מאמר שיטה

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

12 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

תקציר

פרמציום הוא אורגניזם מודל עיקרי לחקר מנגנונים מולקולריים המעורבים בסידורים גנומיים מתוכנתים וחיסול טרנספוזונים במהלך רבייה מיוטית. פרטים רבים על תהליך זה נותרו חידתיים בשל המורכבות של המנגנון המולקולרי המעורב ואינטראקציות חלבון-חלבון חולפות. כאן, אנו מציגים שיטה לתיוג חלבונים עם ביוטין הממוקם קרוב לחלבון מטרה מעניין. ניתן להתאים את השיטה בקלות למטרות שונות מכיוון שהביוטינילציה מושגת על ידי הזרקת DNA המקודד חלבון מטרה המותך לליגאז ביוטין מהונדס. מבנה ההיתוך מתבטא מהמקדם של הגן האנדוגני, ומאפשר פרופיל ביטוי ספציפי לשלב הדומה לזה של החלבון המקומי. יש לציין כי חלק הביוטין המחובר קוולנטית מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים המסומנים באמצעות חרוזים מצופים סטרפטווידין. יתר על כן, עם צביעה אימונופלואורסצנטית, אנו מראים כי תיוג יעיל דורש תוספת של התרבית עם ביוטין. וקטור הביטוי המהונדס plug-and-play, בשילוב עם הליך ההזרקה היעיל המודגם כאן, מאפשר יצירה מהירה של קווי Paramecium המבטאים חלבון שונה. ניתן לעקוב אחר הליך הביוטינילציה המודגם כאן באמצעות ספקטרומטריית מסה לזיהוי החלבונים המועשרים המכילים את השותפים האינטראקטיביים של חלבון המטרה. לביוטינילציה של קרבה יש פוטנציאל לפשט ולהאיץ את הגילוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-Paramecium ולהגביר את המאמצים להבין את מנגנון עריכת הגנום שלו.

מבוא

האורגניזם החד-תאי הריסי Paramecium tetraurelia מכיל שני סוגים נפרדים של גרעינים: גרעין קו נבט לאחסון ארוך טווח של מידע גנטי וגרעין סומטי לתפקודים הפיזיולוגיים של התא1. רבייה מינית באורגניזם זה דורשת היווצרות גנום סומטי חדש. תהליך זה כולל כריתה בלתי הפיכה של יותר מ-45,000 שברי DNA מהגנום הסומטי2 הכוללים אלמנטים הניתנים להעברה3 וחזרות אחרות. בולט במיוחד הוא שאירועי הכריתה מבוצעים בדיוק עד לזוג הבסיסהיחיד 1. דיוק זה הכרחי מבחינה ביולוגית, מכיוון ששברי ה-DNA שנכרתו משבשים את אזורי קידוד החלבון4 וכל כריתה פגומה עלולה לעורר מוטציות בשינוי מסגרת, קודוני עצירה מוקדמים או לשנות את רצף קידוד החלבון. מנגנון השוואת RNA מורכב מאפשר לתא להבדיל בין הרצפים הדרושים בגנום הסומטי החדש. הוא מתחיל עם שעתוק של כל גנום קו הנבט5, ואחריו חיתוך לגודל של 25 bp6, הובלה לגנום הסומטי הישן7, שם כל ה-RNA המשלימים מושלכים8. שאר ה-sRNAs שחסרים רצפים משלימים בגנום הסומטי הישן מועברים עוד יותר לגנום הסומטי החדש המתפתח, שם הם מתיישרים לכל רצף מוגבל בקו הנבט ומכוונים את הכריתה שלהם9. תהליך רב-שלבי מורכב זה דורש משחק גומלין מדויק ומתוזמן של רכיבים תאיים רבים, ובמיוחד, אינטראקציות חלשות חולפות כאשר הרנ"א הקטן עובר בין הגרעינים השונים10,11. בעבר, ניסיונות להבין את המכניקה המולקולרית של התהליך נעשו באמצעות ניסויי נוקדאון כדי לקבוע אם רכיבים משוערים חיוניים לתהליך, ואחריהם גישות חיסון כדי לחשוף את האינטראקציות של חלבונים חיוניים 12,13,14. בעוד ששיטה זו שימושית לאיתור קשירה חזקה ומתמשכת העומדת גם בתנאים הלא פיזיולוגיים במהלך המשיכה, זיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות עשוי לדרוש אופטימיזציה מייגעת. בשל האופי החולף הפוטנציאלי של אינטראקציות רבות המעורבות בתהליך עריכת הגנום, שיטות in vivo יכולות לשפר את הזיהוי של אינטראקציות כאלה. בנוסף, חלק מהחלבונים אינם יכולים להיות מסיסים ביעילות בתנאים חוץ-תאיים15, מה שמייצג בעיה שניתן לפתור באמצעות שינויים בחלבונים המבוססים על אינטראקציה in vivo, כגון תיוג קרבה עם ביוטין.

