מאמר שיטה

בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף

DOI:

10.3791/68483

⸱

8 ביולי 2025

 ,  , 
1Chemistry Department, University of Central Florida

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפטמרים פלואורסצנטיים מבוססי DNA (FLAPs) מבטיחים לבדיקות ביואנליטיות מכיוון שהם מספקים קריאת אות פלואורסצנטי בעלות נמוכה ללא צורך בתיוג של מדווחי אותות חומצות גרעין עם פלואורופורים ו/או מרווה, בניגוד לבדיקות הכלאה קונבנציונליות המשמשות לזיהוי מיידי של חומצות גרעין. במקום זאת, FLAPs קושרים באופן לא קוולנטי ליגנדים צבעוניים, המציגים פלואורסצנטיות נמוכה באופן מהותי בתמיסות מימיות, אך הופכים לפולטים מאוד עם קשירת FLAP. פרוטוקול זה מתאר אלגוריתם לתכנון חיישני אפטמר מוארים מפוצלים (SLAS) תוך שימוש ב-DAP-10-42, ה-DNA FLAP היעיל ביותר שדווח עד כה. כאשר הוא מצויד ברצפי חומצות גרעין המשלימים ליעד חומצת גרעין מעניין, SLAS הוא כלי מבטיח לניתוח חומצות גרעין המאפשר זיהוי ספציפי לרצף של מטרות חומצות גרעין עם סלקטיביות עד נוקלאוטיד אחד כדי לאפשר ניתוח של החלפות נוקלאוטידים בודדים (SNS). SLAS מציעים את היתרון של קריאת אותות מבוססת פלואורסצנטיות ללא תוויות, אותה ניתן למדוד עם ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי קונבנציונאלי מבוסס קובטה, פלואורומטר נייד, או לצפות חזותית בעת עירור עם מקור אור כף יד. גישת SLAS מועילה ליישומי חישה ביולוגית באבחון מחלות, ניטור סביבתי ומחקר ביו-מולקולרי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח חומצות גרעין באמצעות בדיקות הכלאה מבוצע באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת רצפי DNA/RNA ספציפיים1. אחת מבדיקות ההכלאה המוצלחות ביותר היא בדיקת המשואה המולקולרית (MB), שהיא DNA בצורת סיכת ראש
אוליגונוקלאוטיד מסומן עם פלואורופור ומרווה בטרמיניהנגדי 2,3. זה באופן מיידי (ללא צורך לשטוף את קומפלקס יעד הבדיקה מעודף הבדיקה) מזהה נוכחות של רצף חומצות גרעין המשלים לשבר הלולאה של הגשושית ומשמש בדרך כלל ב-PCR כמותי (qPCR). הצורך לחבר קוולנטית שני צבעים - הפלואורופור והמרווה - לרצף האוליגו-נוקלאוטידים של הגשושית מגדיל את העלות, במיוחד כאשר יש צורך בבדיקה חדשה של MB המכוונת לרצף חומצות גרעין חדש. לחלופין, בדיקת ה-MB יכולה לשמש כמדווח אותות בפורמט בדיקת הכלאה רב-רכיבית (מפוצלת), שבה שני אוליגונוקלאוטידים לא מסומנים מקיימים אינטראקציה הן עם המטרה והן עם מדווח בדיקת ה-MB4. גישת הבדיקה הרב-רכיבית משפרת את הסלקטיביות לזיהוי חומצות גרעין ומשפרת את קשירת הגשושית למטרות מובנות 5,6,7, גישה זו, עם זאת, אינה מבטלת את הצורך בתיוג קוולנטי של המדווח עם פלואורופור8.

