 1:800 דילול |
| מלקחיים זוויתיים ('5/45') | FST / Dumont | 11251-35 | |
| נוגדן נגד Brn3a (עכבר) | Chemicon | MAB1585 | 1:200 דילול |
| נוגדן נגד CD206 (חולדה) | Biorad | MCA2235 | 1:200 דילול |
| נוגדן נגד GFAP (עוף) | Abcam | ab4674 | 1:1000 דילול |
| נגד Iba1 נוגדן (ארנב) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | 1:500 דילול |
| אנטי-Tmem119 נוגדן (שרקן) | מערכות סינפטיות | 400 004 | 1:500 דילול |
| B-27, 50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| מלקחיים מעוקלים קהים ('Extra Fine Graefe)FST | 11152-10 | ||
| סרום בקר אלבומין | סיגמא-אולדריץ' | A9647 | השתמש ב-1% w/v לחסימה ודגירת נוגדנים |
| ערכת סינון (0.2 ומיקרו; m קרום aPES, מסנן עליון בקבוק 150 מ"ל) | FisherScientific | FB12566508 | |
| מברשת עדינה, גודל 3/0 | Princeton Art & Brush Co. | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (Thermofisher) | 35050061 | |
| מגבוני מעבדה (מגבוני קים) | KIMTECH | 34155 | |
| N-2, 100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobasal-A Medium, מינוס פנול | אדום Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| סרום חמור רגיל | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 017-000-121 | שימוש ב-10% לחסימה ודגירת נוגדנים |
| פניצילין-סטרפטומיצין | גיבקו (תרמופישר)15140122 | ||
| טיפים לפיפט, 1000 ומיקרו; L | TipOne | 1126-7810 | |
| מספריים קפיצים ('Cohan-Vannas') | FST | 15000-11 | |
| מים סטריליים ('Dnase, Rnase free') | Invitrogen | 10977-015 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| מלקחיים ישרים ('מיני') | FST / Dumont | 11200-14 | |
| פיפט העברה, 5.8 מ"ל | FisherScientific | 13-711-9AMMD | |
| Triton X-100 | Thermo Scientific Chemicals | A16046. שימוש | ב-AP ב-0.5% לחסימה ודגירת נוגדנים |
מקורות
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
- Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
- Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
- Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
- Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
- Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
- Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
- Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
- Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
- Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
- Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
- Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
- Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
- Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
- Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
- Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
- Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
