מאמר שיטה

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

DOI:

10.3791/68568

⸱

6 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ובמיוחד טכניקות EM תלת מימדיות (3D) הפכו לשיטות מבוססות בווירולוגיה מבנית. חקירת שינוי המושרה על ידי וירוס של האולטרה-מבנה התאי, כגון מפעלי שכפול המושרה על ידי נגיף הזיקה (ZIKV) או אברוני שכפול נגיף הקורונה, דורשת הדמיה תלת מימדית. טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) היא שיטה בשימוש נרחב, למרות מגבלתה לדגימות בעובי של עד 200 ננומטר. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (SEM)-טומוגרפיה יכולה לייצר נתונים תלת מימדיים בנפחים גדולים יותר עם רזולוציה איזוטרופית, אם כי בדרך כלל נמוכה יותר. טכניקות חלופיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת פנים בלוק (BF-SEM), טומוגרפיה של מערך SEM או הדמיית TEM של חתכים טוריים משמשות להדמיה של נפחים גדולים יותר. עם זאת, בהשוואה לטכניקות שהוזכרו קודם לכן, טכניקות אלו באות במחיר של רזולוציה נמוכה בהרבה לאורך ציר ה-Z של הדגימה. טכניקה המספקת מידע תלת מימדי של דגימות בעובי של עד 1 מיקרומטר ברזולוציה איזוטרופית של כמה ננומטרים היא טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (STEM).

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת דגימות וירולוגיה קפואות בלחץ גבוה, מוחלפות בהקפאה ומשובצות שרף וניתוחם באמצעות טומוגרפיה STEM. פרוטוקול זה נהנה מהיתרונות של הדמיה בטמפרטורת החדר תוך שמירה על המבנה הביולוגי במצב כמעט מולד. אנו מראים שתי דוגמאות מייצגות לשאלות שניתן לענות עליהן באמצעות טומוגרפיה של STEM. ראשית, אנו מיישמים את הפרוטוקול לחקר מורפוגנזה של ויריון של נגיף סטומטיטיס שלפוחית רקומביננטי (VSV). הטומוגרפיה של STEM מציעה מידע על ניצני VSV רקומביננטיים שאחרת אינם נגישים על ידי הדמיה דו-ממדית. שנית, אנו מראים מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם (CLEM) באמצעות הדמיית העברת אנרגיית תהודה של Foerster (FRET) וטומוגרפיה של STEM (FRET-3D-CLEM) של ננו-סיבים פפטידים EF-C. שילוב זה שפורסם לאחרונה נותן תובנות חדשות לגבי הספיגה והפירוק של ננו-סיבים פפטידים מגבירי זיהום, במיוחד תוך ניצול הנפח הגדול הנגיש על ידי טומוגרפיה של STEM.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
איור 1: השוואה בין טכניקות מיקרוסקופיה תלת-ממדיות שונות, תוך התחשבות ברזולוציה, מכשור, זמן רכישה ומאמץ. הנפח המקסימלי האפשרי של הטכניקות הוא בין טומוגרפיה קריו-TEM התובענית מבחינה טכנית המציעה רזולוציה מולקולרית, לבין מיקרוסקופ אור, שבו הרזולוציה מוגבלת על ידי גבול העקיפה של האור. קיצורים: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה; STEM = סריקת TEM; SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; FIB = קרן יונים ממוקדת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מבנים ומערכות הקשורים לנגיף משתרעים על פני קנה מידה ממשטר תת-אנגסטרום (למשל, מולקולות קטנות לווירותרפיה, חלבונים נגיפיים מבודדים) ועד למספר מטרים (למשל, אורגניזמים נגועים שלמים). חלקיקים נגיפיים נמצאים בטווח של 20-1,000 ננומטר ונחקרים בעיקר בהקשר הביולוגי שלהם, כגון תאים מארחים וקווי תאים של יצרנים ויראליים, הנמצאים בטווח המיקרומטר. הדמיה של מבנים ספציפיים הקשורים לנגיף תלויה אפוא בבחירת טכניקה המספקת שדה ראייה מספיק ורזולוציה מתאימה. המחקר של תאים וחלקי רקמה שמזוהמים בווירוס מסתמך על שיטות מיקרוסקופיה (איור 1). בעוד שניתן לרכוש תמונות סקירה של תאים ורקמות באמצעות מיקרוסקופ אור קלאסי, מבנים תוך-תאיים המעורבים בשכפול הנגיף נחקרים לעתים קרובות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרות שכיום משתמשים בו בעיקר במחקר וירולוגי בסיסי, EM משמש גם באבחון 1,2 ומצא את דרכו גם ליישומים ביו-פרמצבטיים3.

לעתים קרובות, גישות EM דו-ממדיות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים שידור קלאסי (TEM) אינן יכולות לענות מספיק על שאלה ביולוגית נתונה. בווירולוגיה, זה נכון במיוחד כאשר חוקרים אינטראקציות של וירוס-מארח-תא כגון התקשרות וכניסה של ויריון, היווצרות מפעלים ויראליים או מורפוגנזה של ויריון 4,5,6,7,8,9. לכן, טומוגרפיה EM משמשת לניתוח האולטרה-מבנה התלת-ממדי של דגימות ביולוגיות. באופן עקרוני, ישנן שתי דרכים לרכוש טומוגרפיה של דגימה מסוימת: 1) הדמיה צעדית של פרוסות סדרתיות המשולבות מאוחר יותר לערימת תמונות תלת מימדית, או 2) רכישת הקרנות מזוויות צפייה שונות של הדגימה ואחריה שחזור חישובי של המידע לערימת תמונות וירטואלית.

הטכניקות מהסוג הראשון כוללות הדמיה של חתכים סדרתיים על ידי TEM או SEM (טומוגרפיה של מערך SEM), SEM של פני בלוק טורי וטומוגרפיה של קרן יונים ממוקדת (FIB)-SEM. הדמיית SEM ו-TEM של מקטעים טוריים חסרה את הרזולוציה ב-z, המוגבלת על ידי עובי החתך, אך מספקת שדה ראייה גדול ומסתמכת על ציוד הזמין ברוב מעבדות EM4. טומוגרפיה FIB-SEM יכולה להניב רזולוציה איזוטרופית, אך עלויות המכשיר והתחזוקה יכולות להיות מאתגרות, והדמיה של תאים שלמים ברזולוציה איזוטרופית גוזלת זמן 9,10.

הסוג השני של טומוגרפיה מסתמך אך ורק על העברת קרן האלקטרונים דרך דגימה. ניתן לעשות זאת באמצעות שתי שיטות הדמיה שונות: TEM או מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה (STEM). בעוד שטומוגרפיה TEM נפוצה יותר וקלה יותר ליישום, עובי החתך מוגבל ל-~200 ננומטר. לכן, לא ניתן לדמות מבנים גדולים מעובי החתך, כגון מיטוכונדריה, שלפוחיות או ויריונים, בתוך טומוגרפיה אחת. טומוגרפיה של STEM מציעה אפשרות לצלם דגימות בעובי של עד 1 מיקרומטר11,12. עם זאת, הוא דורש STEM עם מתח תאוצה גבוה (≥200 קילו וולט) ומערך התומך בזוויות הטיה גבוהות כמו גם זווית התכנסות קטנהלמחצה 13. למרות שהדמיית STEM היא טכניקה נפוצה במדעי החומרים, היא נותרה טכניקה נדירה במעבדות EM ביולוגיות.

