הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בחינת מאפיינים אנטומיים של תאי גנגליון ברשתית תחת אקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי N-methyl-D-aspartic acid (NMDA)

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68537

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים את השימוש בשיטת תיוג פוספטאז אלקליין (AP) בהכוונה גנטית כדי לחקור את התכונות האנטומיות והפנוטיפים של רשתית עכברים תחת אקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי NMDA. בשילוב עם מספר קווי דיווח ספציפיים לתאי גנגליון רשתית (RGC), אנו חושפים פנוטיפים חדשים ב-RGCs גוססים לאורך התהליך הניווני.

תקציר

תאי גנגליון רשתית (RGCs) הם נוירוני הפלט של הרשתית, האחראים על העברת מידע חזותי למוח. ברשתית העכבר הבוגרת זוהו למעלה מ-40 סוגי RGC על סמך מאפיינים גנומיים, מורפולוגיים ותפקודיים. ניוון RGC הוא סימן היכר של מחלות רשתית מתישות שונות, כולל גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית. השגת תובנה מעמיקה יותר לגבי המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס ניוון, הישרדות ועמידות של RGC במצבי מחלה שונים היא חיונית לפיתוח התערבויות טיפוליות יעילות. כדי לחקור ניוון RGC, אימצנו טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה ששימשה בעבר באופן נרחב במחקרי התפתחות רשתית עבור מורפולוגיות RGC והקרנה מרכזית. כאן, אנו מיישמים שיטה זו כדי להעריך את הפנוטיפים האנטומיים של RGCs תחת אקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי NMDA. גישה זו מאפשרת הדמיה של מספר רב של RGCs מנוונים לאורך זמן, ומאפשרת לנו למפות את רצף האירועים הניווניים, לזהות פנוטיפים מובהקים של RGCs גוססים ולהבחין ב-RGCs העמידים בפני נזק הנגרם על ידי NMDA.

מבוא

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא פגיעה פתאומית שגורמת לנזק עצבי למוח. בצורות חמורות של TBI, כמו למשל אלה שנגרמות על ידי תאונות דרכים או התנגשויות ספורט ופציעות פיצוץ כתוצאה מפיצוצים, כוחות מכניים עלולים לשבש את ארכיטקטורת התא, מה שמוביל לדלקת, עקה חמצונית, אקסיטוטוקסיות, ובסופו של דבר מוות עצבי 1,2.

הרשתית, החלק הנגיש ביותר של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שימשה כמערכת TBI מודל לחקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס אקסיטוטוקסיות ולפיתוח אסטרטגיות להתערבות טיפולית 3,4,5. מודלי הרשתית הרלוונטיים ביותר למחקרי TBI הם מודל ריסוק עצב הראייה ואקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) של רשתית. במודל הרשתית המושרה על ידי NMDA, תאי גנגליון רשתית (RGCs) זוהו כסוג הרגיש ביותר של נוירונים ברשתית מכיוון ש-RGCs משתמשים בגלוטמט כמוליך עצבי מעורר עיקרי וסוגים שונים של קולטני גלוטמט, כולל קולטני AMPA (AMPARs), קולטני KAPA (KAPARs) וקולטני NMDA, כדי להפעיל פוטנציאל אקסון6. בנוסף ל-RGCs, תאי רשתית ומעגלים עצביים אחרים עלולים להיות מושפעים גם מטיפול ב-NMDA 7,8,9. מריחה תוך-זגוגית של NMDA מעוררת פתיחה ממושכת של קולטן ה-NMDA, מה שמוביל לזרם עודף של סידן לתאים, מה שגורם לפעילות עצבית מעוררת יתר ולהומאוסטזיס סידן לא מאוזן 10,11,12,13.

קולטן NMDA הוא קומפלקס הטרומרי המורכב משלוש תת-יחידות: GluN1, GluN2 ו-GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, המקודד על ידי Grin1, מכיל שמונה איזופורמים בעכברים עקב שחבור חלופי של Grin1. ישנן ארבע תת-יחידות שונות של GluN2 (a-d), המקודדות על ידי ארבעה גנים נפרדים: Grin2a-2d. ישנן שתי יחידות משנה שונות של GluN3 (a ו-b), המקודדות על ידי Grin3a ו-3b. על פי נתוני scRNA-seq 19,20, Grin1 מתבטא מאוד ברוב תת-הסוגים של RGC (איור 1A) כמו גם בכמה תת-סוגים של תאי אמקרין (AC) עם רמות ביטוי חלשות עד בינוניות (איור 1B). Grin2a מועשר בפחות תת-סוגים של RGC ו-AC, בעוד ש-Grin2b מתבטא בצורה מתונה ברוב תת-הסוגים של RGC ו-AC רבים (איור 1A,B). רמות הביטוי של Grin2c, Grin2d ו-Grin3b ב-RGCs ו-ACs נמוכות ביותר (איור 1A,B). ניתן לראות ביטוי Grin3a בכמה תת-סוגים של RGC ובאופן חלש בכמה ACs (איור 1A,B). בנוסף לתפקידם של קולטני NMDA, אקסיטוטוקסיות המופעלת על ידי זרם סידן באמצעות AMPARs חדירים לסידן תוארה במודלים מרובים של מחלות21. הביטוי של תת-יחידות קולטן NMDA עשוי לספק רמזים מדוע אקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי NMDA מכוונת בעיקר ל-RGCs כמו גם ל-ACs 9,10,14,22,23.

שיטות קונבנציונליות להערכת פנוטיפים ברשתית המושרים על ידי NMDA כוללות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) לאיתור חריגות היסטולוגיות, בדיקת TUNEL למוות תאי וצביעה אימונופלואורסצנטית (IF) באמצעות סמן ביולוגי ספציפי לסוג התא 8,10,24,25,26 . ברמה התאית, נעשה שימוש בטכניקות הדמיה קונפוקלית ומילוי צבע כדי לחקור את רצף האירועים ב-RGCs גוססים במודל הרשתית המושרה על ידי NMDA. שיטות אלה סיפקו תובנות חשובות לגבי התאים התת-תאיים של ה-RGCs הגוססים ואפשרו לזהות את סוגי ה-RGCs העמידים ששורדים תחת עלבון NMDA27,28.

כאן, אנו משתמשים בצביעה של פוספטאז אלקליין (AP) המופעל גנטית כדי לחקור את המאפיינים האנטומיים והפנוטיפים של נוירונים ברשתית העכבר תחת אקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי NMDA 29,30,31. הרציונל לבחירת שיטה זו נובע מפשטותה, עלות-תועלת ויכולתה לקבל סקירה מקיפה של המאפיינים האנטומיים של תת-סוגים עצביים על פני כל הרשתית, מה שהופך אותה למתאימה היטב להערכות גסות ולניתוחים השוואתיים בקנה מידה גדול. גישה זו מספקת תובנות חדשות לגבי האופן שבו נוירונים ברשתית מגיבים ל-NMDA הן ברמה הגולמית והן ברמה התת-תאית. אנו צופים כי אסטרטגיה זו תהיה ישימה באופן נרחב להערכת שינויים מורפולוגיים במודלים שונים של מחלות המשפיעים על הארכיטקטורה העצבית והארגון הסינפטי 4,26,32,33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים בבעלי חיים פעלו בהתאם למדיניות שירותי בריאות הציבור בארה"ב בנושא טיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס מקגוורן ביוסטון. קומפוזיציות הפתרונות מפורטות בטבלת החומרים.

1. הזרקת טמוקסיפן

  1. מערבבים 30 מ"ג טמוקסיפן עם 30 מיקרוליטר אתנול. במים רותחים מחממים 1 מ"ל שמן זרעי חמניות ותערובת טמוקסיפן/אתנול.
  2. לאחר שהטמוקסיפן התמוסס באתנול, הוסף במהירות 1 מ"ל שמן זרעי חמניות מחומם לתמיסת הטמוקסיפן. מערבבים היטב על ידי פיפטינג.
  3. נעשה שימוש בעכברים משני המינים בגילאים שונים בין 2 ל-6 חודשים. יש להזריק את תמיסת הטמוקסיפן במינון של 100 מיקרוגרם/גרם משקל גוף תוך צפקי באמצעות מזרק אינסולין. קבע את מספר זריקות הטמוקסיפן על סמך קו העכבר. בפרוטוקול זה, טמוקסיפן ניתן פעם ביום במשך ארבעה ימים רצופים.
    הערה: מכיוון שתמיסת הטמוקסיפן מעורבבת עם שמן צפוף, קשה לטפל בה עם מזרק בעל מחט ניתנת להסרה. לפיכך, מזרק אינסולין עם מחט מחוברת עדיף להזרקת טמוקסיפן.
  4. שכן את העכבר בקבוצות של לא יותר מ -5 בכלובים מאווררים בנפרד. עד לזריקת ה-NMDA.

2. הזרקת תמיסת NMDA לעיני העכבר

  1. הכן 20 מ"מ של תמיסת NMDA ב-PBS סטרילי 1x. שטפו את מזרק הננו עם מחט 35G המחוברת באמצעות 100% אתנול פי 20, ולאחר מכן שטפו במים סטריליים אולטרה-טהורים פי 20 נוספים. מלאו את מזרק הננו ב-1 מיקרוליטר של תמיסת NMDA.
  2. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין/קסילזין בתערובת תמיסת 1X PBS (80/10 מ"ג לק"ג משקל גוף). העריכו את חוסר ההכרה על ידי תגובת נסיגה רפלקסית לצביטה בזנב ובבוהן.
  3. הנח את העכבר המורדם על סטריאומיקרוסקופ. מקם את העכבר כשעין ימין פונה כלפי מעלה והאף מצביע לצד ימין. יש למרוח טיפה של תמיסת פרופרקאין הידרוכלוריד 0.5% על גלגל העין הימני להרדמה מקומית.
  4. השתמש במחט הזרקה סטרילית של 30G כדי לנקב את הלימבוס במצב השעה 7, וליצור חור קטן. עקוב אחר מיקום המחט וכיוונה תחת הסטריאומיקרוסקופ. ודא שגודל מחט ההזרקה מעט גדול יותר ממחט הזרקת הננו כדי לאפשר החדרה קלה.
  5. הסר בזהירות את מחט ההזרקה מגלגל העין והשליך אותה כראוי. השתמש בסטריאומיקרוסקופ להנחיה, הכנס את מחט הזרקת הננו לתוך הזגוגית דרך הלימבוס בזווית של 45 מעלות.
  6. הזרקו לאט 1 מיקרוליטר של תמיסת NMDA לתוך הזגוגית. לאחר ההזרקה, שמור את מחט הזרקת הננו בזגוגית למשך כ-10 שניות כדי למנוע את יציאת התמיסה המוזרקת.
  7. משוך בזהירות ובאטיות את מחט הזרקת הננו מהעין. מרחו משחת עיניים 0.5% אריתרומיצין על קרנית העין המוזרקת.
  8. הנח את העכבר בכלוב על כרית חימום. עקוב אחר העכבר כל 15 דקות עד שהוא מתאושש לחלוטין מההרדמה. שכן את העכבר למשך שבוע עד שבועיים עד לאיסוף הרקמות.

3. איסוף רקמות וצביעה של פוספטאז אלקליין (AP)

  1. המתת חסד של העכבר עם חנק CO2, ואחריו פריקת צוואר הרחם. חותכים בזהירות את השרירים המתחברים לגלגל העין ולעצב הראייה בעזרת מספריים של ואנה.
  2. לאחר מכן גלגל העין נאסף בעזרת מלקחיים והועבר לצינורות נפרדים של 2.0 מ"ל.
  3. יש לקבע את גלגלי העיניים בפורמלין ניטרלי 10% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הרכיב שטוח את הרשתית על מסנן קרום חנקת תאית כמתואר להלן.
    1. מעבירים את גלגלי העיניים לצלחות פטרי בגודל 10 ס"מ המכילות 1x PBS. החזק כל רקמת שריר המחוברת לגלגל העין באמצעות מלקחיים. צור חור בלימבוס באמצעות מחט הזרקה 30G. הכנס את קצה המספריים של ואנה לתוך החור וחתוך סביב האורה. הסר את העדשה מכוס העין באמצעות מלקחיים.
    2. בצע 3-4 חתכים בכוס העין והשתמש במלקחיים כדי להחזיק את ה-RPE ולהסיר בעדינות את ה-RPE מהרשתית.
    3. חותכים חתיכה קטנה של פילטר קרום חנקת תאית ומשרים אותה ב-1x PBS. הנח את הרשתית המבודדת על המסנן. דחף בעדינות אזור היקפי של הרשתית עם קצה מברשת עדינה כדי לחבר את קצה הרשתית למסנן.
    4. החזק את קצה המסנן ומשוך אותו לאט החוצה מה-1x PBS, וודא שהרשתית נשארת מחוברת ומשתטחת על המסנן. הנח את הרשתית/המסנן על מגבת נייר למשך דקה אחת כדי לעזור להדק את הרשתית המחוברת למסנן.
    5. מעבירים את הרשתית/פילטר בחזרה לצלחת פטרי עם 1x PBS. הסר בזהירות כל פסולת, שיער וזגוגית מהרשתית באמצעות מלקחיים ו/או מברשת עדינה, ככל האפשר. כדי להבחין בין הרשתית המוזרקת והלא מוזרקת, חתוך מסננים בצורות שונות.
  4. מעבירים את הרשתית/פילטר בחזרה לצלחת פטרי. מקבעים את הרשתית בפורמלין ניטרלי של 10% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
  5. הכינו אמבט מים של 65 מעלות צלזיוס. מחממים מראש 30 מ"ל של 1x PBS בכוס זכוכית של 50 מ"ל. העבירו את הרשתית/מסננים ישירות לתוך ה-PBS שחומם מראש. יש לדגור על רשתית בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: הטיפול בחום משבית את פעילות ה-AP האנדוגנית, הגורמת להכתמת רקע ברשתית. חיוני לטפל ברשתית בתמיסה המחוממת כדי לחסל ביעילות את הרקע הזה.
  6. לאחר טיפול בחום, העבירו את הרשתית לצלחת פטרי 30 מ"מ המכילה מאגר AP (100 מ"מ טריס, pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, 50 מ"מ MgCl2).
  7. דגרו את הרשתית במאגר AP בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
    הערה: שלב זה מחליף את המאגר ברשתית מ-1x PBS למאגר AP, ומונע משקעים כימיים במהלך התפתחות הצבע.
  8. החלף את מאגר ה-AP בתמיסת מכתים (30 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל BCIP ו-60 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל NBP ב-10 מ"ל של מאגר AP).
  9. מניחים את צלחת הפטרי בקופסה ללא אור. פתח את תגובת ה-AP בטמפרטורת החדר למשך יום עד יומיים עם תסיסה עדינה עד שעוצמת צביעת ה-AP מספקת להדמיה.
  10. עצור את התגובה על ידי שטיפת הרשתית עם 1x PBS למשך 5 דקות, 2x, בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
  11. יש לתקן את הרשתית עם פורמלין ניטרלי של 10% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבול עדין.
  12. שטפו את הרשתית עם 1x PBS למשך 5 דקות, 3x, בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. ייבשו את הרשתית על ידי דגירה ב-30% אתנול, ולאחר מכן 50% אתנול למשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
  13. השתמש במכחול עדין כדי להסיר בעדינות את הרשתית מנייר המסנן. ייבשו את הרשתית נטולת המסנן ב-70% אתנול למשך 30 דקות, ולאחר מכן שתי דגירות של 30 דקות ב-100% אתנול בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
  14. נקו את הרשתית בצלחת פטרי מזכוכית עם תמיסת ניקוי בנזיל בנזט/בנזיל אלכוהול (2:1, v/v) למשך 30 דקות עד שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
    הערה: אין לבצע הליך פינוי זה בן לילה, מכיוון שדגירה ממושכת עלולה לגרום לעתים קרובות לאובדן כתמי AP. תמיסת פינוי יכולה להמיס פלסטיק, ולכן יש לבצע את ההליך במיכל זכוכית.
  15. כדי להרכיב את הרשתית על מגלשת זכוכית, החל סרט דו צדדי על המגלשה כדי ליצור פלטפורמה לכיסוי ולרשתית. הנח את הרשתית על המגלשה, מלא את החלל בתמיסת ניקוי, החל את הכיסוי ואטום את השקופית עם לק כדי לאבטח את הרשתית והכיסוי.
  16. דמיינו את הרשתית המוכתמת ב-AP באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Apotome.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יישום NMDA בזגוגית גורם למוות RGC, אשר זוהה באופן קונבנציונלי באמצעות צביעה היסטולוגית או צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) עם סמני RGC. במסגרת הניסוי שלנו, על ידי שימוש באסטרטגיית ה-IF הקונבנציונלית עם סמן פאן-RGC RBPMS, אישרנו שמספר ה-RGCs ירד בכ-65%, שבוע לאחר הזרקת NMDA (איור 2E-G). מחקרים קודמים גילו ש-RGCs המבטאים Tbr2 הם אכן ipRGCs34,35. שימוש בצביעת AP על Tbr2CreER2; רוזהiAP רשתית, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, השתמשנו במערכת תיוג AP דלילה בהכוונה גנטית בשילוב עם מספר קווי עכברים שעברו מניפולציה גנטית כדי לבחון אירועים ניווניים הנגרמים על ידי NMDA בתת-סוגים שונים של RGC ו-AC וחשפנו מספר פנוטיפים סימני היכר 29,31,39. הפנוטיפ הבולט ביותר הוא ההפחתה המשמעותית של RGCs ו-ACs ברשתית המוזרקת על ידי NMDA (איור 2A-D), בהתאמה לתצפיות במחקרים קודמים תוך שימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות - מכון העיניים הלאומי ל-C.A.M. (EY024376) ובחלקה על ידי מענקי הראייה של המכון הלאומי לעיניים P30EY028102 (UTHealth). אנו מכירים גם בתמיכה הכספית של קרן סטיבן לאשר (UTHealth) וקרן ריי ווייט (UTHealth).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משחת עיניים 0.5% אריתרומיצין באוש+לומב24208-910-55
0.5% פרופרקאין הידרוכלוריד באוש+לומב24208-730-06
10% פורמלין ניטרלי חומצי VWR89370-094
10 ס"מ פטרידישקורנינג430167
10x PBSפישר סיינטיפיקBP399יש לדלל במים ליצירת PBS וחיטוי 1x. 
שפופרת 2.0 מ"לVWR525-1136
מחט הזרקה 30 מדאקסלינט אינטרנשיונל26437
30 מ"מ פטרידישבז35208
בנזיל אלכוהול אקרוס אורגניקס447000010
בנזיל בנזאטאקרוס אורגניקס105860010
מסנן קרום חנקת תאיתציטיבה7188-002
תעודת כיסוימדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72204-01
סרט דו צדדיוויסקי597020
אתנולמעבדות דקון2716הימנע מביוריאגנטים של פישר (Cat#: BP2818) להסרת הידור לאחר צביעת AP. מגיב זה מעוות את הרשתית.
מלקחייםטד פלה505
כרית חימוםת'רתרם710298-001
מזרק אינסוליןב.ד.329424
קטמיןדצ'רה17033010110
מיקרוסקופצייסAxio Imager 2
לקמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72180
מזרק ננופילמכשירי דיוק עולמייםננופיל
מחט ננופילמכשירי דיוק עולמייםNF25BL
ערכת ריאגנטים NBT/BICPInvitrogenN6547
תמ"אסיגמא-אולדריץ'M3262
מברשת צבעקינגארט6650
זכוכית שקופיתפישר סיינטיפיק12-550-15
מיקרוסקופ סטריאומוטיקDM143
שמן זרעי חמניותסיגמא-אולדריץ'S5007
טמוקסיפןסיגמא-אולדריץ'T5648אחסן תמיסת טמוקסיפן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בקופסה אטומה לאור. יש להשתמש בתמיסת טמוקסיפן תוך שבוע.
מספריים כלים מדעיים עדינים15000-00
מרחצאות מיםקו מעבדה18052
קסילזיןדצ'רה17033-0099-05שם המוצר: Rompun

מקורות

  1. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).
  2. Zetterberg, H., Blennow, K. Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions. Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).
  3. Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (5), 3440-3450 (2013).
  4. Lund, B. J., Rule, G. T. Pressure wave dosimetry for "Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury". Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1348-1349 (2014).
  5. Peterson, S. L., et al. Retinal Ganglion Cell Axon Regeneration Requires Complement and Myeloid Cell Activity within the Optic Nerve. J Neurosci. 41 (41), 8508-8531 (2021).
  6. Boccuni, I., Fairless, R. Retinal Glutamate Neurotransmission: From Physiology to Pathophysiological Mechanisms of Retinal Ganglion Cell Degeneration. Life. 12 (5), 638(2022).
  7. Shen, Y., Luo, X., Liu, S., Nawy, S. Rod bipolar cells dysfunction occurs before ganglion cells loss in excitotoxin-damaged mouse retina. Cell Death Dis. 10 (12), 905(2019).
  8. Lambuk, L., et al. Dose-dependent effects of NMDA on retinal and optic nerve morphology in rats. Int J Ophthalmol. 12 (5), 746-753 (2019).
  9. Asami, Y., et al. Age-dependent changes in the severity of capillary degeneration in rat retina following N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity. Curr Eye Res. 40 (5), 549-553 (2015).
  10. Siliprandi, R., et al. N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity in the adult rat retina. Vis Neurosci. 8 (6), 567-573 (1992).
  11. Chidlow, G., Osborne, N. N. Rat retinal ganglion cell loss caused by kainate, NMDA and ischemia correlates with a reduction in mRNA and protein of Thy-1 and neurofilament light. Brain Res. 963 (1-2), 298-306 (2003).
  12. Shi, J. M., Jiang, Y. Q., Liu, X. Y. Morphological changes of retina after N-methyl-D-aspartate induced damage in rats. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 29 (3), 287-291 (2004).
  13. Nakazawa, T. Mechanism of N-methyl-D-aspartate-induced retinal ganglion cell death. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 113 (11), 1060-1070 (2009).
  14. Shen, Y., Liu, X. L., Yang, X. L. N-methyl-D-aspartate receptors in the retina. Mol Neurobiol. 34 (3), 163-179 (2006).
  15. Bai, N., et al. NMDA receptor subunits have different roles in NMDA-induced neurotoxicity in the retina. Mol Brain. 6, 34(2013).
  16. Cull-Candy, S., Brickley, S., Farrant, M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr Opin Neurobiol. 11 (3), 327-335 (2001).
  17. Wang, J. X., Furukawa, H. Dissecting diverse functions of NMDA receptors by structural biology. Curr Opin Struct Biol. 54, 34-42 (2019).
  18. Chou, T. H., Kang, H., Simorowski, N., Traynelis, S. F., Furukawa, H. Structural insights into assembly and function of GluN1-2C, GluN1-2A-2C, and GluN1-2D NMDARs. Mol Cell. 82 (23), 4548-4563.e4 (2022).
  19. Tran, N. M., et al. Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  20. Yan, W., et al. Mouse Retinal Cell Atlas: Molecular Identification of over Sixty Amacrine Cell Types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  21. Guo, C., Ma, Y. Y. Calcium Permeable-AMPA Receptors and Excitotoxicity in Neurological Disorders. Front Neural Circuits. 15, 711564(2021).
  22. Lucas, D. R., Newhouse, J. P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina. AMA Arch Ophthalmol. 58 (2), 193-201 (1957).
  23. Karl, M. O., et al. Stimulation of neural regeneration in the mouse retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19508-19513 (2008).
  24. DeParis, S., Caprara, C., Grimm, C. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are resistant to N-methyl-D-aspartic acid excitotoxicity. Mol Vis. 18, 2814-2827 (2012).
  25. Fogo, G. M., Shuboni-Mulligan, D. D., Gall, A. J. Melanopsin-Containing ipRGCs Are Resistant to Excitotoxic Injury and Maintain Functional Non-Image Forming Behaviors After Insult in a Diurnal Rodent Model. Neuroscience. 412, 105-115 (2019).
  26. Cui, Q., Ren, C., Sollars, P. J., Pickard, G. E., So, K. F. The injury resistant ability of melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. Neuroscience. 284, 845-853 (2015).
  27. Christensen, I., et al. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Glutamatergic Excitotoxicity Is Type-Specific. Front Neurosci. 13, 219(2019).
  28. Yang, N., Young, B. K., Wang, P., Tian, N. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Optic Nerve Injury is Type Specific. Cells. 9 (3), 677(2020).
  29. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480 (4), 331-351 (2004).
  30. Badea, T. C., Nathans, J. Morphologies of mouse retinal ganglion cells expressing transcription factors Brn3a, Brn3b, and Brn3c: analysis of wild type and mutant cells using genetically-directed sparse labeling. Vision Res. 51 (2), 269-279 (2011).
  31. Jamal, L., Kiyama, T., Mao, C. A. Genetically Directed Sparse Labeling System for Anatomical Studies of Retinal Ganglion Cells. Methods Mol Biol. 2092, 187-194 (2020).
  32. Hinds, J. W., Hinds, P. L. Early ganglion cell differentiation in the mouse retina: an electron microscopic analysis utilizing serial sections. Dev Biol. 37 (2), 381-416 (1974).
  33. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  34. Mao, C. A., et al. T-box transcription regulator Tbr2 is essential for the formation and maintenance of Opn4/melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 34 (39), 13083-13095 (2014).
  35. Chen, C. K., et al. Characterization of Tbr2-expressing retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 529 (15), 3513-3532 (2021).
  36. Zhang, X. M., et al. Highly restricted expression of Cre recombinase in cerebellar Purkinje cells. Genesis. 40 (1), 45-51 (2004).
  37. Kiyama, T., et al. Essential Roles of Tbr1 in the Formation and Maintenance of the Orientation-Selective J-RGCs and a Group of OFF-Sustained RGCs in Mouse. Cell Rep. 27 (3), 900-915.e5 (2019).
  38. Kiyama, T., Chen, C. K., Zhang, A., Mao, C. A. Differential Susceptibility of Retinal Neurons to the Loss of Mitochondrial Biogenesis Factor Nrf1. Cells. 11 (14), 2203(2022).
  39. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23 (6), 2314-2322 (2003).
  40. Mao, C. A., et al. Eomesodermin, a target gene of Pou4f2, is required for retinal ganglion cell and optic nerve development in the mouse. Development. 135 (2), 271-280 (2008).
  41. Shi, M., et al. Genetic interactions between Brn3 transcription factors in retinal ganglion cell type specification. PLoS One. 8 (10), e76347(2013).
  42. Muzyka, V. V., Brooks, M., Badea, T. C. Postnatal developmental dynamics of cell type specification genes in Brn3a/Pou4f1 Retinal Ganglion Cells. Neural Dev. 13 (1), 15(2018).
  43. Liu, S., Aldinger, K. A., Cheng, C. V., Kiyama, T., Dave, M., McNamara, H. K., Zhao, W., Stafford, J. M., Descostes, N., Lee, P., et al. NRF1 association with AUTS2-Polycomb mediates specific gene activation in the brain. Mol Cell. 81 (22), 4663-4676.e8 (2021).
  44. Kiyama, T., Altay, H. Y., Badea, T. C., Mao, C. A. Pou4f1-Tbr1 transcriptional cascade controls the formation of Jam2-expressing retinal ganglion cells. Front Ophthalmol. 3, 1175568(2023).
  45. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

רעילות עשית של NMDAדגנרציה של תאי RGCרשתית עכברמורפולוגיה של תאיםהישרדות תאיםעמידות תאיםמחלות רשתיתפנוטיפים אנטומייםסימון תאים
בחינת מאפיינים אנטומיים של תאי גנגליון ברשתית תחת אקסיטוטוקסיות הנגרמת על ידי N-methyl-D-aspartic acid (NMDA)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.