אפטאמרים מוארים פלואורסצנטיים (FLAPs)9 הם אפטמרים בעלי זיקה לצבעים רגישים לסביבה פלואורסצנטיים נמוכים (פלואורוגנים), כאשר קשירה על ידי FLAP משפרת את הקרינה של סעפת הפלואורוגן. בניגוד לבדיקות ומדווחי אותות עם תווית פלואורסצנטית, FLAPs אינם דורשים תיוג קוולנטי של רכיבי חישה עם צבע אחד או יותר ובכך מציעים את היתרון של זיהוי פלואורסצנטי ללא תווית10. זה חשוב במיוחד בשלב האופטימיזציה כאשר יש לבדוק עשרות מבנים של חומצות גרעין כדי להשיג ביצועי בדיקה משביעי רצון. יתר על כן, ניתן לבצע אופטימיזציה של מבחני FLAP על ידי התאמת הריכוז של חיישן פלואורוגן ו/או FLAP במקום לשנות את עיצוב החיישן. יתרונות אלה יכולים להיות משמעותיים עבור מעבדות מחקר והוראה בתקציב נמוך. FLAPs DNA מבטיחים במיוחד כמדווחי אותות של בדיקות הכלאה מרובות רכיבים המכונים חיישני אפטמר אור מפוצלים (SLASs)11. ה-DNA FLAP היעיל ביותר שדווח עד כה הוא DAP-10-42, שנבחר במקור כדי לשפר את הקרינה של צבעי דפוקסיל סולפוניל12, עם יכולת מופקרת לקשור ולשפר את הקרינה של מגוון צבעי אריל מתאן (למשל, אורמין O, AO; סגול קריסטל, CV)13. DAP-10-42 הוסב ל-SLAS כדי לשמש לניתוח חומצות גרעין 13,14,15.

מטרת השיטה המתוארת כאן היא לאפשר ניתוח ספציפי לרצף של מטרות חומצות גרעין מעניינות באמצעות גדילי SLAS ללא תוויות וצבע פלואורוגני כמרכיב חיץ. פרוטוקול זה מתאר אלגוריתם לתכנון SLAS המבוסס על DAP-10-42 ומדגיש את ביצועי SLAS לזיהוי סלקטיבי ביותר של רצפי חומצות גרעין הנבדלים זה מזה בנוקלאוטיד בודד.

בדיקת זיהוי חומצות הגרעין SLAS דורשת שני אוליגונוקלאוטידים של DNA לא מותאמים אישית המשמשים בריכוז סופי של 0.5-1 מיקרומטר לביצועים מקסימליים. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בצבע Auramine O (AO) זמין מסחרית כפלואורוגן. ריכוז ה-AO הסופי בבדיקה נע בין 1-10 מיקרומטר כדי להבטיח שיפור פלואורסצנטי גבוה בנוכחות יעד חומצת גרעין ספציפית מעל הריק (היעדר המטרה; איור משלים 1). המרכיבים הדרושים של מאגר הבדיקה הם יוני אשלגן ומגנזיום (איור משלים 2). יוני אשלגן (1.25-40 מ"מ) מייצבים את תחום ה-G-quadruplex המוצע של ה-FLAP המשמש כמדווח אותות. יוני מגנזיום (2.5-50 מ"מ) מפחיתים את הדחייה של קבוצות פוספט טעונות שלילית באינטראקציות SLAS-מטרה. הטמפרטורה של בדיקת ה-SLAS באמצעות הרצפים המדווחים עבור תחום דיווח האותות לא תעלה על 28 מעלות צלזיוס כדי למנוע אובדן ביצועים16.

SLAS תואם למטרות של חומצות גרעין חד-גדיליות, כגון אמפליקונים של DNA של PCR אסימטרי או תגובת הגברה איזותרמית של DNA (למשל, הגברת פולימראז רקומבינאז, RPA17), תוצרי RNA מהגברה מתווכת שעתוק (TMA) או הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין (NASBA)18, ומולקולות RNA מקוריות כגון miRNA, rRNA או ncRNA). ניתן לזהות שינויים ברצף הנוקלאוטידים של המטרה עד לנוקלאוטיד בודד באמצעות גישת SLAS13,14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון חיישן אפטמר אור מפוצל (SLAS) עם DAP-10-42 כמדווח אותות