כאן, אנו מציגים גישה מונעת יישום לשימוש בטומוגרפיה STEM עבור דגימות וירולוגיה. בשל המורכבות הגבוהה והאופי עתיר העבודה של טומוגרפיה EM, הכנת דגימה איכותית היא קריטית. בעוד ש-TEM קריוגני (טומוגרפיה) הוא ללא ספק תקן הזהב לחקירות ברמה המולקולרית, הדמיה בטמפרטורת החדר של תאים קפואים בלחץ גבוה ומוחלפים בהקפאה מספקת שימור מוצק ובהירות של מבנה האולטרה-מבנה התאי 7,14. בקצרה, תאים נדבקים גדלים על דיסק ספיר ונדבקים או מטופלים בדרך אחרת כרצונם. לאחר מכן התאים משותקים על ידי הקפאתם בלחץ גבוה בקצבי קירור גבוהים מאוד, וכתוצאה מכך זיגוג של המים שבתוכם. לאחר מכן, המים מוחלפים בממס בזמן שהדגימות מנוגדות ומוחזרות לאט לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הדגימות מוטמעות בהדרגה בשרף.

ישנם פרוטוקולים רבים להקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה, הנבדלים זה מזה במכונות, במערכת הנשא ובהרכב הדגימה. פורסמו פרוטוקולים מפורטים להקפאה בלחץ גבוה, כולל אחד מאת Walther et al.15, ופרוטוקול וידאו מאת Steyer et al.16, המתמקד בהכנת רקמות עבור FIB-SEM באמצעות שיפור ניגודיות בעזרת מיקרוגל. למחקר וירולוגי, Read et al.17 ו-Romero-Brey18 פרסמו פרוטוקולים מפורטים להכנת תאים נגועים בנגיף על ידי הקפאה בלחץ גבוה עם דיסקי ספיר וניתוח לאחר מכן באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית. חתך אולטרה-דק תואר בעבר גם 15,17. עיין בספרות המצוטטת לפרטים נוספים על גישות אלה.

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה שהיא גרסה מותאמת ומעודכנת של הפרוטוקולים שפורסמו בעבר15,17 בשילוב לראשונה עם מדריך וידאו מפורט. הפרוטוקול מספק זרימת עבודה להכנת דגימה באמצעות הקפאה בלחץ גבוה, החלפת הקפאה והטמעה בשרף אפוקסי. קטעים בעובי 800 ננומטר-1,000 ננומטר נחתכים באמצעות אולטרה-מיקרוטום. סדרת הטיה נרכשת עם STEM של 200 קילו וולט, תוך שימוש בכלי EM של התוכנה. פרוטוקול זה מותאם לתאים נצמדים ומספק זרימת עבודה מקיפה תוך מתן אפשרות לשינויים עבור סוגי דגימות אחרים, כגון תאי רקמה או תאי תרחיף. לטומוגרפיה של STEM בתנאים קריוגניים, עיין בעבודה של קבוצת19,20 של מייקל אלבאום.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

  1. הכנת דיסקי ספיר
    1. נקו את דיסקי הספיר על ידי שטיפה של 3 פעמים באתנול 100% למשך 20 דקות. הסר את האתנול שנותר על ידי משיכת הדיסקים מעל נייר סינון יבש. השאירו את הדיסקים בתא ייבוש של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות, או עד שהם יבשים לחלוטין.
      הערה: בפרוטוקול זה משתמשים בדיסקי ספיר בקוטר 3 מ"מ ובעובי של 0.16 מ"מ. עבור מערכות אחרות, זרימת עבודה מותאמת לתאי רקמה או תרחיף, עיין ב-Walther et al.15. כמה "טיפים וטריקים" לתאים מתורבתים ומערכות אחרות מסופקים על ידי מקדונלד ואחרים.21.
    2. ציפוי פחמן של דיסקיות הספיר על ידי הנחת כ-50 דיסקיות ספיר שטוחות על זכוכית שעון נקייה וציפוי בשכבת פחמן בעובי 10-15 ננומטר באמצעות מכשיר ציפוי פחמן. אופים את הדיסקיות למשך הלילה בחום של 120 מעלות כדי לייצב את שכבת הפחמן.
      הערה: עבור גישות EM מתואמות, הציגו מערכת קואורדינטות: הנח רשת מוצא על גבי דיסקי הספיר לפני ציפוי פחמן, כך שהרשת נראית כשלילי על הדיסק21.
    3. כדי להיות מסוגל לזהות את הצד המצופה פחמן של דיסקת הספיר מאוחר יותר, השתמש בכלי חד (למשל, קצה פינצטה) כדי לגרד סימן בפחמן שניתן לקרוא נכון רק מצד אחד.
      הערה: אנו ממליצים על המספר "2" או דומה (איור 2A,B). דלג על שלב זה עבור דיסקי ספיר עם מערכת קואורדינטות מצופה.
    4. אחסן את דיסקיות הספיר בתא ייבוש של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      הערה: לא מומלץ לעשות שימוש חוזר בדיסקי ספיר מכיוון שהדבר מגדיל את הסבירות לשבירתם במהלך הקפאה בלחץ גבוה.
  2. תרבית תאים
    1. זמן קצר לפני המיקום בתרבית תאים, פרוק את הצד המצופה פחמן של הדיסקים עם מכשיר לפריקת זוהר כדי להפוך אותם להידרופילים (למשל, 0.26 mbar עם זרם של 20 mA למשך 40 שניות). לאחר מכן, עקר את הדיסקים על ידי חשיפתם לאור UV למשך 15 דקות.
      הערה: חשיפה לאור UV במשך יותר מ-30 דקות עלולה לפגוע בציפוי הפחמן.
    2. השתמש בפינצטה סטרילית כדי למקם את הדיסקים בתחתית צלחת תרבית המכילה מדיה, ולהבטיח שהדיסקים לא יצופו. זרע בזהירות את התאים מלמעלה. במקרה שדיסקי הספיר צפים במצע תרבית התאים, יש לפרוק את הזוהר לזמן ארוך יותר בעת חזרה על הניסוי.
      הערה: זה חיוני שה-"2" יהיה מכוון נכון, כלומר הצד המצופה פחמן פונה כלפי מעלה. רצוי חד-שכבת תא על הדיסקים עם מפגש סופי של ~80%. צמיחת התאים על דיסקי הספיר עשויה להיות שונה מזו שבצלחת התרבית שמסביב. בדוק את התפלגות ואיכות התאים על הדיסקים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך לפני שתמשיך בפרוטוקול. ניתן לשפר את חלוקת התאים על ידי נדנוד עדין של הצלחת תוך כדי זריעת התאים.
      עבור תאי תרחיף, כסו דיסקי ספיר מצופים פחמן בפולי-L-ליזין או השתמשו בנימים, כמתוארב-15. אל תחשוף דיסקים מכוסים פולי-L-ליזין לאור UV, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בציפוי הפולי-L-ליזין.
    3. בצע כל טיפול רצוי בתאים (למשל, זיהום, טיפול תרופתי) תוך שמירה על דיסקי הספיר במקומם. טפל בדיסקים בזהירות כדי למנוע ניתוק תאים או שריטות במעטפת הפחמן. דגרו את התאים בהתאם. בצע קידומת כימית עם, למשל, 2.5% גלוטראלדהיד, 1% סכרוז במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.3), או 4% פרפורמלדהיד, על פי התקנות המקומיות, לפני הובלת הדגימות למקפיא בלחץ גבוה 1,7,22.
      הערה: לפני שדגימות נגועות עוזבות מעבדות ברמת בטיחות ביולוגית, ציית לכל תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות החלות על מערכת הדגם.

figure-protocol-1
איור 2: הקפאה בלחץ גבוה. (A) דיסקות ספיר המציגות ציפוי פחמן עם "2" (משמאל) או מערכת קואורדינטות עבור מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם (מימין). (B) תיאור סכמטי של כריך SD-gold spacer-SD כשהוא מוכן להקפאה בלחץ גבוה. התאים הגדלים על הדיסקים פונים זה לזה ובכך מוגנים בחלל הצפוף. (ג) מחזיק להקפאה בלחץ גבוה המכיל כריך SD. (ד) חומרים ומכשירים לטעינת מחזיק ה-HPF: (1) צלחת חימום, (2) מיקרוסקופ סטריאו, (3) נייר סינון, (4) צינור תגובה המכיל 1-הקסדצן, (5) פינצטה, (6) SDs לא מצופים, (7) צלחת פטרי עם מרווחי זהב, (8) מחזיק HPF. (ה) הגדרת מערכת ה-HPF: (1) קופסת LN להעברת דגימות קפואות (ראה גם F), (2) מייבש שיער כדי להאיץ את ההתחממות של מחזיק ה-HPF לאחר ההקפאה, (3) דיוואר חנקן למילוי מחדש של קופסת ה-LN. (F) קופסת LN להחזקת דגימות קפואות לאחר הקפאה בלחץ גבוה עם שוקת מרכזית (קווי מתאר מנוקדים) בה ניתן לפתוח את מחזיק ה-HPF, ולטפל בבטחה ב-SDs. חומרים הדרושים ישירות לאחר הקפאה בלחץ גבוה: (1) מחזיק לעד שישה מיכלי דגימה, (2) פינצטה מבודדת, (3) מיכלי דגימה עם מכסה. המיכלים מכילים חורים קטנים ומשקלים קטנים (למשל בורג) כך שהם טובלים בחנקן נוזלי. קיצורים: SD = דיסק ספיר; HPF = מקפיא בלחץ גבוה; LN = חנקן נוזלי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים

  1. הקפאה בלחץ גבוה
    הערה: פרוטוקול זה מתאר הקפאה בלחץ גבוה עם המקפיא בלחץ גבוה (HPF, טבלת חומרים). השלבים המתוארים לא צריכים להיות שונים בהרבה עבור מכונות אחרות, מכיוון שהם משרתים את אותה מטרה.
    1. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להגדיר את המקפיא בלחץ גבוה. הקפידו על אספקת חנקן נוזלי נאותה (איור 2E), הפעילו את המכונה ובצעו ריצת בדיקה.
    2. הגדר סביבת עבודה לטעינת הדיסקים לתוך מחזיק ה-HPF (איור 2D). הכינו את הפריטים הבאים: פלטת חימום (1), מיקרוסקופ סטריאו (2), פיסות נייר סינון (3), שפופרת תגובה עם הקסדצן כמילוי (4), פינצטה (5), דיסקי ספיר ריקים/לא מצופים להקפאת מספר אי זוגי של SDs עם תאים (6), מרווחי זהב (7) ומחזיק HPF (8, פירוט באיור 2C).
    3. הכן סביבת עבודה לטיפול בדגימות קפואות (איור 2E,F). לפני שמתחילים בהקפאה בלחץ גבוה, הכינו את הציוד הבא:
      1. הכינו את קופסת ה-LN ומלאו אותה בחנקן נוזלי (איור 2E,F) כהכנה לטיפול והעברה של דיסקי הספיר הקפואים ממחזיק ה-HPF לקפסולות אחסון.
      2. הכינו דיואר קטן (3 באיור 2E) ומלאו אותו בחנקן נוזלי: היו מוכנים למלא מחדש את קופסת ה-LN בחנקן נוזלי כמה פעמים במהלך תהליך ההקפאה.
      3. שמור פינצטה מבודדת (2 באיור 2F) מוכנה.
      4. הכן מיכלים לדוגמה שיחזיקו את דיסקי הספיר לאחר הקפאה בלחץ גבוה (קפסולות אחסון, 3 באיור 2F). ודא שיש להם מכסה ומספר חורים לשפוך פנימה חנקן נוזלי ומשקולות קטנות (למשל, ברגים קטנים או דומים) כדי להבטיח שהם לא יצופו. סמן את המיכלים לפני השימוש וקרר אותם מראש בקופסת LN.
        הערה: אנו משתמשים בכמוסות BEEM כקפסולות אחסון.
    4. שמרו את הדגימות באינקובטור קרוב למקפיא בלחץ גבוה אם התאים לא קיבלו קידומת, או אם זה לא אפשרי, על צלחת מחוממת (1 באיור 2D), כדי לשמור על תנאים פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) זמן רב ככל האפשר.
    5. ודא מספר מספיק של תאים על דיסקי הספיר ואיכות תאים טובה לפני תחילת הקפאה בלחץ גבוה. לשם כך, בדוק את הדיסקים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.
    6. בצע הקפאה בלחץ גבוה.
      1. קחו דיסק ספיר אחד מכלי התרבית עם פינצטה והניחו אותו במחזיק ה-HPF (איור 2C) כשהצד המצופה בפחמן פונה כלפי מעלה ("2" קריא). לפני כן, הסר עודפי מדיה על ידי טבילת הדיסק במהירות על נייר סינון אך הקפד לא לתת לתאים להתייבש.
      2. טובלים מרווח זהב בהקסדקן ומניחים אותו בזהירות על גבי דיסק הספיר. קח דיסק ספיר שני ומקם אותו על גבי מרווח הזהב כשהצד המצופה פחמן פונה כלפי מטה, ויוצר דיסק ספיר - מרווח זהב - כריך דיסק ספיר כאשר התאים מצביעים זה לזה. וודאו כי אין אוויר כלוא בחלל הכריך.
      3. סגור את מחזיק ה- HPF. בצע שלב זה בזהירות אך במהירות כדי למזער את הלחץ על הדגימה, במיוחד עבור תאים חיים שלא קיבלו קידומת.
        הערה: עבור דגימות המכילות חומרים סרטניים, מוטגניים או רעילים (CMR), כמו מקבעים כימיים, טען את מחזיק ה-HPF מתחת למכסה אדים כדי למזער את החשיפה.
      4. התחל את תהליך ההקפאה. הכנס במהירות את מחזיק ה-HPF למקפיא בלחץ גבוה, נעל אותו בהתאם להוראות היצרן והתחל את תהליך ההקפאה.
    7. הסר את הדגימות המזוגגות ממחזיק ה- HPF. העבר במהירות את קצה מחזיק ה-HPF הנושא את דיסקי הספיר הקפואים כעת לקופסת ה-LN המקוררת מראש. הסר את הדיסקים בזהירות ממחזיק ה-HPF לתוך השוקת המרכזית בקופסת ה-LN (קו מקווקו באיור 2F). לאחר מכן, יש לחמם את מחזיק ה-HPF ולהסיר שאריות אתנול או הקסדצן לפני שתתחיל להרכיב את הכריך הבא.
      הערה: מעתה ואילך, ודא שכל מה שנוגע בדיסקים מקורר מראש בחנקן נוזלי. בצע את שלבי ההעברה במהירות באטמוספירה של חנקן ואחסן את הדיסקים בחנקן נוזלי כדי למנוע הפשרת הדגימה. תרגלו מראש את העברת המחזיק מ-HPF לתיבת ה-LN כדי להבטיח מעבר חלק ומהיר. ניתן להאיץ את תהליך ההתחממות של המחזיק לאחר ההקפאה באמצעות מייבש שיער (2 באיור 2E).
    8. לאחר הוצאת דיסקי הספיר מהמחזיק, הכניסו אותם למיכלים המסומנים להעברה למכשיר החלפת ההקפאה או לאחסון חנקן נוזלי עד לעיבוד נוסף. אם דיסקי הספיר נערמים היטב לאחר HPF, השתמש באזמל כדי להפריד את דיסקי הספיר לפני החלפת ההקפאה.
      הערה: הקפד לא לשבור את הדיסקים ולהימנע מכוחות גזירה. תכננו מספיק זמן לשלב זה.
  2. החלפת הקפאה-החלפה
    1. הגדר את התקן החלפת ההקפאה בהתאם להוראות היצרן. מלאו את מחסור החנקן הנוזלי והתחילו את התוכנית לקירור מוקדם של תא הדגימה ל-90 מעלות צלזיוס. ודא שיש מספיק חנקן נוזלי לכל תהליך ההחלפה.
      הערה: כימיקלים מעורבים מסוכנים. בצע את כל השלבים מתחת למכסה אדים וציית להנחיות הסביבה, הבריאות והבטיחות המקומיות (EHS).
    2. הכן את תמיסת החלפת ההקפאה המכילה 0.1% (w/v) אורניל אצטט, 0.2% (w/v) אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) ו-5% (v/v) מים באצטון. להכנת נפח של 6 מ"ל (מספיק למילוי 24 קריוביאלים, השווה לקיבולת המקסימלית של מכשיר ההחלפה המשמש כאן), בצע את השלבים הבאים:
      1. שקלו 6 מ"ג של אורניל אצטט לתוך כלי זכוכית עם מכסה הדוק.
      2. הוסף 300 מיקרוליטר של 4% (w/v) אוסמיום טטרוקסיד במים.
      3. סגור את הכלי וסוניקט למשך 5 דקות כדי להמיס את האורניל אצטט.
      4. הוסף 5.7 מ"ל אצטון, ערבב וחלק באופן שווה את התמיסה לקריוביאלים התואמים למכשיר החלפת ההקפאה.
    3. הנח את הקריוביאלים הסגורים המכילים את תמיסת החלפת ההקפאה לתוך מכשיר החלפת ההקפאה שהתקרר מראש בטמפרטורה של -90 מעלות צלזיוס והמתן עד שהתמיסה תתקרר גם ל-90 מעלות צלזיוס (למשך כ-20 דקות).
    4. מלאו את קופסת ה-LN בחנקן נוזלי. להעברת דיסקי הספיר למכשיר החלפת ההקפאה, פינצטה מוקדמת, אזמל וצבת (או פינצטה גדולה) בחנקן נוזלי.
    5. השתמש בפינצטה הגדולה שמקוררת מראש כדי להעביר את קפסולות האחסון עם הדגימות הקפואות בלחץ גבוה ממיכל האחסון לתוך קופסת ה-LN.
      הערה: עבוד במהירות כדי למנוע הפשרה של הדגימות. בעת עיבוד דגימות ישירות לאחר הקפאה בלחץ גבוה, ניתן לדלג על שלב זה.
    6. העבירו את הדגימות הקפואות בלחץ גבוה למכשיר החלפת ההקפאה. הפרד את דיסקי הספיר בזה אחר זה תוך שמירה עליהם בחנקן נוזלי. העבר במהירות כל דיסק בנפרד לתוך קריוביאל עם פתרון החלפת הקפאה, כדי להבטיח שהדיסק שקוע במלואו. סגור את הקריוביאל והחזר אותו מיד למכשיר החלפת ההקפאה.
      הערה: במהלך ההעברה, שמור את הקריוביאל באטמוספירת החנקן הנוזלי כדי למנוע מתמיסת ההחלפה להתחמם אך לא בחנקן נוזלי כדי למנוע את הקפאתה. החזק את הבקבוקון עם האצבעות קרוב למכסה כדי למנוע התחממות של תמיסת ההחלפה. טפל בתמיסת ההחלפה בזהירות, מכיוון שהוא מכיל חומרים רעילים.
    7. לאחר שכל הדיסקים מועברים להתקן ההחלפה, התחל בתהליך החלפת ההקפאה. הגדר את המכשיר להעלות את הטמפרטורה בהדרגה במהלך 16 שעות מ-90 מעלות צלזיוס ל-0 מעלות צלזיוס, עם שלב דגירה של שעה ב-0 מעלות צלזיוס, ואחריו עלייה הדרגתית ל-20 מעלות צלזיוס במשך שעה.
    8. ברגע שהדגימות מגיעות ל-20 מעלות צלזיוס, המשך ישירות בשטיפת הדגימות למשך 3 x 30 דקות עם 100% אצטון.
      הערה: אל תתנו לתאים על הדיסקים להתייבש. בצע את כל השלבים הבאים מתחת למכסה אדים. אסוף את כל הפסולת במיכל מתאים והשליך אותה בהתאם לתקנות ה-EHS המקומיות.
  3. הטבעה
    1. הכינו שרף אפוקסי טרי לפי הוראות היצרן.
      הערה: בצע את כל השלבים עם שרף אפוקסי מתחת למכסה אדים. אנו ממליצים להכין שרף טרי לכל הליך הטבעה עקב צמיגות נמוכה יותר ובכך חדירת דגימה טובה יותר.
    2. כדי להטמיע מראש את הדגימות, דגרו את הדגימות בתמיסה המכילה 1/3 שרף אפוקסי ו-2/3 אצטון למשך שעה. החלף את התמיסה ב -2/3 שרף אפוקסי ו -1/3 אצטון ודגירה למשך 3 שעות. החלף את התמיסה בשרף אפוקסי 100% ותן לו לדגור למשך הלילה כשמכסה הבקבוקון פתוח כדי לאפשר לאצטון שנותר להתאדות.
    3. למחרת, העבירו את דיסקי הספיר לצינורות תגובה חדשים ומסומנים מלאים בשרף אפוקסי טרי שהוכן. מקם את הדיסקים בצורה אופקית, נתמכת על ידי דופן צינור התגובה, וודא שהצד עם התאים פונה כלפי מעלה בצינור התגובה (ה-"2" ניתן לקריאה במיקרוסקופ סטריאו). מכניסים את צינורות התגובה עם מכסה פתוח לתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס ונותנים לשרף האפוקסי להתפלמר לפחות 48 שעות.
      הערה: אם יש צורך להטמיע שבר דיסק ספיר, הטמע אותו בעזרת קצה מפולימר של גוש שרף מניסוי קודם: הנח את הקצה בצינור התגובה, מלא את הצינור בשרף טרי והניח את הדיסק השבור על גבי הקצה הפולימרי.
      יש להכניס כל חומר מתכלה חד פעמי המזוהם בשרף אפוקסי לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לשרף להתפלמר במלואו לפני השלכתו. ניתן לנגב פינצטה ופריטים אחרים באתנול לפני כן.
    4. טבלו את קצה צינור התגובה הסגור בחנקן נוזלי למשך כ -10 שניות. לאחר מכן, הסר את גוש השרף מצינור התגובה על ידי פגיעה בצינור התגובה על השולחן. דיסק הספיר נפרד בקלות ממעטפת הפחמן שנשארת על גבי התאים המוטבעים.
      הערה: ודא שמדיום ההטבעה שלך סובל את שינויי הטמפרטורה הנגרמים על ידי טיפול בחנקן נוזלי.
  4. הכנת קטעי טומוגרפיה של STEM
    1. הכן קטעים עבים בהרבה ממקטעים דקים במיוחד להדמיית TEM, בדרך כלל בין 800 ננומטר ל-1 מיקרומטר.
      הערה: הכנת חתכים לטומוגרפיה של STEM שונה במקצת מאולטרה-מיקרוטומיה קונבנציונלית. לפרוטוקול מפורט המתאר את הכנת קטעי טומוגרפיה של STEM, עיין ב-Walther et al.15 ו-Villinger et al.10.
      לפני שתמשיך בהכנת קטעי טומוגרפיה של STEM, וודא שאיכות התאים טובה. לשם כך, בצע חתך אולטרה-דק (~70 ננומטר) וניתוח TEM (איור 3D,E).
    2. אסוף את החלקים על רשתות נחושת מקבילות, כך שאף פסי רשת לא יחסמו את אלומת האלקטרונים בעת הטיית הדגימה לזוויות גבוהות. לחיבור חתך טוב יותר, טפל ברשתות עם 0.01% פולי-L-ליזין: הכינו אליקוט קטן של 0.01% פולי-L-ליזין מתמיסת מלאי של 0.1%, טבלו את הרשתות באליקווט, יבשו אותן בזהירות על ידי גרירת שפת הרשת על נייר סינון. זוהר לפרוק את הרשתות ולהשתמש בהן כדי לאסוף את החלקים.
    3. התייחס לקטעים עם זהב קולואידי כסמנים נאמנים ליישור סדרת הטיה (ראה סעיף 3).
    4. מרחו מעיל פחמן על החלקים כדי לייצב אותם ולהפוך אותם למוליכים יותר.

