מאמר שיטה

מסגרת הדמיה רב-מודאלית לקידום פנוטיפ של תאי סרטן שד חיים ללא תווית

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68498

⸱

22 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג גישה רב-מודאלית המשלבת ספקטרוסקופיה של ראמאן ומיקרוסקופ פאזה טומוגרפית לפנוטיפ נטול תוויות ולא פולשני של תאי סרטן שד אנושיים חיים. הוא כולל צינור ניתוח ידידותי למשתמש ונטול הטיות אנושיות לניתוח מורפו-כימי מהיר וכמותי, המספק תובנות מולקולריות ומבניות מפורטות עם יישומים בחקר הסרטן וביולוגיה של התא.

תקציר

אנו מציגים מיקרו-ספקטרוסקופיה רמאן קונפוקלית (RS) ומיקרוסקופיית פאזה טומוגרפית (TPM) לפנוטיפ מורפו-כימי מהיר של תאי סרטן שד אנושיים (MDA-MB-231). תוך מינוף האופי הלא-הפרעתי של טכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות אלה, לכדנו נתונים מורפו-מולקולריים מפורטים מתאים חיים ונטולי תוויות בסביבתם הפיזיולוגית הטבעית. צינורות עיבוד נתונים ללא הטיה אנושית פותחו כדי לנתח תמונות ראמאן היפרספקטרליות (המשתרעות על פני מצבי ראמאן מ-600 ס"מ-1 עד 1800 ס"מ-1, המאפיינים באופן ייחודי מגוון רחב של קשרים מולקולריים ומבנים תת-תאיים), כמו גם נתונים מורפולוגיים מטומוגרפיות תלת מימדיות של מקדם שבירה (מתן מדידות של נפח התא, שטח הפנים, טביעת הרגל והכדוריות ברזולוציה ננומטרית, לצד מסה יבשה וצפיפות). על ידי פירוק שיטתי של פרטי התא הבודד העשירים ש-RS ו-TPM מספקים, אנו מדגימים, בצורה כמותית, את היתרון של שיטת מיקרוסקופיה רב-מודאלית כזו לפנוטיפ של תאי סרטן שד גידוליים. הכלים שלנו מספקים גם תובנה נוספת לגבי המידע התת-תאי ללא שימוש בתוויות כלשהן. לבסוף, אנו לומדים ודנים בכל מידע ייחודי או מתואם שמערכי נתונים שמקורם ב-RS ו-TPM מציגים. אנו מאמינים שהכלים שלנו וצינורות ניתוח הנתונים הכמותיים שלנו יכולים לחולל מהפכה במשימות פנוטיפ במחקר ביו-רפואי כאשר יש צורך בשיטה מהירה ולא הפרעה על תאים חיים בתרבית, עם פוטנציאל לתרגום עתידי ליישומים קליניים ואבחנתיים.

מבוא

אפיון תאים ופנוטיפ הם היבטים מרכזיים במחקר הביו-רפואי1. היכולת לאפיין תאים הן ברמה המורפולוגית והן ברמה המולקולרית היא בעלת חשיבות עליונה להבנת תפקוד התא, התמיינות ופתולוגיה 1,2,3. הוא מעניין במיוחד בתחום האונקולוגיה, שבו פרופיל תאים מדויק נחוץ לאבחון גידול, קביעת שלב המחלה ובסופו של דבר זיהוי מטרות טיפוליות2. שיטות אפיון תאים מסורתיות אינן יכולות לספק דינמיקה זמנית ומבוססות בדרך כלל על טכניקות פולשניות, כגון צביעה או תיוג, שעלולות להפריע למצב המקורי של התאים ולהכניס הטיות פוטנציאליות בתוך הנתונים4. לכן, אסטרטגיות לא פולשניות לספק פנוטיפ מדויק ויסודי של תאים חיים, במצבם המקורי והלא מופרע, מבוקשות יותר ויותר.

בהקשר זה, שיטות הדמיה מולטי-מודאליות ללא תוויות חוללו מהפכה במחקר הביולוגיה של התא על ידי שילוב שיטות משלימות ללכידת מידע מורפולוגי ומולקולריכאחד. גישות אלו מאפשרות אפיון משולב ולא פולשני של התאים שטכניקות מסורתיות בודדות לא תמיד מסוגלות לספק 2,5,6. לדוגמה, למרות שטכניקות מיקרוסקופיה כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היו בשימוש נרחב בהדמיית תאים מורפולוגית ופונקציונלית, יש להן מגבלות מובנות. שיטות פלואורסצנטיות סובלות לרוב מהלבנת פוטו, פוטוטוקסיות וכמויות נמוכות של מולקולות הניתנות למטרה, המגבילות את הפוטנציאל האנליטי4. בנוסף, גישות אלו דורשות לעתים קרובות שימוש בתוויות או צבעים אקסוגניים, שעלולים לשבש את מצב התא המקורי או להוביל לחפצים7.

