הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרודיסקציה רב-שכבתית ופרופיל פונקציונלי-מבני של ענפי עורקי הכליה האנושיים

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

5 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד והערכה תפקודית של ענפי עורקי כליה אנושיים, המאפשר מחקרים פרה-קליניים לפיתוח תרופות.

תקציר

תפקוד לקוי של כלי הדם בכליות ממלא תפקיד קריטי בפתוגנזה של מצבים קליניים מרובים, כולל פגיעה כלייתית חריפה, איסכמיה כלייתית ויתר לחץ דם, ומציב אתגרים משמעותיים בניהול הקליני ומשפיע לרעה על תוצאות המטופלים. הבידוד והאפיון התפקודי של העורקים התוך-כליות חיוניים להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד לקוי של כלי הדם בכליות, במיוחד הקשורים לפגיעה בכליות, ולהנחיית התפתחות טיפולית ממוקדת. למרות חשיבותו הקלינית, גישות סטנדרטיות לבידוד והערכה תפקודית של עורקים תוך כלייתיים אנושיים ברמות הסתעפות שונות נותרו לא מפותחות. פרוטוקול זה מספק מסגרת מקיפה לבידוד שיטתי והערכה רב-מודאלית של ענפי עורקים תוך-כליות, המשלב הערכות תפקודיות ומבניות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. המתודולוגיה כוללת שלושה מרכיבים עיקריים: (1) זיהוי אנטומי מדויק ומיקרו-דיסקציה של עורקים תוך כלייתיים מכליות תורמות, בליווי צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E) לאישור מבני; (2) נהלי נורמליזציה קפדניים במיוגרפיה של חוטים כדי לשפר את יכולת השחזור והאמינות של המדידה; ו-(3) ניתוח כמותי של תגובות כלי דם באמצעות טכניקות מיוגרפיה מדויקות של חוטים. הנורמליזציה מבוססת על יחסי אורך השריר-מתח, כאשר מתיחה מצטברת של מקטעי העורקים יוצרת מתח מנוחה אופטימלי כדי למקסם את חפיפת אקטין-מיוזין, ובכך מעוררת תגובות התכווצות שיא. במיוגרפיה של חוטים, מקטעי כלי דם מבודדים תלויים בין שני חוטים מקבילים, ומאפשרים מדידה מדויקת של מתח כלי הדם. על ידי יישום פרוטוקולי נורמליזציה קפדניים, טכניקה זו מאפשרת כימות ניתן לשחזור ואמין של תגובתיות כלי הדם על פני מצבים פתופיזיולוגיים מגוונים והתערבויות תרופתיות.

מבוא

הכליה היא איבר חיוני האחראי על שמירה על הומאוסטזיס אנושי באמצעות פינוי פסולת מטבולית, איזון אלקטרוליטים וויסות נוזלים - פונקציות הדורשות זרימת דם גבוהה במיוחד. בתנאים פיזיולוגיים, הכליות מקבלות כ-25% מנפח הדם הכולל הנשאב על ידי הלב בכל דקה (תפוקת לב), מה שמדגיש את תפקידן המשמעותי בזרימת הדם המערכתית ואת החשיבות הקריטית של זלוף הכליות בשמירה על איזון פיזיולוגי כללי1. מערכת עורקי הכליה מווסתת במדויק את אספקת הדם המסיבית הזו כדי לשמור על GFR תוך הסתגלות לשינויים המודינמיים מערכתיים. כתוצאה מכך, פגיעה בזלוף הכליות מייצגת מנגנון פתולוגי קריטי התורם להפחתת קצב הסינון הגלומרולרי (GFR) במצבים כמו פגיעה כלייתית חריפה ואיסכמיה כלייתית. בנוסף, היא מתרחשת לעתים קרובות משנית להפרעות מערכתיות הפוגעות בזרימת הדם הכלייתי, כולל הלם, תפקוד לקוי של הלב ואלח דם 2,3,4,5. עורק הכליה עובר הסתעפות רציפה בתוך הכליה, ומתחלק תחילה לעורקים אינטרלוברים העוברים דרך עמודי הכליה בין פירמידות מדולריות. בהגיעם לצומת הקורטיקומולרי, כלים אלה מולידים עורקים מקושתים, המתקשתים לאורך הגבול בין קליפת המוח למדולה. מכלים מפותלים אלה יוצאים עורקים בין-לובולריים החודרים רדיאלית לתוך הפרנכימה בקליפת המוח, ובסופו של דבר מעבירים דם לנימים הגלומרולרים דרך עורקים אפרנטיים כדי לחלחל נפרונים בודדים 1,6,7. העורקים האינטרלובריים, הקשתיים והבין-אוניים מהווים את כלי הדם ההתנגדות העיקריים בכליה, ומשמשים כמווסתים עיקריים של המודינמיקה תוך כלייתית ובקרת לחץ 1,8. בידוד ואפיון מדויקים של כלי דם אלה חיוניים להבהרת המנגנונים הבסיסיים השולטים בהומאוסטזיס של זלוף כליות9. יתר על כן, תגובתיות כלי הדם ההטרוגנית שלהם בתנאים פתופיזיולוגיים שונים מציעה מסגרת אסטרטגית לפיתוח חומרים מרחיבי כלי דם חדשים עם פוטנציאל הגנה על הכליות10,11.

נכון לעכשיו, טכניקות הדמיה קליניות (למשל, אולטרסאונד) משמשות באופן שגרתי לניטור שינויים בזרימת הדם בכליות; עם זאת, מתודולוגיות ניסיוניות במחקר בסיסי להערכה ישירה של מתח כלי הדם בכליות, גורם מפתח לזלוף כלייתי, נותרו מוגבלות 12,13,14,15. מערכת מיוגרפיית החוטים היא פלטפורמה ניסויית מבוססת היטב המודדת שינויי מתח ברקמות ביולוגיות קטנות במבחנה, כולל כלי דם, קנה הנשימה 16,17,18, בקטרים הנעים בין 50 מיקרומטר ל-10 מ"מ 16,19,20. למרות שמיוגרפיה של חוטים יושמה באופן נרחב במחקרים בבעלי חיים, הבדלים בין מינים במבנה ותפקוד כלי הדם מגבילים את המידה שבה כלי מכרסמים יכולים לייצג את הפיזיולוגיה של כלי הדם האנושיים21. לכן, זיהוי ובידוד מדויקים של עורקים תוך כלייתיים אנושיים ברמות אנטומיות שונות (אינטרלובר, קשת ואינטרלובר) הם חיוניים כדי לאפשר חקירות מקיפות במבחנה של תכונותיהם הפיזיולוגיות, כמו גם שינויים תפקודיים הקשורים למחלות ומנגנוני פגיעה פתולוגיים. בשילוב עם התערבויות פרמקולוגיות המשתמשות בתרכובות כלי דם שונות, מערכת זו מאפשרת הערכה דינמית ורישום כמותי של תגובות התכווצות כלי דם/הרחבת כלי דם בטבעות עורקים מבודדות, ומספקת כלי רב עוצמה לחקירת תגובתיות כלי הדם בתנאי ניסוי מבוקרים 19,22,23.

פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה מקיפה ללוקליזציה אנטומית מדויקת ומיקרו-דיסקציה של ענפי העורקים הפנימיים האנושיים (עורקים אינטרלובריים, קשתים ואינטרלובולריים), ואחריה אפיון תפקודי באמצעות מערכת ניטור מתח כלי דם במבחנה כדי להעריך את התגובתיות הדיפרנציאלית שלהם לתרופות כלי דם, ובכך לבסס הבחנות מבניות ותפקודיות בין מקטעי כלי הדם הללו. על ידי שילוב של לוקליזציה אנטומית עם פרופיל תגובתיות פרמקולוגית וניתוח היסטופתולוגי, אנו מקימים פלטפורמה ex vivo המאפשרת הערכה מקיפה של תגובות כלי דם ספציפיות לאזור לחומרים כלי דם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול והדוגמאות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי המחלקה האורולוגית של בית החולים הראשון של אוניברסיטת פקין (אישור מס' 2023yan500-002) ונערכו בהתאם להצהרת הלסינקי. כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני ההשתתפות.

1. הכנת פתרון

  1. הכן תמיסת קרבס-רינגר (קרבס) המכילה 119.0 מ"מ NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl2, 1.0 מ"מ MgCl2, 25.0 מ"מ NaHCO3, 1.2 מ"מ KH2PO4 ו-11.0 מ"מ D-גלוקוז ב-pH 7.4.
  2. הכן תמיסת מלח אשלגן גבוהה (60K+) המכילה 64.0 מ"מ NaCl, 60 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl2, 1.0 מ"מ MgCl2, 25.0 מ"מ NaHCO3, 1.2 מ"מ KH2PO4 ו-11.0 מ"מ D-גלוקוז ב-pH 7.4.

2. הכנת ריאגנטים

הערה: אחסן תרופות לפי הפרטים המופיעים בגיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) מיד לאחר קבלתן.

  1. הכן את הפנילפרין (Phe, 10-1 M במלאי) על ידי המסת 167.21 מ"ג פנילפרין ב-10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, מדלל ל-10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 מ' כריכוז עבודה ביום השימוש.
  2. הכן את האצטילכולין (ACh, 10-2 M במלאי), על ידי המסת 18.166 מ"ג אצטילכולין ב -10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). אחסן תמיסת מלאי ב-80 מעלות צלזיוס, מדלל ל-10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M כריכוז עבודה ביום השימוש.

3. איסוף רקמות כליה ובידוד עורק תוך כליה

  1. לגייס חולים בוגרים המאובחנים עם קרצינומה של תאי כליה, כפי שאושר היסטולוגית על ידי ביופסיית מחט ליבה לפני הניתוח או חתך קפוא תוך ניתוחי.
    הערה: חולים שנקבעו לכריתת כליה רדיקלית נבחרים במיוחד מכיוון שהדגימות הכירורגיות שלהם מספקות גישה לקטעי עורקים תוך-כלייתיים שלמים הממוקמים בשולי הגידול. ניתן לנתח ולבודד מקטעים אלה במדויק, מה שמאפשר מחקר מפורט של הפיזיולוגיה של כלי הדם בכליות האנושיות ללא הפרעה מרקמה ממאירה. אישור היסטולוגי מבטיח זיהוי מדויק של קרצינומה ותיחום ברור של גבולות הגידול, מה שמקל על בחירת מקטעי עורקים תקינים ונטולי גידול לחקירות ניסיוניות.
    1. אל תכלול חולים עם מחלות נלוות משמעותיות (יתר לחץ דם, סוכרת או מחלות מערכתיות אחרות) כדי למנוע השפעות מבלבלות על תפקוד כלי הדם, ובכך לשפר את האמינות והרלוונטיות של הערכות פיזיולוגיות.
      הערה: הדגימות לניסוי זה נאספו מחולים שנקבעו לכריתת כליה רדיקלית בבית החולים הראשון של אוניברסיטת פקין.
  2. במהלך כריתת כליה רדיקלית, אספו דגימות כליה אנושיות טריות שנכרתו וטבלו אותן מיד בתמיסת קרבס קרה כקרח כדי לשמר את כדאיות הרקמות. רק אזורים בעלי מראה נורמלי מבחינה מקרוסקופית המרוחקים לשולי הגידול נשמרים לצורך דיסקציה עורקית (איור 1A).
    הערה: לבידוד אופטימלי של העורק התוך-כלייתי, יש לקצור רקמה בריאה סמוכה כטריז קורטיקומולרי בעובי מלא במהלך כריתת כליה רדיקלית, ובכך לשמר את עץ העורקים השלם מכלי הדם בקליפת המוח למדולרית.
    1. אחסן מיד את הרקמה שנכרתה ב-200 מ"ל של תמיסת קרבס קרה. הניחו את המיכל על קרח והעבירו אותו בשקית קירור מבודדת למעבדה תוך שעתיים מרגע האיסוף. ודא שהרקמה נשארת שקועה במלואה לאורך כל ההובלה כדי לשמור על כדאיות ושלמות מבנית לצורך חיתוך וניתוח פונקציונלי לאחר מכן.
      הערה: כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתפקוד הפיזיולוגי, יש להשלים את כל תהליך הבידוד והאחסון שלאחר מכן בתמיסת קרבס בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך 6 שעות 24,25,26,27. יש להחליף את התמיסה באופן קבוע במהלך הליכים כדי לשמור על חמצון וכדאיות הרקמות, תוך הקלה על פינוי רכיבי הדם מלומן כלי הדם.
  3. זהה חזותית את מישור העטרה על ידי איתור הילום הכליה ויישור החתך כך שיעבור הן דרך אגן הכליה והן דרך הגבול הקמור לרוחב. בעזרת אזמל סטרילי, חצו את הכליה לאורך מישור העטרה כדי לייצר שני חצאים סימטריים. גישה זו חושפת את הארכיטקטורה הפנימית, כולל פירמידות הכליה והעמודים, ומאפשרת זיהוי מדויק ודיסקציה לאחר מכן של עורקים תוך כלייתיים (איור 1A).
    הערה: על מנת להקל על ההפרדה של עורקי הכליה, יש להסיר תחילה חלק מאגן הכליה, פירמידות הכליה ושומן על משטח החתך כדי לחשוף כלי דם נוספים (איור 1B). היזהר לא לחתוך את כלי הדם.
  4. תחת סטריאומיקרוסקופ, הפרד בקפידה את העורקים האינטרלובריים, הקשתיים והבין-אוניים באמצעות מספריים ומלקחיים מיקרו-דיסקציה בצלחת תרבית עם תחתית שחורה בגודל 10 ס"מ (איור 1C).
    הערה: בכליה האנושית, העורק הבין-לובולרי עובר דרך פירמידות הכליה, וכולל את דופן כלי הדם העבה ביותר מבין שלושת ענפי העורקים 1,8, בקוטר ממוצע של כ-1-2 מ"מ. בצומת הקורטיקומולרי, העורק הבין-לוברי עובר לעורק הקשת, ויוצר קשת חצי עגולה לאורך גבול הקורטיקומולרי, בקוטר ממוצע של כ-500 מיקרומטר. כלי הדם מסתעפים עוד יותר לתוך קליפת הכליה, שהיא העורק הבין-לובולרי, עם דופן כלי הדם הדקה ביותר והקוטר הקטן ביותר מבין השלושה, כ-200 מיקרומטר (איור 1C). יתר על כן, כאשר מבדילים בין שלושת ענפי כלי הדם, לוקליזציה אנטומית מספקת מידע קריטי יותר ממדידות קוטר כלי דם מוחלטות 1,8.
    1. הסירו בעדינות את כל הרקמות והשומן שמסביב מהעורקים, והקפידו לנקות אותם ביסודיות בצלחת תרבית עם תחתית שחורה בגודל 10 ס"מ (איור 1B).
  5. השתמש בעורקי הכליה המבודדים (עורקים בין-לובולריים, קשתים ואינטרלובריים) לניסויים הבאים:
    1. הכן קטעי עורקים לעיבוד היסטולוגי על ידי חיתוך קפדני של רקמות מבודדות לאורך סטנדרטי של כ-3 מ"מ, המתאים להטמעת פרפין וחתך היסטולוגי. תקן כל דגימה ב-2 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לשמר את מורפולוגיה של הרקמות. לאחר הקיבוע, עבדו עם פרוטוקולי התייבשות, ניקוי והטמעת פרפין סטנדרטיים לצביעה הבאה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) בהתאם לפרוטוקולים היסטולוגיים מבוססים (איור 2).
      הערה: לצורך הערכות היסטולוגיות פוטנציאליות, הדגימות יכולות לעבור צביעת טריכרום של מאסון כדי להעריך שקיעת קולגן או צביעת Verhoeff-Van Gieson (EVG) להדמיית סיבים אלסטיים, על פי פרוטוקולים היסטולוגיים מבוססים28,29.
    2. למחקרי תפקודי כלי דם, יש לאחסן טבעות תוך כליות בתמיסת קרבס קרה כקרח עד לבדיקה. טבעות העורקים צריכות להיות שקועות לחלוטין.
      הערה: עבור בדיקות מולקולריות עוקבות כמו כתם מערבי/qPCR, יש להקפיא מיד דגימות טריות בחנקן נוזלי לאחר הדיסקציה, ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בהתאם לנהלים שפורסמו בעבר כדי לשמור על שלמות ה-RNA ולמנוע פירוק חלבון30,31.

4. הרכבה של טבעת עורקים

  1. זהו את העורק האינטרלוברי, הקשתי והבין-אוני לפי המיקומים האנטומיים הייחודיים שלהם (איור 1C) וטווחי הקוטר שלהם (איור 2), ואז חתכו אותם בזהירות לטבעות באורך של כ-2 מ"מ באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה עבור מחקרי תפקודי כלי דם (איור 3A).
    הערה: אחסן מיד כל טבעת עורקים מבודדת בנפרד ב-5 מ"ל של תמיסת קרבס קרה כקרח עד לבדיקה פונקציונלית. לבדיקה פונקציונלית, בחר טבעות כלי דם לא מסועפות באורך של 1.5-2.0 מ"מ עם חתכים מאונכים נקיים. אל תכלול טבעות העולות על 2.0 מ"מ כדי למנוע קשיי הרכבה או טבעות מתחת ל-1.5 מ"מ כדי למנוע הקלטות מתח לא יציבות.
  2. הכן את כל טבעות העורקים (מעורקים אינטרלובריים, קשתים ובין אונות בנפרד) כפי שהוזכר בשלב 4.1 והבא גם את תמיסות Krebs וגם את תמיסות 60K+ לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הפעל את המחשב המחובר, ואחריו את מערכת השריר החוטית, וודא שכל הרכיבים מאותחלים כראוי לפני שתמשיך בניסויים.
  3. לפני הרכבת טבעות העורקים בתאי שריר החוט, שטפו כל תא פעמיים עם 5 מ"ל תמיסת קרבס כדי להבטיח ניקיון ולסלק שאריות חומרים, ולאחר מכן הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת קרבס לכל תא.
    1. מחממים את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת בקרת הטמפרטורה המובנית של המיוגרף. במקביל, יש לאוורר באופן רציף את התמיסה בגז (תערובת של 95% O2 ו-5% CO2) באמצעות קו גז מחובר כדי לשמור על איזון חמצון ו-pH מתאים במהלך הניסוי.
  4. הכינו שני חוטי הנחיה באורך 3 ס"מ בקוטר 40 מיקרומטר לכל טבעת עורקית והעבירו בזהירות את טבעות העורקים המבודדות לצלחת תרבית נוספת עם תחתית שחורה בגודל 10 ס"מ המכילה תמיסת קרבס.
    הערה: יש לבחור קטרים שונים של חוטי הנחיה עבור כלי דם בקטרים שונים. עבור הטבעת העורקית בקוטר של כ -100 מיקרומטר או פחות, נדרש חוט מנחה של 15 מיקרומטר; אם הקוטר הוא בין 100 מיקרומטר ל -200 מיקרומטר, נעשה שימוש בחוט מנחה של 25 מיקרומטר; אם הקוטר גדול מ-200 מיקרומטר, ניתן להשתמש בחוט מנחה של 40 מיקרומטר. לצורך עקביות הניסוי, מומלץ להשתמש באותו קוטר לכל כלי הדם מאותו סוג בניסוי אחד. 19.
  5. הכנס בזהירות את חוט ההנחיה הראשון לטבעת העורקים בתוך הצלחת, כופף צד אחד של חוט ההנחיה ב-90°, ולאחר מכן העבר אותו לתא לקיבוע על clamp מחזיק דגימה מסוג באמצעות הברגים המיוחדים המסופקים על ידי המכשיר להידוק בורג בכיוון השעון (איור 3B).
    הערה: חוט ההנחיה מוכנס כדי לספק תמיכה מבנית במהלך העברת הטבעת העורקית בעת הרכבתו על מחזיק הדגימה, תוך מזעור נזק או עיוות הנגרמים מהטיפול.
  6. לפני קיבוע הטבעת העורקית על המחזיק, רשום את אורך ורוחב הכלי. מקמו את הטבעת העורקית בין שני המחזיקים (איור 3C) וקראו את סולם המיקרומטר, כאשר סולם 1 מייצג 10 מיקרומטר. הפחיתו את ערך קנה המידה הנמדד כאשר המחזיקים בקושי נוגעים זה בזה (איור 3D) כדי לקבוע את אורך ורוחב הטבעת העורקית.
  7. השחילו חוט מנחה נוסף דרך כלי הדם ולבסוף קבעו אותו בצד השני. סובב את חוט ההנחיה בכיוון השעון סביב ברגי הקיבוע משני הצדדים וודא שהוא מחובר היטב למשטח מחזיק המדגם.
    הערה: במהלך כל תהליך הקיבוע, יש להימנע ממשיכת כלי הדם או גירוד הדופן הפנימית של כלי הדם עם חוט ההנחיה כדי למנוע פגיעה באנדותל כלי הדם. יש לעטוף את חוט ההנחיה סביב בורג הקיבוע בשכבה אחת ללא חפיפה. שני חוטי ההנחיה צריכים להיות באותו מישור אופקי, מקבילים זה לזה, ולא להצטלב זה עם זה. בנוסף, לאחר תיקון חוט המדריך, כוונן את מחזיק המדגם משני הצדדים קרוב יותר; עם זאת, הם צריכים להיות קרובים זה לזה מבלי ליצור מגע בפועל, כדי להימנע מכוח, כפי שמוצג באיור 3E ובאיור 3F.
  8. התקן את החדר בחזרה למערכת שריר החוט. לאחר מכן, מכסים את המכסה ומאווררים את הגז. חבר את החיישן ופתח את תוכנת איסוף הנתונים לבדיקת מתח כלי דם.

5. נורמליזציה ספציפית לכלי לקביעת מתח ראשונית אופטימלית

הערה: קביעת תנאי בסיס יציבים, המוגדרים כמתח המנוחה האופטימלי להיענות התכווצות מקסימלית, היא קריטית למדידות פונקציונליות הניתנות לשחזור. עם זאת, בשל הבדלים פיזיולוגיים בין-אישיים אינהרנטיים, כלי דם אנושיים מציגים שונות גדולה יותר בתכונות המכניות הבסיסיות בהשוואה לכלי דם של בעלי חיים 32,33,34,35,36. גורמים אלה, בשילוב עם הטרוגניות פנימית של כלי הדם (למשל, פערים מבניים ותפקודיים בקוטר, בעובי הדופן ובתכונות ההתכווצות), מובילים יחד לשינויים משמעותיים במתח הבסיסי. לכן, כדי להבטיח שחזור ניסיוני, מומלץ לנרמל כל כלי דם בנפרד. מערכת שריר התיל כוללת מודול נורמליזציה ייעודי, המאפשר קביעה מדויקת של מתח קו הבסיס לכל כלי שיט.

  1. התקן את טבעות העורקים בתא כמתואר בשלבים 4.1 עד 4.8. התחל בהקלטת תרשים, אפס את הערוץ (איור 4A), אפשר ייצוב למשך 30 דקות לפחות, ולאחר מכן אפס מחדש את הערוץ שוב לפני שתמשיך בנורמליזציה.
  2. בחר הגדרות נורמליזציה מתפריט DMT (איור 4B) והגדר את הפרמטרים באופן הבא (איור 4C):
    1. כיול עינית (מ"מ/div): 1; לחץ יעד (kPa): 13.3; IC1/IC100: 0.9; זמן ממוצע מקוון (שניות): 3; זמן עיכוב (שניות): 60.
      הערה: IC1 מציין את היקף הכלי הפנימי בייצור כוח פעיל מקסימלי, בעוד IC100 מייצג את ההיקף המתאים ללחץ טרנסמורלי של 100 מ"מ כספית. עורקי כליה אנושיים מציגים שונות משמעותית בין דגימות, הדורשת סטנדרטיזציה, בניגוד למודלים של בעלי חיים בעלי תכונות כלי דם עקביות לקביעה ניסויית ושימוש חוזר ביחסי IC1/IC100. בשל הבדלים משמעותיים בקוטר הכלי, בעובי הדופן ובתכונות המכניות בין דגימות אנושיות בודדות, כל כלי חייב לעבור נורמליזציה עצמאית כדי לקבוע את מאפייני הבסיס הייחודיים שלו. לכן היחס של 0.9 נקבע כמציין מיקום לאתחול פרוטוקול כאן ולא נעשה בו שימוש בפועל בפרוטוקול זה.
  3. בחר את הערוץ המתאים לעורק היעד ופתח את מסך הנורמליזציה מתפריט DMT (איור 4C), אכלס אותו בנתונים המתאימים:
    1. נקודות קצה של רקמות: a1 צריך להיות 0, a2 צריך להיות אורך הכלי (במ"מ); קוטר חוט: 40 מיקרומטר (הזן את קוטר החוט המשמש); קריאת מיקרומטר: הערך מסולם המיקרומטר, לחץ על הוסף נקודה כדי לתעד את הנקודה.
  4. כשתהיה מוכן, לחץ על הוסף נקודה כדי להקליט את הנקודה הראשונה ולהתחיל בהליך הנורמליזציה.
  5. הפעילו מתיחה פסיבית, המתינו 3 דקות, הזינו את קריאת המיקרומטר כנקודה הבאה, ולאחר מכן הוסיפו 5 מ"ל של 60K+ כדי לעורר התכווצות כלי דם בתיווך אשלגן (איור 5).
  6. המתן עד שההתכווצות תגיע למישור. לאחר מכן, שטפו את תמיסת ה-60K+ עם 5 מ"ל של תמיסת קרבס 3 פעמים, וחשבו את נתוני הכוח האקטיבי מהעקבות על ידי הפחתת הכוח הפסיבי בכל מתיחה מהכוח המופעל על ידי אשלגן (איור 5).
  7. חזור על שלבים 5.5 עד 5.6 (שלבי "Stretch-60K+ Stimulation-Wash") עד שהכוח הפעיל יגיע למקסימום שלו, ולאחר מכן קבע את המתח הבסיסי האופטימלי שבו ייצור הכוח הפעיל של כלי השיט הוא מקסימלי (איור 5).
  8. אזנו את הטבעת העורקית בתא למשך 10 דקות לפני שתמשיכו לשלבים הבאים של הניסוי.

6. זיהוי תגובתיות טבעת עורק הכליה

  1. ודא שנפח הקרבס בכל תא הוא 5 מ"ל לפני תחילת הניסוי.
  2. כדי להעריך התכווצות תלוית ריכוז הנגרמת על ידי פנילפרין, יש ליישם Phe מצטבר במרווחים של חצי לוג (10-9 עד 10-4 M)37.
  3. התחל עם ריכוז ה-Phe הנמוך ביותר (10-9 מ'). הוסף 5 מיקרוליטר של מלאי Phe (10-6 מ') לתא המכיל 5 מ"ל של מאגר קרבס, עקוב ברציפות והמתן עד שההתכווצות תתייצב (2-3 דקות של מתח ללא שינוי), סמן את הנקודה ולאחר מכן הוסף את הריכוז הבא במרווח של חצי לוג. חזור על הפעולה עד להגעה לריכוז הסופי (10-4 M), תוך שמירה על ניטור עקבי לאורך כל הדרך (איור 6).
  4. לבדיקת סמים נוספת, יש לשטוף את החדר ב-5 מ"ל תמיסת קרבס חמה לפחות 5 פעמים עד שהמתח חוזר לקו הבסיס ונשאר יציב למשך 10 דקות לפחות.
  5. כדי להעריך הרחבת כלי דם תלוית ריכוז הנגרמת על ידי אצטילכולין, יש למרוח ACh מצטבר במרווחים של חצי לוג (10-8 עד 10-5.5 מ').
    הערה: בכלי דם רגילים, התגובה לאצטילכולין (ACh) משמשת כאינדיקטור תפקודי לשלמות האנדותל37,38. תגובת הרחבת כלי הדם ל-ACh משקפת את תפקוד האנדותל באמצעות הרפיה ללא תיווך בכלי דם בריאים. עם זאת, בתנאים פתולוגיים, תגובה זו עשויה להיות מוחלשת או להתבטל עקב פגיעה בזמינות הביולוגית של תחמוצת החנקן (NO) ו/או שינוי במסלולי איתות הקולטנים.
  6. חוזה מראש של כלים עם 10-4 M Phe, הוסף 5 מיקרוליטר של מלאי Phe (10-1 M) לתא המכיל 5 מ"ל של מאגר קרבס, ודגירה למשך 15 דקות. החל מריכוז ה-ACh הנמוך ביותר, הוסף 5 מיקרוליטר של מלאי Ach (10-5 M) לתא המכיל 5 מ"ל של מאגר קרבס, נטר ברציפות והמתן לתגובת הרחבת כלי הדם (מאושרת על ידי זיהוי עקבות מתמשך), סמן את הנקודה ולאחר מכן המשך לריכוז הבא. חזור על הפעולה עד שכולם נבדקים (איור 7).
  7. השלם את הניסוי על ידי שמירת הקובץ והסרת טבעות העורקים. יש לנקות היטב את החדר על ידי דגירה עם 10 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית 8% למשך 3 דקות, ואז לשטוף עם 10 מ"ל מים 3 פעמים. לאחר מכן, דגרו ב -10 מ"ל של אתנול 95% למשך 3 דקות ושטפו שוב עם 10 מ"ל מים 3 פעמים. לבסוף, כבה גם את התנור וגם את הגז, וודא שכל הנוזלים מוסרים לפני כיבוי הגז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בכליה האנושית, העורק האינטרלובר עובר בין פירמידות הכליה לצד הווריד המקביל לו. מאופיין בדופן כלי דם עבה יחסית ובמעטפת משמעותית של רקמת שומן, עורק זה דורש דיסקציה זהירה במיוחד. יש להסיר את רקמת השומן שמסביב בזהירות כדי למנוע הפעלת כוח מופרז במהלך הליך הבידוד (איור 1C).

העורק הקשתי ממוקם אנטומית בצומת הקורטיקומולרי, ויוצר קשת חצי עגולה אופיינית לאורך השוליים החיצוניים של פירמידות הכליה. בהשוואה לעורק האינטרלובר, יש לו דופן כלי דם דקה יותר. במהלך הבידוד, יש לנקוט בזהי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יציבות הזלוף הכלייתי משמשת הן כמטרה טיפולית קריטית והן כחלון לפתופיזיולוגיה המודינמית39,40. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד היררכי והערכה תפקודית של עורקי כליה אנושיים מדגימות כריתת כליה טריות, תוך התייחסות לפערים משמעותיים במתודולוגיות הנוכחיות. בניגוד לגישות קיימות המוגבלות לדגימות גופות או מודלים של בעלי חיים, הטכניקה שלנו מאפשרת בידוד אמין של עורקים תוך-כלייתיים ברי קיימא (אינטרלובר עד אינטרלובר) תוך שמירה על שלמות מורפולוגית ותפק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות למתנדבים על השתתפותם במחקר זה, וגם לצוות הכירורגי במחלקה האורולוגית של בית החולים הראשון של אוניברסיטת פקין על אספקת רקמת כליה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (F251013 לי.ז., 7232096 לי.ל.); הקרן הלאומית למדע של סין (82325004, 92168114 לי.ז., 82170422 לי.ל.); תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 עד י.ז., 2021YFF0501404 עד י.ל., 2023YFC2415500 עד ל.י.); פרויקט מחקר של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין במעבדת המפתח הממלכתית להומאוסטזיס ושיפוץ כלי דם (אוניברסיטת פקין; 2024-VHR-SY-07 עד Y.Z.); 2023 ועדת הבריאות העירונית של בייג'ינג הון מדע רפואי וטכנולוגיה חדשנות הישג טרנספורמציה פרויקט תוכנית קידום מעולה (YC202301QX0162 ל.י.); מימון מחקר קליני לאומי ברמה גבוהה של בית חולים (הישגים מדעיים וטכנולוגיים פרויקט קרן הדרכה לחממת טרנספורמציה של בית החולים הראשון של אוניברסיטת פקין, 2024CX24 עד L.Y.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטילכולין כלורידSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, גרמניהA6625
צלחת תרבות עם תחתית שחורהטכנולוגיית Myo הדנית, אורהוס, דנמרק300412
CaCl<תת>2סנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA501330
D-גלוקוזסנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA610219
מלקחיים דומונטטכנולוגיית Myo הדנית, אורהוס, דנמרק300413
Geuder מספריים דיסקציהטכנולוגיית Myo הדנית, אורהוס, דנמרק400431
חוט מנחהטכנולוגיית Myo הדנית, אורהוס, דנמרק400447קוטר 40 ומיקרו; m
KClסנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA100395
KH2PO4סנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA100781
LabChart Professional גרסה 8.3 ADInstruments, אוסטרליה-
MgCl2· 6 שעות<תת>2Oסנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA100288
מערכת מולטי מיוגרף טכנולוגיית Myo הדנית, אורהוס, דנמרק620 מיליון
NaClסנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA100241
NaHCO3סנגון ביוטק ושות', בע"מ, שנחאי, סיןA100865
פנילפריןSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, גרמניהעמ' 6126

מקורות

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טכניקת מיקרו-דיסקציהמיוגרפיה של חוטתפקוד כלי דם לקויבידוד עורק תוך-כליתיתגובות וזומוטוריותיחסי אורך-מתח של השרירצביעת המטוקסילן-אאוזיןהתכווצות המודית על ידי פנילפריןנורמליזציה עורקית
מיקרודיסקציה רב-שכבתית ופרופיל פונקציונלי-מבני של ענפי עורקי הכליה האנושיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.