מאמר שיטה

יצירת גנום חיידקי שלם מדגימות קליניות באמצעות זרימת עבודה של העשרת מטרה

DOI:

10.3791/68506

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology, University of Zürich, 2Facultad de Farmacia y Bioquímica, Cátedra de Microbiología Clínica, Universidad de Buenos Aires

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ריצוף גנום שלם של זיהומים חיידקיים המועברים במגע מיני מדגימות קליניות באמצעות העשרת מטרה. שיטה חדשנית זו מבוססת פאנל סינדרומי מתגברת על אתגרים של DNA אנושי בשפע ועומסי חיידקים נמוכים, ומקלה על מעקב גנומי אחר Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ו-Mycoplasma genitalium.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השגת גנומים מלאים של זיהומים חיידקיים המועברים במגע מיני (STI) ישירות מדגימות קליניות היא מאתגרת בשל נוכחותם של DNA אנושי, מיקרוביוטה ועומסי פתוגנים חיידקיים נמוכים מאוד. תרבית היא לרוב לא אופציה, מכיוון שמינים אלה הם קפדניים, ורוב הדגימות נלקחות באמצעי הובלה שהופכים אותם לבלתי ברי קיימא לתרבות. כדי לטפל בבעיות אלה, השתמשנו בפאנל בדיקה שתוכנן על פני ארבעה מינים כדי ליצור רצפי גנום שלמים של מחלות מין חיידקיות וביצענו העשרת מטרה, הליך הכלאה של יומיים עד שלושה ימים לפני ריצוף הגנום. התוצאות הראשוניות שלנו הניבו נתונים גנומיים מצוינים באמצעות דגימות שריצוף ישיר שלהן לא הצליח. העשרת מטרה הוכחה כיעילה ביותר לריצוף גנומים של מחלות מין חיידקיות, במיוחד כאשר עומס הפתוגן היה גבוה (Ct < 30). דגימות שנבדקו המכילות מיקופלזמה גניטליום היו לעתים קרובות עם ערכי Ct מעל 30, מה שהוביל לשיעורי הצלחה נמוכים יותר של התאוששות הגנום; שיפורים נצפו לאחר אופטימיזציה של טמפרטורת ההכלאה מ-65 מעלות צלזיוס ל-62.5 מעלות צלזיוס. בנוסף לאפשר מעקב גנומי, הזמינות של גנומים שלמים יכולה לספק תובנות חשובות לגבי עמידות אנטי-מיקרוביאלית, כגון זיהוי גורמי עמידות נרכשים הקשורים ל-Neisseria gonorrhoeae. שיטה זו כבר הובילה לזיהוי שושלת חדשה של Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum בבואנוס איירס, ompA-genotype L4, מה שמדגיש את הפוטנציאל של גישה זו לחשיפת מגוון גנומי חדש ושיפור המעקב אחר STI.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעתן של טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS) הקלה על ריצוף גנום שלם של חיידקים (WGS), ואפשרה ריצוף של מבודדים קליניים בתוך מינים רבים של פתוגנים חיידקיים אנושיים. הטכנולוגיה אפשרה מחקרים השוואתיים רבים באמצעות יצירת גנומים שלמים בקנה מידה חסר תקדים. הייתה לכך השפעה רבה על המיקרוביולוגיה הקלינית ובריאות הציבור, שכן גישה לנתוני גנום מדגימות קליניות באמצעות WGS מאפשרת הקלדה וזיהוי של גנים עמידים לאנטיביוטיקה. בנוסף, גישות מטאגנומיות מאפשרות זיהוי ישיר של פתוגנים הקשורים למחלה מדגימות קליניות. מידע כזה יוצר הזדמנויות חדשות לאסטרטגיות טיפול מותאמות אישית למטופלים. בנוסף, WGS הוא כלי רב עוצמה המספק תובנות לגבי האבולוציה של זנים במחזור של פתוגן ספציפי, כמו גם דפוסי ההעברה שלהם, ומאפשר לרשויות בריאות הציבור להבין טוב יותר ולהגיב להתפרצויות פתוגנים 1,2,3.

כדי להשיג איכות ריצוף מספקת עבור WGS, בדרך כלל יש צורך בבידוד חיידקים באמצעות תרבית כדי להשיג את כמויות ה-DNA המיקרוביאליות הנדרשות 4,5,6. זה מייצג גורם מגביל עבור אותם אורגניזמים שקשה לתרבת, כאלה שלא ניתן לגדל עקב עיבוד דגימות אבחון שאינו בר קיימא, או כאלה שנחשפו לאנטיביוטיקה במהלך הטיפול בחולה. דוגמאות למיקרואורגניזמים קשים לתרבית כאלה כוללות פתוגנים חיידקיים המועברים במגע מיני, כגון Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ו-Mycoplasma genitalium 7,8,9. מינים אלה מאתגרים לתרבות בשל מספר גורמים, כולל האופי התוך-תאי שלהם, שבריריותם, דרישות גידול קפדניות ושיעורי שכפול איטיים. מסיבות אלה, פיתוח ויישום טכניקות המאפשרות WGS למרות תכולת DNA נמוכה - כפי שקורה לעתים קרובות בדגימות מטופלים - הוא חיוני לביצוע ניתוחים גנומיים במסגרות קליניות.

העשרת מטרה היא השיטה המבטיחה ביותר לריצוף גנום כאשר ה-DNA המיקרוביאלי נדיר10. לדוגמה, בהקשר של פתוגנים הגורמים לזיהומים המועברים במגע מיני (STI), רק חלק קטן מה-DNA הקיים בדגימת המטופל מקורו בפתוגן. במקרה של זיהומי C. trachomatis, נמצא כי ה-DNA של הפתוגן מהווה עד 0.6% מכלל ה-DNA, אך הערכים בדרך כלל נמוכים בהרבה11. שיטת העשרת המטרה מורכבת מלכידה סלקטיבית של ה-DNA המיקרוביאלי המעניין לפני NGS. זה מושג באמצעות בדיקות RNA מתויגות ביוטין שתוכננו במיוחד ומשלימות את ה-DNA המיקרוביאלי המטרה. קשירת מתאם מבוצעת ליצירת ספרייה גנומית, לפני הכלאה, שבמהלכה בדיקות אלה נקשרות ל-DNA המיקרוביאלי המשלים. לאחר מכן, חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין משמשים ללכידת קומפלקסי חומצות הגרעין המסומנים בביוטין, תוך ניצול האינטראקציה החזקה בין ביוטין לסטרפטווידין. לבסוף, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מגבירה את שברי ה-DNA שנבחרו. צעדים רעיוניים מרכזיים אלה נחוצים להבנת אסטרטגיית העשרת היעד. עם זאת, שלבים פרוצדורליים נוספים, כגון שטיפה ובקרת איכות, מעורבים גם הם בפרוטוקולהמלא 10,12.

לפני התחלת פרוטוקול הרצף, חשוב להעריך את כמות ה-DNA הקלט ולוודא שהתנאים לאורך זרימת העבודה שומרים על שלמותו. על פי המלצות היצרן, הפרוטוקול הסטנדרטי דורש 10-200 ננוגרם DNA בנפח של 7 מיקרוליטר, המתאים לטווח ריכוזים של כ-1.4 עד 28.6 ננוגרם/מיקרוליטר. כאשר ריכוז ה-DNA נמוך יותר, מומלץ להשתמש בגרסה שונה של הפרוטוקול המשתמשת ב-17 מיקרוליטר, המאפשרת ריכוזים בין 0.6 ל-11.8 ננוגרם/מיקרוליטר תוך שמירה על כמות הקלט הנדרשת12. בהתחשב בריכוזים הנמוכים המתקבלים לעתים קרובות מדגימות קליניות, יישמנו באופן שגרתי את גרסת הפרוטוקול של 17 מיקרוליטר. ביצועי הכלאה וריצוף קשורים לאיכות ה-DNA, מה שמדגיש את החשיבות של תנאי אחסון והובלה מתאימים של דגימות לשמירה על שלמות חומצות הגרעין. לכן, שיטות טיפול נכונות כגון ייצוב אמצעי איסוף, עיבוד מהיר, שמירה על תנאי שרשרת קרה ומזעור מחזורי הקפאה-הפשרה הם אמצעים חשובים לייעול איכות ה-DNA. בנוסף לריכוזי ה-DNA הנדרשים, אורך קטע ה-DNA הוא אינדיקטור לשלמות. אנו ממליצים למזער את פירוק ה-DNA במהלך הטיפול והאחסון של הדגימה כדי להשיג שברים ארוכים יותר ולייעל את תוצאות הריצוף. זה רלוונטי במיוחד במסגרות קליניות, שבהן שונות בשיטות האיסוף, המדיום והטיפול נפוצה. יישמנו בהצלחה פרוטוקול זה על DNA שהופק הן ממדיום 2-SP והן ממדיית הובלה NAAT, עם אורכי שבר ממוצעים עד 1kb, כמפורט בתוצאות המייצגות. לבסוף, ריצוף מוצלח הוגדר כהשגת כיסוי גנומי של יותר מ-95% עם עומק קריאה ממוצע העולה על 10x10.