פלטפורמות הדמיה מולטי-מודאליות, המשלבות את החוזקות של שיטות הדמיה מרובות, עולות על מגבלות אלה בכך שהן מאפשרות רכישת סוגים שונים של נתונים מתאים חיים ללא צורך בתיוג. השילוב של ספקטרוסקופיית ראמאן (RS) עם שיטות הדמיה אחרות כמו מיקרוסקופ ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ פאזה טומוגרפי (TPM) היה אסטרטגיה מבטיחה להתגבר על המגבלות של טכניקות בודדות. ואכן, הדמיה רב-מודאלית מספקת הבנה מעמיקה יותר של פנוטיפים תאיים, במיוחד במצבים ביולוגיים מורכבים ופתולוגיות כמו סרטן, שבהם תכונות מולקולריות ומבניות חיוניות לאפיון מדויק 2,5.

RS ללא תוויות מתאים היטב להדמיה כימית של תאים8. על ידי זיהוי מצבי רטט מולקולריים, RS מספק טביעות אצבע ביוכימיות שיכולות לחשוף מידע מעמיק על ההרכב המולקולרי של תאים 9,10,11. ספקטרום ראמאן שנרכש מדגימות ביולוגיות מכיל מידע על מגוון ביומולקולות כגון שומנים, חלבונים, חומצות גרעין ומטבוליטים, הממלאים תפקידים חיוניים בהבנת האופי המולקולרי של תאים 9,12. אחת מנקודות החוזק העיקריות של RS היא שהוא אינו פולשני, ומאפשר לאפיין תאים חיים במצבם הטבעי מבלי לשנות את מצבם הפיזיולוגי.

למרות יתרונותיה הרבים, RS מציגה גם כמה מגבלות. ואכן, למרות ש-RS מספק מידע מולקולרי מפורט, הוא אינו מאפשר מידע כמותי על המורפולוגיה או המבנה של תאים2. זה המקום שבו טכניקות הדמיה משלימות כמו TPM ממלאות תפקיד מכריע.

TPM הוא סוג של הדמיית פאזה כמותית (QPI)13,14, והוא מאפשר הדמיה של מידע כמותי ברזולוציה גבוהה וללא תוויות על מורפולוגיה של תאים15,16. TPM שונה מטכניקות מיקרוסקופיה מסורתיות בכך שהוא אינו דורש חומרי ניגוד; במקום זאת, הוא פועל על ידי מדידת שינויי פאזה הנובעים משינויים במקדם השבירה (RI) של מדגם17. שינויי פאזה מספקים מידע על התכונות המבניות של התא, כולל נפחו, שטח הפנים, צורתו והמבנה הפנימי שלו 2,18. TPM יכול להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה, עד לרמה הננומטרית, ולכן הוא טכניקה אידיאלית לרישום פרטים מורפולוגיים ברזולוציה גבוהה של תאים חיים. יתר על כן, היכולת לשחזר טומוגרפיות RI תלת מימדיות מאפשרת לדמיין מבנים תת-תאיים בסביבת ה-vivo שלהם18, ומספקת מידע מדויק יותר בהשוואה להקרנות דו-ממדיות. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של TPM היא היעדר הספציפיות הכימית שלו, מכיוון שהוא מספק בעיקר מידע על המורפולוגיה של התא והתפלגות הפאזה, מבלי להיות מסוגל להבדיל בין רכיבים כימיים מובחנים או לזהות תכונות ביוכימיות.

השילוב של RS ו-TPM בטכניקה רב-מודאלית מספק יתרונות בפנוטיפ תאים. בעוד RS מאפשר מידע מולקולרי עשיר, TPM מוסיף היבט מבני, המאפשר לנתח את המורפולוגיה התאית בפירוט רב. לאחרונה, השילוב של RS עם TPM הוכח בהצלחה במספר מחקרים המתמקדים בחקר הסרטן 2,19,20. לדוגמה, עבודות קודמות דיווחו כי רישום משותף של ספקטרוסקופיית רמאן עם נתוני מיקרוסקופ פאזה הולוגרפית יכול לספק מידע מולקולרי ומורפולוגי משלים, המאפשר הבחנה בין סוגי תאים שונים ושלבי התפתחות הגידול2. מחקרים אלה הדגישו את כוחה של הדמיה רב-מודאלית לשפר את הדיוק של פנוטיפ תאים, במיוחד בהקשר של סרטן, שבו המאפיינים המולקולריים והמבניים של התאים קשורים קשר הדוק לממאירות ולהתנהגות שלהם 2,20.

למרות ההתקדמות האחרונה בהדמיה רב-מודאלית, עדיין ישנם אתגרים שיש לטפל בהם, במיוחד בעיבוד וניתוח נתונים21. כמויות הנתונים הגדולות שטכניקות הדמיה רב-מודאליות מניבות יכולות להיות מסורבלות לניתוח, ויש להשתמש בהליכים פשוטים כדי לחלץ מידע משמעותי. כדי להתמודד עם אתגר זה, יש להקים צינורות עיבוד נתונים ידידותיים למשתמש כדי להתמודד עם מורכבות הנתונים ולמזער הטיה אנושית בניתוח. צינורות כאלה הם קריטיים להשגת דיוק ושחזור של התוצאות ותרגום אפשרי של גישות אלה ליישומים קליניים ואבחון.

