Method Article

שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle), המאפשר העברת מקטעי DNA מעניינים בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של ספריות פלסמיד ברחבי הגנום באמצעות מאגרים גנומיים קיימים משמש כתנאי מוקדם מרכזי לאפיון פונקציונלי שיטתי של גנים על פני תהליכים ביולוגיים מגוונים. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות בעלות תפוקה גבוהה להעברת שברי DNA בין-וקטוריים מחייבות הגברת PCR של רצפי יעד לפני השיבוט, מה שהופך את יצירת אוספי הפלסמיד בקנה מידה גנומי לתובעני מבחינה טכנית ועתיר זמן. על ידי מינוף קלטת CRISPRshuttle, פיתחנו שיטת שיבוט חדשה בתפוקה גבוהה, שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle), המאפשרת העברה של שברי DNA רבים מפלסמידים תורמים החולקים רצפי עמוד שדרה זהים לווקטור תואם CRISPRshuttle ללא הגברת PCR של שברי ה-DNA. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRshuttle. פרוטוקול זה כולל שתי תגובות מבחנה עוקבות לפני טרנספורמציה חיידקית. ראשית, שברי DNA מטרה נכרתים מפלסמידים תורמים על ידי מחשוף בתיווך Cas9 של רצף עמוד השדרה הווקטורי המשותף שלהם. שנית, שברי ה-DNA שנכרתו מוכנסים לווקטורים תואמי CRISPRshuttle ליניאריים באמצעות מכלול גיבסון. התוצאות שלנו מדגימות כי היעילות של CRISPRshuttle עולה על 94% וכי שני חוקרים יכולים לייצר כ-300 פלסמידים תוך 7 ימים באמצעות CRISPRshuttle. CRISPRshuttle מאפשר העברת שברי DNA יעילה, ניתנת להתאמה וחסכונית בין וקטורים, ומייעלת משמעותית את יצירת ספריית הפלסמיד בכל הגנום.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניית ספריות פלסמיד ברחבי הגנום ממשאבים זמינים היא הבסיס והתנאי המוקדם לשימוש בגנומיקה פונקציונלית לניתוח תהליכים ביולוגיים. שיטות השיבוט הנוכחיות בעלות תפוקה גבוהה, כולל מערכות שיבוט Gateway, In-Fusion, Creator ו-Univector, מחייבות הגברת PCR של שברי DNA יעד 1,2,3,4,5. דרישה מוקדמת זו כוללת זרימות עבודה ספציפיות לשברים הכוללות מספר פעולות סטנדרטיות, כולל אך לא רק תכנון פריימר אוליגונוקלאוטידים, טיהור ג'ל ואימות רצף באמצעות ריצוף. כתוצאה מכך, בניית ספריות פלסמיד ברחבי הגנום (למשל, ספריות ביטוי יתר של cDNA/ORF) הפכה לעתירת עבודה וגוזלת זמן, מה שמעכב את התקדמות הגנומיקה הפונקציונלית.

בעבר, פיתחנו את CRISPRmass, שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה שנועדה לשלב מקטעי DNA ספציפיים (למשל, מודול הכטב"ם) במספר פלסמידים החולקים עמוד שדרה וקטורי זהה6. באמצעות CRISPRmass, בנינו יותר מ-5,500 פלסמידים של UAS-cDNA/ORF מבוססי GAL4/UAS מספריית cDNA/ORF של דרוזופילה , אוסף הזהב של מרכז המשאבים הגנומיים של דרוזופילה (DGRC)6. עם זאת, ל-CRISPRmass אין את היכולת להעביר מקטעי DNA בין וקטורים, מה שמגביל את יישומו בשיבוט בתפוקה גבוהה.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (CRISPRshuttle), שיטה חדשה בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת העברה של מקטעי DNA מרובים לווקטורים של יעד מפלסמידים תורמים7. תהליך זה דורש רק שתי תגובות מבחנה עוקבות, ובכך עוקף את הדרישה לטיפול ספציפי לשבר במטרות DNA נפרדות7.