  1. תכנן את הרצפים של שני גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA לא מותאמים המהווים SLAS. השתמש במקטע המכיל נוקלאוטידים (nts) 4,6-39 של DAP-10-42 (טבלה 1, איור 1A).
  2. המר את הרצף של גזע 1 (nts 1-8 ו-36-42) לגבעול 1' על ידי הסרת שאריות תימין בולטות במיקום nt 5, קיצור הגבעול ל-4 bp (nts 4,6-8 ו-36-39), והוספת מסוף C-G bp (איור 1A, שלב 1). בנוסף, אחד מגדילי ה-SLAS מכיל nts 9-29 מרצף הליבה DAP-10-42, בעוד שגדיל SLAS אחר מכיל nts 30-35 של הרצף.
  3. הרחב את הרצף הטרמינלי 3' של המקטע המכיל nts 9-29 עם d(GGTCAT), ואת הרצף הטרמינלי 5' של שבר nts 30-35 עם d(ATGACC) ליצירת גזע 2 של 6 bp (איור 1A, שלב 2).
    הערה: זוגות הבסיסים T4-A39, A6-T38, C7-G37 ו-G8-C36 של גזע 1 ב-DAP-10-42 נדרשים לפונקציית ההארה של ה-aptamer. ניתן לשנות את רצף הגבעול 1' רק ב-bp הטרמינל ויכול להיות זוג בסיסים G-C, A-T, T-A או להרחיב עם 1-2 זוגות בסיסים לפי הצורך. הרצף של גזע 2 הוא שרירותי וניתן לשינוי. עם זאת, מומלץ לשמור על היציבות התרמודינמית של גזע 2 אלא אם כן טמפרטורת הבדיקה עולה מעל 28 מעלות צלזיוס. קיצור או ערעור יציבות אחר של גזע 2 מונע קשירת צבע מוקדמת ללא מטרה אם נצפה רקע גבוה של מבחן פלואורסצנטי מבוסס SLAS. פיצול של רצף הנוקלאוטידים DAP-10-42 בין nts 28-29, 27-28 או 26-27 במקום nts 29-30 מותר גם כן (איור 1B).
  4. כדי להתאים את ה-SLAS המתוכנן למטרה או לעניין של חומצת גרעין, הרחב את גזע 1' עם רצפי DNA המשלימים לשברי קשירת המטרה-מטרה (זרועות) באמצעות מקשרים d(TT) (איור 1A, שלב 3). זה מניב את רצפי הגדילים SLAS-U ו-SLAS-S המרכיבים את הבדיקה.
  5. הפוך את זרוע קשירת המטרה של SLAS-S למשלימה למקטע 7-10-nt של המטרה המכיל את אתר ה-SNS, ואת זרוע קשירת המטרה של SLAS-U - משלימה למקטע 15-25 nt של המטרה הסמוך לזרוע קשירת המטרה של SLAS-S (טבלה 1).
    הערה: זה אופציונלי אם לחבר את זרוע קשירת המטרה של SLAS-S ל-nt 4 או nt 39 של רצף DAP-10-42 (איור 1, זרוע 1 או זרוע 2, בהתאמה).
  6. הערך את טמפרטורת ההיתוך (Tm) של הדופלקסים בין היעד המעניין לבין הזרועות קושרות המטרה של SLAS-S ו-SLAS-U באמצעות שרת האינטרנט של UNAFold (unafold.org)19.
    1. לחץ על הכרטיסייה DINAMelt בחלק העליון של דף האינטרנט; עבור אל יישומים ובחר היברידיזציה של התכה דו-מצבית (איור משלים 3A). בדף היברידיזציה של התכה דו-מצבית, הזן אחד מהרצפים האינטראקטיביים בתיבה השמאלית ואחר בתיבה הימנית (איור משלים 3B). ודא ששני הרצפים הם בסדר של 5 'עד 3'. באפשרותך להזין יותר מזוג אחד של רצפים המקיימים אינטראקציה על-ידי הפרדתם באמצעות נקודה-פסיק.
    2. בתחתית העמוד, ציין את טמפרטורת הבדיקה (22 מעלות צלזיוס), ריכוזי הקטיונים החד-ערכיים והדו-ערכיים (20 מ"מ ו-25 מ"מ, בהתאמה) כדי להתאים לתנאי הבדיקה. ציין את ריכוז הרצפים האינטראקטיביים.
    3. לחץ על שלח (איור משלים 3B). שימו לב לתוצאות הכוללות את שינוי האנרגיה של גיבס, שינוי האנטלפיה ושינוי האנטרופיה של הכריכה, כמו גם את ערכי ה-Tm עבור הדופלקסים המתאימים (איור משלים 3B).
    4. ודא שערכי ה-Tm עבור הדופלקסים בין היעד התואם במלואו (M) לבין זרועות קשירת המטרה של SLAS-S ו-SLAS-U נמצאים מעל טמפרטורת הבדיקה, שהיא 22 מעלות צלזיוס בפרוטוקול הנוכחי. כאן, ערכי ה-Tm היו 32.2 מעלות צלזיוס ו-74.4 מעלות צלזיוס, בהתאמה (איור משלים 3C).
    5. ודא שלדופלקס בין SLAS-S למטרה לא תואמת (MM) המכיל SNS יש Tm מתחת לטמפרטורת הבדיקה. זה מבטיח סלקטיביות גבוהה של זיהוי מטרת הבדיקה, ומונע מהפלואורוגן AO לאותת על נוכחות אנליט חומצת הגרעין הממוקדת אם הוא מכיל SNS במקטע קשירת SLAS (איור 2). כאן, ה-Tm היה 21.3 מעלות צלזיוס (איור משלים 3C), וזה היה מספיק כדי להבחין בין אי ההתאמה לקומפלקס התואם.
    6. התאם את הרצפים של זרועות קשירת המטרה על ידי קיצור או הרחבה של השברים המשלימים למטרה, במידת הצורך, כדי לעמוד בדרישות היציבות שצוינו.
  7. השג את הגדילים המעוצבים SLAS-S ו-SLAS-U מכל ספק מסחרי המספק אוליגונוקלאוטידים של DNA בהתאמה אישית או סנתז את גדילי ה-DNA בתוך הבית באמצעות סינתיסייזר אוליגונוקלאוטידים אוטומטי.