מטרת העבודה הנוכחית היא להמחיש את הפוטנציאל של מיזוג RS עם TPM לפנוטיפ נטול תוויות, במהירות גבוהה וללא הפרעה של תאי סרטן בודדים חיים. על ידי מיזוג שתי גישות הדמיה חזקות אלה, אנו מספקים אפיון מקיף וכמותי של התכונות המולקולריות והמורפולוגיות של תאי סרטן שד אנושיים (MDA-MB-231). העבודה גם מדגישה את החשיבות של הקמת צינורות עיבוד נתונים ללא הטיות אנושיות כדי להבטיח שהמידע המופק ממערכי הנתונים הרב-מודאליים נכון ואמין. כאן, אנו מבקשים להקים פלטפורמה חזקה לפנוטיפ של תאים סרטניים שניתן להכליל לסוגים אחרים של תאים. הרבגוניות והרגישות של גישה זו הופכות אותה למועמדת פוטנציאלית למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, החל ממחקרים בסיסיים בביולוגיה של התא ועד לאבחון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדגם

  1. זרע תאי MDA-MB-231 על צלחות פטרי קוורץ.
    1. צלח תאי סרטן שד אנושיים MDA-MB-231 על צלחות פטרי קוורץ עם תחתית זכוכית בגודל 3.5 ס"מ.
    2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO2 עד לחיבור מלא לפני השטח (לפחות 12 שעות לאחר הזריעה).
  2. שטפו תאים והתכוננו למדידה.
    1. הסר את מדיום התרבית מהתאים לאחר שנדבקו לצלחת הפטרי.
    2. שטפו את התאים בעדינות עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר שאריות מדיום.
    3. הוסף מדיום תרבית תאים טרי ושמור על התאים מכוסים במדיום לאורך כל הליך המדידה כדי להבטיח את כדאיותם.
      הערה: כמדיום תרבית, מחקר זה השתמש בפנול ללא אדום DMEM/F-12 בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין (100 יחב"ל/מ"ל)-סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).

2. מערכת מיקרוסקופ ראמאן בעלת תפוקה גבוהה

הערה: פרטים טכניים של מיקרוסקופ ראמאן שנבנה בבית המשמש לעבודה הנוכחית הנוגעת להדמיית תאים חיים של תאי MDA-MB-231 תוארו בעבר22. בקצרה, מערכת מיקרוסקופ Raman בעלת תפוקה גבוהה שנבנתה בהתאמה אישית כוללת לייזר Ti-Sapphire 785 ננומטר הנשאב על ידי לייזר 532 ננומטר (איור 1A). לייזר עירור רמאן 785 ננומטר מחובר לגוף מיקרוסקופ פלואורסצנטי IX83 הפוך, עם עירור המכוון לדגימה דרך אובייקט טבילה במים UPLSAPO60× 1.2 NA באמצעות מראה דיכרואית של 749 ננומטר. מקטב מכוון את עוצמת הלייזר הממוצעת ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. הדמיית שדה בהיר מתאפשרת על ידי צימוד אור לבן באופן דומה. המערכת עוברת בין מצבי רמאן לשדה בהיר על ידי החלפת מסננים דיכרואיים באופן אוטומטי. המערכת משלבת סריקת מראה גלבו וסריקת במה להדמיה בתפוקה גבוהה. סקריפט MATLAB מותאם-במיוחד מקיים אינטראקציה עם תוכנת בקרת מיקרוסקופ בקוד פתוח, לוח רכישת נתונים (DAQ) ומערכות גילוי אותות כדי להפוך את תהליך רכישת הנתונים לאוטומטי. אור הרמאן המפוזר לאחור נאסף על ידי אותה מטרה, בעוד שהאור הנראה מסונן החוצה על ידי מראה דיכרואית של 785 ננומטר ומופנה לספקטרוגרף NIR ולגלאי התקן מצמד מטען (CCD). הגדרה זו מאפשרת הדמיה רב-ממדית, לכידת אותות שדה בהיר, פלואורסצנטי ורמאן על פני מיקומים שונים וערימות z 2,22.