פרוטוקול CRISPRshuttle כולל שתי תגובות מבחנה עוקבות (איור 1). ראשית, רצפי עמוד שדרה וקטורי משותף של פלסמידים תורמים נבקעים על ידי Cas9/sgRNA כדי לשחרר שברי DNA מטרה. שברים אלה מועברים לאחר מכן לקלטת CRISPRshuttle של וקטור תואם CRISPRshuttle באמצעות מכלול גיבסון כדי ליצור את הפלסמידים הסופיים. קלטת CRISPRshuttle כוללת רצף עמוד שדרה וקטורי של ~20-40 bp המאגף את הקצוות 5' ו-3' של שברי ה-DNA שמקורם בפלסמידים תורמים, ואתר זיהוי אנזימי הגבלה ייחודי אחד או שניים הממוקמים בין רצפי האגפים הללו. וקטור תואם CRISPRshuttle נבנה על ידי הכנסת קלטת CRISPRshuttle לווקטור יעד, אשר לאחר מכן עובר ליניאריזציה על ידי עיכול אתרי ההגבלה בתוך הקסטה. וקטור היעד חייב לשאת גן עמידות לאנטיביוטיקה הנבדל מאלה שבפלסמידים של תורם; אם זהה, יש להחליף את גן העמידות בגן מובהק לפני השימוש.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המשתמש ב-CRISPRshuttle לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF. תהליך זה כולל העברת ORFs אנושיים מספריית הביטוי הוויראלי של CCSB-Broad לתוך וקטור הטרנסגנזה של דרוזופילה pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle מייעלת את הבנייה של ספריות פלסמיד ברחבי הגנום, ובכך מקלה על מחקרי גנומיקה פונקציונליים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קביעת אתרי המחשוף האופטימליים Cas9/sgRNA המאגפים cDNA/ORF

  1. הכנת פלסמידים cDNA / ORF
    1. השג שיבוטי cDNA/ORF ממאגרים ציבוריים.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש בשיבוטי ORF מבוססי וקטור pLX304 מספריית הביטוי Lentiviral האנושית הרחבה CCSB8.
    2. בודד פלסמיד באמצעות ערכת מיני-הכנה של פלסמיד ומדוד את ריכוזו בעזרת ספקטרופוטומטר.
  2. עיצוב sgRNA
    1. גש לאתר CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). הדבק את אזור ה-20-100 bp של עמוד השדרה הווקטורי pLX304 המאגף את קצה ה-ORF 3' לתוך שדה המטרה.
    2. בחר Drosophila melanogaster כמין ולחץ על מצא אתרי יעד. בחר מועמדים sgRNA שצפויים להיות בעלי יעילות של מעל 80%.
  3. הכנת sgRNA
    1. סנתז פריימר קדימה (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′) כאשר (N)20 מייצג את רצף המטרה sgRNA, ופריימר הפוך sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      הערה: מומלץ להשתמש בפריימרים מטוהרים ב-PAGE.
    2. צור תבנית DNA עבור שעתוק sgRNA במבחנה (IVT) באמצעות PCR. הכן תגובה של 100 מיקרוליטר המכילה 5 מיקרוליטר כל אחד מתבנית pX330 (Addgene plasmid 42230; 0.1 ננוגרם/מיקרוליטר), פריימר קדימה (10 מיקרומטר) ופריימר sgRNA-REV (10 מיקרומטר); 50 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR בנאמנות גבוהה פי 2; ו-35 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים שטופלו בדיאתיל פירוקרבונט (DEPC).
    3. הגברה ב-PCR Thermal Cycler באמצעות התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 5 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 8 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות; 30 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 8 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. לפתור מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 0.8%. הסר את הרצועה ~120-bp וטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
    5. הכן תגובת IVT של 10 מיקרוליטר המכילה 300 ננוגרם של שבר DNA מטוהר, 3.33 מיקרוליטר של תערובת חיץ NTP, 0.67 מיקרוליטר של תערובת פולימראז RNA T7 ומים טהורים במיוחד שטופלו ב-DEPC. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    6. כימות sgRNA לא מטוהר על ידי ספקטרופוטומטריה, לדלל ל-20 ננוגרם/מיקרוליטר עם מים טהורים במיוחד שטופלו ב-DEPC, ולהקפיא ב-80 מעלות צלזיוס בכמויות קטנות.
      הערה: טיפול ב-DNase אינו נחוץ, מכיוון ש-DNA שיורי אינו מפריע לתגובות במורד הזרם.
  4. הערכת sgRNA
    1. עכל פלסמיד cDNA/ORF המכיל את עמוד השדרה הווקטורי pLX304 באמצעות אנזים הגבלה. פתרו את שברי ה-DNA המתקבלים באמצעות ג'ל אגרוז 0.8%. טהר את מצע ה-DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
    2. הכן תערובת תגובת מחשוף Cas9 של 5 מיקרוליטר המכילה 0.2 מיקרוליטר של 1.22 מיקרומטר S. pyogenes Cas9, 0.5 מיקרוליטר של 20 ננוגרם/מיקרוליטר sgRNA, 0.015 pmol של מצע DNA, 0.5 מיקרוליטר של 10x Cas9 Buffer ומים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. פותרים את מוצרי המחשוף באמצעות ג'ל אגרוז 0.8%. כלול את מצע ה- DNA הלא מחוספס כבקרה שלילית.
    4. דמיין את דפוסי המחשוף באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית ובחר את ה-sgRNA עם מצע שיורי מינימלי לניסויים הבאים (איור 2).