עד כה, העשרה ממוקדת יושמה בהצלחה על ידי קבוצות מחקר שונות על מגוון רחב של מיקרואורגניזמים ווירוסים, כולל פתוגנים הגורמים למחלות מין, נורו-וירוסים, וירוסים של בעלי חיים ופתוגנים צמחיים 10,13,14,15,16. עם זאת, עד כה, תכנון הגשושית הוגבל בדרך כלל לפתוגנים בודדים ולא לפאנל המכוון לגנומים שלמים של פתוגנים מרובים הקשורים לסינדרום. מטרות אידיאליות הן אורגניזמים עם גנומים קטנים ומשומרים, שאכן כוללים C. trachomatis, T. pallidum ו-M. genitalium. בעוד של-N.gonorrhoeae יש גנום מגוון יותר ופאן-גנום גדול יותר, עדיין ניתן להסביר את הבדיקות שיכסו אותו בתכנון עם שלושת החיידקים האחרים. יש סטייה מסוימת ב-%G+C בין החיידקים הללו, ואחרים שעשויים להיות קשורים סינדרומית, מה שאומר שייתכן שיהיה צורך לייעל את התנאים.

מטרת פרוטוקול זה היא להשיג גנומים שלמים ישירות מדגימות קליניות כדי לאפשר ניתוחים פילוגנטיים ואפידמיולוגיים. אנו מדגימים אסטרטגיה חדשה ויעילה באמצעות פאנל בדיקה המותאם ל- C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ו- M. genitalium לשחזור גנומים שלמים באמצעות DNA שהופק מדגימות קליניות כגון ספוגיות אורוגניטליות ואנורקטליות. גישה זו הוכחה כמוצלחת ויושמה באפיון התפרצות הלימפוגרנולומה ונריום (LGV) בבואנוס איירס, מה שמאפשר תיאור של שושלת חדשה של C. trachomatis LGV10,13.

הליך העשרת המטרה יתואר, כולל שימוש בשיטת לכידת DNA זמינה מסחרית עם איגום לאחר לכידה לריצוף הדור הבא (NGS) המשמש להשגת גנומים שלמים ישירות מדגימות קליניות מחולים שאובחנו עם C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ו/או M. genitalium זיהומים. להצלחה מיטבית, מומלץ לבחור דגימות עם ערך Ct מתחת ל-30, מכיוון שערכי Ct גבוהים יותר משקפים עומסי פתוגנים נמוכים יותר ויש להם פחות סיכוי להניב גנומים שלמים. ניתן להשיג תמצית DNA לשיטה מדגימות קליניות מסוגי דגימות שונות ואמצעי איסוף. ניתן לבצע הליכי מיצוי DNA באופן ידני או עם מערכות אוטומטיות, באמצעות ערכות המיועדות לבידוד של פתוגן או DNA ויראלי מדגימות מטוש אנושיות (ראה טבלת חומרים).

ערכת הבדיקה ששימשה בהליך העשרת המטרה (ראה טבלת חומרים) תוכננה במיוחד כדי ללכוד את המגוון הגנומי של C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum ו-M. genitalium. בדיקות מותאמות אישית נוצרו באמצעות מספר גנומים שלמים עבור כל מין, תוך אופטימיזציה של הכיסוי של הפאן-גנומים הידועים שלהם10. קריטריוני התכנון כללו הומולוגיה מינימלית של רצף של 90% לרצפי הייחוס ותדירות אריחים של 1x-2x כדי לשפר את יעילות לכידת המטרה. כדי לייעל את העלות-תועלת, האלגוריתם ששימש בתכנון בדיקה מזער את מספר הבדיקות תוך שמירה על ייצוג גנומי מקיף. ערכת הבדיקה הסופית כללה 242,000 בדיקות לעיצובי המולטיפלקס המכוונים ל-C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium ו-T. pallidum. ניתן לבצע את כל פרוטוקול העשרת המטרה תוך יומיים או שלושה. אינדיקציות ברורות לנקודות עצירה מסופקות הן עבור אפשרויות זרימת העבודה של יומיים והן עבור שלושה ימים.

הצהרת אתיקה
מחקר זה מציע שיפורים מתודולוגיים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו בעבר10,13. ההליכים המתוארים כוללים רק דגימות לא מזוהות ואינם כוללים נתוני מטופלים; לכן, לא נדרש אישור אתי ספציפי להיבטים המתודולוגיים. התוצאות המייצגות התקבלו משתי קבוצות של דגימות שנחקרו בעבר: דגימות ארגנטינאיות שנאספו תחת הפרוטוקול המאושר Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, אישור מס' 201723), עם הסכמה מדעת בכתב שהתקבלה מכל המשתתפים; ודגימות פיניות אנונימיות, שעבורן לא נדרש אישור אתי ספציפי. לפני הגשת מסד נתונים של נתוני ריצוף כלשהם המתקבלים, יש להסיר קריאות אנושיות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: יש לחלק את חלל העבודה לאזור טרום-PCR (ampסביבת עבודה נטולת פליקון) ואזור פוסט-PCR (ampסביבת עבודה לטיפול ב-amplicon) כדי למנוע זיהום. אלא אם צוין אחרת במפורש, יש לבצע את כל השלבים באחת משתי סביבות העבודה המבוקרות. יש להכין את כל תערובות המאסטר ותערובות תגובת ה-PCR בסביבת העבודה נטולת המגבר, בעוד שכל השלבים הבאים הכוללים DNA מוגבר צריכים להתבצע בסביבת העבודה לטיפול במגבר. כל הכמויות בפרוטוקול זה מחושבות לעיבוד שמונה דגימות.

1. פיצול DNA

  1. למדוד את ריכוז ה-DNA של תמציות ה-DNA מדגימות קליניות המכילות DNA פתוגן מטרה (DNA) בשיטה רגישה, מדויקת ומבוססת פלואורסצנטיות (בדיקת DNA דו-גדילי [dsDNA], באמצעות 1 מיקרוליטר של דגימה, עם טווח זיהוי של עד 120 ננוגרם/מיקרוליטר; ראה טבלת חומרים). שיטת כימות זו משמשת באופן עקבי לאורך כל הפרוטוקול בכל פעם שריכוז ה-DNA נמדד.
  2. לדלל כל דגימת DNA לריכוז של 10 - 200 ננוגרם באמצעות מים נטולי נוקלאז, מה שמבטיח נפח סופי של 17 מיקרוליטר בכל רצועת צינור PCR. כדי להשיג תוצאות ריצוף מיטביות, השתמש בכמות הגבוהה ביותר האפשרית של DNA קלט בטווח המומלץ.
    הערה: במקרים שבהם ריכוז ה-DNA הכולל נמוך מהמינימום המומלץ של 10 ננוגרם ב-17 מיקרוליטר, ניתן להשתמש בתוספת עם DNA רקע (למשל, DNA גנומי אנושי) כדי לעמוד בדרישות הקלט, כפי שהוצע על ידי היצרן. זה יכול לעזור לייצב את תגובת הכנת הספרייה ולשפר את ביצועי הריצוף בדגימות קליניות בעלות קלט נמוך.
  3. הפשירו את מאגר הפיצול (פי 5), מערבולת והניחו על קרח.
  4. תכנת את המחזור התרמי לפי טבלה 1. הפעל את התוכנית והשהה מיד.
    הערה: משך שלב הדגירה של 37 מעלות צלזיוס עשוי להשתנות בהתאם לגודל מקטע ה-DNA הראשוני ואורך הקריאה הרצוי של NGS. עבור דגימות DNA באיכות גבוהה, מומלץ זמן דגירה של 15 דקות כדי להשיג שברים של 150 עד 200 bp המתאימים ל-2 קריאות של 100x, ו-10 דקות כדי להשיג שברים של 180 עד 250 bp עבור 2 קריאות של 150x.
  5. אחזר את הבקבוקונים הנדרשים לתערובת מאסטר הפיצול מאחסון של -20 מעלות צלזיוס. הכן את תערובת המאסטר על בסיס טבלה 2. אטום את הצינור והמערבולת במהירות גבוהה למשך 5-10 שניות. סובב בקצרה כדי להסיר בועות ולשמור את תערובת המאסטר על קרח.
  6. הוסף 3 מיקרוליטר של תערובת אב פיצול לכל באר המכילה 17 מיקרוליטר של DNA קלט. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 20, אוטמים את רצועת צינור ה-PCR, מערבולת במהירות גבוהה למשך 5-10 שניות וסובבים קצרות.
  7. הנח את רצועת צינור ה-PCR במחזור התרמי (ראה טבלת חומרים) והמשך את התוכנית המוצגת בטבלה 1 בתחילת שלב 1.
  8. לאחר שמגיעים לשלב ההחזקה של 4 מעלות צלזיוס, הסר את רצועת צינור ה-PCR מהמחזור התרמי והוסף 30 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. הנח את רצועת צינור ה-PCR על קרח.