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת ביוטינילציה ספציפית in vivo של חלבונים הממוקמים קרוב לחלבון המטרה הרצוי. ניתן להשתמש בשינוי הביוטין הקוולנטי להעשרה יעילה באמצעות גישות נפתחות מבוססות סטרפטווידין. פיתוח שיטה זו הושג על ידי שימוש בביוטין ליגאז TurboID16 לביצוע מחקרי אינטראקציה עם חלבונים ב-Paramecium tetraurelia. ניתן ליישם את הגישה שלנו בקלות על כל חלבון מטרה בעקבות השלבים המתוארים בפרוטוקול. לכן, מאמר זה מספק אסטרטגיה יעילה וניתנת להרחבה לביוטינילציה קרובה שניתן להשתמש בה למחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה באורגניזם מודל פרוטוזואי בולט.

פרוטוקול

1. שיטות כלליות

  1. השג חוצצים, ריאגנטים וחומרים אחרים כמפורט בטבלה 1.
  2. לטפח קווי Paramecium חד-שבטיים כמתואר קודם לכן17. בקצרה, העבירו תא אחד לבאר שקע חדשה המכילה מדיום אור בקטרי (0.8 מיקרוגרם/מ"ל β-sitosterol) כך שצפיפות התאים תישאר נמוכה מ-500 תאים/מ"ל, כדי למנוע התחלה מוקדמת של המחזור המיוטי. ב-50 חלוקות תאים, העבירו את התאים לתרבית בינונית עשירה בחיידקים (עם 0.8 מיקרוגרם/מ"ל β-סיטוסטרול) והשאירו עד לצריכת כל החיידקים, ובכך לגרום לרבייה מינית (אוטוגמיה)18.
    הערה: עם השלמת מחזור הרבייה המינית, התאים יישארו במצב פוסט-אוטוגמי שאינו מתחלק עד שיסופק מקור תזונה חדש.
  3. בנה חלבוני היתוך של גני המטרה באמצעות וקטור המכיל רצף 3x HA turboID מותאם לקודון עם אתרי חיתוך אנזים הגבלה במעלה הזרם.
    1. בצע הגברת PCR של גן המטרה ואזור המקדם שלו מ-DNA גנומי, באמצעות פריימרים שתוכננו עם תלויים המקודדים אתרי הגבלה מתאימים.
    2. הכנס את המוצר באמצעות עיכול הגבלה סטנדרטי לאתרי החיתוך התואמים בתוך המסגרת19 במעלה הזרם של אזורי הקידוד turboID.
  4. רצף, אמת והגביר את ה-DNA הפלסמיד הבנוי ב-E.coli DH5α. בודד את הפלסמיד באמצעות ערכת midiprep פלסמיד וליניאריזציה של 100 מיקרוגרם של DNA פלסמיד על ידי עיכול הגבלה.
  5. יש לטהר באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם, ולאחר מכן לסנן דרך מסנן צנטריפוגלי12. בצע משקעי אתנול והמיס את כדור ה-DNA במים כדי לקבל ריכוז של 5 מ"ג/מ"ל.
    הערה: ניתן להכניס את ה-DNA לגרעינים הסומטיים של תאי Paramecium באמצעות הליך המיקרו-הזרקה הבא.

2. מיקרו-הזרקה לגרעין הסומטי (MAC)