2. החלפת גן העמידות לאנטיביוטיקה של וקטור היעד

הערה: בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בדוגמה של החלפת גן העמידות לאמפיצילין של וקטור היעד pBID-UASC בגן העמידות לכלורמפניקול, ובכך ליצור את וקטור היעד הנושא כלורמפניקול pBIDC-UASC.

  1. הסר את גן העמידות לאמפיצילין מ-pBID-UASC.
    הערה: גן העמידות לאמפיצילין של pBID-UASC הוסר על ידי עיכול Cas9 בשילוב עם שני sgRNAs, f1Ori5-G4 (רצף מטרה: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') ו-Amp3-G2 (רצף מטרה: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), וכתוצאה מכך עמוד שדרה וקטורי pBID-UASC ליניארי של 7,687 bp. שני sgRNAs אלה מכוונים ל-5' במעלה הזרם ו-3' במורד הזרם של גן העמידות לאמפיצילין, בהתאמה.
    1. הכן תגובת מחשוף של 10 מיקרוליטר המכילה 0.03 pmol של pBID-UASC, 0.25 מיקרוליטר של 1.22 מיקרומטר S. pyogenes Cas9, 20 ננוגרם של f1Ori5-G4, 20 ננוגרם של Amp3-G2, 1 מיקרוליטר 10x Cas9 Buffer ומים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
      הערה: הפלסמיד השסוע Cas9, ללא טיהור, נתון ישירות להרכבת גיבסון.
  2. PCR מגביר את גן העמידות לכלורמפניקול.
    הערה: גן עמידות לכלורמפניקול של 840 bp הוגבר מהפלסמיד pMartini-Cam6 על ידי PCR באמצעות f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATGTATGATATGATACATAAGGTT-3') ו-Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTGTTTGACAGC-3') פריימרים.
    1. הכן את גן העמידות לכלורמפניקול על ידי PCR המגביר את גן העמידות לכלורמפניקול 840 bp. הגדר תגובת PCR של 20 μL המכילה 2 μL של pMartini-Cam (0.1 ng/μL), 1 μL של f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL של Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL של חוצץ 5x, 0.4 μL של dNTPs (10 mM), 0.4 μL של DNA פולימראז בנאמנות גבוהה (2.5 יחידות/מיקרוליטר), 11.2 μL של מים אולטרה-טהורים.
    2. בצע PCR באמצעות תנאי התרמו-אופניים הבאים: מחזור אחד של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 5 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 46 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 61 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות; מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. בצע את התגובה במחזור תרמי.
    3. פתרו את מוצרי המחשוף על ידי 0.8% ג'ל אגרוז וטהרו שבר DNA של 840 bp באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
  3. הכנס את גן העמידות לכלורמפניקול לעמוד השדרה של וקטור pBID-UASC הליניארי, וכתוצאה מכך pBIDC-UASC.
    1. בצע תגובת הרכבה של 2 מיקרוליטר גיבסון: 0.008 pmol של גן עמידות לכלורמפניקול 840 bp, 0.002 pmol של pBID-UASC ליניארי (שלב 2.1.1), 1.0 מיקרוליטר של תערובת מאסטר הרכבה של 2x גיבסון. בצע את התגובה ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    2. הפוך 10 מיקרוליטר של תאים מוכשרים של E. coli עם 1 מיקרוליטר של תוצר תגובת קשירה. שנאים נבחרים על צלחת LB בתוספת 15 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול.
    3. בחר מושבה בודדת והכפיף אותה לתרבית חיידקים ומיני-הכנת פלסמיד לאחר מכן. אמת את וקטור היעד הנושא כלורמפניקול pBIDC-UASC על ידי ניתוח הגבלה וריצוף DNA.