  1. הליך הדמיית ראמאן
    1. הכנת הדגימה ושימור תנאים פיזיולוגיים
      1. התקן את הדגימה בחממה על הבמה כדי לשמור על תנאים פיזיולוגיים. ודא שהחממה מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, עם ויסות משוב בזמן אמת לבקרת טמפרטורה.
      2. שמור על רמות לחות בתוך החדר ב->95% באמצעות יחידת האמבטיה ההיקפית הפנימית המלאה במים מזוקקים. הגדר את בקר הגז CO2 לערבב 5% CO2 עם 95% אוויר ולספק אותו לתא החממה.
    2. ניהול טבילה אוטומטי במים
      1. הפעל את מזין הטבילה האוטומטי במים שנבנה בבית כדי לספק מים לעדשת המטרה בקצב זרימה של 2 מיקרוליטר לדקה באמצעות משאבות מזרקים ומחטי מזרק המודבקות לקצה המטרה.
      2. בדוק באופן קבוע את מפלס המים כדי למנוע אידוי ולהבטיח תנאי הדמיה עקביים לאורך כל המדידות.
    3. רכישת נתוני ספקטרוסקופיה של ראמאן
      1. הפעל את לייזר המשאבה והתאם את כוחו כדי להשיג כוח לייזר במישור הדגימה של 75 mW.
      2. פתח את תוכנת בקרת המיקרוסקופ בקוד פתוח Micro-manager. בהגדרות התצורה, בחר BF ולחץ על Live בצד שמאל של חלון התוכנה על מנת להמחיש את תמונת השדה הבהיר. בחר את התא היחיד הרצוי ממנו יירכש ספקטרום הראמאן. לאחר מכן לחץ על עצור כדי לסיים את התצוגה החזותית של השדה הבהיר.
      3. הגדר את קואורדינטת ה-Z של מישור ההדמיה של Raman על ידי מקסום ספירת האותות במצלמת ה-CCD.
      4. לשם כך, פתח את תוכנת בקרת מצלמת CCD (LightField); בהגדרת הניסוי, הגדר את זמן החשיפה ל-1.5 שניות. לאחר מכן, לחץ על הפעל בסרגל הכלים ניסוי והפעל את קרן הלייזר.
      5. לאחר מכן, התאם את מיקום Z כדי למקסם את ספירת האותות באזור טביעות האצבע מ-600 ס"מ-1 ל-1800 ס"מ-1 כדי לייעל את ההדמיה של פסגות הרמאן הקשורות לחתימות ביולוגיות. לאחר מכן כבה את הלייזר ולחץ על עצור בסרגל הניסוי של תוכנת מצלמת CCD, וצא מהתוכנה.
        הערה: ספירת אותות ה-Raman המקסימלית במצלמת ה-CCD נצפתה בהתאמה למיקום לאורך ציר Z בקנה אחד עם +8 מיקרומטר ביחס למישור ההדמיה שאינו מראה שום זכר לפסגות ראמאן הקשורות לתא, עקב נקודת מוקד שנופלת למדי בתוך הקוורץ. ערך זה עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא ולמצבו.
    4. התחל את תהליך רכישת הנתונים באמצעות סקריפט MATLAB, שיטפל אוטומטית בערוצי Raman במדידות רב מימדיות וישמור את נתוני Raman ההיפרספקטרליים.
    5. הגדר את שדה הראייה ל 50 × 50 מיקרומטר2, 40 × 40 פיקסלים, כאשר כל שטח פיקסל מתאים ל -1.25 × 1.25 מיקרומטר2. הגדר את זמן החשיפה לכל ספקטרום רמאן השווה ל -1.5 שניות.
      הערה: בצע כיול מספרי גל באופן קבוע באמצעות דגימות אצטמידופנול כדי לבאר פסגות ראמאן ידועות. כיול את ציר היסט רמאן באמצעות אינטרפולציה ריבועית.
      זהירות: טפל בלייזרים בזהירות. השתמש תמיד במשקפי מגן מתאימים המדורגים לאורך גל הלייזר במהלך ההתקנה והתפעול.