  1. העבר תא מהתרבית הפוסט-אוטוגמית שהתקבלה בשלב 1.2 למגלשת שקע טרייה עם מדיום אור בקטרי עם 0.8 מיקרוגרם/מ"ל של β-סיטוסטרול. יש לדגור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני ההזרקה כדי לשחזר את התאים.
  2. השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי להעביר את התאים מהתרבית המשוחזרת לשקופית דיכאון טרייה שהוכנה מלאה במדיום הכביסה.
  3. בזמן שהתאים נמצאים במדיום הכביסה, הוסף 20 מיקרוליטר של ddH2O על שקופית זכוכית וכיסוי עם זכוכית כיסוי.
  4. הוסף 200 מיקרוליטר שמן מינרלי על גבי הכיסוי.
  5. לאחר מכן, העבירו תאים שטופים בודדים כטיפות מתחת לשמן המינרלי תוך שימוש בנפח נוזלי קטן ככל האפשר. הנח עד 20 בועות המכילות תא בודד לכל שקופית ולאחר מכן מקם את השקופית המוכנה על הדום של מיקרוסקופ ההזרקה.
  6. חבר את מחט השאיבה והעבר אותה למקומה, ולאחר מכן הפעל את הזרוע הרובוטית ואת מכונת ההזרקה.
  7. בעזרת קצה פיפטה של מיקרו-מעמיס, הוסף 2-3 מיקרוליטר מתמיסת ה-DNA שהוכנה בשלב 1.5 למחט ההזרקה. חבר את המחט לזרוע הרובוטית והעבר אותה למקומה, ולאחר מכן חבר אותה לשסתום הלחץ של מכונת ההזרקה.
  8. השתמש בזרוע הרובוטית כדי למקם את מחט ההזרקה לתוך טיפת מים ריקה על המגלשה. לאחר מכן לחץ על נקה כדי לטהר את כל האוויר שנותר במחט ההזרקה עד לצפייה בזרימת ה-DNA.
  9. עברו לטיפה המכילה תא, ואז הורידו את מחט השאיפה. הסר בעדינות את הנוזל (מים) מהטיפה הזו עד שהתא משותק.
  10. הרם את מחט השאיפה והורד את מחט ההזרקה, ולאחר מכן עבור להגדלה גבוהה יותר.
  11. ודא שהגרעין הסומטי (MAC) נראה כעת כאזור כהה יותר נטול ואקואולים של מזון (ראה איור 1c) שבו יש להחדיר את מחט ההזרקה.
  12. שאפו לחדור ל-MAC לחלוטין עם מחט ההזרקה ולמשוך לאט את המחט במשך מספר שניות.
    הערה: כאשר המחט ממוקמת בתוך ה-MAC, ה-DNA יזרום ב-MAC עקב לחץ האוויר הקבוע המופעל על ידי מכונת ההזרקה. ואקואול מפוזר המורכב מה-DNA המוזרק יכול להיות גלוי בגבולות ה-MAC.
    הערה: ניתן להזריק את אותו תא מספר פעמים כדי להבטיח הזרקה מוצלחת.
  13. לאחר השלמת הזרקת התאים, הורד את מחט השאיפה המכילה את המים שנשאבים בשלב 2.9. הפוך את הזרימה כדי להחזיר מספיק מים לטיפה עד שהתא יתחיל לנוע שוב.
  14. המשך עד שכל הטיפות המכילות תא יעובדו.
  15. שחזר כל תא מוזרק על ידי איסוף הטיפות מהשקף והעברתן לבאר נפרדת מלאה בתווך אור בקטרי, עם 0.8 מיקרוגרם/מ"ל של β-sitosterol.
  16. דגירה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה, העברת תא בודד מכל באר לבאר חדשה ושמירה על הבאר המקורית בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס כגיבוי.
  17. תרבית התאים המועברים למשך הלילה ב-27 מעלות צלזיוס למשך יום אחד ולאחר מכן העבירו 5 תאים מכל באר חד-שבטית לתוך צינור PCR. השתמש בפריימרים ספציפיים למבנה להגברה כדי לאמת את נוכחות ה-DNA המוזרק בתאים.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית לאימות לוקליזציה נכונה של חלבון ותפקוד ביוטין ליגאז