figure-protocol-1
איור 1: המרה של אפטמר מואר פלואורסצנטי (FLAP) DAP-10-42 לחיישן אפטמר מואר מפוצל (SLAS). (א)המבנה המשני של DAP-10-4212 נחזה על ידי יישום קיפול DNA של שרת האינטרנט UNAFold19 ב-22 מעלות צלזיוס, 20 מ"מ Na+, 25 מ"מ מ"ג2+. האפטמר כולל מבנה משני של סיכת ראש עם ליבה המתקפלת ככל הנראה למוטיב G-quadruplex המיוצב על ידי גזע 1. כדי ש-DAP-10-42 יומר ל-SLAS, (1) גזע 1 של האפטמר מתקצר ל-4 bp ומשני צדיו G-C bp נוסף כדי ליצור גזע 1'; (2) רצף הליבה מחולק בין NTS 29 ו-30, כאשר הצדדים 3' ו-5' של האתר המפוצל מורחבים עם רצפים משלימים d(GGTCAT) ו-d(ATGACC), בהתאמה, כדי ליצור גזע 2; (3) STEM 1' מורחב עם הרצפים המשלימים לשברים הסמוכים של מטרה מעניינת - זרועות קשירת מטרה, עם מקשר d(TT) בין הזרועות קושרות המטרה לתחום דיווח האותות של הגשושית. (B) הליבה יכולה גם להיות מפוצלת בין nts 28-29, 27-28 או 26-27 ללא אובדן משמעותי של האות ו/או עלייה בקפלי הקרינה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2: מנגנון יצירת אותות SLAS. SLAS מורכב משני גדילים - SLAS-U ו-SLAS-S - וצבע פלואורוגני (למשל, Auramine O; AO). בהיעדר יעד חומצת גרעין מעניין, שני הגדילים נמצאים במצב מנותק ואינם מסוגלים לקשור את הצבע; לא נצפה אות (מרכז). בנוכחות יעד M תואם במלואו, גם SLAS-U וגם SLAS-S מתכלאים למקטע הסמוך של M כדי להביא את שברי הליבה בסמיכות. זה מאפשר היווצרות אתר קשירת הצבע. קשירת AO משפרת את הקרינה שלו, הנמדדת כקריאת אות פלואורסצנטי (משמאל). בנוכחות יעד לא תואם MM המכיל החלפת נוקלאוטיד יחיד (SNS) במקטע המקיים אינטראקציה עם SLAS-S, רק SLAS-U יכול להכליא ליעד MM , בעוד SLAS-S נמצא במצב מנותק. זה מונע את היווצרות אתר קשירת הצבע, ולא נצפה אות (מימין). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הגברה של הרצף הממוקד