טבלה 1: תוכנית מחזורית תרמית לפיצול אנזימטי. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: הכנת מיקס מאסטר פיצול אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

2. הכנת הספרייה

  1. הכנת תערובת מאסטר קשירה
    הערה: יש להכין תערובת מאסטר קשירה בשלב זה מכיוון שהיא זקוקה ל-30-45 דקות כדי לאזן לטמפרטורת החדר.
    1. אחזר מאגר קשירה מאחסון של -20 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח. אחזר את ה-T4 DNA ligase מאחסון של -20 מעלות צלזיוס, ערבב על ידי היפוך הבקבוקון והשאר על קרח.
    2. הכן את תערובת מאסטר הקשירה לפי טבלה 3. אטום את הצינור והמערבולת במהירות גבוהה למשך 10-20 שניות, סובב קצרות ושמור בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות לפני השימוש.
  2. תיקון קצה ושברי זנב dA
    1. תכנת את המחזור התרמי לפי טבלה 4.
    2. אחזר את מאגר הזנב לתיקון הקצה מאחסון של -20 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח. לאחר ההפשרה, מערבולת במהירות גבוהה, הסתובב לזמן קצר. אחזר את תערובת אנזימי הזנב לתיקון הקצה, ערבב על ידי היפוך הבקבוקון והשאר על קרח.
    3. הכן את תערובת המאסטר לתיקון קצה/זנב dA לפי טבלה 5 (ראה טבלת חומרים). מערבבים על ידי איטום מאובטח של הצינור והמערבולת במהירות גבוהה למשך 10-20 שניות, מסתובבים קצרות ושומרים על קרח.
    4. פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לתיקון קצה/זנב dA לכל באר המכילה 50 מיקרוליטר של שברי DNA (משלבים 1.1-1.8). אטמו את רצועת צינור ה-PCR, ערבבו היטב על ידי מערבולת במהירות גבוהה למשך 5-10 שניות. סובב בקצרה את רצועת צינור ה-PCR והנח אותה במחזור התרמי. המשך את התוכנית של טבלה 4.
  3. קשירה של מתאמים מתויגים MBC
    1. לאחר שהתוכנית בטבלה 4 משלימה את השלב הסופי שלה, הנח את רצועת צינור ה-PCR על קרח. הגדר את המחזור התרמי לפי הפרמטרים בטבלה 6. הפעל את התוכנית והשהה אותה מיד.
    2. הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה בטמפרטורת החדר לכל דגימה שהוכנה בשלב 2.1. אטום את רצועת צינור ה-PCR, מערבולת למשך 5-10 שניות, וסובב קצרות.
    3. אחזר את תערובת האוליגו של המתאם עבור ספריות מתויגות MBC (ראה טבלת חומרים) מאחסון של -20 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח. לאחר ההפשרה, מערבולת במהירות גבוהה למשך 5-10 שניות. סובב לזמן קצר והמשיך על הקרח.
    4. הוסף 5 μL של תערובת אוליגו מתאם עבור ספריות מתויגות MBC לכל דגימה. אטום את רצועת צינור ה-PCR והמערבולת במהירות גבוהה למשך 5-10 שניות, סובב קצרות. הנח מיד את רצועת צינור ה-PCR לתוך המחזורי התרמי והמשך להפעיל את התוכנית כמפורט בטבלה 6.
  4. ניקוי קשירה
    1. בצע טיהור DNA באמצעות חרוזים מגנטיים. אחזר את החרוזים מאחסון של 4 מעלות צלזיוס ואפשר להם להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    2. הכן 4 מ"ל של 70% אתנול באמצעות מים נטולי נוקלאז. יש לשמור בטמפרטורת החדר.
      הערה: מומלץ בחום להכין טרי תמיסת אתנול 70% לשימוש בשלבי הניקוי כדי להבטיח ביצועים מיטביים. להכנת אתנול של 70%, השתמש במים נטולי נוקלאז מיד לפני השימוש.
    3. מערבולת את תרחיף החרוז המגנטי ביסודיות עד שהתערובת אחידה, והצבע נראה עקבי.
    4. כאשר התוכנית בטבלה 6 מגיעה לשלב ההחזקה של 4 מעלות צלזיוס, העבר את רצועת צינור ה-PCR מהמחזור התרמי לטמפרטורת החדר. הוסף 80 מיקרוליטר מתלה חרוזים לכל באר. אטום את רצועת צינור ה-PCR והמערבולת למשך 5-10 שניות, סובב קצרות.
    5. דגרו את מתלי החרוזים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את רצועת צינור ה-PCR למעמד מגנטי (ראה טבלת חומרים) והמתן 5-10 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    6. תוך שמירה על רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי, הסר בזהירות והשליך את התמיסה המנוקה מכל באר, הימנע ממגע עם החרוזים.
    7. עם פס צינור ה-PCR במעמד המגנטי, בצע שתי שטיפות עם 70% אתנול באופן הבא: הוסף 200 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל דגימה. יש להמתין דקה אחת ולהוציא 70% אתנול. הימנע מלגעת בחרוזים בזמן הסרת התמיסה.
    8. לאחר הכביסה השנייה, אטמו את רצועת צינור ה-PCR וסובבו בקצרה את הדגימות כדי לאסוף שאריות אתנול. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי למשך 30 שניות.
    9. הסר את האתנול שנאסף תוך הימנעות מנגיעה בחרוזים. כדי להסיר את שאריות האתנול, הסר את רצועת צינור ה-PCR מהמעמד המגנטי ושמור לא אטום (באופן אידיאלי בתוך מכסה המנוע) עד 5 דקות. ודא שהחרוזים מיובשים לחלוטין אך אינם סדוקים במראה; זה יפחית את היעילות של תהליך הפליטה.
    10. לחסל את ה-DNA על ידי הוספת 35 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לכל באר דגימה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10x-15x, אוטמים את הצינורות ומערבולת למשך 5-10 שניות. אשר את היעדר גושים גלויים. במקרה שיש כאלה, מערבולת עד להמסה.
    11. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד מגנטי והמתן כ-5 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    12. הסר בזהירות את הסופרנטנט המנוקה (~34 מיקרוליטר) מכל באר והעביר לבאר מתאימה ברצועת צינור PCR טרייה. שמור את הדגימות על קרח והשליך את החרוזים.
      הערה: עבור פרוטוקול של 3 ימים, זה מסמן את סוף היום הראשון. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. הגברה ואינדקס כפול
    הערה: בחר את זוג פריימר האינדקס המתאים עבור כל דגימה כדי להבטיח זיהוי נכון במהלך הרצף. כל רצף אינדקס מורכב מתג של 8 bp המשולב בתוך הפריימרים המשמשים להגברה של ספריות הלכידה המוקדמת.
    1. אחזר את מאגר ה-DNA פולימראז בנאמנות גבוהה עם dNTPs (5x) מאחסון של -20 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח. אחזר את פריימרים לריצוף באינדקס שנבחרו מאחסון של -20 מעלות צלזיוס ושמור על קרח.
      הערה: הקפד לתעד את הברקוד הספציפי שהוקצה לכל דגימה לזיהוי מדויק ועקיבות לאורך תהליך הרצף.
    2. תכנת את המחזור התרמי לפי טבלה 7. הפעל את התוכנית והשהה מיד.
      הערה: היצרן ממליץ לבצע 8 עד 14 מחזורי PCR לפני לכידה בהתאם לאיכות וכמות ה-DNA הקלט. בפרוטוקול זה יושמו 11 מחזורים בהתאם להמלצות היצרן, וכתוצאה מכך נתוני ריצוף באיכות גבוהה 10,12.
    3. אחזר את אנזים ההיתוך בנאמנות גבוהה להגברת PCR מאחסון של -20 מעלות צלזיוס. פיפט את האנזים למעלה ולמטה כדי לערבב תוך הימנעות מתסיסה מוגזמת, ומערבל את מאגר ה-DNA פולימראז בנאמנות גבוהה כדי להבטיח הומוגניות. הכן את תערובת תגובת ה-PCR לפני הלכידה (כמתואר בטבלה 8). מערבלים את המיקס הסופי ומסתובבים לזמן קצר, ממשיכים על הקרח.
    4. הוצא 11 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR לפני הלכידה (שהוכנה כמתואר בטבלה 8) לכל דגימה המכילה את ספריית ה-DNA המטוהר. הוסף 5 מיקרוליטר מזוג פריימר האינדקס שנבחר לכל תגובה. אטום את רצועת צינור ה-PCR והמערבולת למשך 5 שניות, ולאחר מכן סובב במהירות.
    5. המשך את תוכנית המחזור התרמי כמפורט בטבלה 7. לאחר שהטמפרטורה מגיעה ל-98 מעלות צלזיוס, הנח את רצועת צינור ה-PCR במחזור התרמי וסגור היטב את המכסה.
  6. ניקוי הספרייה
    1. אפשר לחרוזים מגנטיים להתאזן לטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות לפני השימוש. הכן 4 מ"ל של 70% אתנול באמצעות מים נטולי נוקלאז. יש לשמור בטמפרטורת החדר.
    2. מערבולת את תרחיף החרוז המגנטי ביסודיות עד שהתערובת אחידה, והצבע נראה עקבי.
    3. כאשר התוכנית בטבלה 7 מגיעה לשלב ההחזקה של 4 מעלות צלזיוס, העבר את רצועת צינור ה-PCR מהמחזור התרמי לטמפרטורת החדר. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים לכל דגימה. אטום את רצועת צינור ה-PCR והמערבולת למשך 5-10 שניות, סובב בקצרה (מבלי לגלול את החרוזים המגנטיים).
    4. דגרו את מתלי החרוזים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את רצועת צינור ה-PCR למעמד מגנטי והמתן 5-10 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    5. תוך שמירה על רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי, הסר בזהירות והשליך את התמיסה השקופה מכל באר. הימנע מלגעת בחרוזים בזמן הסרת התמיסה.
    6. עם פס צינור ה-PCR במעמד המגנטי, בצע שתי שטיפות עם 70% אתנול בדרך הבאה. הוסף 200 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל דגימה. יש להמתין דקה אחת ולהוציא 70% אתנול. הימנע מלגעת בחרוזים בזמן הסרת התמיסה.
    7. לאחר הכביסה השנייה, אטמו את רצועת צינור ה-PCR וסובבו אותה בקצרה כדי לאסוף שאריות אתנול. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי למשך 30 שניות. הסר את שאריות האתנול תוך הימנעות מנגיעה בחרוזים.
    8. כדי להסיר את שאריות האתנול, הסר את רצועת צינור ה-PCR מהמעמד המגנטי ושמור לא אטום (באופן אידיאלי בתוך מכסה המנוע) עד 5 דקות. ודא שהחרוזים מיובשים לחלוטין אך אינם סדוקים במראה, מכיוון שהדבר יפחית את יעילות תהליך הפליטה.
    9. לחסל את ה-DNA של הספרייה על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לכל שפופרת דגימה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10x-15x, אוטמים את רצועת צינור ה-PCR ומערבולת למשך 5-10 שניות. אשר את היעדר גושים גלויים. במקרה שיש כאלה, מערבולת עד להמסה.
    10. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד מגנטי והמתן כ-5 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    11. הסר בזהירות את הסופרנטנט המנוקה (~15 מיקרוליטר) מכל באר והעביר לבאר מתאימה ברצועת צינור PCR טרייה. שמור את הדגימות על קרח והשליך את החרוזים.
  7. בקרת איכות
    1. מדוד את ריכוז ה-DNA של ה-DNA של הספרייה המטוהר. בשל הרגישות הגבוהה יותר, השתמש בשיטה מבוססת פלואורסצנטי כדי לכמת את ה-DNA ב-1 מיקרוליטר.

