הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיתל פיגמנט רשתית ראשוני של עכבר שהועבר על ידי RNA Alu: מודל רלוונטי פתולוגית במבחנה לניוון מקולרי הקשור לגיל

559 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את התהליך המלא של הקמת מודל רלוונטי לפתולוגיה לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוני (RPE) של עכבר באמצעות טרנספקציה של Alu RNA.

תקציר

ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), במיוחד AMD שאינו אקסודטיבי, דורש מודלים ניסיוניים המשכפלים טוב יותר את הפתולוגיה האנושית. מודלים נוכחיים in vivo נותרו תובעניים מבחינה טכנית ודורשים זמן רב, בעוד שמערכות קונבנציונליות במבחנה אינן מצליחות לסכם טריגרים פתולוגיים ספציפיים למחלה. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת מודל ניוון אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) באמצעות תאי RPE ראשוניים של עכבר שהועברו עם Alu RNA, רטרוטרנספוזון המעורב ישירות בפתולוגיה של אטרופיה גיאוגרפית.

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד האנזימטי של תאי RPE ראשוניים של עכבר, ואחריו טרנספקציה של Alu RNA כדי לגרום לניוון RPE. אימות משלב מורפולוגית (ארכיטקטורה משושה), פונקציונלית (אובדן קוטביות והפרעה בחלבון עכבר ZO-1) וניתוח מולקולרי (PCR כמותי). כתוצאה מכך, ראינו שינויים רב-פקטוריאליים המופעלים על ידי טרנספקציה של Alu RNA: הפרשת ציטוקינים דלקתיים (גנים של עכברים Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0.05) והזדקנות תאית (גנים של עכברים p21 ו-p53 upregulation; p < 0.05). בהשוואה למודלים מסורתיים של מתח אקוטי, מערכת זו מסכמת מפלים דלקתיים-ניווניים כרוניים של AMD באמצעות טכניקות סטנדרטיות, ומבטיחה שחזור. על ידי שילוב היבטים של מבחנים פשוטים במבחנה ומודלים מורכבים in vivo, גישה זו יכולה לשמש פלטפורמה ראשונית לחקר מנגנונים מונעי רטרוטרנספוזון וסינון מועמדים טיפוליים פוטנציאליים.

מבוא

ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא גורם עיקרי לליקוי ראייה עולמי. עם זאת, טיפולים יעילים ל-AMD שאינו אקסודטיבי נותרו מוגבלים. לפיכך, יש צורך דחוף במודלים מחקריים יעילים וניתנים לשחזור כדי לחשוף מנגנוני מחלה ולזהות מטרות טיפוליות 1,2. מרכזי במאמץ זה הוא אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE), חד-שכבתי הממוקם בין קרום ברוך (כורואיד) לקולטני האור (רשתית), הממלא תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס ברשתית על ידי תמיכה בתפקוד קולטני האור, ויסות מחסום הדם-רשתית והקלה על פינוי פסולת 3,4.

תפקוד לקוי או אובדן של תאי RPE הוא מאפיין בולט של מחלות ניווניות רבות ברשתית, במיוחד ב-AMD, כאשר תפקוד לקוי של RPE מייצג שלב מוקדם וקריטי בהתקדמותו 2,4,5. יש לציין כי בחולים המפגינים ניוון גיאוגרפי (GA), השלב המתקדם של AMD, רמות מופחתות של האנזים לעיבוד מיקרו-RNA Dicer 1 ribonuclease III (DICER1) גורמות להצטברות רעילה של Alu RNA, תעתיק רטרוטרנספוזון הקשור ישירות לניוון RPE ומעורב בפתולוגיה אנושית6.