3. ניתוח נתוני RS

  1. מפות היפרספקטרליות של Raman לאחר התהליך באמצעות כלי מבוסס אינטרנט של RamApp (https://ramapp.io/):
    1. היכנס לכלי מבוסס האינטרנט.
    2. ייבא את הנתונים ההיפרספקטרליים. בכרטיסייה הניתוחים שלי , לחץ על חדש והעלה את קובץ ה- .mat, המכיל את משתנה הנתונים המרחבי והספקטרלי ואת משתנה ציר ה- x (כלומר, ערכי הזזת רמאן).
    3. כדי לחתוך את הספקטרום לאזורים שצוינו בהזזת Raman, בתפריט הנפתח Crop and Rotate , לחץ על Spectral crop והגדר את הגבול התחתון ואת הגבול העליון של אזור הזזת Raman השווה ל- 600 cm-1 ו- 1800 cm-1, בהתאמה.
      הערה: על ידי ביצוע חיתוך ספקטרום זה, השיא הרחב והמשרעת הגבוהה הקשור לחומר הקוורץ של צלחת הפטרי אינו נכלל בניתוח.
    4. כדי לתקן את ספקטרום הרמאן עבור קרניים קוסמיות, בתוך אפשרויות הפחתת הרעשים, לחץ על Despike, בחר ציון Z כשיטה והגדר את הסף שווה ל-8.
      הערה: פונקציית העיבוד המקדים של Despike עוזרת לטפל בבעיה של פיקסלים המכילים קוצים באות שלהם, הנובעים מקרינה קוסמית.
    5. סמן את האפשרות השתמש בהבדל ראשון כדי למצוא חריגים באמצעות הפרש העוצמות הנפרד הראשון לאורך הספקטרום, וסמן את האפשרות תיקון קוצים . הספקטרום של כל פיקסל גרוע יוחלף בספקטרום החציוני של הפיקסלים השכנים לו.
    6. לחץ על הפעל כדי לתקן את הקוצים.
    7. כדי להסיר רעש מהמפות המתאימות לכל מספר גל, בתוך אפשרויות הפחתת הרעשים , לחץ על מפה חלקה, בחר מסנן חציוני והגדר את גודל הצד של הריבוע שנלקח בחשבון בעת החלת המסנן על כל פיקסל במפה שווה ל-3 פיקסלים. לאחר מכן לחץ על הפעל.
    8. כדי להחיל מסנן להחלקת הספקטרום של כל פיקסל, לחץ על Smooth spectrum בבחירות Denoising . בחר את מסנן Savitzky-Golay כשיטה והגדר את אורך חלון המסנן שווה ל-7 ואת הסדר הפולינומי של המסנן שווה ל-2. לאחר מכן, לחץ על הפעל.
      הערה: מסנן Savitzky-Golay דורש לציין את אורך חלון המסנן (מספר שלם אי-זוגי חיובי) ואת סדר הפולינום.
    9. להסרת אות הרקע הממוצע מהחזית, פתחו את החלונית 'הסרת מצע אופטי ' ולחצו על 'זיהוי מצע'. הגדר את k-means כשיטה ואת מספר האשכולות שווה ל-2.
      הערה: פונקציה זו מפלחת את התאים ("החזית") ואת המצע שלהם באמצעות גישת אשכולות. לאחר מכן תוכל להסיר את אות הרקע הממוצע מהחזית או להגביל שלבים מסוימים לעבודה רק על פיקסלים בחזית. מספר האשכולות שייבחרו עשוי להשתנות בהתאם לדגימה הספציפית.
    10. באפשרויות מתקדמות, בדוק ניקוי מורפולוגי כדי להסיר כמה כתמים קטנים מהחזית (למשל, חלקי תאים מזויפים וכו'). לאחר מכן לחץ על הפעל.
    11. בחלונית 'הסרת מצע אופטי ', כדי להחסיר את אות הרקע הממוצע, לחצו על 'הסר מצע', בחרו 'ממוצע כללי' (ממוצע של 95% הערכים המרכזיים) ולחצו על 'הפעל'.
      הערה: K-means הוא בדרך כלל מהיר יותר, אם כי לא דטרמיניסטי (עם זאת, מכיוון שהזרע האקראי קבוע, אותה תוצאה תתקבל בכל ריצה, כל השאר שווים). ניתן להגדיל את מספר האשכולות מעבר ל-2 אם חלקים מסוימים של החזית עדיין מזוהים כרקע. האשכול עם האות הממוצע הנמוך ביותר מוגדר כרקע.
    12. לתיקון הקרינה של קו הבסיס, פתחו את החלונית Baseline ולחצו על Correct baseline. בחר asPLS (Adaptive Smoothness PLS) והגדר λ השווה ל-5000000. לאחר מכן, לחץ על הפעל.
      הערה: ישנן 7 שיטות זמינות שניתן לבחור, 5 מהן מבוססות על ריבועים מינימליים (PLS). בשיטות PLS אלה, יש צורך בפרמטר החלקה (λ). ערך גבוה יותר של λ יביא לקווי בסיס חלקים יותר.
    13. כדי לנרמל כל מפה היפר-ספקטרלית של Raman על-ידי חלוקתה בנורמה של Frobenius שלה, לחץ על שונות ובחר באפשרות Normalize . לאחר מכן, בחר Frobenius כשיטה ולחץ על הפעל.
      הערה: הנורמה של פרובניוס משמשת לנורמליזציה של כל מטריצת הנתונים.
    14. לקבלת תמונה בצבע כוזב הממחישה את ההתפלגות המרחבית של רכיב תת-תאי, בחלונית Images בצד ימין, ב-Intensity Image, לחץ על סמל התפריט Open . לאחר מכן לחץ על ערוך תמונה אפשרות לפתיחת לוח העריכה.
    15. בלוח העריכה, בחר פס יחיד, ולאחר מכן הגדר את הטווח הספקטרלי (למשל, 715-725 ס"מ-1 עבור הציטופלזמה). בחרו צבע כפול במפת הצבע, הגדירו את הצבע, את סף העוצמה ואת האטימות, ולחצו על 'אשר'.
    16. כדי להוריד ספקטרום של נקודה אחת, לחץ על הפיקסל המעניין בתמונה כדי לבחור אותו. לאחר מכן, בחלונית מקרא ספקטרלי , במקטע סמן , לחץ על הורד ספקטרום. חזור על אותו הליך עבור רכיבים תת-תאיים שונים.
    17. כדי לייצא את ספקטרום Raman של החזית והמצע, בלוח המקרא הספקטרלי, במקטע זיהוי מצע, לחץ על הורד ספקטרום עבור המקטעים Foreground ו-Substrate.
      הערה: בפרוטוקול שתואר קודם לכן לניתוח נתוני RS, תוארו שלבי עיבוד מקדים וניתוח חד-משתני כדי ליצור תמונות בצבע כוזב הממחישות את ההתפלגות המרחבית של רכיבים תת-תאיים מרכזיים, ספקטרום עוצמת רמאן הן מהחזית והן מהמצע, וספקטרום חד-נקודתי של מבנים תת-תאיים. בעוד שניתוח במורד הזרם מותאם לעתים קרובות לשאלה הביולוגית הספציפית, מחקר זה מדגיש כעת שיטות מייצגות רב-משתניות וסיווג הנגישות באמצעות מדור ניתוח המפה של הכלי מבוסס האינטרנט בו נעשה שימוש. אלה כוללים ניתוח אשכולות, ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), רזולוציית עקומה רב-משתנית (MCR), N-FINDR והתאמה ספקטרלית. התאמה ספקטרלית מאפשרת כימות והשוואה של תכונות ספקטרליות באמצעות גישות מבוססות מרחק כגון מקדם מתאם פירסון או ממפה זווית ספקטרלית. ניתוח אשכולות יכול להתבצע באמצעות אלגוריתמים כמו k-means, Mini-batch k-means או אשכולות אגרומרטיביים היררכיים, מה שמקל על פילוח של נתונים היפרספקטרליים על סמך דמיון ספקטרלי. ניתן ליישם PCA כדי להפחית את ממדי הנתונים ולהדגיש דפוסי שונות, בעוד MCR מאפשר פירוק של אותות מעורבים לספקטרום רכיבים טהור. אלגוריתם N-FINDR מסייע בחילוץ ספקטרום איברי קצה על ידי יישום PCA להפחתת הממדיות, מה שהופך אותו למתאים במיוחד עבור מערכי נתונים היפר-ספקטרליים. כלים אלה מספקים מסגרת חזקה לחקר במורד הזרם של דפוסים ביולוגיים המקודדים בנתונים ספקטרליים של ראמאן.