טבלה 3: הכנת תערובת מאסטר קשירה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 4: תוכנית מחזורית תרמית לתיקון קצה/זנב dA. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 5: הכנת תמהיל מאסטר לתיקון קצה/זנב dA. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 6 תוכנית מחזור תרמי לקשירה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 7: תוכנית מחזור תרמי PCR לפני לכידה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 8: הכנת תערובת תגובת PCR לפני לכידה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

3. הכלאה/לכידה של מדגם

  1. ספריות היברידיזציה לבדיקה
    1. תכנת את המחזור התרמי לפי טבלה 9. הפעל את התוכנית והשהה מיד.
      הערה: היצרן ממליץ על טמפרטורת הכלאה של 65 מעלות צלזיוס. טמפרטורה זו הופחתה ל-62.5 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך התוצאות השתפרו.
    2. אחזר את מאגר ההכלאה מאחסון של -20 מעלות צלזיוס, הפשיר על קרח ושמור בטמפרטורת החדר עד לשימוש. אחזר גם את חוסם ה-RNase וגם את תערובת חוסם האוליגונוקלאוטידים מאחסון של -20 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח. שמור את הבקבוקונים האלה על קרח עד לשימוש.
    3. חשב את הנפח הנדרש לכל דגימה להכיל 500-1000 ננוגרם של ספריית DNA, בהתבסס על ריכוז ה-DNA שנמדד בשלב 2.7. העבירו את הנפח המחושב לרצועת צינור PCR חדשה והתאימו את הנפח הכולל ל-12 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז.
    4. מערבולת וסובב במהירות את תערובת חוסמי האוליגונוקלאוטידים. הוסף 5 מיקרוליטר לכל צינור דגימה. אטום את רצועת צינור ה-PCR והעביר למחזור התרמי. המשך את תוכנית הרכיבה התרמית המתוארת בטבלה 9 והפעל עד שלב 3, שבו יש להוסיף ריאגנטים נוספים ישירות לבארות הדגימה במחזור התרמי.
    5. הכן את תמיסת בלוק 25% RNase לפי טבלה 10. אוטמים את הצינור והמערבולת במהירות גבוהה למשך 10-20 שניות, סובבו קצרות ושמרו על קרח עד לשימוש.
      הערה: הימנע מחשיפה ממושכת של תמיסות המכילות בדיקה לטמפרטורת החדר. שומרים בטמפרטורת החדר רק בשלבי ההכנה.
    6. אחזר את בקבוקון הבדיקה מאחסון של -80 מעלות צלזיוס ושמור את הבקבוקון במתלה קירור בזמן שאינו בשימוש. מעבירים לקרח להפשרה. מומלץ להשתמש בבדיקות כמפורט, אך ניתן לדלל אותן אם נבדקו10,13.
    7. לאחר שכל הריאגנטים המפורטים בטבלה 11 הגיעו לטמפרטורת החדר, שלב להכנת תערובת הכלאת הבדיקה. מערבבים את התמיסה על ידי מערבולת במהירות גבוהה למשך 5 שניות, מסתובבים קצרות וממשיכים מיד לשלב הבא.
    8. כאשר המחזורי התרמי מגיע לשלב 3 של התוכנית המתוארת בטבלה 9, הוסף 13 מיקרוליטר מתערובת הכלאת הבדיקה בטמפרטורת החדר לכל באר דגימה, תוך שמירה על הצינורות במחזור התרמי לאורך כל התהליך. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לאט 8x-10x.
    9. אטום היטב את רצועת צינור ה-PCR, מערבולת קצרה וסובב את הצינורות. ודא שאין בועות, ולאחר מכן החזר מיד את צינורות הרצועה למחזור התרמי. בדוק שוב שהצינורות אטומים כראוי.
    10. המשך את תוכנית המחזור התרמי על מנת לבצע הכלאה של דגימות ה-DNA המוכנות של הספרייה עם הבדיקות. הכלאה נמשכת בן לילה
      הערה: עבור פרוטוקול של יומיים, זה מסמן את סוף היום הראשון. עבור פרוטוקול של 3 ימים, זה מסמן את סוף היום השני.
  2. הכנת חרוזי סטרפטווידין
    1. אחזר את החרוזים המגנטיים המצופים סטרפטווידין (חרוזי סטרפטווידין) מאחסון של 4 מעלות צלזיוס. מערבל את הבקבוקון ביסודיות כדי להבטיח שהחרוזים מושעים במלואם. ההשעיה חייבת להיות הומוגנית.
    2. עבור כל דגימת הכלאה, העבירו 50 מיקרוליטר מהחרוזים התלויים במלואם לצינורות בודדים של רצועת צינור PCR חדשה.
    3. שוטפים את חרוזי הסטרפטווידין בצורה הבאה: מוסיפים 200 מיקרוליטר של מאגר מחייב לכל צינור, מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. אוטמים את הצינורות, מערבולת במהירות גבוהה למשך 5-10 שניות, וסובבים לזמן קצר. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד מגנטי. הניחו לתמיסה להתנקות למשך 5 דקות, ולאחר מכן הסירו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלבים פי 2, והשלם בסך הכל שלוש כביסות.
    4. השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של מאגר קשירה.
  3. לכידת ספריות היברידיות
    1. לאחר שתוכנית הרכיבה התרמית ההיברידית המצוינת בטבלה 9 השלימה את השלב הסופי שלה, העבר את רצועת צינור ה-PCR לטמפרטורת החדר.
    2. העבירו את כל הנפח (~30 מיקרוליטר) מכל צינור לצינורות המתאימים המכילים 200 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין שטופים מראש. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 5x-8x, ולאחר מכן אטום היטב את צינור הרצועה.
    3. מניחים את צינור הרצועה על מערבל צלחות של 96 בארות ומערבבים במרץ ב-1800 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הקפידו על ערבוב נכון של הנוזל בתוך הבארות.
      הערה: אם מערבל צלחות של 96 בארות אינו זמין או שהדגימות אינן מתערבבות ביעילות, שקול שיטות חלופיות כגון אבטחת צינורות הרצועה אופקית על המשטח העליון של המיקסר או שימוש בשייקר מבוקר טמפרטורה (עם אפשרות חימום כבויה) כדי להבטיח תסיסה יסודית של הדגימה.
    4. במהלך זמן הדגירה הזה, הכינו שש מנות של 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה בטמפרטורה גבוהה עבור כל דגימה (כלומר, במקרה זה, 6 x 8 צינורות רצועה כל אחד עם 200 מיקרוליטר). אוטמים את הצינורות ודוגרים במחזור התרמי המוחזק ב-70 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    5. לאחר השלמת הדגירה של 30 דקות, סובב לזמן קצר את רצועת צינור ה-PCR כדי לאסוף את הנוזל. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים. המתן עד שהתמיסה תתבהר (כ-2 דקות), ואז הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט תוך הימנעות מנגיעה בחרוזים.
    6. לאחר הסרת רצועת צינור ה-PCR מהמעמד המגנטי, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה בטמפרטורת החדר. פיפטה למעלה ולמטה עד שחרוזי הסטרפטווידין מושעים במלואם (15x-20x).
    7. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי והמתן עד שהמתלה יתנקה (כדקה אחת). לאחר מכן, הסר והשליך את הסופרנטנט.
      הערה: כדי להבטיח ספציפיות לכידה, חיוני לשמור על מתלה החרוזים ב-70 מעלות צלזיוס לאורך כל הליך הכביסה המתואר להלן. לכן, ודא שמאגר הכביסה בטמפרטורה גבוהה מחומם מראש ל-70 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    8. שטפו את חרוזי הסטרפטווידין פי 6 עם מאגר כביסה בטמפרטורה גבוהה של 70 מעלות צלזיוס כמתואר להלן.
      1. הסר את צינור רצועת ה-PCR המכיל את החרוזים מהמעמד המגנטי. הוסף 200 מיקרוליטר של 70 מעלות צלזיוס מאגר כביסה בטמפרטורה גבוהה מחומם מראש לכל צינור המכיל את החרוזים. פיפטה למעלה ולמטה עד לתלייה מלאה של החרוזים (15x-20x). אטום בזהירות את רצועת צינור ה-PCR, מערבולת במהירות גבוהה למשך 8 שניות, וסובב במהירות מבלי לגלול את החרוזים.
      2. הנח את צינור רצועת הדגימה המכיל את החרוזים התלויים בבלוק המחזורי התרמי בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. העבר את צינור הרצועה מהמחזור התרמי למעמד המגנטי בטמפרטורת החדר.
      3. המתן דקה אחת עד שהתמיסה תתבהר. לאחר מכן, הסר והשליך את הסופרנטנט. חזור על הפעולה 5 פעמים בסך הכל שש כביסות.
    9. ודא שכל מאגר הכביסה הוסר לחלוטין, ולאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לכל צינור דגימה. השעו לאט את החרוזים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 8, בניסיון למנוע היווצרות בועות.
    10. שמור את רצועת ה-PCR המכילה את הדגימות על קרח עד שהן מוכנות לשימוש בתגובות ה-PCR המתוארות להלן.
  4. ספריות מועשרות בהגברה
    1. תכנת את המחזור התרמי לפי טבלה 12. הפעל את התוכנית והשהה מיד.
      הערה: היצרן ממליץ לבצע 10 עד 16 מחזורי PCR לאחר הלכידה בהתאם לגודל עיצוב הבדיקה. בפרוטוקול זה יושמו 22 מחזורים, וכתוצאה מכך התאוששות מוצלחת של גנום הפתוגן10,12.
    2. אחזר גם את מאגר ה-DNA פולימראז בנאמנות גבוהה עם dNTPs (5x) וגם את תערובת הפריימר לאחר הלכידה (ראה טבלת חומרים) מאחסון, הפשרה ושמירה על קרח. מערבולת במהירות גבוהה ומסתובבת במהירות לפני השימוש.
    3. אחזר את אנזים ההיתוך בנאמנות גבוהה להגברת PCR (ראה טבלת חומרים) מאחסון של -20 מעלות צלזיוס. כדי לערבב כראוי את תמיסת האנזים, פיפטה למעלה ולמטה בנוזל כדי למנוע תסיסה מוגזמת. לאחר מכן, הכינו את תערובת תגובת ה-PCR לאחר הלכידה על ידי שילוב כל הריאגנטים לפי טבלה 13. מערבלים את המיקס הסופי ומסתובבים לזמן קצר, ממשיכים על הקרח.
    4. הוסף 25 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR לאחר הלכידה לכל צינור דגימה (כל אחד מכיל 25 מיקרוליטר של DNA מועשר במטרה קשור לחרוזים). פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התגובות עד שמתלה החרוזים אחיד. אטום היטב את רצועת צינור ה-PCR. אין לסובב את רצועת צינור ה-PCR בשלב זה.
    5. הנח את רצועת צינור ה-PCR במחזור התרמי והמשך את תוכנית המחזור התרמי כמפורט בטבלה 12. לאחר שהתוכנית מגיעה לשלב הסופי שלה, סובב את רצועת צינור ה-PCR לזמן קצר. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי, המתן כ-2 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    6. העבירו כ-50 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל רצועת צינור PCR לבאר המתאימה של רצועת צינור PCR חדשה. ניתן להשליך את צינור הרצועה המכיל את חרוזי הסטרפטווידין.
  5. ניקוי ספריות סופיות
    1. אפשר לחרוזים מגנטיים להתאזן לטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות לפני השימוש. הכן 4 מ"ל של 70% אתנול באמצעות מים נטולי נוקלאז. יש לשמור בטמפרטורת החדר.
    2. מערבולת את תרחיף החרוז המגנטי ביסודיות עד שהתערובת אחידה, והצבע נראה עקבי.
    3. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים לכל צינור דגימה. אטום את הצינורות והמערבולת למשך 5-10 שניות, סובב בקצרה (מבלי לגלול את החרוזים המגנטיים).
    4. דגרו את מתלי החרוזים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את רצועת צינור ה-PCR למעמד מגנטי והמתן 5-10 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    5. תוך שמירה על רצועת צינור ה-PCR במעמד המגנטי, הסר בזהירות והשליך את התמיסה השקופה מכל באר. הימנע מלגעת בחרוזים בזמן הסרת התמיסה.
      1. עם פס צינור ה-PCR במעמד המגנטי, בצע שתי שטיפות עם 70% אתנול באופן הבא: הוסף 200 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל דגימה. המתן דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים המופרעים להתיישב ולהסיר את 70% האתנול. הימנע מלגעת בחרוזים בזמן הסרת התמיסה.
    6. לאחר הכביסה השנייה, אטמו את הצינורות וסובבו בקצרה את רצועת צינור ה-PCR כדי לאסוף שאריות אתנול. הנח את רצועת צינור ה-PCR על המעמד המגנטי למשך 30 שניות.
    7. כדי להסיר את שאריות האתנול, הסר את פס צינור ה-PCR מהמעמד המגנטי ושמור לא אטום (באופן אידיאלי בתוך מכסה המנוע) למשך 5 דקות לכל היותר. ודא שהחרוזים מיובשים לחלוטין אך אינם סדוקים במראה, זה יפחית את יעילות תהליך הפליטה.
    8. לחסל את ה-DNA של הספרייה על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לכל שפופרת דגימה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10x-15x, אוטמים את רצועת צינור ה-PCR ומערבולת למשך 5-10 שניות. אשר את היעדר גושים גלויים.
    9. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את רצועת צינור ה-PCR במעמד מגנטי והמתן כ-5 דקות עד שהתמיסה תתבהר.
    10. הסר בזהירות את הסופרנטנט המנוקה (כ-25 מיקרוליטר) מכל באר והעביר לבאר מתאימה ברצועת צינור PCR טרייה. שמור את הדגימות על קרח והשליך את החרוזים.
  6. בקרת איכות
    1. מדוד את ריכוז ה-DNA של ה-DNA של הספרייה המטוהר. כדי להשיג רגישות טובה יותר, השתמש בשיטה מבוססת פלואורסצנטי כדי לכמת את ה-DNA ב-1 מיקרוליטר.
  7. ריצוף מהדור הבא
    הערה: בהתאם לקיבולת הפלטפורמה שבה נעשה שימוש ולכמות נתוני הריצוף הנדרשת לכל דגימה, ניתן לשלב ספריות באינדקס ממספר קבוצות בריצת רצף אחת.
    1. לפני איגום הדגימות, התאם את ריכוז ה-DNA של כל דגימה ל-5 ננוגרם/מיקרוליטר. אסוף את הספריות בכמויות שוות ערך כדי לשמור על ייצוג מאוזן.
    2. רצף את הספריות המוכנות באמצעות מערכת ריצוף קריאה קצרה בעלת תפוקה גבוהה עם, למשלample, תצורת קריאה מזווגת של 150 bp (ראה טבלת חומרים).