מודלים מסורתיים in vivo, כגון מודל נתרן יודאט (NaIO3) ומודל עמילואיד-β (Aβ), שומרים על מורכבות המחלה המערכתית אך מתמודדים עם מגבלות קריטיות. מודל NaIO3 גורם במהירות למתח חמצוני ברשתית ולנזק ל-RPE, עם זאת, הרעילות החריפה שלו משבשת הן את ה-RPE והן את קולטני האור, ואינה מצליחה לחקות את ההתקדמות הכרונית הקשורה לפתולוגיה של AMD ומטשטשת את ההערכה הטיפולית של תפקוד לקוי עדין של RPE7. באופן דומה, מודל Aβ מציג גורמי לחץ ספציפיים למחלה אך דורש מומחיות טכנית נרחבת ולוחות זמנים ממושכים בהשוואה לגישות במבחנה 8,9. מודלים קונבנציונליים של RPE במבחנה, כמו H2O2 ומודלים של חשיפה להידרוקינון, לעומת זאת, חסרים רלוונטיות פתולוגית, ואינם מצליחים לסכם גורמי לחץ ספציפיים למחלה כגון אגרגטים של חלבונים רעילים או טריגרים דלקתיים1.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט להקמת מודל ניוון RPE בתאי RPE ראשוניים של עכבר באמצעות Alu RNA, RNA שאינו מקודד שמקורו ברטרוטרנספוזון המעורב ישירות בפתוגנזה של GA6. Alu RNA מפעיל מסלולים דלקתיים ופוגע בשלמות מחסום RPE10,11, ובכך מחקה את המאפיינים הפתולוגיים הקשורים ל-AMD שאינו אקסודטיבי. שיטה זו משתמשת בבידוד אנזימטי ותרבית של תאי RPE, ולאחר מכן אינדוקציה של ניוון RPE באמצעות Alu RNA. בנוסף, אנו מספקים מערכת אימות מקיפה, המשלבת קריאות מורפולוגיות (ארכיטקטורה משושה), פונקציונליות (שלמות מחסום ואובדן קוטביות) ומולקולריות (סמני דלקת והזדקנות) כדי להעריך את מודל הניוון הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים הכללי בשנחאי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג. פרוטוקול זה עוקב בקפדנות אחר התקנות לניהול עניינים הנוגעים לבעלי חיים ניסיוניים (שהונפקו על ידי הוועדה הממלכתית למדע וטכנולוגיה) וההנחיות לשימוש אתי בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה שנקבעו על ידי האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO). עיין בטבלת החומרים לפרטים נוספים הקשורים לחומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. בידוד תאי RPE ראשוניים של עכבר

  1. הכנת צלחות מצופות
    1. לדלל מטריג'ל ביחס של 150 מיקרוליטר מטריג'ל ל-13 מ"ל DMEM/F12 (ריכוז סופי כ-1.14%).
    2. מצפים באופן שווה את תחתית הצלחת במטריג'ל המדולל (כ -150 מיקרוליטר לצלחת של 48 בארות). יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ליצירת ג'ל.
  2. הכנת פתרון
    1. הכן את מצע תרבית ה-RPE השלם באמצעות תערובת F-12 (DMEM/F12) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. הכן תערובת פפאין על ידי הוספת 4.5 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) לבקבוקון פפאין (100 יחידות לבקבוקון).
    3. הכן את DNase I Mix על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של EBSS לבקבוקון DNase I (1,000 יחידות לבקבוקון).
    4. הכן תמיסת עיכול פפאין על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של DNase I Mix ל-4.5 מ"ל של תערובת פפאין (התאם את הפרוטוקול שסופק על ידי הספק כדי להשיג ריכוז פפאין סופי של 22 IU/mL), מה שהופך את הנפח הסופי ל-4.75 מ"ל.
  3. המתת חסד ואיסוף רקמות
    1. המתת חסד של עכברים בני 2-3 שבועות באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 5% נתרן פנטוברביטל במשקל גוף של 150-200 מ"ג/ק"ג. אשר הרדמה עמוקה ומוות על ידי אימות הפסקת פעימות הלב והנשימה.
    2. יש לרסס היטב את אזור העין ב-70% אתנול לפני הוצאתו כדי לחסל מזהמים על פני השטח 12,13,14. לחץ בעדינות על השפה הפריאורביטלית כדי להבליט את הגלובוס. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לחלץ את גלגל העין, תוך שמירה על עצב הראייה לדיסקציה קלה יותר.
      הערה: כל הכלים (למשל, מלקחיים, מספריים) עוברים חיטוי, וההליכים מבוצעים מתחת למכסה זרימה למינרי כדי לשמור על סטריליות.
    3. טבלו את גלגלי העיניים מיד במדיום תרבית RPE שלם סטרילי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
  4. עיכול אנזימטי
    הערה: יש לבצע את כל השלבים, כולל עיכול אנזימטי וההליכים הבאים, מתחת למכסה זרימה למינרי כדי לשמור על סטריליות.
    1. העבירו את גלגל העין לצלחת והשתמשו במלקחיים כדי לחסל את רקמת החיבור הדביקה ואת שאריות השרירים החוץ-עיניים תחת סטריאומיקרוסקופ.
    2. יש לשטוף בעדינות את העיניים פעמיים עם תמיסת מלח פוספט בופר מקוררת מראש של Dulbecco (D-PBS; ללא Ca2+/Mg2+; ב-4 מעלות צלזיוס).
      הערה: שאריות של מדיום תרבית RPE שלם עלולות לפגוע בפעילות האנזימטית של הפפאין.
    3. טבלו את העיניים במלואה ב-1 מ"ל של תמיסת עיכול פפאין ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  5. הפרדת תאי RPE
    1. לאחר העיכול, יש לנטרל את הפעילות האנזימטית עם מדיום תרבית RPE מלא.
    2. העבירו את גלגל העין לצלחת, ותחת סטריאומיקרוסקופ, כרתו את הקרנית, הקשתית והעדשה, ושמרו על העין האחורית.
      הערה: תאי RPE בודדו ונשמרו כיריעות שלמות (במקום להתפרק לתאים בודדים) במהלך כל התהליך.
    3. הפרד את קומפלקס ה-RPE מהכורואיד, ולאחר מכן קלף את שכבת ה-RPE הרחק מהרשתית כיריעות רציפות במדיום תרבית RPE שלם. אוספים את שכבות ה-RPE המנותקות באופן אחיד למצע תרבית RPE שלם וטרי כתערובת ולאחר מכן מגדלים אותן על משטחים מצופים מטריג'ל.
  6. תרבית תאים
    1. זרעו את התערובת בצלחת מצופה מטריג'ל של 24 בארות (8-10 גלגלי עיניים לבאר על הכיסוי, לצביעה חיסונית), צלחת מצופה מטריג'ל עם 48 בארות (6-8 גלגלי עיניים לבאר, עבור qPCR), או צלחת מצופה מטריג'ל של 96 בארות (5-6 גלגלי עיניים לבאר).
    2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2. בצע את שינוי המדיום הראשון לאחר 48 שעות באמצעות מדיום תרבית RPE מלא. החלף את המדיום כל 48 שעות לאחר ההחלפה הראשונה.
      הערה: כדי לשמור על הקוטביות של תאי RPE ככל האפשר, הימנע ממעבר שלהם במידת האפשר, שכן תת-תרבות חוזרת עלולה להוביל לאובדן התמיינות ושלמות תפקודית.
  7. ניטור מורפולוגיה של תאים
    1. אפשר לתאים ליצור שכבה אחת עם מורפולוגיה משושה אופיינית. מעקב אחר מורפולוגיה תחת מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך.