  1. להגביר קטע של הגן שיש לנתח באמצעות בדיקת SLAS. עבור PCR או RPA amplification, השתמש בתנאים אסימטריים (למשל, כאשר ה-Forward Primer נוסף בעודף פי 10 מעל הפריימר ההפוך) כדי ליצור מגבר חד-גדילי. כדי להגביר מקטע של 126 nt מהגן NANOGP8 באמצעות Linear After The Exponential (LATE) PCR20, השתמש ברצפי הפריימר המפורטים בטבלה 2. כאן, נעשה שימוש בתבנית DNA חד-גדילית (תבנית NANOGP8 או תבנית G1423C, טבלה 2) המתאימה למקטע 126-nt של הגן. התבנית סונתזה בהתאמה אישית על ידי Integrated DNA Technologies, Inc.
    1. הכן תגובת PCR של 100 מיקרוליטר על ידי ערבוב של 10 מיקרוליטר של מאגר תגובה סטנדרטי של 10x Taq, 2 מיקרוליטר של תערובת dNTP של 10 מ"מ (כדי לקבל את הריכוז הסופי של 0.2 מ"מ), 10 מיקרוליטר של פריימר קדימה של 10 מיקרומטר ו-10 מיקרוליטר של פריימר הפוך של 1 מיקרומטר (לריכוז הסופי של 1 מיקרומטר ו-0.1 מיקרומטר, בהתאמה), 0.5 מיקרוליטר של 5U/μL Taq DNA פולימראז, תבנית DNA ומים נטולי נוקלאז. עבור פקד ללא תבנית, הוסף מים במקום התבנית.
    2. השתמש בתנאי התרמו-סייקלינג הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 45 מחזורים של (1) דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, (2) חישול פריימר ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, (3) הארכת פריימר ב-68 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; והארכה סופית ב-68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש בטכניקות הגברה מבוססות שעתוק כגון NASBA18 במקום PCR או RPA, במיוחד אם תבנית RNA זמינה להגברה. NASBA מייצרת אמפליקון RNA חד-גדילי בריכוז תוצר סופי בתחום המיקרו-מולרי, שהוא גבוה מספיק כדי לשמש בבדיקת SLAS במורד הזרם ללא ריכוז תוצר.
  2. זרז את הדגימות המוגברות באתנול על ידי הוספת נפח 0.1x של 3 M נתרן אצטט (pH 5.5) ונפח פי 3 של אתנול. דגירה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה, צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000-18,000 x גרם למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
  3. שטפו את הגלולה עם 70% אתנול, צנטריפוגה מחדש והשליכו שוב את הסופרנטנט. יבש את הגלולה באוויר והמיס ב-10 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לשימוש בבדיקת SLAS.