3. בניית וקטור יעד תואם CRISPRshuttle

הערה: קלטת CRISPRshuttle כוללת כ-20-40 רצפי עמוד שדרה וקטוריים של bp המאגפים את שני הקצוות של 5' ו-3' של שברי DNA מטרה, עם אתר הגבלה ייחודי אחד או שניים הממוקמים ביניהם.

  1. חישול אוליגונוקלאוטידים באמצעות מחזור תרמי עם התוכנית הבאה: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 70 מחזורים של 52 שניות ב-(95-N) מעלות צלזיוס, כאשר N מייצג את מספר המחזור.
    הערה: קלטת ה-CRISPRshuttle המחוסמת מכילה 5 'תלויים משלימים ל-EcoRI ו-XbaI.
  2. חבר את קלטת ה-CRISPRshuttle המחוסמת לווקטור יעד מעוכל EcoRI/XBAI PBIDC-UASC כדי ליצור את וקטור היעד התואם ל-CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
    הערה: קשירה זו מבטלת את אתרי EcoRI ו-XbaI המקוריים בתוך אתרי השיבוט המרובים, מה שהופך את אתרי EcoRI ו-XhoI באמצע קלטת CRISPRshuttle לייחודיים בווקטור הסופי. אתרי ההגבלה הייחודיים בקלטת CRISPRshuttle מאפשרים ליניאריזציה של וקטור היעד התואם ל-CRISPRshuttle.
    1. הכן תגובת קשירה של 5 מיקרוליטר המכילה 14 ננוגרם של 8,451 bp pBIDC-UASC מעוכל EcoRI/XbaI, 0.02 pmol של קלטת CRISPRshuttle מחוסמת, 0.5 מיקרוליטר של 10x T4 DNA ligase buffer, 0.3 מיקרוליטר של T4 DNA ligase. דגרו את התגובה למשך הלילה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס.
    2. טרנספורמציה של 10 מיקרוליטר של תאים מוכשרים של E. coli עם 1 מיקרוליטר של תוצר תגובת הקשירה. בחר שנאים על צלחת LB בתוספת 15 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. בחר מושבה בודדת והכפיף אותה לתרבית חיידקים ומיני-הכנת פלסמיד לאחר מכן. אמת את וקטור היעד התואם ל-CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect על ידי ניתוח הגבלה וריצוף DNA.

4. יצירת פלסמידים של UAS-cDNA/ORF באמצעות CRISPRshuttle

הערה: פרוטוקול CRISPRshuttle כולל תגובות מבחנה דו-שלביות המתבצעות במקביל לפני טרנספורמציה חיידקית (איור 1).