4. פרוטוקול מדידת TPM

  1. הכן את הגדרת המיקרוסקופ.
    1. הנח טיפת מים מזוקקים על עדשת האובייקט של המיקרוסקופ. מקם את הדגימה בשלב התרגום של המיקרוסקופ. התאם את מיקום הדגימה כדי ליישר אותה עם עדשת האובייקטיב.
  2. יישר את עדשות המטרה והמעבה.
    1. הפעל את המיקרוסקופ והפעל את תוכנת ההדמיה TomoStudio. לחץ על סמל המיקרוסקופ בסרגל הכלים. לאחר האתחול, לחץ על תצורה. בחר LiveCell בחלונית Job ו-PBS כמדיום.
      הערה: ערך ה-RI בלוח Medium מוגדר אוטומטית ל-1.337 כאשר PBS נבחר כמדיום.
    2. גש לכרטיסייה כיול בלוח הבקרה של תוכנת ההדמיה. הגדר את המיקומים הציריים של עדשות האובייקט והמעבה על ידי בחירה בפוקוס ומשטח, בהתאמה.
    3. לחץ על מצב סריקה כדי לכוונן את העדשות באופן ידני, ולהבטיח שדפוסי התאורה מרוכזים במרכז שדה הראייה ונראים כמעט דוממים.
  3. אתר את הדוגמה.
    1. לחץ על מצב רגיל והתאם את שלב התרגום כדי למקם את התא בשדה הראייה. התמקד בדגימה על ידי התאמת המיקום הצירי של עדשת האובייקט עד שגבול הדגימה הופך כמעט בלתי נראה על המסך.
    2. התאם את שלב התרגום כדי לאתר אזור ללא תאים, כדי להבטיח תצוגה ללא הפרעה.
  4. כייל את המערכת.
    1. בחר כיול בתוכנת ההדמיה כדי ללכוד הולוגרמות דו-ממדיות מרובות בזוויות תאורה משתנות.
  5. רכוש את הטומוגרפיה התלת-ממדית של RI.
    1. התאם את שלב התרגום כדי למרכז את התא בתוך שדה הראייה. נווט אל הכרטיסייה Acquisition ובחר 3D Snapshot כדי ללכוד את הטומוגרמה של התא.
      הערה: זמן הרכישה עבור טומוגרפיה תלת-ממדית של תא בודד קצר משמעותית (בסדר גודל של שניות), בהשוואה לזמן הרכישה הנדרש על ידי נתוני RS; לפיכך, אימוץ חממה על הבמה עבור TPM אינו נדרש בדרך כלל. עם זאת, אם יש לבצע מדידות על מספר רב של תאים, או בתנאים ספציפיים, תאי דגירה מסחריים ייעודיים המספקים תנאים פיזיולוגיים זמינים וניתן לשלב אותם במערכת TPM.