טבלה 9: תוכנית מחזורית תרמית להכלאה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 10: הכנת תמיסת בלוק RNase. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 11: הכנת תערובת הכלאה של בדיקה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 12: תוכנית מחזור תרמי PCR לאחר לכידה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 13: הכנת תערובת תגובת PCR לאחר לכידה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר על התפרצות C. trachomatis LGV בבואנוס איירס, ארגנטינה, הראה כמה מאפיינים חדשים בדגימות, כלומר, 10 החלפות נוקלאוטידים בגן ompA בהשוואה ל-ompA-genotype L1, ורצף Multi-Locus Sequence Typing (MLST) יוצא דופן מסוג 2 17,18,19. מטרתנו הייתה לחקור את הגנומים מהדגימות הקליניות הללו, ולמקם אותם בהקשר של נתונים גלובליים. כדי להשיג זאת, השווינו את הביצועים של גישת העשרת מטרה עם ריצוף מטאגנומי ישיר עבור WGS של מחלות מין חיידקיות מדגימות קליניות, בניסיון להתגבר על האתגרים שמציבים עומסי חיידקים נמוכים ושפע של DNA אנושי ומיקרוביאלי.

ה-DNA ששימש היה מדגימות ספוגית פי הטבעת שנאספו בין השנים 2017 ל-2023 בבואנוס איירס, ארגנטינה, הונחו במדיום 2-SP (מדיום סוכרוז-פוספט) בתוספת 2% סרום עגל עוברי (FCS) ואנטיביוטיקה (גנטמיצין 25 מיקרוגרם/מ"ל, ונקומיצין 0.5 מ"ג/מ"ל ואמפוטריצין B 2.5 מיקרוגרם/מ"ל) ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס, או שופכה, אנורקטלית, וספוגיות לוע שנאספו בבית החולים האוניברסיטאי בציריך (USZ) במאגר NAATs (בדיקות הגברה של חומצות גרעין). DNA מדגימות בואנוס איירס חולץ באמצעות ערכת מיצוי ידנית מבוססת סיליקה, בעוד DNA מדגימות USZ חולץ באמצעות מערכת אוטומטית מבוססת חרוזים מגנטיים.

כל הדגימות הקליניות שנכללו במחקר זה אושרו כחיוביות על ידי בדיקת PCR בזמן אמת שפותחה על ידי החברה (ראה טבלת חומרים) עם ערכי סף מחזור qPCR (Ct) הנעים כדלקמן: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36, ו-M. genitalium:  30-37. ריכוז ה-DNA כומת באמצעות בדיקה פלואורומטרית ברגישות גבוהה לפני הריצוף כדי לאפיין את חומר הקלט של הדגימות הקליניות (ראה טבלת חומרים).

כדי להשוות ריצוף מטאגנומי ישיר להעשרת מטרה, השתמשנו ב-32 דגימות, מתוכן 29 היו חיוביות ל-C. trachomatis, תשע ל-N. gonorrhoeae, חמש ל-T. pallidum ושלוש ל-M. genitalium. ריצוף מטגנומי ישיר לא הביא לגנום שלם ואכן בקושי השיג נתוני מטרה מעל קו הבסיס שנצפה בדגימות שליליות. העשרת מטרה עם הכלאה ב-65 מעלות צלזיוס הביאה לתוצאות טובות בהרבה עבור כל פתוגן, וגנומים מוצלחים הושגו במקרים רבים משיטה זו (איור 1).

כדי להעריך את בחירת הדגימה האופטימלית להעשרת מטרה, הערכנו את הקשר בין ערכי qPCR Ct אבחנתיים לבין יעילות התאוששות הגנום, כפי שנמדד על ידי אחוז הקריאות על המטרה (%OTR). מדד זה משקף את שיעור קריאות הריצוף הממופות לגנום של אורגניזם המטרה ומשמש בדרך כלל להערכת ביצועי העשרה. נמצא מתאם מובהק בין עומס פתוגן להצלחת ריצוף עבור C. trachomatis, עם חתך Ct להצלחה סביב Ct30. למרות שהנתונים עבור פתוגנים המטרה האחרים היו מוגבלים, נצפתה מגמה דומה, שבה הצלחת ריצוף הגנום התרחשה בעיקר בדגימות עם עומס פתוגן מתחת ל-Ct30 (איור 2).

ניסוי זה עם טמפרטורת הכלאה של 65 מעלות צלזיוס העניק שיעורי הצלחה בריצוף הגנום עם העשרת מטרה של 75%-80% עבור C. trachomatis, N. gonorrhoaee ו-T. pallidum, בהתבסס על דגימות עם ערכי Ct מתחת ל-30. לשלוש הדגימות החיוביות של M. genitalium היו ערכי Ct של 30-37 והשיגו כיסוי גנומי נמוך יותר ועומק קריאה ממוצע. על מנת לשפר את התוצאות הללו, התנסינו בהפחתת טמפרטורת ההכלאה, המשפרת את ההכלאה בשל תכולת ה-%G+C הנמוכה בגנום של M. genitalium . באמצעות טמפרטורות הכלאה נמוכות יותר, כמו למשל הטמפרטורה המומלצת כיום של 62.5 מעלות צלזיוס, אנו יכולים לשפר את ההתאוששות של גנומים של M. genitalium מבלי לפגוע בהתאוששות של גנומים אחרים (איור 3). תוצאות אלו מוכיחות כי העשרת מטרה היא גישה יעילה להשגת מידע גנומי בעל ערך מדגימות קליניות וניתן להתאים אותה למגוון רחב של גנומים, גם על פני עיצוב מבוסס פאנל.

ניתוח פילוגנטי של הגנום המועשר בהצלחה של C. trachomatis הראה שרוב הדגימות מבואנוס איירס מתקבצות בתוך קבוצת הגנוטיפ OmpA-L2b, מה שמרמז על שושלת מוצלחת עם מחזור עולמי. הניתוח חשף גם נוכחות של שושלת חדשה ומובחנת בארגנטינה, הגורמת ל-LGV. הדגימות מקבוצה זו שונות בכ-600 SNPs משושלות LGV האחרות, ושושלת זו מוצעת כ-ompA-genotype L4 (איור 4). תיאור מפורט של הדגימות המשמשות באיור 1, איור 2 ואיור 4 מסופק בטבלה משלימה 1.