  1. תגובת מבחנה שלב 1
    1. הוצא ORFs מפלסמידים pLX304-ORF על ידי חיתוך עמוד השדרה הווקטורי באמצעות Cas9 בשילוב עם שני sgRNAs, pLX304-CMV-G16 (רצף יעד: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', ממוקם בעמוד השדרה הווקטורי pLX304 המאגף את קצה ORF 5') ו-pLX304-3'-G1 (רצף יעד: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', ממוקם בעמוד השדרה הווקטורי pLX304 המאגף את קצה ORF 3').
      1. הכן תערובת מאסטר למספר נתון (N) של תגובות עיכול באופן הבא: (N+1) x 0.4 מיקרוליטר של 1.22 מיקרומטר S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0.5 מיקרוליטר של 80 ננוגרם/מיקרוליטר pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0.5 מיקרוליטר של 80 ננוגרם/מיקרוליטר pLX304-3'-G1, (N+1) x 0.4 מיקרוליטר של 10x Cas9 Buffer, ו-(N+1) x 1.45 מיקרוליטר של מים טהורים שטופלו ב-DEPC.
      2. מערבבים היטב ומסובבים את תערובת המאסטר. Aliquot 3.75 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל צינור. הוסף 0.75 μL של פלסמיד pLX304-ORF של 0.03 μM לכל צינור. מערבבים היטב ומדגרים את התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
        הערה: יש לדלל כל פלסמיד pLX304-ORF לריכוז של 0.03 מיקרומטר עם מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC. אם הריכוז נמוך מ- 0.03 מיקרומטר, הוסף DNA פלסמיד ישירות לתגובה. אין צורך לטהר את הפלסמידים השסועים Cas9 לאחר תגובות מחשוף וניתן להשתמש בהם ישירות להרכבת גיבסון שלאחר מכן.
  2. תגובת מבחנה שלב 2
    1. הכנס את ה-ORFs שנכרתו לתוך וקטור היעד התואם ל-CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect באמצעות מכלול גיבסון, וכתוצאה מכך פלסמידים של UAS-cDNA/ORF.
      1. עכל pBIDC-UASC-pLXvect עם EcoRI ו-XbaI. הפרד את ה-pBIDC-UASC-pLXvect הליניארי על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
      2. הכן תערובת מאסטר עבור מספר נתון (N) של תגובות הרכבה של גיבסון באופן הבא: (N+1) x 0.14 μL של 3.36 μM ליניארי pBIDC-UASC-pLXvect, ו-(N+1) x 1.8 μL של תערובת מאסטר הרכבה של גיבסון.
      3. מערבבים היטב ומסובבים את תערובת המאסטר. Aliquot 1.94 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל צינור. הוסף 1.66 מיקרוליטר של פלסמיד שסוע Cas9 לכל צינור. מערבבים היטב ומדגרים את התגובות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
        הערה: שמור את תערובת המאסטר והצינורות קרח לפני הדגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
  3. טרנספורמציה של E. coli עם מוצרי הרכבה של Gibson.
    הערה: המוצרים של הרכבת גיבסון אינם דורשים טיהור לפני טרנספורמציה של E. coli .
    1. להפשיר תאים חיידקיים מוכשרים על קרח. יש 10 מיקרוליטר תאים לכל צינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל.
      הערה: מומלץ תאי חיידקים מוכשרים עם יעילות טרנספורמציה של לפחות 1 ×10 8 CFU/μg של DNA pUC19.
    2. מערבבים בעדינות 10 מיקרוליטר של תאים מוכשרים עם 1 מיקרוליטר של מוצרי הרכבה של גיבסון. מניחים על קרח למשך 30 דקות.
    3. הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן מצננים על קרח למשך 2 דקות.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום SOC שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) לכל צינור. יש לנער במהירות של 250 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. הנח תאים על לוחות LB המכילים 15 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: ביצוע הליכים אלה בקנה מידה גדול דורש בדרך כלל מספר שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור גם את הריאגנטים וגם את מערכי התגובה על קרח.
  4. אימות של פלסמידים UAS-cDNA/ORF.