figure-protocol-2
איור 3: בקרת איכות על ידי מראה שונה של תאים TEM לאחר הטבעה, חיתוך וחתך אולטרה-דק. (A) תאים משובצים בשרף אפוקסי לאחר הסרת ה-SD. שכבת הפחמן עם ה-'2' השרוט נשארת על התאים המשובצים בשרף ונראית בבירור. התאים הכמעט שקופים מפוזרים באופן שווה על פני הבלוק. (B) פנים בלוק קצוץ לפני מיקרוטומיה. חלק מה-2 השרוט עדיין נראה על פני גוש השרף. (ג) קטעים בעובי 70 ננומטר המורכבים על רשת TEM. (D) סקירה כללית של TEM של קטע אולטרה-דק אחד שלם. שימו לב לחורים בקטע (ראשי חצים לבנים) הנובעים מחדירת שרף לא שלמה ומהווים חפץ נפוץ. (E) תצוגה מוגדלת של תא נבחר המסומן במלבן לבן ב-(D). בדומה ל- (D), הטבעה לא שלמה נראית בקרום הפלזמה (ראשי חץ לבנים); עם זאת, שאר התא מראה השתמרות והטמעה טובים. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (D), 10 מיקרומטר (E). קיצורים: SD = דיסק ספיר; TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הדמיה

  1. רכישת סדרת הטיה STEM
    1. הגדר את המיקרוסקופ בהתאם להנחיות היצרן. הקפידו על יישור נכון של האלומה.
    2. מלאו בזהירות את ניקוי החנקן הנוזלי במיקרוסקופ.
    3. בחר את מחזיק הטומוגרפיה הנכון בתוכנת פעולת המיקרוסקופ.
    4. הכנס את הרשת למחזיק. שימו לב שסורגי הרשת מכוונים בניצב לציר ההטיה כדי למנוע מהסורגים לחסום את אלומת האלקטרונים בזוויות הטיה גבוהות.
    5. הכנס את המחזיק למיקרוסקופ.
    6. יישר את הקורה על ידי ביצוע השלבים הבאים:
      1. טען את קובץ היישור שסופק על-ידי היצרן. פתח את שסתום הקורה ועבוד במצב TEM לעת עתה. הגדר הגדלה של כ-20,000x והגדר מיקוד סטנדרטי על-ידי לחיצה על STD Focus.
      2. חפש חור בדגימה. זה קל יותר במצב הגדלה נמוכה (לחץ על LowMag).
      3. ודא שלא הוכנס צמצם. הגדר את גודל הנקודה ל-1 ואת אלפא ל-3. צמצם את האלומה על מסך הצפייה על ידי סיבוב לחצן הבהירות נגד כיוון השעון ומרכז אותו באמצעות לחצני הזזת האלומה.
      4. יישור נכון של האקדח: בלוח היישור של תוכנת פעולת המיקרוסקופ, בחר אקדח ואת האנודה וובלר. כוונן את הסימטריה של האלומה באמצעות לחצני DEF/STIG . ודא שתנועת הקרן על מסך הפלואורסצנט היא הומוגנית. העבר את הנקודה הבהירה ביותר לאמצע המסך באמצעות כפתורי SHIFT ; בטל את הבחירה באפשרות הכל בסיום.
      5. תיקון סטיגמות מעבה: באותו לוח יישור, בחר CLA ו-HT wobbler. התאם באמצעות לחצני DEF/STIG כדי להשיג תנועה הומוגנית.
      6. הגדר את צמצם עדשת הקבל: הגדל את האלומה במסך הפלואורסצנטי על ידי סיבוב לחצן הבהירות בכיוון השעון. הכנס את צמצם עדשת המעבה הקטן ביותר וודא שהוא מיושר בקורה בצורה נכונה על ידי החלפת הבהירות. אם האלומה נעה בצורה א-סימטרית במסך הצפייה, כוונן את הצמצם באופן ידני באמצעות כונני הצמצם הידניים. אם הצמצם נראה מעוות במסך הפלורסנט, תקן שוב את סטיגמטורי המעבה CLA עם DEF/STIG (שלב קודם 3.1.6.5).
      7. עבור למצב STEM (בחר ASID).
        הערה: אתה יכול להפריע לדיאלוג הרפיית העדשה לאחר 5-10 שניות.
      8. העבר את הבמה לאזור דק ועשיר בניגודיות של הדגימה. לחץ על STD Focus והסר את כל הצמצמים. שנה להגדלה של 25,000 עם גודל ספוט של 1.5 ננומטר, הגדר את אורך המצלמה בין 80 ל-120 ס"מ ובחר מצב נקודה.
      9. שנה את ערך ה-z של הגוניומטר עד שהרונכיוגרמה תהיה גלויה על מסך הצפייה. שנה את אורך המצלמה אם הרונצ'יגרמה חלשה. אם הוא לא עגול, השתמש בלחצן COND Stig כדי לכוונן אותו.
      10. הכנס את צמצם עדשת הקבל הקטן ביותר. השתמש בכונני הצמצם הידניים כדי למרכז את הצמצם סביב הסיכון.
    7. הכנס את הגלאי המתאים. בהתבסס על שאלת המחקר, השתמש בגלאי השדה הבהיר ו/או בגלאי השדה האפל. הפעל את מצב הסריקה וקבל תמונת בדיקה ראשונה של הדגימה.
    8. בחר הגדלה גדולה מזו הרצויה לטומוגרפיה (גבוהה מ - 800,000x). מיקוד ואסטיגמציה נכונים: עשה זאת ליד אך לא ישירות באזור העניין (ROI) כדי למנוע נזק אלומה לאזורי דגימה קריטיים.
      הערה: סמני הזהב יכולים להקל על שלב זה.
    9. הגדר את הגובה האוצנטרי כדי להבטיח שהחזר ה-ROI יישאר מרוכז על פני כל טווח ההטיה (כלומר -72 ° עד 72 °). בחר תכונה ליד ה-ROI, הביא אותה למרכז, התמקד, תקן אסטיגמציה והטה את הבמה צעד ל-72 מעלות. כוונן את מיקום ה-z של המחזיק כדי לשמור על התכונה ממורכזת והתאם את הניגודיות והבהירות במידת הצורך. במידת הצורך, חזור על כך על ידי הטיה צעד ל +72 °.
    10. בחר את שדה הראייה על ידי ניווט חזרה אל החזר ההשקעה, מיקוד וקבל תמונת סקירה כללית (איור 4). הגדר את ההגדלה הרצויה לרכישת סדרת הטיה.
    11. הגדר רכישה אוטומטית של סדרות הטיה של תמונות מ-72° עד +72° ותמונה כל 1.5°.
    12. כדי לנטרל השפעות מכניות המתרחשות בעת החלפת כיוון הטיית הבמה, התחל את סדרת ההטיה בזווית גדולה יותר מזו שאיתה להתחיל לצלם. אם הדמיה מ-72° ל-72°, התחל בהטיית ה-stage מ-0° ל-74° ולאחר מכן התחל ברכישת התמונה בדרך ל-+72°, וקבל את התמונה הראשונה ב-72°-.
    13. התחל ברכישת סדרת הטיה אוטומטית. הקפד להפעיל מיקוד דינמי בתוכנת הרכישה.
      הערה: אם רכישת סדרת ההטיה מסתיימת בטרם עת, תקן את הגובה האוצנטרי. במיוחד בהגדלה גבוהה יותר, זה יכול לגרום לבעיות ברכישת סדרת הטיה אוטומטית עקב הגירה של החזר ה-ROI מחוץ לשדה הראייה.
      תוכנה נפוצה לטומוגרפיה של STEM ו-TEM היא SerialEM. Kirchweger et al.20 פרסמו פרוטוקול וידאו לטומוגרפיה של Cryo-STEM באמצעות SerialEM, שניתן להתאים בקלות לטומוגרפיה של STEM בטמפרטורת החדר.

figure-protocol-3
איור 4: רכישת סדרת הטיה. (A) 200 kV STEM. (B) סקירת STEM של תא קפוא בלחץ גבוה ומוחלף בהקפאה המוטבע בשרף אפוקסי. סדרת ההטיה המוצגת ב-(C-E) נרכשה במיקום המסומן במלבן הלבן. (ג-ה) תמונות נבחרות של סדרת הטיה שנרכשו מ-72° עד +72°. סימני זהב משני צידי הקטע משמשים לשחזור טומוגרפיה חישובית. לא ניתן להשתמש באשכולות כמו אלה המסומנים באליפסות הלבנות לשחזור הטומוגרמה, אך ניתן לזהות אותם היטב בזוויות הטיה גבוהות. מבנים אלה או דומים להם מחוץ לאזור העניין שימושיים לקביעת הגובה האוצנטרי. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר (B). קיצור: STEM = מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סורק. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. שחזור ופילוח טומוגרמה

  1. לבצע שחזור טומוגרפיה (למשל, עם תוכנת Etomo של חבילת התוכנהIMOD 23).
    1. בצע את היישור הראשון של סדרת ההטיה ושחזר את הטומוגרמה באמצעות הקרנה אחורית משוקללת.
      הערה: פרוטוקול מפורט ניתן למצוא באתר משרד הביטחון: מדריך טומוגרפיה של אמ"ן (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). לעיבוד תמונות שנרכשו עם גלאי השדה האפל, עיין בעבודה שפורסמה בעבר11,13.
  2. פלח מבנים סלולריים (למשל, עם תוכנה כמו 3DMOD מחבילת IMOD או פתרונות מבוססי AI).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה של STEM מציעה אפשרות לצלם קטעים עבים יותר מאשר טומוגרפיה TEM ברזולוציה איזוטרופית בטווח הננומטרי ובהשוואה לטומוגרפיה FIB-SEM - מספקת זרימת עבודה חסכונית יחסית בזמן. בווירולוגיה, זה שימושי במיוחד מכיוון שהוא מאפשר הדמיה של מספר רב של תכונות אולטרה-מבניות לניתוח סטטיסטי בתלת מימד, או בעת חיפוש אירועים נדירים. כאן, אנו מראים שתי תוצאות מייצגות המדגימות כיצד ניתן להשתמש בטומוגרפיה של STEM ביחס לשני ההיבטים הללו.

הדמיה של ויריונים VSV רקומביננטיים ניצנים

קיים מגוון רחב של נגיפים היוצרים חלקיקים בצורות ובגדלים שונים. כדי לנתח את צורת הוויריונים בתרחיף נגיף, לעתים קרובות מספיקה שיטה פשוטה כמו כתם שלילי TEM. אפיון המורפולוגיה של ויריונים בהקשר התאי קשה יותר. זה נכון במיוחד עבור וירוסים היוצרים חלקיקים עם מורפולוגיה אנאיזוטרופית, כמו rhabdoviridae. VSV הוא וירוס רבדו היוצר נגיפים בצורת כדור באורך של ~180 ננומטר. בתאי תרחיף, הוויריונים מכוונים באופן אקראי, מה שמקשה תמיד להבחין בצורת הקליע בתמונות דו-ממדיות (איור 5A-C). כדי להגדיר כראוי את צורת התבליט של כל ויריוני ה-VSV הרקומביננטיים בדגימה, יש צורך בשיטה תלת מימדית עם רזולוציה איזוטרופית - כזו שיכולה גם לספק מידע נפחי על פני שטח דגימה גדול מספיק. טומוגרפיה של STEM יכולה לכלול ויריונים שלמים רבים במערך נתונים יחיד (איור 5D,E). לפיכך, ניתן לדמות מספר גבוה של ויריונים לניתוח סטטיסטי, גם אם נרכשת רק טומוגרפיה אחת לכל תא. לשם השוואה, טומוגרפיה TEM של חתך בעובי 200 ננומטר תלכוד רק כמה ויריונים רקומביננטיים שלמים של VSV (כפי שמסומן באיור 5E).

figure-results-1
איור 5: טומוגרפיה של STEM של אתרי ניצני VSV רקומביננטיים. (A-C) פרטים מקטע וירטואלי של טומוגרפיית STEM המתקבלים מקטע בעובי 800 ננומטר מראים שצורת התבליט לא תמיד נראית לעין עקב (A,B) כיוונים שונים של הוויריונים. (ג) רק נגיפים המכוונים במקביל למישור הצפייה מוצגים ככדורים מוגדרים היטב. (D) אתרים ניצנים של VSV רקומביננטי דומים לאשכולות גדולים של ויריונים ללא כיוון מועדף. (E) מבט מהצד של הטומוגרמה מדגים את היכולת ללכוד הרבה ויריונים VSV רקומביננטיים שלמים בקטע אחד באמצעות טומוגרפיה של STEM. ערימת התמונות הווירטואלית בעובי של כ-600 ננומטר במיקום זה. הקווים המקווקווים מייצגים את העובי המשוער של קטע עבור טומוגרפיה TEM (200 ננומטר), שבו ייכללו רק כמה ויריונים שלמים בצורת כדור. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר (D). קיצורים: STEM = מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סורק; VSV = נגיף סטומטיטיס שלפוחיתית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

פירוק של ננו-סיבים פפטידים EF-C

בהקשר של ריפוי גנטי, ננו-סיבים פפטידים משפרי התמרה הפכו לנושא מעניין. במחקר שפורסם לאחרונה24, נעשה שימוש בהדמיה קורלטיבית באמצעות הדמיית העברת אנרגיה של תהודה (FRET) וטומוגרפיה של STEM (FRET-3D-CLEM) כדי לחקור את הספיגה והפירוק של ננו-סיבים פפטידים EF-C. יעילות FRET גבוהה, המתאימה לזוגות FRET הקרובים זה לזה, פולטת פלואורסצנטיות אדומה המתאימה לסיבים מורכבים. יעילות FRET נמוכה, המתאימה לזוגות FRET הרחוקים זה מזה, פולטת פלואורסצנטיות ירוקה, המייצגת סיבים מפורקים. שני האותות מופיעים בתאים כאשר הם נמצאים בתהליך של קליטה ופירוק של ננו-סיבי פפטיד EF-C. אזורים שבהם נמצאות יעילות FRET גבוהה ונמוכה מופיעים בצהוב (איור 6A).

figure-results-2
איור 6: הדמיה של פירוק ננו-פיבריל פפטיד EF-C על ידי הדמיית FRET בקורלציה וטומוגרפיה STEM (FRET-3D-CLEM). (A) מיקרוסקופיה קונפוקלית של תא שהודגר עם ננו-פיברילים EF-C שסומנו עם זוג FRET. אותות ירוקים תואמים לסיבים מפורקים כביכול. אדום מתאים לסיבים שלמים כביכול. צהוב מתאים לאזורים שבהם מזוהה תערובת של האות האדום והירוק. Nu nucleus. (B) סקירת STEM של קטע בעובי 800 ננומטר מאותו תא. (ג) מצוין מיקום הטומוגרמה. התמונה היא מורכבת משתי תמונות שנרכשו בקטעים שונים, מכיוון שהתא נחסם חלקית על ידי רשת העמודות באחד המקטעים. הגרעין מסומן ב-Nu ב-A, B ו-C. (C) קטע וירטואלי מהטומוגרפיה. ראשי חץ אדומים מסמנים אזורים החופפים לאותות פלואורסצנטיים אדומים. טומוגרפיה של STEM מאשרת את נוכחותם של סיבים שלמים. ראש החץ הירוק מצביע על אזור עם סיבים מפורקים. (ד) סגמנטציה של הטומוגרמה. פילופודיום אנדוציטוזי צובט את קרום השלפוחית (חץ לבן). הנפח הגדול שניתן לחקור באמצעות טומוגרפיה של STEM (כאן בערך: 7 מיקרומטר x 7 מיקרומטר x 550 ננומטר) מקל על צפייה באירוע נדיר שכזה. (ה) סעיפים וירטואליים 19, 24 ו-29 של הטומוגרמה. בגודל פיקסל של 6.8 ננומטר, כל אחד מהחלקים נמצא במרחק של 27.2 ננומטר זה מזה. הנתון משוחזר מהנתונים שפורסמו על ידי Rauch-Wirth et al.24 . פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר (A), 1 מיקרומטר (C). קיצורים: STEM = מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סורק; FRET = העברת אנרגיית תהודה של פורסטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיה בוצעה על ידי גישה מתאמת זו כדי לאשר שסיבי EF-C נקלטים על ידי התא ולאחר מכן מתפרקים. מיקרוסקופ אור מאפשר לנו לבחור תאים למיקרוסקופ אלקטרונים המספקים אותות אדומים וירוקים, כדי להשוות את המראה האולטרה-מבני המתאם עם אותות הקרינה השונים. טומוגרפיות STEM מאותו תא מראות שהאות האדום יכול לנבוע מסיבים שעדיין נמצאים מחוץ לתא, או שלכאורה הופנמו טריים על ידי מקרופינוציטוזיס (איור 6C). יתר על כן, CLEM אימתה שהאות הירוק אכן מקורו בסיבים מושפלים (איור 6B,C שניתן למצוא בליזוזומים (איור 6C, השלפוחית הגדולה ביותר). בשל הנפח הגדול הנגיש על ידי טומוגרפיה STEM והדמיה תלת מימדית של המבנים, קל יותר לתאם את האות ממיקרוסקופ אור עם תכונות אולטרה-מבניות ולפרש אותן. יתר על כן, אירועים נדירים, כמו למשל צביטה של פילופודיה בתוך הליזוזום (איור 6D,E, חץ לבן) יכולים להיות מזוהים בגישה הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה STEM מציעה רזולוציה דומה לטומוגרפיה TEM בשילוב עם היכולת לחקור נפחים בעובי של עד 1 מיקרומטר. לכן אנו רואים בו אידיאלי להדמיית שינויים הנגרמים על ידי וירוסים של מבנים תוך-תאיים, כמו שיפוץ ממברנה 4,6,25, ניצנים של ויריונים7 או אנדוציטוזיס5. בהתאם לשאלת המחקר, ניתן לשקול טכניקות אחרות של VolumeEM. עבור טכניקה המספקת שדה ראייה גדול יותר ברזולוציה דומה, אנו ממליצים על טומוגרפיה FIB-SEM. טומוגרפיה של FIB-SEM תהיה איטית יותר מטומוגרפיה של STEM בעת הדמיית נפח דומה ברזולוציה דומה, מכיוון שזמן ההדמיה גדל כאשר הרזולוציה עולה. לעתים קרובות, זה נמדד על ידי הדמיית שדות ראייה קטנים יותר. יתר על כן, רזולוציית z של 6.8 ננומטר (איור 6) תהיה מאתגרת מבחינה טכנית עם כרסום אלומת יונים. לכן, FIB-SEM אופטימלי להדמיית מבנים גדולים יותר כמו תאים שלמים ורקמות 9,10,26,27, אם כי בדרך כלל עם גדלי פיקסלים (איזוטרופיים) של כמה עשרות ננומטרים. יתר על כן, טומוגרמות FIB-SEM אינן מציגות אפקטים של "טריז חסר", האופייני לטומוגרמות ששוחזרו מסדרת הטיה. יתרה מכך, עם התפתחות מכונות FIB פלזמה, מוצגות כיום לתחום חלופות המספקות כרסום מהיר יותר ומדויק עדיין.

אם רזולוציה גבוהה ב-z אינה קריטית, הדמיית TEM או SEM של חתכים טוריים יכולה להוות חלופה המאפשרת חקירה של שדה ראייה גדול מאוד בזמן קצר28,29, עם זאת, בדרך כלל ברזולוציה אנאיזוטרופית. בטומוגרפיה של TEM, ניתן לשלב טומוגרמות שונות מקטעים עבים סדרתיים30,31. אותו הדבר אפשרי בטומוגרפיה של STEM; עם זאת, בהתחשב בעובי הקטעים שניתן לחקור, יש פחות צורך לשלב מספר טומוגרפיות. בווירולוגיה, טומוגרפיה TEM משמשת לעתים קרובות לאפיון שיפוץ ממברנה המושרה על ידי וירוס 32,33,34,35. בעוד שטומוגרפיה TEM עצמה מספקת תובנות חשובות במחזור השכפול של וירוסים, רוב מקרי השימוש ייהנו מהיכולת של טומוגרפיית STEM לצלם נפחים עבים יותר. זה נכון במיוחד עבור ויריונים עם מורפולוגיה אנאיזוטרופית, כמו rhabdoviridae, שם טומוגרפיה TEM יכולה ללכוד רק כמה ויריונים שלמים בטומוגרמהאחת 35 או להדמיה של מספר ויריונים עוטפים בתא שכפול בגודל של קומפלקס ההרכבה הנגיפי הציטופלזמי (cVAC) של הציטומגלווירוס האנושי (HCMV)4.

טומוגרפיה של STEM בתנאים קריוגניים מציעה תובנות פונקציונליות נוספות19 ופרוטוקול וידאו זמין20. הפרוטוקול שלנו שונה בזרימת העבודה של הכנת הדגימה, שבמקום לשמר את הדגימה במצב המקורי, מספק שימור אולטרה-מבני כמעט מקורי. בעוד שטומוגרפיה STEM של דגימות קפואות בלחץ גבוה ומוחלפות בהקפאה אינה יכולה להשיג את השימור האולטרה-מבני והרזולוציה האטומית הנראית ב-EM קריוגני, היא נהנית מהיתרונות של ציוד פשוט יותר, דגימות יציבות יותר ותפוקה גבוהה יותר.

השלבים הבאים קריטיים להצלחת השיטה:

ראשית, מטרה ברורה של ניסוי ההדמיה. בשל האופי עתיר העבודה של הטכניקה, יש צורך בניסוי מתוכנן היטב עם מטרה ברורה להדמיה. יש ליצור ידע מפורט על מערכת המודל - קו תאים ווירוס - מראש על ידי שימוש בשיטות אחרות שפחות קשות לביצוע. לכן, אנו מעודדים אופטימיזציה של שיעורי ההדבקה בניסויים מקדימים מבוססי מיקרוסקופ אור והתאמת תנאי הניסוי כך שיתאימו למערכת הביולוגית. פרמטרי האופטימיזציה כוללים את מספר התאים, ריבוי ההדבקה (MOI) ונקודות זמן המבוססות על הנגיף והאירוע שיש לצלם. זה יבטיח שיעור גבוה של תאים מוערכים בדגימה.

שנית, הכנת דגימה איכותית. אנו מדגישים את החשיבות של הכנת דגימה איכותית. נכון לעכשיו, אנו רואים בזיגוג על ידי הקפאה בלחץ גבוה את תקן הזהב עבור דגימות עבות כמו תאים. החלפת הקפאה, הטמעה והדמיה לאחר מכן בטמפרטורת החדר היא דרך חזקה להשיג תוצאות באיכות גבוהה בשילוב עם טומוגרפיה STEM. לכן, קביעת שגרה יציבה להכנת הדגימה היא קריטית. לשם כך, ברצוננו להדגיש את הספרות על הקפאה בלחץ גבוה14,21. אם יש להשתמש בתמיסת החלפת הקפאה פחות רעילה, אנו ממליצים להשתמש באשלגן פרמנגנט כתחליף לאוסמיום טטרוקסיד, כפי שמתואר על ידי Schauflinger et al.36.

לבסוף, יש ליצור זרימת עבודה חלקה לרכישת סדרות הטיה, כולל מיקרוסקופ מיושר היטב, בהתאם להוראות המשתמש של ה-STEM ויהיה שונה ממיקרוסקופ למיקרוסקופ. יצירת זרימת עבודה חלקה תלויה גם במחולל הסריקה ובתוכנת רכישת התמונות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR ו-MD הם עובדים של Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, חברת תרופות עם עניין בפיתוח וייצור מוצרים מבוססי וירוסים. לא הייתה לכך השפעה על עיצוב העיתון; לכן, איננו מדווחים על ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרסום זה הוא חלק מאסטרטגיית טכנולוגיית הפיתוח הגלובלית ונתמך על ידי ניהול הטכנולוגיה הגלובלית ב-Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. אנו מודים לרנטה קונץ וג'אנה אפולוני על הסיוע הטכני המצוין והדיון המועיל בנוגע להכנת הדגימה. אנו מודים לריינהרד וייה על הסיוע המצוין בנושאים טכניים ובתחזוקת המכשירים. אנו מודים לטורסטן פרידריך על הדיון המועיל ועל הסיוע בהגדרת המיקרוסקופ. עבודתם של קלריסה ריד, ג'וליה לרוש ויאן מינך קיבלה מימון ממענק מרכז המחקר השיתופי של קרן המחקר הגרמנית (SFB1279).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-הקסדקןמרק KGaA8220640500
רשת 200 נחושת עם מוטות מקביליםפלאנו GmbHG2014C
37 & deg; תא ייבוש CBinder GmbH9010-0323
אצטוןVWR אינטרנשיונל GmbH20066330
DDSAמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים13710
סכין יהלוםדיאטום בע"מhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים13600
שרף מוטמע-812מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים14900
כלי אלקטרומגנטיTVIPS GmbHתוכנת TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
אתנול 100%מרק KGaA1.00983.2511
נייר פילטרVWR אינטרנשיונל GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR אינטרנשיונל GmbH548-0625
פורמווארמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15830-25
יחידת הקפאה Leica EM AFS2לייקה מיקרוסיסטמס GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
גלוד סול 25 ננומטרAURION Immuno Gold Reagent & אביזרים425.011
אורן זהב ואוסלאש; 2000 ו-mu; mשירותי המדע GmbHGA2000-AU
Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupferפלאנו GmbHNH6C
פלטת חימוםMEDAX GmbH & פלוגה KG12501
מערכת אידוי בוואקום גבוה BAF 300BAL-TEC AG
מקפיא בלחץ גבוה Wohlwend HPF Compact 01משרד ההנדסה M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
מיכל חנקן נוזליH.Erben GmbH94500
חנקן (נוזל)VWR אינטרנשיונל GmbH-
NMAמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים19000
טטרוקסיד אוסמיוםChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
תנור 120 ומעלות גבוה; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-Glowטד פלה, בע"מ.91000
פולי-אל-ליסין 0.1% ללא ערך AQ. פתרוןטד פלה, בע"מ.18026
צינורות נעילה בטוחים 0.5 מ"לאפנדורף SE0030 121.023
מיכלי דגימות (קפסולות ביים)פלאנו GmbHG360-1
קוטר דיסק ספיר. 3 x 0.16 מ"ממשרד ההנדסה M. Wohlwend GmbH500
אולטרהמיקרוטום לייקה EM UC7לייקה מיקרוסיסטמס GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
אצטט אורנילרידל דה הא&אומל; n AG31697
תא אור UVדיניסELG100S

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

STEM

מאמרים קשורים