  1. תרבית את השיבוטים החיוביים ל-PCR שנבחרו ב-20 מ"ל של מדיום חיידקי עם 0.8 מיקרוגרם/מ"ל של β-סיטוסטרול.
  2. לאחר שהמדיום הופך פחות עכור, אוספים דגימה של 50 מיקרוליטר מהתרבית. הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת DAPI (0.1 מ"ג/מ"ל) ו-1 מיקרוליטר EDTA (0.5 מ"מ) לצביעת DNA כדי לבדוק את התחלת האוטוגמיה.
    הערה: אוטוגמיה מתחילה בדרך כלל בצפיפות תאים של 2,000 תאים/מ"ל.
  3. אם רוצים ביוטינילציה, השלימו את מדיום התרבית בביוטין לריכוז סופי של 500 מיקרומטר למשך שעה אחת לפחות לפני קצירת התאים.
  4. קצרו את התאים בשלב ההתפתחותי המתאים באמצעות צנטריפוגה למדידת שמן המצוידת בצינורות בצורת אגס ב-280 x גרם למשך 2 דקות. השליכו את מדיום התרבות והוסיפו PBS לצינורות, ואז שוב צנטריפוגה והסר את ה-PBS.
  5. השעו מחדש את גלולת התא ב-PBS והעבירו לצינור מיקרו-צנטריפוגה שקוף של 1.5 מ"ל.
  6. הכן דילול PFA של 3.7% ב-PBS מתמיסת המניות של 37%.
  7. השעו מחדש את גלולת התא ב-0.5 מ"ל של 3.7% PFA ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב צינור.
  8. צנטריפוגה ב-600 x גרם למשך דקה אחת עד שנוצרת גלולה גלויה. השליכו את תמיסת ה-PFA למיכל הפסולת המיוחד המיועד.
  9. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 50 מ"מ גליצין ב-PBS. דגירה למשך 5-10 דקות על מסובב צינור.
  10. צנטריפוגה ב 600 x גרם למשך דקה. הסר את הסופרנטנט והוסף 0.8 מ"ל של 1x PBS. לחלופין, שטפו פעם נוספת עם PBS.
    הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, במידת הצורך.
  11. צנטריפוגה ב-600 x גרם למשך דקה אחת, הסר את ה-PBS והוסף 500 מיקרוליטר של 0.5% Triton X-100 ב-PBS. דגירה למשך 20 דקות על מסובב צינור.
  12. צנטריפוגה עד שהגלולה נראית לעין (1,000 x גרם למשך 2 דקות), הסר את תמיסת הטריטון X-100 והשהה מחדש את התאים ב-PBS.
  13. הכן תמיסת BSA 5% ב-PBS בהתאם לנפח הנוגדנים הנדרש.
  14. הסר את שטיפת ה-PBS מהתאים והוסף לתאים 100 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני המדולל ב-5% BSA ב-PBS. התאם את זמן הדגירה בהתאם לנוגדנים המשומשים.
    הערה: דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר מספיקה לרוב הנוגדנים.
  15. צנטריפוגה ב-600 x גרם, הסר את דילול הנוגדנים הראשוני ושטוף את התאים ב-500 מיקרוליטר PBS.
  16. הוסף 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המדולל ב-5% BSA ב-PBS. התאם את זמן הדגירה; בדרך כלל, שעה אחת בטמפרטורת החדר מספיקה. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורופור מפני אור.
  17. הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת DAPI (0.1 מ"ג/מ"ל) במהלך 10 הדקות האחרונות של הדגירה עם הנוגדן המשני.
  18. צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 x גרם למשך דקה, הסר את תמיסת הצביעה ושטוף פעמיים עם PBS. השאירו 20 מיקרוליטר מהכביסה השנייה בצינור והשעו מחדש את התאים.
  19. התקן 10 מיקרוליטר על שקופית לבדיקה במיקרוסקופ.

4. העשרה סלקטיבית של חלבונים ביוטיניים

  1. קצור 1 x 106 תאים בשלב ההתפתחותי הנכון כמתואר בסעיף 3.4.
  2. השעו מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של מאגר ליזה.
  3. מעבירים להומוגניזטור dounce ומעבירים את התאים ב -100 משיכות עלי.
  4. העבירו את הליזאט לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-21,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. איזון חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר (לכל דגימה) של תמיסת חרוזים תלויה עם מערבולת דופק עם 1 מ"ל של מאגר הליזיס בצינור מיקרוצנטריפוגה ודגירה למשך 2 דקות.
  6. הסר את מאגר הליזיס מהחרוזים באמצעות מעמד מגנטי והשהה מחדש במאגר ליזה.
  7. חזור על שלב 4.6.
  8. הסר את מאגר הליזיס וערבב את החרוזים המאוזנים עם הסופרנטנט (ליזאט מובהר) משלב 4.4.
    הערה: ריכוזי המלח האופטימליים ואחוז חומרי הניקוי לקשירה לחרוזים עשויים להיות שונים ויש לאמת אותם בניסוי. בנוסף, ניתן לדגור את הגלולה מ-4.4 ב-50 מיקרוליטר של 2% SDS למשך 10 דקות ב-60 מעלות צלזיוס כדי לחלץ חלבונים מהחלק הבלתי מסיס, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-21,000 x גרם למשך 10 דקות. הוסף תמצית זו לליזט המובהר ולחרוזים.
  9. דגירה למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר על מסובב צינור.
  10. צנטריפוגה קצרה (<1 שניות) את הצינור כדי להחזיר את כל הנוזל לתחתית הצינור, לאסוף את החרוזים על מעמד מגנטי, ולאחר מכן להחליף את הסופרנטנט (זרימה) במאגר כביסה 1.
  11. דגירה למשך 5 דקות על מסובב צינור ואז חזור על הפעולה כמו בשלב 4.10 לשטיפה שנייה.
  12. החלף מאגר כביסה 1 במאגר כביסה 2 לשתי כביסות נוספות (כביסה 3 ו-4).
  13. החלף את מאגר הכביסה 2 במאגר כביסה 3 לשתי כביסות אחרונות (כביסה 5 ו-6).
  14. לאחר הסרת הכביסה הסופית, אחסן את החרוזים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני העיבוד במורד הזרם.
    הערה: ניתן לשטוף את החרוזים עם מאגר Laemmli לניתוח כתמים מערביים ולהגיש אותם לשירותי ספקטרומטריית מסה להכנת פפטיד על חרוזים לזיהוי חלבון.