ממצאים אלה מדגישים את הערך של העשרת מטרה בחקר מגוון פתוגנים ומדגימים רמה גבוהה של הצלחה בריצוף גנום מדגימות קליניות.

figure-results-1
איור 1: העשרת גנומים באמצעות העשרת מטרה בהשוואה לריצוף מטגנומי ישיר. אחוז הקריאות על המטרה (%OTR), המוגדר כאחוז קריאות הרצף הממופות לגנום של אורגניזם המטרה, מראה את מידת ההעשרה שהושגה עם העשרת מטרה. הקו מייצג את החציון של כל נקודות הנתונים, והתיבה מציינת את הטווח הבין-רבעוני (IQR) של 50%. צבעי נקודות הנתונים תואמים למקור המדגם: כחול חיוור עבור ארגנטינה ואדום עבור שוויץ. הצלחה בריצוף הגנום, המוגדרת ככיסוי >95% ועומק קריאה ממוצע >10, מיוצגת על ידי נקודות גדולות, בעוד שכשל מסומן על ידי נקודות קטנות. שימו לב לסולמות השונים על ציר ה-y. קיצורים: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. נתון זה שונהמ-10. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מתאם של %OTR מהעשרת יעד עם ערכי qPCR Ct אבחנתיים. צבעי נקודת הנתונים מייצגים את מקור המדגם: כחול חיוור עבור ארגנטינה ואדום עבור שווייץ. הצלחת ריצוף הגנום, המוגדרת ככיסוי >95% ועומק קריאה ממוצע >10, מסומנת על ידי נקודות גדולות, בעוד שהכישלון מיוצג על ידי נקודות קטנות. שימו לב לסולמות השונים על ציר ה-y. קיצורים: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. נתון זה שונהמ-10. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השפעת טמפרטורת ההכלאה על התאוששות גנומים שלמים על פני כל הפתוגנים החיידקיים של STI בעשר דגימות. ה-DNA האנושי בטווח של זה בדגימות קליניות הועלה עם ריכוזים ידועים של DNA חיידקי מטרה בנפרד (יחיד) וגם לגמרי כדי לייצג דגימה עם זיהומים מרובים (מאוגד). בוצעו שני ניסויים, כל אחד עם חמשת הפתוגנים/שילובים: 0.01% ו-0.03% כדי לייצג את האחוז המשוער של DNA מכל מיקרואורגניזם ביחס ל-DNA הכולל בדגימה (ה-DNA הנותר תואם ל-DNA האנושי). ההתאוששות של M. genitalium משתפרת בטמפרטורות נמוכות יותר. C. trachomatis הדנ"א נבדק בריכוז נמוך; ניסויים נוספים מראים שהטמפרטורות לא השפיעו על התאוששות הגנום של C. trachomatis (נתונים לא מוצגים). קיצורים: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: פילוגנזה מותאמת רקומבינציה של זני LGV מארגנטינה. הניתוח כולל את כל הגנומים הזמינים של LGV עם נתונים שפורסמו. מטא-נתונים המוצגים מימין לפילוגנזה כוללים דגימות מטופלים כפולות, ניתוח בייסיאני של מבנה האוכלוסייה (BAPS; אשכול = קלייד, כאשר אשכול BAPS הפוליפילטי 6 מייצג את המגוון הגנטי של האוכלוסייה), שיטת ריצוף גנום (נתונים ממחקר זה), גנוטיפ ompA , מדינה ושנה, כפי שמצוין במפתח בפינה השמאלית העליונה. נתונים חסרים מוצגים בלבן. שמות הגנום ממחקר זה מודגשים בכחול בהיר עבור ארגנטינה וכחול כהה עבור פינלנד (לא מתקבלים על ידי העשרת מטרה). צבעים אלה משמשים אך ורק כדי להבחין בין הגנומים שנוצרו במחקר זה. ערכי Bootstrap מ-1000 אתחולים מהירים במיוחד מוצגים כאחוזים בענפים העיקריים. נתון זה שונהמ-13. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: תיאור החומרים, הריאגנטים, המכשירים והציוד ששימשו במחקר. הטבלה כוללת מידע מפורט על השם המסחרי, היצרן והמספר הקטלוגי של הרכיבים המשמשים למיצוי DNA, הכנת ספרייה, העשרת יעד וריצוף. הוא כולל גם פריטים המשמשים לבדיקות qPCR פנימיות והליכים כלליים של ביולוגיה מולקולרית. ניתן להשתמש בחלופות שוות ערך עבור פריטים המסומנים בכוכבית (*). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפקת נתוני גנום חיידקים מלאים מדגימות קליניות היא מאתגרת במיוחד. עם זאת, אנו זקוקים לנתונים אלה כדי לקבל מידע על שיבוטים במחזור ולחקור פרופילי עמידות אנטי-מיקרוביאלית, במיוחד בחיידקים קפדניים וקשים לתרבית. באמצעות שיטות חלופיות כגון ריצוף עמוק או ריצוף אדפטיבי עם Oxford Nanopore Technologies, לא ניתן להשיג נתונים מספיקים לניתוח רצף גנום שלם. במקרים כמו דגימות STI, העשרת מטרה היא הטכניקה האופטימלית לגישה לגנום המלא, וניתן להשתמש בשיטה זו על פני פאנל של פתוגנים חיידקיים למחלות מין. אמנם זה לא הליך זול, אבל לא ניתן להשיג את התוצאות שהוא יכול להציע בשום דרך אחרת10.

יש לבחור בקפידה דגימות מתאימות, באופן אידיאלי כדי לענות על שאלות רלוונטיות וחשובות באבחון ומחקר. המדיום המשמש לאיסוף אינו בהכרח ממלא תפקיד קריטי, עם רצפים מוצלחים המתקבלים הן ממדיה 2-SP והן ממדיה NAAT. אחסון דגימות חשוב, במטרה לשמור על שלמות ה-DNA. הגורם החשוב ביותר נמצא כעומס אבחנתי, המכוון לערכי Ct משוערים תחת Ct30. עבור דגימות עם ערכי Ct מעל 30, הסבירות להצלחת ריצוף גנום מלא נמוכה יותר, אך נתונים חלקיים עשויים לספק מידע רלוונטי במקרים מסוימים.

ההליך אינו טריוויאלי, וכולל שלבים רבים כולל מחזורי PCR, הכלאה ושטיפת חרוזים רבות. נדרשת תשומת לב קפדנית להליך לקבלת תוצאות מיטביות. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול - פיצול DNA, הכלאה עם בדיקות לכידה ולכידה מבוססת חרוזים מגנטיים עם שטיפה - דורשים ביצוע זהיר וטיפול נכון. חוקרים וטכנאים יכולים ללמוד את הפרוטוקול לאחר כמה ניסיונות. בסבבים הראשונים, בזמן הלמידה, פרוטוקול 3 הימים יכול להוות יתרון; עם משתמשים מנוסים יותר, פרוטוקול היומיים יכול להאיץ את התוצאות. מכיוון שהריאגנטים יקרים, כדאי להריץ ריצת מבחן ללא הרכיבים היקרים, למשל, הבדיקות. עבור ערכות פיתיון חלופיות, ניתן לכוונן את טמפרטורת ההכלאה, מה שעשוי לשפר את הרגישות או הספציפיות של ההעשרה. אם נוצרים מספיק נתונים, ונצפה חלק ניכר מכפילויות PCR, ניתן להתאים גם את מספר מחזורי ה-PCR לפני הלכידה ואחרי הלכידה.

ניתן להשתמש בנתונים המתקבלים מניסויים אלה להקלדה, עם חילוץ MLST ומטרות רלוונטיות אחרות. ניתן לנתח אותו בהקשר אפידמיולוגי, גלובלי או מקומי, בהשוואה לגנומים רלוונטיים לתובנות עכשוויות. רקומבינציה וניתוח אלמנטים ניידים על פני הגנום מסיקים גם שינויים לאורך זמן ותחת לחץ סלקטיבי, וזיהומים נלווים אפשריים. עם מספיק נתונים ומטא נתונים נלווים, ניתן לבצע חישובים זמניים, ולהסיק את האבות הקדמונים של מאפיינים ושושלות ספציפיות, כמו גם דרכי העברה ומנגנונים אפשריים. כל ההתקדמות הללו בידע שלנו על קבוצה חשובה של פתוגנים יכולה לתרום לאסטרטגיות בריאות הציבור. הפרוטוקול והתוצאות המייצגות שלנו מראות את השימוש בערכות בדיקות מטרה של פאנל סינדרומי, היעילות בדגימות STI חיידקיות וניתן להרחיב אותן לסוגי דגימות נוספות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מקרב לב לכל מי שתרם לפרויקט זה. מאוניברסיטת ציריך, אנו מודים לד"ר פאני וגנר, סריניטי פורושוטהמן, ד"ר פרנק אימקאמפ, ד"ר טים רולוף, ד"ר דומיניק בראון ופרופ' ד"ר אדריאן אגלי על מעורבותם בפיתוח ואופטימיזציה של הטכניקה. אנו מודים לדניאל גנדר, ולריה פירס, אריאניטה אסאני וסטפן אנטנר על הסיוע הטכני יוצא הדופן שלהם בריצוף. מאוניברסיטת בואנוס איירס, אנו מודים לד"ר אנדריאה קרולינה אנטרוקאסי, ד"ר מריה לוסיה גאלו וולט, ד"ר דייסי לופז אקינו, ד"ר לורה סבידלר לופז וד"ר לוסיאנה לה רוזה על תרומתם רבת הערך. לבסוף, אנו אסירי תודה לד"ר איברהים קיסקסן ולד"ר אנדראס שרייבר מ-Agilent על תמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק STIDirect מקרן גוטפריד וג'וליה בנגרטר-ריינר ועל ידי מענק STISeq STWF-24-009 מהקרן למחקר מדעי הרוח של אוניברסיטת ציריך. כספים בלתי מוגבלים נוספים ניתנו מאוניברסיטת ציריך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיפטה 8 ערוצים 0.5-10 ומיקרו; Lאפנדורף3125000010מחקר אפנדורף  פלוס, 8 ערוצים, 0.5-10 ומיקרו; L, אפור בינוני, נפח משתנה.
פיפטה 8 ערוצים 10-100 ומיקרו; Lאפנדורף3125000036מחקר אפנדורף  בנוסף, 8 ערוצים, 10-100 ומיקרו; L, צהוב, נפח משתנה.
מתאם Oligo Mix עבור ספריות עם תיוג MBCאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
מערכת מיצוי חומצות גרעין אוטומטית באמצעות ערכת מיצוי DNA ויראלי/פתוגןקיגן937036 (ערכה) / 9001297 (כלי נגינה)מכשיר QIAsymphony SP/AS המשמש עם ערכת וירוסים/פתוגנים QIAamp DSP לחילוץ DNA אוטומטי.
מאגר מחייבאג'ילנט טכנולוגיות5190-9687חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (לאחר PCR).
ערכת מיצוי DNA ומכשיר אוטומטיתאגיד המחקר זימוD3024/D3025ערכת Quick-DNA Miniprep המשמשת למיצוי DNA כולל מדגימות קליניות. תהליכי עבודה ידניים או אוטומטיים.
End Repair- תערובת אנזימי זנבאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
מאגר זנב לתיקון סוףאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
אתנולVWR כימיקלים BDH20816.298אתנול מוחלט ≥ 99.5% Ph. Eur., USP
פלואורומטר עם בדיקת dsDNA ברגישות גבוהה / שיטה מבוססת פלואורסצנטי לכימות DNAתרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)Q33238, Q33231פלואורומטר קיוביט 4 עם ערכת בדיקה 1X dsDNA רגישות גבוהה (HS).
מאגר פיצולאג'ילנט טכנולוגיות5191-4080חלק מערכת הפיצול האנזימי של SureSelect עם השם ''5X Fragmentation Buffer''.
אנזים פיצולאג'ילנט טכנולוגיות5191-4080חלק מערכת הפיצול האנזימי של SureSelect.
מאגר DNA פולימראז בנאמנות גבוההאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR) עם השם ''Herculase II Buffer''.
מאגר DNA פולימראז בנאמנות גבוהה עם dNTPs (5X)אג'ילנט טכנולוגיות5190-9687חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''Herculase II Buffer''.
אנזים היתוך בנאמנות גבוהה להגברת PCRאג'ילנט טכנולוגיות5191-5688חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''Herculase II''.
מאגר כביסה בטמפרטורה גבוההאג'ילנט טכנולוגיות5190-9687חלק מ-SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''Wash buffer 2''.
מאגר הכלאה אג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
פריימרים לרצף סדורים באינדקסאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מזוגות פריימר אינדקס SureSelect XT HS2 1-96 עבור ILM (Pre PCR).
בדיקת PCR בזמן אמת מולטיפלקס פנימיטיב מולביוללא ישיםבדיקה שפותחה ומוסמכת על ידי החברה המבוססת על ערכות Lightmix לגילוי STI
מאגר קשירהאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
חרוזים מגנטיים לניקויאג'ילנט טכנולוגיות5191-5740חרוזי SureSelect DNA AMPure XP.
מעמד מגנטיתוכנת מעבדה של פרמגןMSRLV080.2 מ"ל PCR 8 רצועות מפריד מגנטי 5 ומיקרו; L ~ 0.2 מ"ל נפח.
ריצוף מהדור הבא (NGS): מערכת ריצוף לקריאה קצרה בתפוקה גבוהה אילומינה בע"מלא ישיםריצוף מזווג של 150 bp (PE150) מבוצע על פלטפורמות Illumina NextSeq1000 ו-MiSeq.
מים ללא נוקלאזביוקונספט3-07F04-Hמים לביולוגיה מולקולרית, ללא DNA/DNAse/RNase, סטריליים, ללא מעכבי PCR.
תערובת חוסמי אוליגונוקלאוטיד אג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
רצועת צינור PCRavantor, נמסר על ידי VWR   732-3608רצועות צינור PCR עם מכסים שטוחים מחוברים.
תערובת פריימר לאחר הצילוםאג'ילנט טכנולוגיות5190-9687חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (לאחר PCR).
בדיקת RNAאג'ילנט טכנולוגיות5191-6916 בדיקה SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb, למשל מזהה עיצוב S3465164).
חוסם RNaseאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
מאגר כביסה בטמפרטורת החדראג'ילנט טכנולוגיות5190-9687ערכת העשרת יעד SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''מאגר כביסה 1''.
חרוזי סטרפטווידיןאג'ילנט טכנולוגיות5191-5742SureSelect חרוזי סטרפטווידין.
T4 DNA ליגאזאג'ילנט טכנולוגיות5500-0147חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).
שיטת העשרת מטרה / שיטת לכידת DNAאג'ילנט טכנולוגיותG9983-90000ערכת DNA SureSelect XT HS2 עם הכנת ספרייה, העשרת יעדים מהירה-Hyb וזרימת עבודה של איגום לאחר לכידה. גרסת פרוטוקול F0, מאי 2023. עבור פלטפורמת Illumina NGS
ערכת בדיקת העשרת מטרה עבור C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum, ו-M. genitaliumטכנולוגיות אג'ילנט / המעבדה למיקרוביולוגיה מעשירה (IMM, UZH)מזהה עיצוב S3465164סט בדיקה מעוצב בהתאמה אישית (~242,000 בדיקות) ללכידת מולטיפלקס של ארבעה פתוגנים של STI. תכנון המבוסס על גנום ייחוס מרובה.
מחזור תרמיתרמופישר.4375305Veriti 96-Well Thermal Cycler.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology. J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).
  2. Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. Next generation sequencing of infectious pathogens. JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).
  3. Hasman, H., et al. Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples. J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).
  4. Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens. J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).
  5. Baert, L., et al. Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective. Food Control. 130, 108148(2021).
  6. Didelot, X., et al. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).
  7. Scidmore, M. A. Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).
  8. Edmondson, D. G., Norris, S. J. In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum. Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).
  9. Pitt, R., et al. Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium. J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).
  10. Büttner, K. A., et al. Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs. Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).
  11. Seth-Smith, H. M. B., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).
  12. SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf (2023).
  13. Büttner, K. A., et al. Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina. Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).
  14. Brown, J. R., et al. Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method. J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).
  15. Dao, T. D., et al. Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus. Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).
  16. Cai, W., et al. SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus. Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).
  17. Büttner, K. A., et al. ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes. Microorganisms. 12 (3), 587(2024).
  18. La Rosa, L., et al. Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina. Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).
  19. Rodríguez Fermepin, M., et al. More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum. Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole Genome SequencingBacterial Pathogen GenomesHybridization WorkflowAntimicrobial ResistanceChlamydia TrachomatisNeisseria GonorrhoeaeDNA PurificationPCR Amplification

מאמרים קשורים