3. בדיקת פלואורסצנטיות באמצעות SLAS

  1. הכן פתרונות מלאי של AO (0.1 מ"מ ב-DMSO, 10x), SLAS-S (10 מיקרומטר במים נטולי נוקלאז, 10x), SLAS-U (10 מיקרומטר במים נטולי נוקלאז, פי 10) ומאגר בדיקה פי 4 (80 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ MgCl2, 80 מ"מ KCl).
    הערה: יוני אשלגן נחוצים כדי לייצב את מוטיב ה-G-quadruplex המשוער של האפטמר, שהוא חלק מאתר קשירת הצבע. די ב-1 מ"מ KCl (ב-25 מ"מ MgCl2) במאגר בדיקה 1x כדי להבטיח שיפור פלואורסצנטי פי ~14 בנוכחות המטרה הספציפית M מעל הריק (דגימה ללא מטרה; איור משלים 2B). יוני מגנזיום מייצבים את האינטראקציות של גדילי חומצות הגרעין (בין SLAS-S, SLAS-U והמטרה). הריכוז של Mg2+ במאגר הבדיקה 1x צריך להיות לפחות 5 מ"מ (ב-20 מ"מ KCl; איור משלים 2C,D). תמיסת המלאי של AO (~1 מ"מ) מוכנה ב-DMSO. ריכוזי המלאי של SLAS-S ו-SLAS-U הם שרירותיים וניתנים להתאמה במידת הצורך כל עוד הריכוזים הסופיים של הגדילים נשמרים (ראה את הרציונל לבחירת ריכוז ה-SLAS הסופי בדיון).
    זהירות: AO מזיק בבליעה, רעיל במגע עם העור וחשוד כגורם לסרטן. ללבוש תמיד כפפות בעת עבודה עם פתרונות AO. השקילה של AO והכנת פתרונות המלאי שלה צריכה להיעשות מתחת למכסה המנוע הכימי.
  2. הכן את תערובת המאסטר המכילה את כל רכיבי הבדיקה מלבד המטרה. חשב את נפח המיקס הראשי (מיקס V) על ידי הכפלת נפח הדגימה (60 מיקרוליטר) במספר הדגימות ועוד אחת (n+1):
    figure-protocol-3
    מספר הדגימות n צריך לכלול בקרות שליליות וחיוביות נחוצות.
  3. שלב 0.25x Vmix μL של 4x Assay Buffer, 0.1x Vmix μL של 0.1 mM AO, 0.1x Vmix μL של 10 μM SLAS-S, ו-0.1x Vmix μL של 10 μM SLAS-S. הוסף מים נטולי נוקלאז לנפח הסופי של figure-protocol-4 כך שיתאים לנפח היעד שנוסף בשלב 3.4. מערבולת וקצרה צנטריפוגה את תערובת המאסטר. יש להשתמש ב-50 מיקרוליטר של תערובת המאסטר ל-n צינורות דגימה.
    הערה: ניתן לכוונן את עוצמת הקול לדוגמה בהתאם למאפייני המכשיר המשמש לזיהוי האות הפלואורסצנטי. ניתן לכוונן את נפח תערובת המאסטר המועברת לצינורות דגימה על סמך נפח היעד שנוסף בשלב 3.4. יש להתאים את נפח המים נטולי הנוקלאז שנוספו להכנת תערובת המאסטר בהתאם. לדוגמה, אם הדגימה המכילה יעד מתווספת ב-10% (V/V) מנפח הדגימה הסופי, יש להוסיף מים לתערובת המאסטר עד 0.9xV.
  4. השתמש בדגימה אחת כפקד ללא יעד (ריק) ובדגימה אחת כפקד חיובי. הוסף 10 מיקרוליטר מהדגימה המכילה מטרה לתערובת המאסטר (50 מיקרוליטר) כדי להפוך את נפח הדגימה הסופי של 60 מיקרוליטר המכיל 10-1000 ננומטר ליעד. עבור הריק, השתמש במים נטולי נוקלאז (10 מיקרוליטר) במקום המטרה. לבקרה חיובית, השתמש באוליגו-נוקלאוטיד DNA סינתטי המכיל את הרצף הממוקד (למשל, יעד M, טבלה 1). הוסף 10 מיקרוליטר של בקרה של 0.6-3 מיקרומטר כדי ליצור ריכוז סופי של 0.1-0.5 מיקרומטר.
    הערה: פלואורסצנטיות גבוהה בבקרה חיובית זו מבטיחה שהבדיקה פועלת כצפוי, גם אם נצפה אות שלילי עבור הדגימות הלא ידועות שנבדקו.
  5. מערבבים את הדגימות ומסובבים באמצעות מיקרו-צנטריפוגה. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 10-60 דקות. האות גדל רק ב-<15% בין 40 דקות ל-60 דקות (איור 3).
  6. מדוד את הקרינה של הדגימות ב-540 ננומטר בעת עירור ב-475 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי.
    הערה: אפשר להשתמש בפלואורומטר נייד המודד פלואורסצנטיות בצינורות PCR בעלי קירות דקים. הפלואורומטר צריך להיות בעל מסנני עירור ופליטה המתאימים לזיהוי פלואורסצנטיות AO. דוגמה למסנן עירור מתאים הוא מעבר קצר של 495 ננומטר. דוגמה למסנן פליטה מתאים היא 510-580 ננומטר. לחלופין, ניתן לצפות באות באופן ויזואלי עם עירור של פלואורסצנטיות AO בדגימה עם מקור אור UV או כחול.
    זהירות: אם נעשה שימוש ב-UV lamp יש להרכיב משקפי מגן UV.

figure-protocol-5
איור 3: תלות בזמן של יצירת האותות עבור SLAS-29U/30S. דגימה המכילה AO, SLAS-29U ו-SLAS-30S נותחה באמצעות מצב קינטי של ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי (עירור ב-475 ננומטר, פליטה ב-540 ננומטר, חריצי עירור/פליטה של 5 ננומטר) במשך 60 דקות. בזמן של 5 דקות (מסומן בחץ), המטרה M נוספה לדגימה. הנתונים נמדדים בממוצע משני ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביצועים של SLAS תוך שימוש בליבת DAP-10-42 כמדווח אותות הודגמו באמצעות בדיקה שנועדה לחקור מקטע של גן NANOGP8 החשוב להתקדמות גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM), צורה אגרסיבית של סרטן המוח21. דווח כי מקטע זה מכיל SNS במטען ה-DNA של אקסוזומים שמקורם בתאי סרטן22. לכן, ה-SLAS הותאם לאתר ה-SNS של הגן. מטרות DNA סינתטיות M או MM המחקות את רצף הגן NANOGP8 המכיל G או C ב-nt 1423 (GenBank NM_001355281.2), בהתאמה, שימשו להדגמת ביצועי SLAS בפרוטוקול זה. יע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול המדווח, השלבים הקריטיים כוללים (i) תכנון SLAS; (ii) טמפרטורת הבדיקה; (iii) נוכחות של קטיוני מתכת חד-ערכיים ודו-ערכיים (K+ ו-Mg2+); (iv) ריכוזים של גדילי SLAS.

עיצוב SLAS
בתכנון גדילי SLAS, חשוב לקחת בחשבון את היציבות התרמודינמית של הקומפלקסים הנוצרים על ידי גדילי SLAS-S ו-SLAS-U בהיעדר מטרות, ובנוכחות מטרה ספציפית או לא ספציפית (אם יש צורך בהתמיינות SNS). ניתן לווסת את היציבות של קומפלקס SLAS-S/U על ידי שינוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כספים ממשרד המחקר לתואר ראשון של UCF (OUR) עבור AK מוערכים מאוד. העבודה על אופטימיזציה של תנאי LATE-PCR עבור הגן NANOGP8 נתמכת על ידי קרן החדשנות לסרטן בפלורידה (מענק MOABC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אורמין אמ.פ. ביומדיקל 195064צבע פלואורוגני המשמש לדיווח אותות
קארי ליקוי פלואורומטראג'ילנט טכנולוגיותG9800אכדי למדוד את האות הפלואורסצנטי של הדגימות
דימטי סולפוקסידמ.פ. ביומדיקל 196055ממס להכנת פתרונות מלאי של Auramine O
אוליגונוקלאוטידים של DNA (פריימרים, גדילי SLAS, תבנית סינתטית ל-PCR)IDTלא ישיםמיוצר בהתאמה אישית ומותפל על ידי הספק, בשימוש ללא טיהור נוסף
מיקס dNTP, 10 מ"מתרמו-פישר סיינטיפיקR0191לתגובת PCR מאוחרת
מגנזיום כלורידInvitrogenAM9530Gרכיב מאגר; הדרוש לשיוך נכון של גדילי הגשושית עם המטרה המנותחת
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)פישרברנד02-681-320פלסטיק להכנת דגימה
מיקרופיפטה (0.1-2.5 ומיקרו; L)אפנדורףK56877Gמשמש להכנת דגימה
מיקרופיפטה (100-1000 ומיקרו; L)אפנדורףK13160Fמשמש להכנת דגימה
מיקרופיפטה (20-200 ומיקרו; L)אפנדורףJ05253Mמשמש להכנת דגימה
מיקרופיפטה (2-20 ומיקרו; L)אפנדורףG24675Gמשמש להכנת דגימה
מיני צנטריפוגהקורנינג 6770משמש לסיבוב הדגימות 
מים ללא נוקלאז (לא מטופלים על ידי DEPC)תרמו-פישר סיינטיפיקAM9932השתמש בדגימות בבדיקת PCR ו-SLAS
צינורות PCR (0.5 מ"ל)InvitrogenAM9932למדוד פלואורסצנטיות באמצעות פלואורומטר קוונטי
טיפים לפיפט (20-200 ומיקרו; L)VWR76322-150פלסטיק להכנת דגימה
קצות פיפטה (1-10 uL)VWR76322-528פלסטיק להכנת דגימה
אשלגן כלורי InvitrogenAM9640Gרכיב מאגר; דרוש לקיפול נכון של תחום האפטמר המואר הפלואורסצנטי של הגשושית
פלואורומטר קוונטיפרומגהE6150פלואורומטר נייד בעלות נמוכה שיכול לשמש למדידות פלואורסצנטיות
קובטה קוורץסטארנה16.50F-Q-10/Z15לשמש למדידת פלואורסצנטיות באמצעות פלואורומטר Cary Eclipse
Taq DNA פולימראז עם מאגר Taq סטנדרטימעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM0273Sלהגברה של מקטע גן לניתוח באמצעות בדיקת SLAS 
חוצץ Tris-HCl (pH 7.4)בוסטון ביופרודקטסR-314רכיב מאגר
מנורת UVUVP95-0016-14כדי לעורר את AO לתצפית אותות חזותיים
מערבל מערבולתVWR10153-838משמש לערבוב הדגימות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
  2. Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14, 303-308 (1996).
  3. Kolpashchikov, D. M. An elegant biosensor molecular beacon probe: challenges and recent solutions. Scientifica. 2012, 928783(2012).
  4. Kolpashchikov, D. M. A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition. J Am Chem Soc. 128 (32), 10625-10628 (2006).
  5. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110 (8), 4709-4723 (2010).
  6. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. J Am Chem Soc. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  7. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  8. Gerasimova, Y. V., Hayson, A., Ballantyne, J., Kolpashchikov, D. M. A single molecular beacon probe is sufficient for the analysis of multiple nucleic acid sequences. Chembiochem. 11 (12), 1762-1768 (2010).
  9. Gao, T., Luo, Y., Cao, Y., Pei, R. Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications. Analyst. 145, 701-718 (2020).
  10. Du, Y., Li, B., Wang, E. "Fitting" makes "sensing" simple: Label-free detection strategies based on nucleic acid aptamers. Acc Chem Res. 46 (2), 203-213 (2013).
  11. Kolpashchikov, D. M., Spelkov, A. A. Binary (split) light-up aptameric sensors. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (10), 4988-4999 (2021).
  12. Kato, T., Shimada, I., Kimura, R., Hyuga, M. Light-up fluorophore--DNA aptamer pair for label-free turn-on aptamer sensors. Chem Commun. 52 (21), 4041-4044 (2016).
  13. Connelly, R. P., Madalozzo, P. F., Mordeson, J. E., Pratt, A. D., Gerasimova, Y. V. Promiscuous dye binding by a light-up aptamer: Application for label-free multi-wavelength biosensing. Chem Commun. 57 (30), 3672-3675 (2021).
  14. Kikuchi, N., Reed, A., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Split dapoxyl aptamer for sequence-selective analysis of nucleic acid sequence based amplification amplicons. Anal Chem. 91 (4), 2667-2671 (2019).
  15. Wang, L., et al. MicroRNA detection in biologically relevant media using a split aptamer platform. Bioorg Med Chem. 69, 116909(2022).
  16. Gerasimova, Y. V., Nedorezova, D. D., Kolpashchikov, D. M. Split light up aptamers as a probing tool for nucleic acids. Methods. 197, 82-88 (2021).
  17. Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clin Chem. 62, 947-958 (2016).
  18. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003).
  20. Pierce, K. E., Sanchez, J. A., Rice, J. E., Wangh, L. J. Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: primer design criteria for high yields of specific single-stranded DNA and improved real-time detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8609-8614 (2005).
  21. Grochans, S., et al. Epidemiology of glioblastoma multiforme-Literature review. Cancers. 14, 2412(2022).
  22. Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker. PLoS One. 13, e0197782(2018).
  23. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).
  24. Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. Metal cations in G-quadruplex folding and stability. Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).
  25. Chen, R. F. Fluorescence of free and protein-bound auramine O. Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).
  26. Klymchenko, A. S. Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications. Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Split Hybridization ProbeDNA Light Up AptamerSequence Specific DetectionNucleic Acid AnalysisLabel Free FluorescenceSingle Nucleotide SubstitutionFluorescent SpectrophotometerPortable FluorometerMelting Temperature AnalysisTarget Binding Duplex

מאמרים קשורים