תוצאות

הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה פשוטה להכנסת שינוי ביוטין קוולנטי לחלבונים בקרבת חלבון מטרה ב Paramecium (איור 1א). לאחר מכן ניתן להעשיר את החלבונים הביוטיניים הללו באמצעות משיכת סטרפטווידין ולזהות אותם באמצעות ספקטרומטריית מסה20. כדי להדגים מקרה שימוש מעשי של השיטה, יישמנו את הפרוטוקול על חלבון Nowa1. חלבון זה חיוני לתהליך הסידור מחדש הגנומי ויש לו שינויים דינמיים בלוקליזציה שלו12. בשלבים המוקדמים הוא נשאר בגרעין הסומטי הישן ובשברים, אך מאוחר יותר הוא ממוקם בגרעין המתפתח החדש. יש לציין כי ניסיונותינו הקודמים להעשרה בתיווך תג של חלבוני האינטראקציה Nowa1 לא צלחו (תוצאות שלא פורסמו). סביר להניח שהסיבה לכך היא החזרות המורכבות הנושאות דמיון לחלבון הפריון PrP27 שעלולות לגרום לצבירה עצמית בתנאים לא אופטימליים במהלך הליך המשיכה21. ה-PCR הגביר את אזור הקידוד Nowa1 יחד עם האזור הלא מקודד במעלה הזרם המכיל את המקדם. לאחר מכן המוצר הוכנס למסגרת עם רצף קידוד turboID מותאם לקודון (איור 1ב). כדי למנוע השתקה הנגרמת על ידי טרנסגנים הנגרמת על ידי הזרקת DNA מעגלי פנימה Parameciumהווקטור עבר ליניאריזציה לפני ההזרקה., לאחר מכן ה-DNA הליניארי והמטוהר הוזרק לתוך הגרעין הסומטי (MAC) כמתואר בפרוטוקול זה. טיפה מפוזרת המוגבלת בתוך האזור הכהה יותר של הגרעין הסומטי נראתה בחלק מההזרקות המוצלחות (איור 1ג). ההזרקה המוצלחת והגברת ה-DNA על ידי התאים במהלך חלוקת התאים אומתו לאחר מכן על ידי PCR. כצפוי, 40-50% מהתאים היו חיוביים ל-DNA המוזרק של מבנה Nowa1 (גודל מוצר צפוי 685 bp) (איור 2). השלב הבא היה לאמת את נוכחות החלבון המקודד על ידי ה-DNA המוזרק. מכיוון שהווקטור הנמען מכיל את רצף ה-turboID שמשני צדיו תג HA משולש, השתמשנו בצביעה אימונופלואורסצנטית כדי לזהות את התג. זה איפשר לנו לוודא אם התאים המוזרקים מבטאים את חלבון ההיתוך ואם הוא ממוקם כראוי. השתמשנו בתאים בשלב מאוחר שהראו לוקליזציה של חלבון ההיתוך בשני הגרעינים המתפתחים החדשים, כפי שנצפה בעבר עבור חלבון Nowa1 מסוג פרא12. קווי התאים הבודדים שהוזרקו הראו רמות שונות של חלבון האיחוי (איור 3). רמת ביטוי נמוכה יותר יכולה להועיל ליישומים שבהם רצוי רקע מופחת, אך במקרה זה, בחרנו באות מקסימלי והמשכנו עם שיבוט 2, שהראה את הביטוי הגבוה ביותר. לאחר מכן אספנו דגימות בשלבי התפתחות שונים כדי לעקוב אחר הלוקליזציה של חלבון ההיתוך. החלבון היה ממוקם בתחילה בשרידים שנוצרו מהגרעין הסומטי הישן ובשברי הגרעין המופרדים במהלך השלבים המוקדמים של האוטוגמיה. עם הופעת האנלאגן הגרעיני, חלבון ההיתוך עבר לעבר הגרעינים המתפתחים החדשים הללו (איור 4). כדי לטפח את הביוטינילציה של הפרוטאום הפרוקסימלי בשלבים השונים, השלמנו את התרבית עם 500 מיקרומטר ביוטין למשך שעתיים לפני קצירת התאים ל-IF. דמיינו את החלבונים המסומנים בביוטין באמצעות צביעת IF באמצעות סטרפטווידין מתויג פלואורסצנטי. האות שנצפה תאם את הלוקליזציה של חלבון ההיתוך המתויג HA. חשוב לציין, ניתן היה להשיג לוקליזציה של ביוטינילציה ספציפית לשלבי ההתפתחות הגרעיניים השונים, שכן אפילו דגירה קצרה עם ביוטין מספיקה להשגת ביוטינילציה משמעותית (איור 4). בנוסף, ללא תוספת של ביוטין משלים, ניתן היה לזהות רק ביוטינילציה זניחה בתאים שהוזרקו. בתאים מסוג בר, תוספת של ביוטין משלים לא גרמה לביוטינילציה ניתנת לזיהוי (איור 5א). יש לציין כי הביוטין לא רק הצטבר בגרעין המתפתח, שכן גם בתנאי דנטורציה, הוא נשאר מחובר לחלבונים. (איור 5ב). באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין, ניתן היה להעשיר באופן סלקטיבי את החלבונים הביוטיניים (איור 6). ניתן לזהות את החלבונים המועשרים באמצעות ספקטרומטריית מסה. בניסויי זיהוי החלבונים הבאים הללו, התרבית ללא תוספת, כמו גם תאים המבטאים חלבון טורבו-ID שאינו מאוחד, יכולים לשמש כקבוצות ביקורת רקע.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של ההליך לביוטינילציה של קרבה ב-P. tetraurelia. (א) מתווה כללי של הפרוטוקול. (B) עקרון השיבוט עבור וקטור מקבל ה-turboID plug-and-play והמבנה המתקבל עבור חלבון ההיתוך Nowa1. אזור 3'UTR המשמש בפלסמיד זה נגזר מ-CenH3a. (C) טיפות מפוזרות גלויות שכלולות באזור הכהה יותר שמתאים לגרעין הסומטי (MAC) לאחר הזרקה מוצלחת של דנ"א. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת PCR להזרקה מוצלחת. ניתוח ג'ל אגרוז של תגובת PCR למוצר עם פריימר קדמי ספציפי לאזור במעלה הזרם המקודד לעמידות לאמפיצילין (התחלת אמפר) ופריימר הפוך משלים ל-Nowa1. ראש החץ מציג את גודל המוצר הצפוי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: צביעה אימונופלואורסצנטית כדי לאמת את הלוקליזציה הנכונה של חלבון ההיתוך turboID. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדן ראשוני ארנב-אנטי-HA (1:100) ונוגדנים משניים מצומדים נגד ארנב Alexa Fluor 568 (1:1000) של קווי Paramecium חד-שבטיים עם אות PCR חיובי ל-DNA המקודד חלבון היתוך Nowa1-HA-turboID. קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ביוטינילציה ספציפית ל-Nowa1 בשלבי התפתחות שונים. צביעה אימונופלואורסצנטית של הקו החד-שבטי 2 בשלבים מתקדמים במהלך היווצרות הגרעין הסומטי החדש. מדיום התרבית הוסיף 500 מיקרומטר ביוטין לפעילות טורבו-ID אופטימלית. תג HA זוהה כמו באיור 3, וביוטין זוהה באמצעות Streptavidin-FITC (1:200). קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תיוג קרבה יעיל על ידי turboID דורש ביוטין משלים בתרבית. (A) צביעה אימונופלואורסצנטית של wt ותאים מוזרקים בשלב ההתפתחותי המאוחר המראה את הביטוי של Nowa1-HA-turboID ואת הביוטינילציה הנצפית עם ביוטין משלים של 500 מיקרומטר. HA-tag וביוטין זוהו כמו באיור 4. קנה מידה 20 מיקרומטר. (B) ניתוח כתמים מערביים לביוטין באמצעות HRP-סטרפטווידין של תאי wt שגודלו עם 500 מיקרומטר ביוטין ותאים שהוזרקו עם ובלי ביוטין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: העשרה של חלבונים ביוטיניליים עם חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין. ניתוח כתמים מערביים לביוטין של דגימות מניסוי משיכה באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין. הדגימות הן: ליזאט תא Nowa1-HA-turboID (קלט), השבר הלא קשור (זרימה), שלבי הכביסה (שטיפה 1-6) והחלבונים הקשורים לחרוזים (פלט). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקה להצמדת חלק ביוטין לחלבונים בסמיכות לחלבון המבוקש. בהתבסס על הזיקה החזקה של סטרפטווידין לביוטין, זה מאפשר העשרה מהירה ויעילה של החלבונים שהשתנו. בשילוב עם יכולת ההסתגלות המהירה לחלבונים שונים מעניינים, השיטה המוצגת יכולה להקל על המחקר של אינטראקציות מרובות חלבונים ב-Paramecium. אורגניזם מודל זה מבוסס היטב למחקר על אינטראקציות טרנספוזון-מארח במהלך רבייה מיוטית3. בנוסף, היא יכולה להציע כלים מולקולריים חדשים לעריכה גנומית מדויקת מכיוון שהיא מסירה יותר מ-45,000 רצפים במהלך הסידורים הגנומיים המתוכנתים שלה. התהליך מתוזמר על ידי מנגנון מורכב רב-רכיבי המאפשר כריתה מדויקת מכוונת RNA של שברי DNA אלה עם אתר מחשוף הניתן לשחזור לאורך כל דור. השיטה המוצגת כאן מציעה שני יתרונות עיקריים לחקר תהליך זה. זה מפשט את הגילוי של אינטראקציות חלבון-חלבון חולפות. בנוסף, וקטור הנמען plug-and-play מאפשר יצירה מהירה של חלבוני היתוך פונקציונליים רבים. מכיוון שסביר להניח שגורמים מרובים מעורבים בתהליך בשלבים שונים, יכולת ההסתגלות מאפשרת לחשוף את האינטראקטומים של חלבונים רבים שיכולים להיות חלק ממנגנון הכריתה. חשוב לציין, מבני ההיתוך באים לידי ביטוי מהמקדם של הגן האנדוגני, ולכן הם תואמים באופן צר את מהלך זמן הביטוי המקומי. יתר על כן, השימוש המודגם במיקרו-הזרקה להעברת חומר גנטי אקסוגני לאורגניזם מודל זה מאפשר יצירת אוכלוסיות חד-שבטיות הומוגניות. אוכלוסיות כאלה מאפשרות התחלה סינכרונית יותר של תהליך האוטוגמיה, שבמהלכו מתרחשת התפתחות של גרעין סומטי חדש.

בעוד שההליך המודגם להכנסת מבני ההיתוך של turboID הוא חזק, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה ספציפית בפרוטוקולי העשרת החלבון במורד הזרם, בשל מנגנון הביוטינילציה. מכיוון שאנזים ה-turboID הממוזג מייצר חלקי ביוטין-AMP תגובתיים המתפזרים הרחק מהאנזים, אלה יכולים להגיב עם כל חלק נוקלאופילי בסביבה. לפיכך, שלב חיוני במתודולוגיה זו הוא זיהוי שותפי האינטראקציה האמיתיים מפגעי הרקע ומהחלבונים הממוקמים בסביבה הכללית של חלבון ההיתוך turboID, שאינם שותפי האינטראקציה בפועל. כדי להשיג זאת, ניתן להתאים וריאציה של פרמטרים, כגון משך הדגירה עם ביוטין16. יתר על כן, מערך ניסוי הכולל קבוצת ביקורת ללא תוספת ביוטין במדיום יכול להצביע על קשירת הרקע. כפי שהוכח, קבוצת ביקורת כזו תהיה זהה מבחינה גנטית לניסוי בפועל, אך הביוטינילציה על ידי turboID מופחתת מאוד בשל השפע הנמוך של ביוטין. קבוצות ביקורת חשובות נוספות יכולות לכלול חלבון טורבו-ID שאינו מותך, כמו גם קבוצה מסוג בר, שתיהן מתורבות במדיום בתוספת ביוטין. בנוסף, למרות שהזיקה החזקה של סטרפטווידין לביוטין היא יתרון משמעותי על פני משיכות מבוססות נוגדנים, ריכוזי מלח וחומרי ניקוי שונים עשויים להשפיע על טוהר ויעילות ההעשרה.

גישות פרוטאומיות מעולות יכולות להגביר את ההבנה שלנו לגבי המנגנונים המולקולריים הייחודיים של Paramecium, ופוטנציאלית, ריסים אחרים. רכיבים מולקולריים עם פונקציות חדשות מבטיחים להיות מיועדים מחדש ככלים בביולוגיה סינתטית ובכך יכולים לטפח פיתוחים ביוטכנולוגיים22,23. חלבונים סינתטיים מהונדסים מורכבים לרוב משילובים של תחומים פונקציונליים בעלי תכונות חדשות המאפשרים יישומים טיפוליים שלא היו מעשיים בעבר. חלבונים מהונדסים יכולים למצוא שימוש גם בתהליכי ייצור תרופות24. מערכת כריתת הגנום המכוונת RNA מ-Paramecium מעניינת במיוחד עבור פיתוחים כאלה. מערכת זו משיגה כריתה תלויה ב-RNA של אלפי מקטעי DNA, עם דיוק עד לנוקלאוטיד הבודד25. פרמטרים כאלה הופכים את זה למעניין לשפר את הדיוק של עריכת הגנום בתאים אנושיים. ניתן להשתמש בשיטת הביוטינילציה המוצגת כדי להאיץ ולטפח את הגילוי של רכיבי חלבון חדשים והאינטראקציות ביניהם בתוך מכונות מולקולריות מרובות חלבונים.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק DigiK של אוניברסיטת ברן ומענק של הקרן הלאומית השוויצרית למדע שהוענק 229074 ל-B.-A.S. ומענק הקרן הלאומית השוויצרית למדע 214853 הוענק ל-M.N.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ Axiovert 40 CFL (עדשות 10x, 40x)צייסנה
ב-סיטוסטרולסיגמא אולדריץ'567152
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא אולדריץ'א9647
שמן סלטראםאפנדורףנה
רצף DNA 3xHA-turboID אופטימלי של קודוןטוויסט מדעי הביולוגיהנהGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCTCTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTACGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAACAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTTTTTTT
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTCTCAT
TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGCTAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
> TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGTAGTAGGCTGCTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGGTTG
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAAa
GAAATGA
DAPIסיגמא אולדריץ'D9542
EDTAפישר סיינטיפיקAAA151610B
טיפים למיקרו-מעמיס epT.I.P.S.אפנדורף5242956003
אתנולגרוג כימי1009832500
פמטו-ג'ט 4iאפנדורףנה
פמטוטיפ IIקליבר סיינטיפיק5242957000
תמיסת פורמלדהידסיגמא אולדריץ'F8775
גליציןAppliChem10021259
נוגדן IgG נגד ארנב עיזים, Alexa Fluor 568תרמו פישר סיינטיפיקא-11011
HA-tag (C29F4) ארנב mABמערכות תאים3724
InjectMan NI 2אפנדורףנה
בינוני בהירנהנהתמיסת אבקת עשב חיטה 0.2x ב-2.5 מ"מ Na2HPO4
שמן מינרליסיגמא אולדריץ'M8691
N2HPO4סיגמא אולדריץ'71643
פנול-כלורופורם-איזואמילאלקוהולסיגמא אולדריץ'77617
מי מלח עם זרחן פישר סיינטיפיק10722497
ערכת פלסמיד פלוס midiprepקיאג'נה12945
מדיום עשירנהנה1x תמיסת אבקת עשב חיטה ב-2.5 מ"מ Na2HPO4
סטרפטווידין-FITCתרמו פישר סיינטיפיק11-4317-87
מסנן צנטריפוגלי Ultrafree-MC GV EMD מיליפורUFC30GV00
פתרון כביסהנהנה0.1% BSA במי וולביק 
תמיסת אבקת עשב חיטהפיינס אינטרנשיונלנההכן כמלאי פי 20 מהאבקה כפי שתואר קודם לכן (0.5 גרם/10 מ"ל)
סטרפטווידין-HRPאילן אילןאילן אלכסנדר
חרוזי מגנאטי מצופים סטרפטווידיןסיגמא אולדריץ'LSKMAGT02
מאגר ליזיס למשיכהנהנה50 מ"מ טריס pH 8; 150 מ"מ NaCl; 0.5% נתרן דאוקסיכולאט; 1% טריטון X-100; 5 מ"מ MgCl2; 2x מעכב פרוטאז cOmplete (Roche);  
מאגר כביסה 1 למשיכהנהנה50 מ"מ טריס pH 8; 150 מ"מ NaCl; 0.5% נתרן דאוקסיכולאט; 1% טריטון X-100; 5 מ"מ MgCl2;
מאגר כביסה 2 למשיכהנהנה10 מ"מ טריס pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 0.01% NP40; 1 מ"מ MgCl2
מאגר כביסה 3 למשיכהנהנה10 מ"מ טריס pH 7.4; 150 מ"מ NaCl;

מקורות

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TurboIDDNAWestern Blot
ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.