    1. לחסן מושבה בודדת ב-4.5 מ"ל של מדיום LB עם 15 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול. יש לנער ב-250 סל"ד בלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. בודד DNA פלסמיד באמצעות ערכת מיני הכנה של פלסמיד.
    3. הכן תגובת עיכול הגבלה של 20 מיקרוליטר עבור כל פלסמיד המכיל 300-500 ננוגרם של DNA פלסמיד, 0.3 מיקרוליטר של PvuII, 2 מיקרוליטר של מאגר פי 10 ומים טהורים במיוחד. בצע את התגובות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    4. לפתור שברי DNA על ידי 0.8% ג'ל אגרוז. תמונה תחת אור אולטרה-סגול (איור 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו ב-CRISPRshuttle כדי לבנות אוסף פלסמיד UAS-cDNA/ORF המכסה 1,397 גנים אנושיים השמורים בדרוזופילה7. ניתוח הגבלות גילה כי CRISPRshuttle מגיעה ליעילות של 94.5% לשימוש בווקטורי יעד תואמי CRISPRshuttle המכילים שני רצפים חוזרים ו-96.1% לשימוש בווקטורי יעד ללא רצפים חוזרים7. הנתונים שלנו הראו שבאופן כללי ניתן ליצור ~300 פלסמידים באמצעות CRISPRshuttle על ידי שני חוקרים תוך 7 ימים7. העברה מוצלחת של מקטעי cDNA/ORF בתיווך CRISPRshuttle אומתה באמצ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלב קריטי בפרוטוקול CRISPRshuttle הוא הכנת וקטורי יעד תואמי CRISPRshuttle ליניאריים. כדי להבטיח עיכול מלא, השתמש בעודף של אנזימי הגבלה כדי לעכל את הווקטורים, ומומלץ מאוד לטהר ג'ל של הווקטורים המעוכלים. שלב מכריע נוסף הוא העיכול של פלסמידים cDNA/ORF עם Cas9. אם בניית הפלסמיד נכשלת, השתמש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לבדוק אם לפחות cDNAs/ORFs חלקיים שוחררו מהפלסמידים התורמים. לחלופין, בדוק את העיכול של כל הפלסמידים על ידי אלקטרופורזה לפני שתמשיך בהרכבת גיבסון. CRISPRshuttle מתפקד בדרך כלל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071135) וקרן סטארט-אפ מבית החולים המסונף Nanhua, בית הספר לרפואה Hengyang, אוניברסיטת דרום סין. אנו אסירי תודה לפרופ' פנג ז'אנג על מתן הפלסמיד pX330 ולד"ר שיאוהוי קאי על הסיוע הטכני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אבקת אגרכימבייסKBS-001H
אגרוזסנגוןA600014-0100
מערכת ניתוח תמונות ג'ל דיגיטלית אוטומטיתטאנוןטאנון-2500 ב'
כלורמפניקולסנגוןA100230-0010
ערכת מיצוי ג'ל E.Z.N.A.אומגהD2500-02
E.Z.N.A. ערכת מיני DNA פלסמיד IאומגהD6942-02
אקורי-HFנבR3101S
גיבסון אסמבל מאסטר מיקסנבE2611S
HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA מהירה בתפוקה גבוההנבE2050
NEBuilder HiFi DNA הרכבה מאסטר מיקסנבE2621X
PCR תרמי Cyclerלונגג'יןT20
פלטינה SuperFi II DNA פולימראזתרמו סיינטיפיק12361010
PvuII-HFנב₪3151L
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixנבM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
חממת טלטולג'יצ'וZQLY-180V
ספקטרופוטומטרשימדזוביוספק-ננו
T4 DNA ליגאזפרומגהM1801
Trans 10 תא מוכשר כימיתטרנסג'ןCD101-02
טריפטוןאוקסואידLP0042
XbaIנבR0145S
תמצית שמריםאוקסואידליפ 0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).
  3. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  4. Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes. Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).
  5. Marsischky, G., Labaer, J. Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).
  6. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  7. Liu, X., et al. CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).
  8. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  9. Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila. PLoS One. 7 (7), e42102(2012).
  10. Christie, K. A., et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).
  11. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  12. Lei, C., et al. The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

Related Articles