2. אינדוקציה של מודל הניוון RPE

  1. סינתזה ואימות של Alu RNA
    1. לסנתז Alu RNA באמצעות מערכת שעתוק במבחנה .
      הערה: הסינתזה של Alu RNA ששימשה במחקר שלנו התבססה על הפרוטוקול שתואר על ידי מעבדת אמבטי6.
    2. טהר את ה-RNA ואשר את איכותו באמצעות מיקרוספקטרופוטומטר.
  2. טרנספקציה של Alu RNA
    הערה: ייעדנו את יום זריעת תאי ה-RPE הראשוני ליום 0. ביום החמישי, תאי ה-RPE הראשוניים הדבקים הפגינו מורפולוגיה אחידה והגיעו ליותר מ-50% מפגש תאי, ובשלב זה בוצעה טרנספקציה של Alu RNA באמצעות ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני, על פי הנחיות היצרן.
    שתי קבוצות ביקורת נכללו כדי לאמת את התוצאות: 1) בקרה שלילית (NC), שבה לא נוספו Alu RNA ולא מגיב הטרנספקציה ומדיום נמוך בסרום שימש כתחליף; ii) בקרת ליפוזום (LC), שבה הושמט Alu RNA אך אותה כמות של מגיב טרנספקציה עורבבה עם מדיום נמוך בסרום והוחלה על תאים, כדי לשלוט בהשפעות הקשורות לליפופקציה. השלבים הבאים מתארים את הליך טרנספקציה של Alu RNA.
    1. החלף את המדיום הקיים ב-300 מיקרוליטר של מדיום תרבית RPE שלם לבאר (צלחת 48 בארות) לפני הליכי טרנספקציה.
    2. הכן קומפלקסים של טרנספקציה עם Alu RNA וריאגנט מבוסס שומנים קטיוני במדיום סרום נמוך.
      1. הכן תערובת 1 עם 1.2 מיקרוליטר של מגיב על בסיס שומנים קטיוני ו-18.8 מיקרוליטר של המדיום הנמוך בסרום. מערבבים בעדינות (לא מערבולת) ומדגרים אותו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. מכינים ערבוב 2 עם 6 מיקרוליטר של Alu RNA (100 מיקרוגרם/מ"ל) ו-14 מיקרוליטר של מדיום נמוך בסרום.
      3. הכן מתחמי טרנספקציה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של Mix 2 טיפה ל-20 מיקרוליטר של Mix 1.
        הערה: Alu RNA הועבר בריכוז סופי של 0.6 מיקרוגרם לבאר באמצעות 1.2 מיקרוליטר של מגיב מבוסס שומנים קטיוני לבאר (1.2 מיקרוליטר של מגיב: 0.6 מיקרוגרם יחס RNA).
      4. יש לערבב בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, השאירו אותו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. הוסף 40 מיקרוליטר/באר של מתחמי הטרנספקציה לכל באר של צלחת של 24 בארות. הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 למשך 48 שעות.
    4. בצע qPCR, צביעה חיסונית והליכים ניסיוניים אחרים 48 שעות לאחר הטרנספקציה.

3. תיקוף מודל הניוון

הערה: ניסויי אימות מודל מקיפים בוצעו ביום השביעי.

  1. צביעה אימונופלואורסצנטית להערכת קוטביות ושלמות מחסום
    1. תקן תאי RPE מתורבתים עם פורמלדהיד נטול מתנול 4% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו 3 x 10 דקות עם 1x PBS.
    2. חסום קשירה לא ספציפית עם אלבומין סרום בקר 5% (BSA) בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) למשך שעה.
    3. דגירה עם נוגדנים ראשוניים אנטי-ZO1 (דילול של 1:1,000 ב-3% BSA) ופאלואידין 488 (דילול של 1:1,000 ב-3% BSA) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, תוך הימנעות מאור.
    4. שוטפים את התאים 3 x 10 דקות בעדינות עם PBS.
    5. דגירה עם נוגדנים משניים (דילול של 1:1,000 ב-3% BSA) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    6. שטפו את הדגימות 3 x 10 דקות עם 1x PBS.
    7. כתם נגד עם DAPI (דילול של 1:1,000 ב-PBS) למשך 10 דקות.
    8. שטפו את הדגימות למשך 3 x 10 דקות עם 1x PBS.
    9. הסר בזהירות את הכיסוי מצלחת 24 הבארות והנח אותו על מגלשת זכוכית טעונה מראש עם טיפת מדיום הרכבה. צלם תמונות קונפוקליות באמצעות מטרה של 40x/0.95.
  2. PCR כמותי (qPCR) להזדקנות וסמני דלקת
    הערה: גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (גן העכבר Gapdh) שימש כגן הייחוס הפנימי לנורמליזציה של ערכי מחזור סף (Ct). כל תגובות ה-PCR הכמותיות (qPCR) כללו שלושה שכפולים ביולוגיים לכל קבוצת ניסוי. רצפי פריימר מסופקים בטבלה משלימה S1.
    1. מיצוי RNA
      1. הוסף מאגר ליזה (ערכת RNA כוללת) לצלחת התרבות (1 מ"ל לכל שטח פנים של 10 ס"מ) ודגר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 13,400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לשפופרת חדשה ללא RNase.
        הערה: דלג על שלב זה אם הדגימות נקיות מפסולת (למשל, ליזאט תאים שקוף).
      3. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם לסופרנטנט, מערבולת למשך 15 שניות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
      4. צנטריפוגה בטמפרטורה של 13,400 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי העליון (~500 מיקרוליטר) לצינור חדש.
      5. הוסף 0.5 נפחי אתנול לשלב הימי. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג.
      6. טען את התערובת על עמוד קרום סיליקה (כלול בערכת RNA כוללת). צנטריפוגה במשקל 13,400 × גרם למשך 30 שניות. השלך את הזרימה.
      7. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הסרת חלבון (ערכת RNA כוללת) לעמודה. צנטריפוגה במשקל 13,400 × גרם למשך 30 שניות. השלך את הזרימה.
      8. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה (ערכת RNA כוללת) לעמודה. צנטריפוגה במשקל 13,400 × גרם למשך 30 שניות. השלך את הזרימה.
      9. חזור על שלב 3.2 הקודם.
      10. צנטריפוגה את העמוד הריק בטמפרטורה של 13,400 × גרם למשך 2 דקות לייבוש הממברנה.
      11. הסר RNA על ידי הוספת 30-100 מיקרוליטר של מים נטולי RNase לממברנה. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. צנטריפוגה במשקל 13,400 × גרם למשך 2 דקות.
    2. סינתזת DNA משלימה (cDNA)
      1. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר.
        הערה: יחס A260/A280 בין 1.8 ל-2.0 נחשב לקשור לטוהר RNA מקובל.
      2. הכן את תערובת התגובה בשפופרת נטולת RNase: תבנית RNA (500-1,000 ננוגרם): X μL (קשור לריכוז שלה), מאגר שעתוק הפוך פי 5: 4 μL, מים ללא RNase: עד 20 μL.
      3. דגרו את תערובת התגובה במחזור תרמי באמצעות התוכנית הבאה: 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 85 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, והחזקה בלתי מוגבלת ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. qPCR
      1. הכן תערובת מאסטר qPCR לכל תגובה (סה"כ 10 מיקרוליטר): TB Green (כלול ב-Premix Taq): 5 מיקרוליטר, צבע ROX (כלול ב-Premix Taq): 0.2 מיקרוליטר, פריימר קדימה (1 מיקרומטר): 0.2 מיקרוליטר, פריימר הפוך (1 מיקרומטר): 0.2 מיקרוליטר, מים ללא RNase: 3.4 מיקרוליטר, תבנית cDNA: 1 מיקרוליטר.
      2. מוסיפים 10 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של צלחת של 96 בארות.
      3. אטום את הצלחת עם מכסה אופטי דביק. צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך דקה.
      4. הפעל את התוכנית הבאה במערכת PCR בזמן אמת: שלב 1: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; שלב 2: 40 מחזורים של: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; שלב 3: ניתוח עקומת התכה.
      5. חשב את רמות הביטוי היחסיות של mRNAs יעד באמצעות שיטת 2−ΔΔCt 15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי RPE ראשוניים של עכבר לפני טרנספקציה של Alu RNA
ביום 0 (איור 1), תאי RPE ראשוניים של עכבר בודדו והציגו את המורפולוגיה המשושה האופיינית, האופיינית לתאי RPE בריאים. תאים אלה שמרו על שכבה חד-שכבתית מאורגנת היטב. התאים עברו תרבית כדי לאפשר ארגון מבני ראשוני ויצירת צמתים הדוקים, כפי שמעידים הצורה המשושה והגבולות המוגדרים היטב. מורפולוגיה זו שימשה כבסיס לאינדוקציה הבאה של ניוון RPE. שלמות מחסום ה-RPE נשמרה גם בשלב זה, מה שמבטיח שהתאים היו במצב תפקודי לפני ביצוע טרנספקציה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מטרתנו הייתה להקים מודל פגיעות RPE הניתן לשחזור ונגיש המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח מכניסטי עם מגבלות משאבים מינימליות. גישה זו סיפקה הדמיה ברורה של הפרעה מבנית הנגרמת על ידי Alu RNA בהשוואה לקבוצת הביקורת, כולל פיצול צומת הדוק אפיקלי וחוסר ארגון ציטו-שלד בסיסי באמצעות הדמיית Z-stack קונפוקלית (גודל צעד של 0.5 מיקרומטר). שני שלבים קריטיים מבטיחים את אמינות המערכת: עיכול אנזימטי וטרנספקציה של Alu RNA. באמצעות בידוד מבוסס פפאין (22 IU/mL, 37 °C, 45 דקות), צפינו בתכונות מבניות העולות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תוכנית הפעולה לחדשנות במדע וטכנולוגיה פרויקט מיוחד למחקר חדשנות רפואית (23Y11901300), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82171076) וועדת החינוך העירונית של שנגחאי (2023ZKZD18). אנו מודים לפרופסור L.Z על המתנה הנדיבה של Alu RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ארון בטיחות ביולוגי מסדרת 1300 Class II, סוג A2תרמו סיינטיפיק
37 מעלות; חממת C/5% CO2תרמו סיינטיפיק
4% פרפורמלדהיד (PFA)סרוויסביוG1101-500 מ"ל
RNA Alu אנושיהוענק במתנה על ידי ל.ז.
נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 568 (עז)Invitrogen Thermo Scientificא 11011
כיסוי אופטי דבק MicroAmp של Applied Biosystemsתרמו פישר סיינטיפיק
Applied Biosystems MicroAmp לוחות תגובה אופטיים של 96 בארותתרמו פישר סיינטיפיק
מערכת PCR בזמן אמת של Applied Biosystems ViiA 7תרמו פישר סיינטיפיקמערכת PCR בזמן אמת לניתוח ביטוי גנים כמותי
אלבומין סרום בקר (BSA, Fraction V)ביוטיןST023-50 גרם
קרל זייס פרימוברט מיקרוסקופ תרבית תאים הפוךצייסלניטור מורפולוגיה של תאים
צנטריפוגה 5424 Rאפנדורף
כלורופורםסיגמאהפרדת פאזה במיצוי RNA.
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (LSM900 + תא גילוי 7)צייסהדמיה ברזולוציה גבוהה של סמני אימונופלואורסצנציה (למשל, ZO-1 ו-F-actin).
צלחת באר Costar 24/48/96קורנינג
כיסויתרמו פישר סיינטיפיקמשמש על צלחת 24 בארות להדמיה אימונופלואורסצנטית.
DAPIתרמו62248
אמבטיה יבשה דיגיטליתמולאב
DMEM/F12ג'יבקומדיה לגידול תאי RPE 
חוצץ פוספט של Dulbecco (D-PBS)שתף ביוSB-CR017
ארל' s תמיסת מלח מאוזנת (EBSS)ג'יבקותמיסת מלח מאוזנת המשמשת לדילול פפאין ו-DNase I במהלך בידוד RPE.
אתנול (אבסולוטי)סיגמאמשקעי RNA ושטיפת עמודים.
סרום בקר עוברי (FBS)סיגמאלמדיית תרבית תאים RPE מלאה
מלקחייםלדיסקציה
ליפופקטמין 3000 (מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני)תרמו פישרL300015כדי להעביר Alu RNA לתאי RPE
מטריגלקורנינג356234מטריצה (דילול של 1.14%) לציפוי לוחות לתמיכה בהדבקה וקיטוב RPE.
פורמלדהיד נטול מתנולתרמו סיינטיפיקקיבוע חלופי (4%) לשימור אפיטופים באימונופלואורסצנציה
מיקרופיפטהאפנדורף
ספקטרופוטומטר Nanodrop 2000תרמו סיינטיפיקמודד ריכוז וטוהר RNA
Nikon ECLIPSE Ti-S מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךניקוןהדמיה פלואורסצנטית של דגימות מוכתמות
סטריאומיקרוסקופ אולימפוס SZX16אולימפוסלדיסקציה של גלגלי עיניים של עכבר ובידוד RPE
אופטי-MEMג'יבקומדיום סרום נמוך להכנה מורכבת של טרנספקציה
מערכת דיסוציאציה פפאיןוורטינגטוןLK003150לאנזים עובד
פניצילין-סטרפטומיצין ג'יבקולמדיית תרבית תאים RPE מלאה
מלח נתרן פנטוברביטלסיגמאסוכן המתת חסד
פלואידין 488 אבקם176753להערכת קוטביות
ערכת ריאגנט PrimeScript RTטקארהRR037Aערכת שעתוק הפוך לסינתזת cDNA (הכנת תבנית qPCR)
ערכת RNAsimple Total RNAטיאנגןDP419למיצוי RNA
שחפת ירוק  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)טקארהRR420Aעבור qPCR
ZO-1 נוגדן רב-שבטי ארנבפרוטאינטק21773להערכה מורפולוגית

מקורות

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טרנספקציית Alu RNAתאי RPE ראשוניים של עכברדגנרציה של RPEבידוד אנזימטיהפרשת ציטוקינים דלקתייםהזדקנות תאיתPCR כמותידלקת כרונית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.