5. ניתוח נתוני TPM

  1. מפות TPM לאחר עיבוד באמצעות תוכנת TomoStudio.
    1. כדי להציג באופן חזותי את הטומוגרפיות ההולוגרפיות, בחר את הנתונים בלוח הניווט בנתונים , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הנתונים ולחץ על פתח. הכרטיסייה מחקר תיפתח אוטומטית לניתוח נוסף. בחלונית מנהל הנתונים , לחץ על RI Tomogram.
    2. בחלונית Volume Visualization , בחר RI וצייר ארבע תיבות צבע מלבניות בתוך בד הציור של RI.
      הערה: כל תיבת צבע מאפשרת לשייך, בטומוגרמה המוצגת בלוח התצוגה , צבע ספציפי לרכיבי תא המאופיינים בטווח ה-RI המזוהה על ידי התיבה בבד ה-RI. לאחר ציור כל תיבת צבע, המידע הקשור מופיע באופן אוטומטי בטבלה מתחת לבד הציור של RI.
    3. בחלונית שמתחת לבד הציור של RI, הגדר את ערכי המינימום והמקסימום של טווח RI עבור כל תיבת צבע (כלומר, תיבת צבע ראשונה: MinRI = 1.3450 ו- MaxRI = 1.3499, תיבת צבע שנייה: MinRI = 1.3506 ו- MaxRI = 1.3571, תיבת צבע שלישית: MinRI = 1.3586 ו- MaxRI = 1.3650, תיבת צבע רביעית: MinRI = 1.3688 ו- MaxRI = 1.3866). שייך ערך אטימות וצבע (על-ידי לחיצה כפולה על כל תיבה ובחירת צבע) לכל תיבה. זה מאפשר הדמיה של הטומוגרמות על פי התפלגויות ה-RI התלת-ממדיות.
    4. לחץ על שמור כדי לשמור את טווחי ה- RI ותיבות הצבע שהוגדרו.
      הערה: יש להתאים את טווחי ה-RI בהתאם לדגימות הספציפיות.
    5. כדי להשיג מתארים כמותיים של מורפולוגיה של תא (כלומר, נפח [V], שטח פנים [S], שטח מוקרן [A], RI ממוצע, צפיפות [D], מסה יבשה [DM] וכדוריות [Φ]), השתמש בממשק הניתוח .
      הערה: פרטים על החישוב התיאורטי של הפרמטרים הכמותיים ניתן למצוא כאן 2,23.
      1. בסרגל הכלים, לחץ על ניתוח. בחלונית ניתוח מימין, בחר ידני בחלונית פילוח והגדר את 1.3450 כספים RI. לאחר מכן לחץ על החל.
        הערה: ודא שהערכים של ה-RII (fl/pg) ו-Baseline RI הם בהתאמה 0.19 (תוספת השבירה, שנקבעה באופן נרחב על ידי מחקרים קודמים24) ו-1.3370 (RI של PBS המשמש ל-RI של כיול רקע PBS). תוכנת ההדמיה מבצעת פילוח נפחי של תא המטרה על פי סף ה-RI שנקבע ומחשבת את האינדקסים המורפולוגיים (V, S, A, ממוצע RI, D, DM ו-Φ) ומדווחת עליהם בטבלת פלט בלוח המדידה .
      2. לחץ על שמור כדי לשמור את האינדקסים המורפולוגיים המחושבים.
        הערה: בנוסף לתוכנה המופעלת, ניתן להשתמש במספר כלי קוד פתוח לכימות תכונות מורפולוגיות מנתוני TPM. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) מספק כלים לניתוח תמונה, כולל פילוח וחילוץ תכונות, התואמים לתמונות ניגודיות פאזה. פיג'י (https://fiji.sc/) היא תוכנת קוד פתוח עם תוספים לסגמנטציה וחישוב פרמטרים מורפולוגיים25. Napari (https://napari.org/) הוא מציג תמונות רב מימדי עם תמיכה בשילוב מודלים של למידת מכונה לפילוח וניתוח. Ilastik (https://www.ilastik.org/) מציעה כלי פילוח מבוססי למידת מכונה, ו-DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) משלבת מודלים של למידה עמוקה עם ImageJ/Fiji לניתוח מתקדם. חוץ מזה, MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) מספק כלים לפעולות מורפולוגיות דו-ממדיות ותלת-ממדיות בפיג'י. Cellpose326 הוא כלי נוסף מבוסס למידה עמוקה לפילוח תאים שניתן ליישם על הדמיית ניגודיות פאזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תיארנו זרימת עבודה לאפיון מורפו-כימי ללא תוויות של תאים חיים המבוסס על RS קונפוקלי ו-TPM. בדקנו את היכולת של זרימת העבודה המוצעת להשיג את ההרכב המולקולרי והפרמטרים המורפולוגיים של קו תאי סרטן השד האנושי MDA-MB-231 (איור 1).

תאי MDA-MB-231 נזרעו על צלחות פטרי עם תחתית זכוכית קוורץ. מיקרוסקופ ראמאן קונפוקלי שנבנה בהתאמה אישית (איור 1A), הפועל בעירור לייזר גל רציף של 785 ננומטר, שימש להשגת ספקטרום הרמאן של תאים בודדים בטווח היסט ראמאן (Ω...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצגנו גישה רב-מודאלית וצינור ניתוח פשוט המשלב שתי טכניקות הדמיה מתקדמות ללא תוויות: RS ו-TPM. זרימת העבודה המתוארת אפשרה פנוטיפ מורפו-כימי מהיר ולא פולשני של תאים בודדים של סרטן שד אנושי חי (MDA-MB-231) ללא צורך בתיוג חיצוני.

RS היא טכניקה לא הרסנית המאפשרת לאפיין את ההרכב הביוכימי של דגימות ביולוגיות באמצעות זיהוי מצבי הרטט של מולקולות 9,27,34,35.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי Progetto Rocca של קרן MIT באיטליה, מענקי NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (סיאול, דרום קוריאה) והמרכז הלאומי לסרטן בקוריאה (NCC-24H1170). לאונרדו ביאנקי מכיר בהענקת מלגת פוסט-דוקטורט Progetto Rocca לביצוע מחקר משותף במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס ובפוליטכניקו די מילאנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצלמת CCDפרינסטון אינסטרומנטסPIXIS 100BR eXcelonגלאי לאות פיזור ראמאן.
תוכנת בקרת מצלמות CCDפרינסטון אינסטרומנטסלייטפילד
לייזר Ti-Sapphire גל רציף (אורך גל: 785 ננומטר)ספקטרה-פיזיקה3900 שניותהוא משמש לעירור מיקרוסקופ ראמאן.
מראה דיכרואיתמעבדות תורDMSP750Bמראה דיכרואית של 749 ננומטר, מסיטה עירור רמאן של 785 ננומטר לדגימה, מסננת אותות פלואורסצנטיים ושדה בהיר.
סרום בקר עובריתרמו פישר סיינטיפיקA5256701
גוף מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסIX83
לייזר (אורך גל: 532 ננומטר)ספקטרה-פיזיקהמילניה eVמשאבת לייזר למערכת לייזר Ti-Sapphire 785 ננומטר.
תוכנת MATLABמת'וורקס2023א
קו תאים MDA-MB-231ATCCHTB-26
ספקטרוגרף NIRאנדרורהולוספקט HSG-785-LFהוא משמש לניתוח ספקטרלי של אור מפוזר לאחור.
עדשת אובייקט (60 פעמים; טבילה במים של 1.2 NA)אולימפוסUPLSAPO60 וזמנים;
תא דגירה על הבמהטוקאי היטסט STXG-Welsx
תוכנת בקרת מיקרוסקופ בקוד פתוחומיקרו; מנהלתמיקרו-מנג'ר-2.0
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק15140122
ללא פנול DMEM/F-12תרמו פישר סיינטיפיק21041025
מי מלח חוצץ פוספטג'יבקו10-010-023
צלחות פטרי קוורץ עם תחתית זכוכיתהתעוררות בי טקSF-S-D12
תוכנת ניתוח נתונים של Ramanרמףכלי מבוסס אינטרנט לעיבוד נתונים היפרספקטרלי של ראמאן.
מצלמת sCMOSהמאמאטסו פוטוניקהאורקה פלאש 4.0 v2
משאבת מזרקכימיקספיוז'ן 720
מיקרוסקופ פאזה טומוגרפיתטומוקוב בע"מHT-2Hמערכת מסחרית להשגת תמונות פאזה כמותיות.
תוכנת ניתוח נתונים TPMטומוקוב בע"מטומו סטודיותוכנה המשמשת לניתוח נתוני מיקרוסקופ פאזה טומוגרפית (TPM)

מקורות

  1. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
  2. Bresci, A., et al. Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography. Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).
  3. Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy. Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).
  4. Vicar, T., et al. Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison. BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).
  5. Kang, J. W., et al. Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis. Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).
  6. Pandey, R., et al. Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells. J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).
  7. Zhao, W., Sun, D., Yue, S. Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures. Front Phys. 10, 1100090(2023).
  8. Hanna, K., et al. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).
  9. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  10. Puppels, G. J., et al. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy. Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).
  11. Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing. Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).
  12. Chandra, A., et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research. ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).
  13. Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. Quantitative phase imaging trends in biomedical applications. Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).
  14. Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).
  15. Kuś, A., et al. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).
  16. Memmolo, P., et al. Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors. Intell Comput. 2, 0010(2023).
  17. Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited]. JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).
  18. Pirone, D., et al. Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry. Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).
  19. Bresci, A., et al. Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells. Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).
  20. Ghislanzoni, S., et al. Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells. Biosensors. 13 (11), 973(2023).
  21. Bischof, J., et al. Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers. npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).
  22. Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA. Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).
  23. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  24. Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).
  27. Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).
  28. Hobro, A. J., et al. Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES. Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).
  29. Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  30. Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).
  31. Park, C., Shin, S., Park, Y. Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths. JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).
  32. Bresci, A., et al. Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy. Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).
  33. Baczewska, M., et al. Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy. Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).
  34. Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. Raman spectroscopy of biological tissues. Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).
  35. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).
  36. Allakhverdiev, E. S., et al. Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research. Cells. 11 (3), 386(2022).
  37. Xu, J., et al. Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing. Cancers. 13 (7), 1718(2021).
  38. Swain, R. J., et al. Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping. Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).
  39. Smith, R., Wright, K., Ashton, L. Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies. Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).
  40. Du, J., et al. Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells. Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).
  41. Jones, R. R., et al. Raman techniques: fundamentals and frontiers. Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).
  42. Shirokova, O., et al. Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain. Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).
  43. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  44. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  45. Jung, J., et al. Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography. Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).
  46. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים