מאמר שיטה

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

826 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68569

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

במאמר זה

סיכום

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

תקציר

מיוזה היא חלוקה תאית, חיונית לרבייה מינית. במהלך פרופאזה מיוטית, כרומוזומים הומולוגיים ממוצא אימהי ואבהי מזהים זה את זה ומתקשרים, תהליך שמקל על ידי תנועותיהם המהירות בנוקלאופלזמה. תנועות פרופאזה מיוטיות מסתמכות על הצמדת הכרומוזומים למעטפת הגרעין ועל כוחות ציטופלזמיים המועברים לכרומוזומים דרך המעטפת הגרעינית. בצמחים, הנגישות והשבריריות המוגבלת של מיוציטים זכריים בתוך האנתרים הופכים גישות הדמיה חיה וניתוח תנועת כרומוזומים למאתגרים מבחינה טכנית. אכן, תנועות אלו מהירות מאוד, וניתוחן מחייב מציאת תנאי הרכישה האופטימליים. כאן, מתוארת שיטה יעילה ללכידת תנועות כרומוזומים מהירות במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב-Arabidopsis thaliana, בסרטי זמן-lapse, על ידי מעקב אחר תנועות של צנטרומרים מתויגים פלואורסצנטיים. הוא מבוסס על נתיחה ורכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), בתלת מימד ולאורך זמן. רכישת ערימות z מיוטיות כל 7 שניות מאפשרת רזולוציה מספקת לשחזור וניתוח המסלולים של צנטרומרים מתויגים. הנתונים שחולצו מעובדים לאחר מכן, ומאפשרים ניתוח כמותי של תנועות כרומוזומליות אלה. פיתוח מודלים מנתונים אלה חיוני להבנת מנגנון התנועה המהירה של הכרומוזומים, כולל אופי ועוצמת הכוחות המניעים תהליך זה.

מבוא

מיוזה היא תהליך ביולוגי בסיסי המבטיח העברה נאמנה של חומר גנטי מדור לדור. תהליך המיוזה מחולק לשני סבבים רצופים של חלוקת תאים, מיוזה I ומיוזה II. לפני מיוזה I קדם פרופאזה ארוכה שבמהלכה כרומוזומים הומולוגיים מזהים זה את זה ומזדווגים. במהלך הפרופאזה המורחבת הזו מתרחשים תהליכים ביולוגיים רבים. מלבד זיווג הכרומוזומים ההומולוגיים, כרומוזומים אלה עוברים גם תהליך הנקרא סינפסה. סינפסה כרוכה בהיווצרות קומפלקס חלבוני המכונה קומפלקס סינפטונמלי, המחבר את הכרומוזומים ההומולוגיים לאורכם. הקומפלקס הסינפטונמלי מקדם רקומבינציה הומולוגית, ואחריה חילופי חומר גנטי בין כרומוזומים הומולוגיים והיווצרות הצלבות. אלה יוצרים קשר פיזי בין כרומוזומים הומולוגיים, מה שמקל על יישור נכון שלהם והפרדה מאוזנת 1,2.

במהלך זיהוי כרומוזומים הומולוגי, ידוע כי תנועות כרומוזום פרופאזה מהירות (RPM) ממלאות תפקיד מכריע. מחקרים שנערכו בכמה מיני מודל הראו שבמהלך הלפטוטן, כרומוזומים מתחברים למעטפת הגרעין (NE). הם מחוברים לשלד הציטופלזמי דרך ה- NE, באמצעות קומפלקס החלבון LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton)3. הכוחות הנוצרים בציטופלזמה מועברים לכרומוזומים דרך קומפלקס LINC, ומאפשרים תנועת כרומוזומים.

חקר הסל"ד חיוני להבנת המנגנונים הבסיסיים של מיוזה, במיוחד אלה המעורבים בזיהוי כרומוזומים הומולוגיים. עם זאת, חקר התנועות האלה דורש ניסויי הדמיה חיים ספציפיים. רוב מחקרי ההדמיה החיה ב- A. thaliana מתמקדים ברקמות סומטיות ואיברים צמחיים. מחקרים אלה נערכו כדי לקבוע כיצד תאים מולידים איברים4. מחקרים כאלה נערכו על מריסטמים5ושורשים6. לאחרונה, כמה צוותים פיתחו טכניקות לתצפית על התפתחות פרחים, כולל מיוזה, בזמן אמת ב-A. thaliana לאורך תקופות של מספר ימים 7,8. עם זאת, פרוטוקולים אלה יכולים להיות גם תובעניים וקשים להגדרה עבור מספר רב של דגימות.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיית תאים חיים וניתוח דינמיקת כרומוזומים במהלך מיוזה ב - A. thaliana. באמצעות שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, טכניקה פשוטה להכנת דגימה, בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי של כרומוזומים, תנועת הכרומוזומים נלכדה ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה על פני פרקי זמן קצרים. הפרוטוקול מתאר את הכנת רקמת הצמח להדמיה, אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה כדי למזער פוטוטוקסיות ולמקסם את איכות התמונה, כמו גם עיבוד תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של דינמיקת הצנטרומר במהלך מיוזה, שהיא חיונית להבנת התנהגות הכרומוזומים העומדת בבסיס היווצרות גמטות מוצלחת. לידע זה יש השלכות ישירות על החקלאות, במיוחד בשיפור תוכניות גידול יבולים על ידי הקלה על חקר תהליכי זיווג כרומוזומים ורקומבינציה המשפיעים על פוריות ומגוון גנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה משתמש בצמחי A. thaliana טרנסגניים המבטאים טרנסגנים GFP-CENH3 ו-NUP54-RFP 9,10. סמן CENH3 מאפשר לעקוב אחר תנועת הצנטרומרים. סמן NUP54 מסמן את הנקבוביות הגרעיניות ובכך עוזר להבחין בגרעין. ניתן להשתמש בסמנים אחרים, אך אלה חייבים להיות עמידים בפני פוטוהלבנה מכיוון שהדגימה מוארת ברציפות. כדי להבטיח שהסמן לא יעבור פוטו-הלבנה, בצע את הניסוי באותם תנאי לייזר ופרמטרי רכישה, ובדוק שהאות נשאר יציב לאורך כל רכישת התמונה. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול ותרבות צמחים

  1. זרעו זרעים ישירות בעציצים בחממה.
  2. מניחים את העציצים בחממה בתנאים הבאים: 16 שעות יום/8 שעות לילה, 20 מעלות צלזיוס, 70% לחות.
  3. אפשר לצמחים להתפתח בחממה למשך כ -4 שבועות. צמחים חייבים להגיע לשלב שבו יש להם 5/6 גבעולי פרחים (ראו איור 1A).

2. ניתוח אנתרים והכנת שקופיות

  1. הכינו שקופית זכוכית, הניחו מרווח (דבק דו צדדי עם ניקוב בקוטר 9 מ"מ, עומק 0.12 מ"מ) במרכזו, והקפידו להסיר את סרטי המגן מכל צד. מרווח זה יחזיק את הדגימה וייצור רווח בין המגלשה לכיסוי.
  2. הפקידו 8 מיקרוליטר מי ברז במרכז המרווח.
  3. בעזרת מלקחיים, בחרו תפרחת מאחד הגבעולים העיקריים (ראו איור 1B) (אל תשתמשו בתפרחות קטנות מהגבעולים המתהווים).
  4. הניחו את התפרחת על שקופית חדשה מתחת לסטריאומיקרוסקופ המצויד בסרגל. בחר ניצני פרחים באורך של כ-0.5 מ"מ (איור 1C).
  5. בעזרת מחטים חדות, פתחו בעדינות את הניצנים, פרקו את עלי הגביע ועלי הכותרת כדי לשמור רק על האנתרים. הקפד לא לפגוע באנתרים ולא לתת להם להתייבש.
  6. העבירו בעדינות את צרורות האנתר למים בחלל המרווח. כדי למנוע התייבשות, עשו זאת מיד לאחר הסרת הגביעים ועלי הכותרת.
  7. הפקידו כמה צרורות אנתר בתוך חלל המרווח.
  8. מכסים את השקופית בכיסוי, והימנעו מבועות אוויר. לשם כך, הוסף 8 מיקרוליטר מים על כיסוי והפוך בזהירות את הכיסוי עם טיפת המים על חלל המרווח. ודא שצרורות האנתר טובלים בסך הכל ב-16 מיקרוליטר מים וכיסוי הכיסוי מודבק היטב למרווח (ראה איור 1D; איור 2).

3. תצפית זמן-lapse במיקרוסקופיה קונפוקלית - הגדרת הדמיה

הערה: הדרך להגדיר את פרמטרי ההדמיה תלויה במערכת הקונפוקלית שבה נעשה שימוש. להתייחסות נוספת לפרמטרי ההדמיה, עיין בסעיף דיון . התמונות נרכשו באמצעות CLSM ועדשת טבילה במים פי 20. שימוש במטרת טבילה במים מספק התאמה טובה יותר של מקדם השבירה, מכיוון שהדגימה הביולוגית מותקנת במים.

  1. הגדר את המיקרוסקופ על ידי GFP מרגש ב-488 ננומטר וזיהויו עם גלאי היברידי בין 494 ננומטר ל-547 ננומטר.
    הערה: רווח ההיסט של הגלאי ההיברידי הוגדר ל-100. RFP נרגש ב-561 ננומטר ומזוהה עם גלאי היברידי בין 584 ל-629 ננומטר. רווח הקיזוז של הגלאי ההיברידי נקבע ל-130. מהירות הסריקה היא 400 הרץ, והסריקה היא דו-כיוונית. מוחל ממוצע קו של 2. שני הערוצים נרכשו בו זמנית כדי למזער את זמן הרכישה. עוצמת הלייזר נקבעה ל-15% עבור לייזר 488 ננומטר ו-30% עבור לייזר 561 ננומטר.
  2. מקם את האנטר באמצעות תאורת שדה בהיר.
  3. בעזרת ערוץ השדה הבהיר, קבע את השלב המיוטי על סמך צורת התאים.
    הערה: דרגות זיגוטן או פצ'יטן נדרשות כדי לצפות בסל"ד. וריאציה של המיקוד לאורך ציר ה-Z מאפשרת הערכה של הצורה התלת-ממדית של התא. בשלב הלפטוטנן, מיוציטים מציגים צורה מרובעת מובהקת, והגרעין ממוקם במרכז הגרעין, מה שהופך אותם לניתנים לזיהוי בקלות. במהלך שלבי הזיגוטין והפצ'יטן, מיוציטים מתחילים לאמץ צורה טרפזית, והגרעין נודד לעבר המעטפת הגרעינית. בשלב הדיפלוטן, מיוציטים מציגים מורפולוגיה מעוגלת לחלוטין10.
  4. דמיין את האנטר בתוכנה. אות ה-RFP הוא גם אינדיקטור טוב לשלב המיוטי של התאים.
    הערה: מיוציטים בשלב הזיגוטנ/פצ'יטן מציגים תיוג NUP54 בצורת סהר, המתאים למקבץ של נקבוביות גרעיניות בטריטוריה מוגבלת של ה-NE בשלבים אלה (איור 3A). במידת הצורך, סובב את האנטר כך שהוא יהיה ממוקם אופקית (ראה איור 3).
  5. הגדר גודל תמונה של 400 פיקסלים על 150 פיקסלים, עם זום דיגיטלי של 4, המרכז את התמונה בתמונה.
  6. הגדר את עובי הדגימה שיש לצלם על מנת להשיג כמה שיותר מיוציטים שלמים. עם זאת, חשוב להגביל את מספר פרוסות ה-z כדי למזער את זמן הרכישה. בעובי של 15 מיקרומטר מייצרים 16 פרוסות z. ערימות Z נרכשו בגודל צעד של 1.04 מיקרומטר.
  7. על מנת לבצע רכישות רציפות, הגדר את מרווח הזמן לאפס בקטע הזמן . עם המיקרוסקופ והפרמטרים שתוארו לעיל, זמן הרכישה של 16 פרוסות הוא כ-6-8 שניות. משך הרכישה המינימלי הוא 2 דקות, אך הוא יכול להגיע עד 20 דקות.
  8. התחל את הרכישה.

4. ניתוח תמונה - מעקב אחר תנועת צנטרומר

הערה: שחזור תנועות הצנטרומר דורש תוכנת ניתוח תמונה המסוגלת לעקוב אחר תנועה תלת מימדית. התוכנה תקצה אובייקט לאות פלואורסצנטי, על סמך הפרמטרים שהוגדרו, בכל זמן רכישה. לאחר מכן, כלי המעקב מנתח באופן אוטומטי עצמים נעים ויוצר עלילת שושלת.

  1. עיבוד מקדים של תמונה
    1. כדי להקל על ניתוח התנועות, בצע עיבוד תמונה לאחר הרכישה. לדוגמה, ניתן להשתמש בתהליך חילוץ מידע אדפטיבי (אלגוריתם דה-קונבולוציה) כדי לחשוף מבנים ופרטים עדינים ולשפר את איכות התמונה.
  2. מעקב אחר צנטרומר גלובלי
    1. עקוב אחר כל הצנטרומרים של התמונה: השתמש במודול נקודתי כדי לעקוב באופן אוטומטי אחר כתמים (לאורך זמן).
    2. בחר את ערוץ המקור, ירוק במקרה זה. ציין את קוטר ה-XY, 1 מיקרומטר, עבור הצנטרומר המסומן GFP-CENH3. זיהוי אובייקטים מזהה את כל האובייקטים בתמונה (איור 3B).
    3. שנה את איכות הזיהוי על סמך עוצמת האות באמצעות הגרף בתחתית חלון הבקרה.
    4. השתמש באלגוריתם מעקב תנועה אוטו-רגרסיבי כדי לעקוב אחר המסלולים (איור 3C). הדמיה של כל המסלולים מקלה על זיהוי מיוציטים מרקמות סומטיות (וידאו 1).
  3. מעקב אחר צנטרומרים במיוציט בודד
    הערה: באמצעות תוכנת הדמיה תלת מימדית, בדוק את הגרעינים ואת המסלולים, ונתח רק גרעינים שלמים ולא נחתכו בשום שלב במהלך הרכישה. ניתוח מיוציט גזום מביא לנתונים שגויים.
    1. מעקב צנטרומר אוטומטי
      הערה: בעת ניתוח גרעין בודד, התהליך מופעל מחדש מההתחלה.
      1. השתמש במודול הספוט כדי לעקוב אחר כתמים (לאורך זמן) בגרעין שנבחר, תוך הגדרת אזור עניין (ROI) תואם באמצעות האפשרות פלח רק אזור עניין ועקוב אחר נקודות (לאורך זמן).
      2. בחר החזר ROI הכולל כראוי את הגרעין בכל שלושת הממדים ולאורך זמן. (איור 4A).
      3. השתמש באותם פרמטרים כמו עבור כל האנתר עבור זיהוי צנטרומר (איור 4B) ומעקב (איור 4C).
      4. בתרשים שושלת (איור 4F), כל המסלולים מסומנים. ניתן להסיר את המסלולים מחוץ למיוציט המנותח (איור 4C). בחר את הרצועות ומחק אותן באמצעות מקש Delete במקלדת. ניתן לזהות אותם בקלות באמצעות מציג התלת מימד של התוכנה.
    2. תיקון מעקב צנטרומר ידני
      הערה: ברוב המקרים, יש לתקן את המסלולים באופן ידני מכיוון שתוכנת מעקב אינה יכולה להבדיל בין צנטרומרים קרובים מדי זה לזה.
      1. השתמש במצב עריכה כדי למחוק או להוסיף אובייקט. ודא שהאובייקט נוסף במישור הנכון.
      2. חבר ידנית את האובייקטים החדשים במצב עריכת רצועות באמצעות עלילת השושלת, לאחר ניתוח אישי זהיר ויסודי של התא בתלת מימד. איור 4E,G מציג את המסלולים המתוקנים על תמונת המיוציט ועל העלילה הליניארית, בהתאמה. סרטון 2 מראה את המסלולים של מיוציט אחד לאחר התיקון.
      3. ייצוא נתונים
        1. ייצא את נתוני המעקב לתבנית תוכנית גיליון אלקטרוני כדי להקל על עיבוד וניתוח נתונים נוספים. קבצים אלה מכילים טבלאות מדידה הנובעות מהמעקב שבוצע באמצעות התוכנה.
        2. ודא שקובץ הגיליון האלקטרוני המיוצא מכיל את המשתנים הבאים: זמן, המתעד את נקודת הזמן של כל מדידה; מזהה מסלול, המזהה באופן ייחודי כל רצועה; תזוזה דלתא X, Y, Z, המייצגת את השינוי במיקום בתלת מימד בכל נקודת זמן; ו-Position X, Y, Z, המאחסן את המיקום המוחלט של כל אובייקט במרחב.

5. ניתוח נתונים

הערה: חלק זה מתאר את זרימת העבודה של ניתוח הנתונים באמצעות סקריפטים R11 שבוצעו ב-RStudio12. ניתן לאחזר אותם ממאגר הנתונים INRAE בכתובת: 10.57745/V1NNFI. כל הנתונים נוצרים באמצעות ggplot213 כדי להמחיש את המדדים המחושבים. קבצי ה- Script מבצעים ברצף את השלבים הבאים: תצורת המשנה של meiomove. סקריפט R מבוצע תחילה כדי לאתחל את סביבת R, לטעון את הספריות הנדרשות ולהגדיר משתנים גלובליים. הקישור לתסריט הוא: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. קריאה ובחירה של נתונים
    הערה: הסקריפט שבו יש להשתמש מאוחסן בתור: meiomove-sub-loader.R."
    1. אסוף את כל קבצי האקסל הבודדים המכילים נתוני מעקב ומזג אותם לקובץ מאוחד אחד.
    2. שמור את הקובץ הממוזג בפורמט TSV (ערכים מופרדים בכרטיסיות) כדי להבטיח תאימות לשלבי עיבוד נתונים נוספים.
    3. חשב את מיקומי x, y, z על ידי צבירת ערכי התזוזה לאורך זמן, והבטח שהמסלול המרחבי של כל אובייקט במעקב משוחזר בצורה מדויקת. זה נעשה כדי לפצות על באג בתוכנה שייצא מיקומי XYZ שגויים.
  2. ניקוי נתונים
    הערה: הסקריפט שבו יש להשתמש מאוחסן כ: meiomove-sub-clean.R."
    1. הסר רצועות קצרות, המוגדרות ככאלה עם משך מינימלי של 50 שניות. רצועות אלו אינן מכילות מספיק נקודות נתונים לניתוח משמעותי, מכיוון שהן עלולות להכניס רעש או אי דיוקים.
    2. זהה ומחק מסלולים שבהם המיקום (X, Y, Z) נשאר קבוע לאורך זמן, מכיוון שהם מצביעים על חפצים או מבנים סטטיים שאינם רלוונטיים לניתוח.
    3. סנן ערכי תזוזה חסרים (ערכי NA) כדי להבטיח את תקינות הנתונים ולהימנע משגיאות חישוביות בשלבים מאוחרים יותר.
    4. זהה ומחק רצועות שבהן ערכי התזוזה המתקבלים מתוכנת ניתוח תמונות שונים באופן משמעותי מאלה שחושבו מחדש, מה שמבטיח עקביות ואמינות בנתוני המעקב.
  3. תיקון סחיפה של תאים מיוטיים
    הערה: הסקריפט שבו יש להשתמש מאוחסן גם בשם: meiomove-sub-clean.R."
    1. קחו בחשבון סחיפה אפשרית במהלך הרכישה על ידי הבחנה בין צנטרומרים מיוטיים וסומטיים. שלב זה מבטיח שהתנועות הנצפות תואמות לתהליכים ביולוגיים ולא לחפצים ניסיוניים.
    2. החל תיקון סחיפה על ידי התאמת מיקומי התאים המיוטיים ביחס לתאים הסומטיים, המשמשים כהתייחסות יציבה.
  4. הפקת פלט
    הערה: הסקריפט שבו יש להשתמש מאוחסן בתור: meiomove-sub-metrics.R."
    1. חשב את המהירות המיידית בכל שלב זמן כדי לעקוב אחר שינויים במהירות התנועה לאורך זמן.
    2. חשב את זווית הסיבוב, המייצגת את השינוי בכיוון התנועה בין צעדי זמן עוקבים, ומספק תובנות לגבי דפוסי מסלול. התוצאה מאוחסנת כ: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (פלט 1).
    3. חשב את יחס החשיפה באמצעות celltrackR14, המכמת כמה רחוק אובייקט במעקב נע ביחס למיקום ההתחלה שלו, ונותן אינדיקציה להתנהגות חקרנית. התוצאה מאוחסנת כ: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (פלט 2).
    4. חשב את המהירות הממוצעת עבור כל מסלול בודד כדי לסכם את מאפייני התנועה לאורך כל תקופת התצפית. חשב את זווית הסיבוב הממוצעת לכל מסלול כדי לנתח את כיווניות התנועה הכוללת ודפוסי ההתנהגות. התוצאה מאוחסנת כ: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (פלט 3).
    5. קבע את המיקום המרכזי בכל שלב זמן עבור כל מסלול תאים. הצנטרואיד הוא הממוצע של מיקומי הצנטרומר במיוציט נתון.
    6. חשב את גודל הצנטרואיד בכל שלב זמן, המספק מדד לפיזור המרחבי של צנטרומרים סביב מיקומם הממוצע. וריאציות של גודל הצנטרואיד לאורך זמן נותנות מידע על עקביות גלובלית על פני מסלולי צנטרומר. התוצאה מאוחסנת כ: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (פלט 4).
    7. חישוב מתאם צולב מהירות כדי לנתח קשרים בין דינמיקת התנועה של אובייקטים שונים במעקב, לחשוף התנהגויות מתואמות פוטנציאליות. התוצאה מאוחסנת כ: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (פלט 5).
    8. חשב את התזוזה הריבועית הממוצעת (MSD) עבור כל מסלול, מדד מפתח המכמת את המרחק הריבועי הממוצע שעוברים צנטרומרים במרווחי זמן נתונים (פיגורי זמן) כדי לאפיין את סוג התנועה.
      הערה: על ידי בחינת האופן שבו ה-MSD מתפתח עם פיגור זמן הולך וגדל, ניתן להסיק אם התנועה היא בעיקר דיפוזית או מוגבלת, ובכך לספק תובנה לגבי ההתנהגות הדינמית הבסיסית. התוצאה מאוחסנת בתור: results/dataframes/metrics-msd.tsv (פלט 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פותח פרוטוקול מהיר להמחשת תנועות כרומוזומים במהלך הפרופאזה של מיוזה ב-Arabidopsis thaliana, המאפשר רכישות מרובות של זמן-lapse ובכך ניתוח של מערך נתונים גדול. מיוציטים המבטאים סמן GFP, המאפשר הדמיה של צנטרומרים, וסמן RFP, המאפשר הדמיה של הגרעין, מצולמים למשך 4 דקות בעקבות הפרוטוקול המתואר.

פרמטרי הרכישה המשמשים בפרוטוקול המתואר כאן עברו אופטימיזציה כדי להשיג רזולוציה מרחבית וזמנית מספקת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר הדמיה in vivo וניתוח של תנועת צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית ב-Arabidopsis thaliana. ניתן ליישם פרוטוקול זה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף או הפוך, מה שהופך אותו לנגיש לרוב המעבדות המצוידות בטכנולוגיה קונפוקלית. למרות שמערכות קונפוקליות משתנות במהירות הסריקה, הרגישות, הגלאים והיכולת להפריד בין אורכי גל, ניתן להתאים את פרמטרי הרכישה לקבלת תמונות ברזולוציה זמנית ומרחבית טובה. הבחירה בחלבונים פלואורסצנטיים יכולה להשתנות גם10, א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נהנתה מתמיכת הפלטפורמות הטכנולוגיות של מצפה הצמחים של מכון ז'אן-פייר בורגן PO-Plants ו-PO-Cyto. מחקר זה מומן על ידי ה-ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042 : M.G., P.A., L.C., S.L., ו-DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). המכון ז'אן-פייר בורגן נהנה מתמיכת Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קרקע רבייהTREF (ג'יפי)101820/02227861
מיקרוסקופ קונפוקלילייקהTCS SP8 AOBS (מפצל קרן אקוסטו-אופטי)
תוכנה קונפוקליתלייקהתוכנת LAS X 3.5.0.18371
כיסויי כיסויפול מריאנפלד GmbH10705222x22 מס' 1,5H
מלקחייםאידיאל-טק4.SA.0פינצטה מדויקת
GFP:CENH3ראווי ואח' 2010זרעי Arabidopsis thaliana משמשים כאן
ggplot2  ggplot2: גרפיקה אלגנטית לניתוח נתונים  Reference13https://ggplot2.tidyverse.org
ידית למחטיםהממאכרידית ללולאה, אורך 170 מ"מ
אימאריסכלי אוקספורדאימאריס 9.7.2ניתוח תמונה - מודול "Spot"
עדשהלייקהHC PL APO CS2 20× ;/0.75 IMM
ברקלייקהדה-קונבולוציה אדפטיביתחילוץ מידע חכם אוטומטי מנתוני קונפוקליים
אורותVEGELEDאפולו LL252-Gen2
מחטיםווטקינס & דונקסטרפיני E3 בגודל 0.0124" (.31 מ"מ) x 25 מ"מ
NUP54:RFPקרומר ואח' 2024זרעי Arabidopsis thaliana משמשים כאן
סיריםטקו (פופלמן)VDF 7x7x6.5 ס"מ
Rצוות RCoreR: שפה וסביבה לסטטיסטיקה   מחשוב. קרן R למחשוב סטטיסטי, וינה, אוסטריה.  מקור11https://www.R-project.org/  
Rstudioצוות פוזיט  RStudio: סביבת פיתוח משולבת עבור R. Posit Software, PBC, בוסטון, מסצ'וסטס. Reference12http://www.posit.co/
שקופיותזכוכית סריגה10000326x76x1.0 מ"מ
ספייזריםתרמו-פישרספייסר Secure-Seal, 8 בארות, קוטר 9 מ"מ, עומק 0.12 מ"מחתך כל מרווח בנפרד
סטריאומיקרוסקופיםניקוןSMZ800

מקורות

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: Integrating structure and function. Annu Rev Genet. 33 (1), 603-754 (1999).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances between homologs. Annu Rev Genet. 57 (1), 1-63 (2023).
  3. Kim, H. J., Liu, C., Dernburg, A. F. How and why chromosomes interact with the cytoskeleton during meiosis. Genes (Basel). 13 (5), 901(2022).
  4. Harline, K., Roeder, A. H. K. An optimized pipeline for live imaging whole Arabidopsis leaves at cellular resolution. Plant Methods. 19 (1), 10(2023).
  5. Prunet, N. Live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers. J Vis Exp. (122), e55156(2017).
  6. Peng, Z., Jiao, Y., Wang, Y. Live imaging of Arabidopsis shoot primordia via a confocal laser scanning microscope. STAR Protoc. 4 (2), 102217(2023).
  7. Prusicki, M. A., et al. Live cell imaging of meiosis in Arabidopsis thaliana. eLife. 8, e42834(2019).
  8. Valuchova, S., et al. Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy. ELife. 9, e52546(2020).
  9. Ravi, M., Chan, S. W. L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature. 464 (7288), 615-618 (2010).
  10. Cromer, L., et al. Rapid meiotic prophase chromosome movements in Arabidopsis thaliana are linked to essential reorganization at the nuclear envelope. Nat Commun. 15 (1), 5964(2024).
  11. R: A language and environment for statistical computing. , at https://www.R-project.org/ (2021).
  12. RStudio: Integrated development environment for R. , at http://www.posit.co/ (2025).
  13. Wickham, H. Data Analysis. ggplot2. , 189-201 (2016).
  14. Wortel, I. M. N., et al. CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data. Immunoinformatics. 1 - 2, 100003(2021).
  15. Lee, C. -Y., et al. Mechanism and regulation of rapid telomere prophase movements in mouse meiotic chromosomes. Cell Rep. 11 (4), 551-563 (2015).
  16. Nozaki, T., Weiner, B., Kleckner, N. Rapid homologue juxtaposition during meiotic chromosome pairing. Nature. 634 (8036), 1221-1228 (2024).
  17. Fang, Y., Spector, D. L. Centromere positioning and dynamics in living Arabidopsis plants. Mol Biol Cell. 16 (12), 5710-5718 (2005).
  18. Arpòn, J., Gaudin, V., Andrey, P. A method for testing random spatial models on nuclear object distributions. Plant Chromatin Dynamics: Methods and Protocols. 1675, 493-507 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים