הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תפקוד עורקי הכליה והיסטופתולוגיה קשורים למטבוליטים של פלזמה וצואה בחולי אי ספיקת לב

546 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68583

⸱

9 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח פלטפורמה רב-מודאלית להבהרת תפקוד לקוי של כלי הדם בכליות המונעות על ידי מטבוליט לב בתסמונת הלב-כליה.

תקציר

מיקרוביוטת המעי והמטבוליטים הקשורים אליה מוכרים יותר ויותר כמווסתים מרכזיים של איזון מטבולי מערכתי וציר הלב-כליה, במיוחד בהקשר של תסמונת קרדיו-כליה. למרות שעדויות קליניות מצביעות על כך שתפקוד לקוי של הלב עלול ליזום או להחמיר שינויים פתולוגיים כלייתיים, מולקולות האיתות המטבוליות העיקריות המתווכות את ציר הלב-כליה והמנגנונים הבסיסיים שלהן נותרים חמקמקים. מחקר זה מבסס פלטפורמת מחקר שיטתית חדשה המשלבת חתימות קרדיומטבוליות עם ניתוח תפקודי כלי דם בכליות, הכוללת: (1) בידוד ומיצוי של מטבוליטים בפלזמה/צואה מחולי אי ספיקת לב; (2) בידוד כלי דם כלייתיים ex vivo וטכניקות תרבית ראשוניות; (3) מסגרת הערכה רב-מודאלית לאינטראקציות מטבוליות לב-כליות, המשלבת מבחנים תפקודיים של כלי הדם, בדיקות ביוכימיות מולקולריות לסמני פגיעה בכלי הדם בכליות וניתוחים היסטופתולוגיים. בהשוואה לבקרות בריאות, מטבוליטים מחולי אי ספיקת לב פגעו בתפקוד כלי הדם בכליות וגרמו לתגובות דלקתיות, מה שמדגיש את הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים תפקודיים בתסמונת הלב-כליה. מחקר זה אינו מתמקד במטבוליט ספציפי; לכן, יידרש זיהוי ואימות נוסף של הסוגים הספציפיים של מטבוליטים המפעילים השפעות פתוגניות במחקרים עתידיים תוך שימוש בטכניקות אנליטיות כגון LC-MS/MS ו-NMR. יישום פלטפורמה זו גילה כי מטבוליטים הקשורים למחלות לב פוגעים בתפקוד כלי הדם בכליות ובהומאוסטזיס. ממצאים אלה מספקים תובנה מכניסטית לגבי המניעים המטבוליים של אינטראקציות לב-כליות ומציעים כלי תרגומי לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים ומטרות טיפוליות.

מבוא

תסמונת קרדיו-כליה (CRS) היא מצב פתולוגי מורכב המאופיין בנזק דו-כיווני בין הלב לכליות. התלות ההדדית המורכבת בין שני האיברים הללו תוארה לראשונה על ידי רוברט ברייט בשנת 1836, שתיעד באופן שיטתי שינויים מבניים משמעותיים בלב הקשורים למחלת כליות מתקדמת1. השכיחות של CRS קשורה קשר הדוק לדו-קיום של מחלות לב וכלי דם (CVD) ומחלת כליות כרונית (CKD). מחקרים מצביעים על כך שכ-30% מחולי אי ספיקת לב סובלים גם מ-CKD, בעוד ש-44%-51% ממקרי המוות בחולי CKD מיוחסים ישירות לאירועים קרדיווסקולריים2.

ניהול CRS מציב מספר אתגרים משמעותיים. ראשית, הטיפול הקליני נותר מקוטע, עם היעדר תיאום בין-תחומי ומנגנוני אזהרה מוקדמת, מה שמוביל לעתים קרובות להתערבויות מאוחרות בשלב3 של ביטול הפיצוי. שנית, אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות עומדות בפני דילמה פרדוקסלית. טיפולים קונבנציונליים, כגון משתנים ומעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון (RAAS), יכולים להקל על תסמיני אי ספיקת לב4; עם זאת, שימוש ממושך או במינון גבוה עלול להפעיל את ה-RAAS ומערכת העצבים הסימפתטית (SNS), להחמיר היפוקסיה כלייתית ופיברוזיס, ובסופו של דבר לתרום לעמידות משתן ולהחמרת תפקוד הכליות5. באופן דומה, בעוד שמעכבי אנזים ממיר אנגיוטנסין (ACEIs) וחוסמי קולטני אנגיוטנסין (ARBs) יכולים להפחית נזק לב-כלייתי, השימוש הקליני בהם מוגבל לרוב בשל חששות מקריאטינין מוגבר בסרום או היפרקלמיה, כאשר רק 30%-40% מהחולים מסוגלים לסבול טיפול ארוך טווח6.

בהתחשב באתגרים אלה, יש צורך דחוף לזהות סמנים ביולוגיים מוקדמים יעילים ולהשיג הבנה מעמיקה יותר של פתוגנזה של CRS כדי להקל על גילוי מטרות טיפוליות חדשות. עם זאת, המגבלות הנוכחיות בזיהוי מתווכים הניתנים לפעולה של דיבור צולב כלייתי - במיוחד מטבוליטים ספציפיים למחלה המקשרים ישירות בין תפקוד לקוי של הלב לפגיעה בכלי הדם בכליות - מעכבות את ההתקדמות בפתרון הצרכים הקליניים הללו שלא נענו. עדויות מתפתחות מצביעות על כך שמטבוליטים הקשורים למחלות לב עשויים לשמש הן כסמנים ביולוגיים אבחנתיים והן כמניעים מכניסטיים של CRS על ידי תכנות מחדש של הומאוסטזיס כלי דם בכליות, אך תפקידיהם המרחביים-זמניים בהתחלה או הגברה של פגיעה כלייתית נותרו מאופיינים בצורה גרועה 7,8,9. מחקרים אחרונים הראו כי מטבוליטים אנדוגניים כגון סרמידים יכולים להחמיר באופן פעיל דלקת בכלי הדם ועיצוב מחדש, במיוחד במצבים לב-כליות, מה שמדגיש את הרלוונטיות הרחבה יותר של חישת מטבוליט בפתולוגיה של כלי הדם10.

בין תאי הכליה המושפעים ב-CRS, כלי הדם מוכרים יותר ויותר כיעד ראשוני ומוקדם לפגיעה. תפקוד לקוי של האנדותל במיקרו-סירקולציה הכלייתית - המסומן על ידי פגיעה בזמינות הביולוגית של תחמוצת החנקן, מתח חמצוני וביטוי מוגבר של מתווכים פרו-דלקתיים ופרו-טרומבוטיים - תורם לנדירות מיקרו-וסקולרית, חדירות מוגברת של כלי הדם והיפוקסיה אזורית11. במקביל, תאי שריר חלק בכלי הדם (VSMCs), החיוניים לוויסות טונוס העורקים ותאימות, פגיעים גם הם לחוסר ויסות מטבולי ב-CRS. עדויות מצטברות מצביעות על כך שמטבוליטים הקשורים למחלה יכולים לשבש את התכווצות VSMC, לקדם שיפוץ לא מסתגל ולתרום לנוקשות מוגברת של כלי הדם ולפגיעה בזלוף הכליות. למרות תפקידם הבסיסי, מנגנונים מונעי שרירים חלקים של תפקוד לקוי של כלי הדם נותרו לא נחקרים במודלים הנוכחיים של CRS 8,12. שינויים פתופיזיולוגיים אלה לא רק מחמירים את הנזק הכלייתי אלא גם מקדמים הפעלה נוירו-הורמונלית לא מסתגלת והפרעות המודינמיות מערכתיות, פוגעים עוד יותר בתפקוד הלב ומנציחים את התקדמות CRS13. לפיכך, התמקדות בפגיעה בכלי הדם בכליות מציעה חלון אינפורמטיבי מכניסטי לפתוגנזה המוקדמת של CRS ומספקת מיקוד רציונלי לחקירת אינטראקציות מטבוליות בין לב לכליות.

כדי להתמודד עם פערים אלה, המחקר שלנו נותן עדיפות לזיהוי שיטתי ואימות תפקודי של מטבוליטים הקשורים לאי ספיקת לב כמווסתים מרכזיים של התקדמות CRS. עבודה זו מגשרת על הנתק הקריטי בין גילוי סמנים ביולוגיים תצפיתיים לבין מחקר פתוגנזה מכניסטי על ידי תיחום האופן שבו מטבוליטים אלה גורמים לתפקוד לקוי של כלי הדם בכליות, מפעילים מפלים דלקתיים ופוגעים במנגנוני תיקון רקמות. למודלים מסורתיים המשמשים לחקר CRS - כולל מודלים של בעלי חיים, תרביות תאים במבחנה ואורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) - לכל אחד מהם יש מגבלות14. מודלים של בעלי חיים סובלים מהבדלים בין מינים המגבילים את הרלוונטיות הקלינית. תרביות במבחנה חסרות אינטגרציה ברמת האיבר, בעוד שאורגנואידים שמקורם ב-iPSC - למרות שהם מסוגלים לדגמן אינטראקציות של תאי אפיתל קרדיומיוציטים-צינוריים - נשארים לא בשלים מבחינה תפקודית ומוגבלים לשלבי התפתחות מוקדמים15. יתר על כן, מערכות אורגנואידים בכלי הדם הנוכחיות מורכבות בעיקר משכבות חד-שכבתיות אנדותל או מיקרו-כלים פרימיטיביים, חסרות את שכבת השריר החלק המתכווץ וקריאות פונקציונליות הדרושות להערכת תגובות ברמת כלי הדם לפגיעה מטבולית16.

לעומת זאת, הפלטפורמה שלנו משתמשת במטבוליטים לבביים שמקורם בבני אדם ובכלי דם כלייתיים אנושיים ex vivo, המאפשרים עורקי כליה אנושיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ושלמים מבחינה מבנית, ומאפשרים ניתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ואינפורמטיבי מכניסטי של אינטראקציות מטבוליות לב-כליות בממשק כלי הדם. זה מספק יתרון ייחודי במידול התקשורת המטבולית הבין-איברית העומדת בבסיס התקדמות תסמונת הלב-כליה. פלטפורמת המחקר הלב-כלית המשולבת החלוצית שלנו משלבת שלושה חידושי ליבה: פרופיל מטבולומי של מטבוליטים פלזמה/ צואה שמקורם באי ספיקת לב, מערכות בידוד/תרבית רב-תכליתית, והערכה תפקודית-מולקולרית-היסטופתולוגית רב-מודאלית. כל רכיב בפלטפורמה זו עבר אופטימיזציה לשחזור ורלוונטיות תרגום, כולל שימוש ב-200 מיקרוליטר פלזמה או 0.1 גרם של חומר צואתי לדגימה, דגירה של מקטעי עורק כליה אנושי בגודל 2 מ"מ ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך עד 24 שעות, וזיהוי כמותי בזמן אמת של תגובת שרשרת פולימראז (qRT-PCR) של סמני פגיעה בכלי הדם. מערכת זו לא רק מפענחת את הפוטנציאל האבחנתי של חתימות מטבוליטים, אלא גם מקשרת ישירות את התרומות הסיבתיות שלהם לפתולוגיה של CRS, ומאפשרת זיהוי מטרה טיפולית באמצעות מיפוי ברמה המולקולרית של חוסר ויסות מטבולי בין איברים. על ידי גישור בין גילוי מכניסטי לתרגום קליני, פרדיגמה ממוקדת כפולה זו מעבירה את ניהול ה-CRS מבקרת סימפטומים תגובתית להתערבויות פרואקטיביות המונעות על ידי סמנים ביולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולי הניסוי ומתודולוגיות המקרה ששימשו במחקר זה אושרו מבחינה אתית על ידי המחלקה האורולוגית בבית החולים הראשון של אוניברסיטת פקין (קוד סקירה אתית: 2023yan500-002) ובית החולים של המכללה הרפואית פקין יוניון (אישור מס' I-23PJ585), תוך הקפדה על העקרונות המפורטים בהצהרת הלסינקי. לצורך מחקר זה, גייסנו חולים גברים או נשים שאושפזו בבית החולים Peking Union Medical College (PUMCH) מיולי 2019, שאובחנו עם אי ספיקת לב (HF) על ידי לפחות שני קרדיולוגים מנוסים. בסך הכל נכללו ארבעה חולי HF (HF1-HF4) למיצוי מטבוליט פלזמה וצואה. התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל הנבדקים לפני הכללתם במחקר. מנגנון הניסוי והריאגנטים מוצגים בטבלת החומרים.

1. עיבוד דגימות פלזמה וצואה - מיצוי מטבוליט קוטבי

  1. איסוף דוגמאות
    1. אסוף את כל דגימות הפלזמה והצואה בצינורות איסוף סטריליים ומקוררים מראש והקפיא אותן מיד בחנקן נוזלי לאחר האיסוף. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
    2. כדי להבטיח יציבות מטבוליט, עבד את כל הדגימות במחזור הקפאה-הפשרה אחד, ואל תתנו למרווח הזמן בין איסוף הדגימה למיצוי לעלות על שבועיים.
      הערה: אמצעים אלה ננקטו כדי למזער את פירוק המטבוליטים ולהבטיח שחזור בניתוחים מטבולומיים במורד הזרם.
    3. חלץ מטבוליטים מדגימות צואה ופלזמה לפי שלבי הפרוטוקול 1.3 או 1.4, בהתאמה.
  2. אוכלוסיית המחקר
    1. בצע מדידות לחץ דם בסיסיות ורשום את היסטוריית התרופות של כל המשתתפים.
    2. אסוף דגימות מטופלים לפני כל הידרדרות קלינית חריפה, למעט אנשים עם מחלות נלוות מטבוליות עיקריות (למשל, סוכרת, יתר לחץ דם ראשוני) כדי למזער גורמים מבלבלים בניתוח מטבולומי (טבלה משלימה S1).
    3. השג מידע קליני עבור כל נבדק באמצעות נהלים סטנדרטיים.
  3. מיצוי פלזמה
    1. סרום גולמי צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 × גרם למשך 10 דקות (4-8 מעלות צלזיוס). אסוף את הסופרנטנט לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים של 1.5 מ"ל.
    2. הוסף מתנול צונן (-80 מעלות צלזיוס) בדרגת HPLC כדי להשיג ריכוז מתנול של 80% (v/v). מערבבים בעדינות על ידי היפוך ודוגרים בחום של -80 מעלות צלזיוס למשך 6-8 שעות.
    3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 × גרם למשך 10 דקות (4-8 מעלות צלזיוס). העבירו את הסופרנטנט המתנולי לצינורות טריים לפרופיל מטבולומי.
      הערה: הנח את דגימות הפלזמה לאחר האיסוף במקפיא של -80 מעלות צלזיוס תוך שעתיים, ומזער את מחזורי ההקפאה-הפשרה כדי להבטיח יציבות מטבוליט.
  4. מיצוי צואה
    1. הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול בדרגת HPLC (מקורר מראש ל-80 מעלות צלזיוס) לדגימות צואה טריות או קפואות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הומוגניזציה באמצעות מיקרו-עלי/הומוגנייזר רקמות על קרח יבש למשך 1-2 דקות, ולאחר מכן מערבולת (דקה אחת ב-4-8 מעלות צלזיוס) ודגירה ב-80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    2. צנטריפוגה בחום של 14,000 × גרם למשך 10 דקות (4-8 מעלות צלזיוס) באמצעות צנטריפוגה מקוררת. העבירו את הסופרנטנט לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים של 1.5 מ"ל; יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשלב 1.4.4.
    3. השעו מחדש את הגלולה עם 400 מיקרוליטר של מתנול מקורר מראש (-80 מעלות צלזיוס) בדרגת HPLC. מערבולת ביסודיות (דקה אחת בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס) ודגירה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    4. חזור על הצנטריפוגה (14,000 × גרם, 10 דקות, 4-8 מעלות צלזיוס). שלבו את הסופרנטנטים משני שלבי המיצוי.
    5. בצע צנטריפוגת הבהרה סופית (14,000 × גרם, 10 דקות, 4-8 מעלות צלזיוס). העבירו את הסופרנטנט המטוהר לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל לניתוח במורד הזרם.
      הערה: הנח את דגימות הצואה לאחר האיסוף במקפיא של -80 מעלות צלזיוס תוך שעתיים, ומזער את מחזורי ההקפאה-הפשרה כדי להבטיח יציבות מטבוליט.

2. בידוד עורק הכליה

  1. בחירת משתתפים ואיסוף רקמות
    1. סקר חולים העוברים כריתת כליה רדיקלית לקרצינומה של תאי כליה. כלול רק את אלה בגילאי ≥ 18 שנים ללא מחלות נלוות מטבוליות (למשל, יתר לחץ דם ראשוני, סוכרת). במהלך הניתוח יש לאסוף פרנכימה כלייתית תקינה מבחינה היסטולוגית הממוקמת לפחות 3 ס"מ משולי הגידול.
    2. טבלו מיד את הדגימות שנקטפו במאגר קרבס-הנסלייט מחומצן (4 מעלות צלזיוס, pH 7.4; הרכב במ"מ: 119.0 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1.0 MgCl2, 25.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 גלוקוז). השלם את הליכי הבידוד תוך 6 שעות מהניתוח.
  2. הכנת רקמת כליה
    1. בצע חתך עטרה במאגר קרבס של 4 מעלות צלזיוס כדי להשיג דגימות המינפריות המכילות מבנים הילריים שלמים. בצע מיקרודיסקציה באמצעות מערכת סטריאומיקרוסקופית (הגדלה פי 40) כדי לחשוף ענפי עורק קשת כליה ולזהות עורקים קשתיים.
  3. דיסקציה מיקרו-וסקולרית
    1. השג בידוד מדויק של מקטעי עורקים באמצעות הסרה רציפה של רקמה אדוונטיאלית פריוסקולרית באמצעות מספריים מיקרו-קרנית.
    2. שמור על מקטעי העורקים בקוטר של כ -500 מיקרומטר.
    3. צמצם את מתח הגזירה של האנדותל באמצעות מניפולציה נטולת מתח עם מיקרו-מלקחיים. בצע את הדיסקציה בתנאים היפותרמיים (4 מעלות צלזיוס) עם חידוש מאגר קרבס כל 15 דקות כדי לשמר את ה-pH הפיזיולוגי וההומאוסטזיס היוני.
      הערה: כימות מפורש של מידות העורקים והרכב המאגר, זרימת עבודה מווסתת תרמית מהרכש (4 מעלות צלזיוס) ועד לעיבוד (4 מעלות צלזיוס), ודיסקציה מיקרו-וסקולרית מלאה תוך 6 שעות לאחר איסוף הדגימות מבטיחים כדאיות רקמה אופטימלית ושלמות תפקודית.

3. דגירה של עורק הכליה עם מטבוליטים של פגיעה בלב

  1. הכנת רקמת כלי דם: לנתח עורקי כליה באופן מיקרוכירורגי בתנאים סטריליים, ולהסיר בקפידה את רקמת החיבור הפרי-וסקולרית הדבוקה באמצעות מלקחיים עיניים עדינים. חתכו את עורקי הכליה המבודדים למקטעים של 2 מ"מ באמצעות מספריים סטריליים לתרבית אורגנוטיפית לאחר מכן.
  2. טיהור אנטיביוטיקה: שטפו את מקטעי כלי הדם במשך 3 x 5 דקות עם מי מלח עם פוספט (PBS) בתוספת קוקטייל אנטיביוטי/אנטי-פטרייתי משולש כדי למזער זיהום מיקרוביאלי ולהבטיח סטריליות לפני חשיפה למטבוליטים.
  3. קיבוץ ניסיוני: הקצה באופן אקראי מקטעי כלי דם לארבע קבוצות ניסוי והעביר לצלחות תרבית של 24 בארות המכילות 500 מיקרוליטר של מדיום הנשר השונה של דולבקו לבאר.
  4. התערבות מטבוליט
    1. הוסף מטבוליטים מהקבוצות הבאות: 1) מטבוליטים בריאים שמקורם בפלזמת בקרה (HC-P); 2) מטבוליטים שמקורם בפלזמה של חולי אי ספיקת לב (HF-P); 3) מטבוליטים בריאים שמקורם בצואה (HC-F); 4) מטבוליטים שמקורם בצואה של חולי אי ספיקת לב (HF-F).
    2. להרכיב מחדש תמציות מטבוליט במתנול (בדרגת HPLC) ולתת 10 מיקרוליטר מכל תמצית לבאר המתאימה של צלחת התרבית בת 24 הבארות, המכילה 500 מיקרוליטר של מדיום הנשר השונה של Dulbecco ומקטעי עורק הכליה (ריכוז ממס סופי של 2% (v/v)). הוסף נפחים שווים של רכב (תערובת מתנול/PBS) לבארות הבקרה.
  5. תנאי תרבית: דגרו את מכלולי הצלחות בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות) למשך 24 שעות באמצעות חממה לחה.

4. בדיקת טבעת עורק הכליה

  1. מתלה וקיבוע טבעת עורקי כליה
    1. הכנת חוטים: השחילו שני חוטי נירוסטה מקבילים בגודל 2 ס"מ (מאוזנים מראש בקרבס, 95% O2/5% CO2) דרך לומן העורקי במיקרוסקופיה אופטית, תוך הבטחת בליטת חוט שווה בשני הקצוות.
    2. הרכבה מיוגרף: הפעל את מערכת החימום והגז כדי לשמור על טמפרטורה פיזיולוגית וחמצון. אבטח חוטים אופקית באמבט מיוגרף תיל מבוקר טמפרטורה (קרבס, 95% O2/5% CO2). כוונן את ידיות הברגים כדי לשמור על הרפיה טבעית של כלי הדם.
  2. קביעת המתח הראשוני האופטימלי עם נורמליזציה ספציפית לכלי
    הערה: מתח המנוחה הותאם באמצעות הליך נורמליזציה כדי לתקנן את תנאי הבסיס, לייעל את תגובת כלי השיט ולהבטיח שחזור. שיווי משקל למשך 30 דקות לפני שתמשיך בנורמליזציה.
    1. בחר הגדרות נורמליזציה מתפריט DMT , תוך שימוש בפרמטרים הבאים: כיול עינית: 1 מ"מ/div; לחץ מטרה: 13.3 kPa; יחס IC1/IC100: 0.9 C; ממוצע מקוון: 3 שניות; זמן עיכוב: 60 שניות.
      הערה: רקע נוסף ופרטי תצורת מערכת מסופקים במסמך17 המוזכר.
    2. כדי לנרמל כלי שיט, בחר את הערוץ המעניין ואכלס את מסך הנורמליזציה בנתונים. הגדר נקודות קצה של רקמות על סמך קריאת המיקרומטר וקוטר החוט של 40 מיקרומטר.
    3. החל מתיחה פסיבית והמתן 3 דקות. יש לתת 60K+ כדי לגרום להתכווצות בתיווך אשלגן ולהמתין עד שההתכווצות תגיע למישור. שטפו את התכשיר 3 x 5 דקות בתמיסת קרבס כדי לשטוף את ה-60K+. חשב את הכוח הפעיל על ידי הפחתת הכוח הפסיבי בכל רמת מתיחה מהכוח המושרה על ידי אשלגן שנרשם על המעקב.
    4. חזור על שלב 4.2.3 עד להשגת הכוח הפעיל המרבי. הגדר מתח מנוחה אופטימלי כרמה המניבה מתח פעיל מקסימלי בכל עורק, עם תגובות שיא ל-K+ גבוה המשמשות כהתכווצויות ייחוס.
    5. אזנו את הטבעת העורקית למשך 10 דקות לפני ניסויים נוספים.
      הערה: בשל שונות בין-אישית משמעותית בדרגות כלי הדם, בעובי ובמקורות, נרמל כל כלי דם בנפרד כדי להבטיח שחזור. השתמש במודול הנורמליזציה של מערכת מיוגרף החוט כדי לקבוע את מתח הבסיס המתאים על סמך הקוטר הפסיבי והתכונות המכניות של כל כלי. החל את ההליך באופן עקבי על כל הדגימות לפני בדיקה פונקציונלית.
  3. זיהוי תגובתיות של טבעות עורקי הכליה
    1. כדי לחקור את ההשפעות של מטבוליטים שונים על התכווצות כלי הדם, בצע בדיקות תפקוד התכווצות כלי דם באמצעות עורקי כליה שהודגרו עם מטבוליטים של פלזמה וצואה שחולצו ממתנדבים בריאים וחולי HF למשך 12 שעות. לפרטים ספציפיים, עיין בסעיף 3.
    2. השתמש ב-60K+ כדי לעורר התכווצות בתיווך אשלגן. ודא שלכל תא יש תמיסת קרבס של 5 מ"ל.
    3. כדי לקבוע התכווצויות תלויות ריכוז הנגרמות על ידי פנילפרין (Phe) בטבעות העורקים, הוסף Phe במרווחים של חצי לוג מ-10-9 ל-10-4 M. התחל עם ריכוז ה-Phe הנמוך ביותר, הכנס אותו לתא, והמתן להתכווצות יציבה.
    4. סמן את הנקודה שבה מגיעים להתכווצות קבועה (כלומר, רשום את ערך המתח במישור), ואז המשך לריכוז הבא. חזור על הפעולה עד להוספת הריכוז הסופי בהצלחה.
    5. לאחר סיום הניסוי, שמור את קובץ הנתונים והסר את טבעות העורקים. נקו היטב את החדר עם תמיסת חומצה אצטית של 8%, ואז דגרו למשך 3 דקות.
    6. כבה את מערכת החימום והגז, וודא שכל הנוזלים הוסרו לפני כיבוי הגז.

5. בדיקה היסטופתולוגית של עורק הכליה: צביעת המטוקסילין-אאוזין

הערה: השלך ריאגנטים מסוכנים ופסולת ביולוגית בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית והיגיינה כימית מוסדיים. באופן ספציפי, יש לאסוף קסילן ופרפורמלדהיד במיכלי פסולת כימית מסומנים ואטומים ולאחסן באזור מכסה אדים ייעודי לפני סילוקם על ידי מטפלים מוסמכים בפסולת מסוכנת. יש לנטרל חומצה אצטית המשמשת לניקוי תא מיוגרף ולהשליך אותה בהתאם להליכים סטנדרטיים לסילוק פסולת חומצה. אין לפרוק אף אחד מהריאגנטים הללו לכיורי מעבדה.

  1. שטפו את העורקים ב-PBS קר וקבעו ב-4% פרפורמלדהיד (pH 7.4) למשך הלילה. חותכים חתכים טוריים ב-4 מיקרומטר ומעבדים להיסטולוגיה.
  2. דגרו על קטעי רקמה המותקנים על שקופיות זכוכית במייבש שקופיות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן העבירו מיד לקסילן. טבלו את החלקים בקסילן (3 x 5 דקות).
  3. הכפיף את הסעיפים להידרציה מדורגת: 100% אתנול (2 x 5 דקות), 95% אתנול (1 x 5 דקות), 90% אתנול (1 x 5 דקות), 80% אתנול (1 x 5 דקות), 70% אתנול (1 x 5 דקות), שטוף במים טהורים במיוחד (1 x 5 דקות).
  4. כתם עם המטוקסילין (0.5% משקל/נפח) למשך 5 דקות; ואז לשטוף תחת מים זורמים.
  5. יש להבדיל עם אלכוהול חומצי 1% (HCl-ethanol) למשך 5-10 שניות ולשטוף תחת מים זורמים.
  6. כחול את החלקים במי אמוניה 0.6% ושוטפים תחת מים זורמים.
  7. טבלו את החלקים בתמיסת אאוזין (1% משקל/נפח) למשך 2 דקות.
  8. יבש ונקה את החלקים ב-95% אתנול (2 x 5 דקות), 100% אתנול (2 x 5 דקות) וקסילן (2 x 5 דקות).
  9. יבש באוויר לזמן קצר עד להשגת שקיפות אופטית, הרכיב במדיום הרכבה, כסה בכיסויים ואטום את החלקות הכיסוי במדיום הרכבה ניטרלי.
  10. בצע הדמיית שדה בהיר והערכה היסטומורפומטרית.

6. איתור סמנים ביולוגיים מולקולריים הקשורים לפגיעה כלייתית

  1. מיצוי mRNA של עורק הכליה
    1. הוסף את רקמת כלי הדם השמורה בהקפאה בחנקן נוזלי ל-1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA והעביר להומוגניזטור רקמות מקורר מראש להומוגניזציה יסודית.
    2. הוסף 250 מיקרוליטר כלורופורם לכל 100 מיקרוליטר של מגיב המיצוי, מערבולת במרץ במשך 30 שניות ודגירה למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 × גרם (10 דקות, 4 מעלות צלזיוס) ולהעביר את השלב המימי לצינור טרי.
    4. מוסיפים 500 מיקרוליטר איזופרופנול לשלב הימי, מערבבים בהיפוך ודוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
    5. צנטריפוגה בחום של 12,000 × גרם (10 דקות, 4 מעלות צלזיוס) והשליכו את הסופרנטנט.
    6. שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל של 75% אתנול (2 x 5 דקות), יבשו באוויר את כדור ה-RNA והשעו מחדש ב-DEPC-H2O (0.1% v/v).
      הערה: ודא את טוהר ה-RNA (OD260/OD280 = 1.9-2.0) ואשר רצועות 28S/18S rRNA שלמות.
  2. סינתזת cDNA
    1. מערבבים 2 מיקרוגרם mRNA + 1 מיקרוליטר פריימר אוליגו(dT), מכווננים ל-8 מיקרוליטר עם DEPC-H2O (0.1% v/v), מחממים ב-70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ומצננים בהצמדה על קרח למשך 5 דקות.
    2. הכן את תערובת מאסטר התמלול ההפוך ב-10 מיקרוליטר של תערובת תגובה TS 2x, 1 מיקרוליטר של תערובת אנזים RT/RI ו-1 מיקרוליטר של מסיר gDNA. הוסף את 12 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ל-8 מיקרוליטר של תערובת RNA/פריימר משלב 6.2.1 כדי להשיג נפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.
    3. מחממים את התערובת משלב 6.2.2. ב-42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ומסיימים את התהליך על ידי חימום ב-85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. לדלל את 20 מיקרוליטר של תגובת שעתוק הפוך על ידי הוספת 80 מיקרוליטר של H2O נטול נוקלאז, וכתוצאה מכך נפח סופי של 100 מיקרוליטר (דילול פי 4). השתמש ב-cDNA המדולל כתבנית ל-PCR כמותי.
  3. ניתוח PCR כמותי
    1. הגדר את התגובה על ידי ערבוב של 2.0 מיקרוליטר של תבנית cDNA, 0.5 מיקרוליטר של פריימר קדימה (10 מיקרומטר), 0.5 מיקרוליטר של פריימר הפוך (10 מיקרומטר), 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר SYBR Green (2x) ו-7 מיקרוליטר של ddH2O.
    2. בצע את ה-PCR באמצעות ההגדרות הבאות: דנטורציה ראשונית: 95 מעלות צלזיוס/3 דקות; 40 מחזורים: 95 מעלות צלזיוס/30 שניות; TM-5 מעלות צלזיוס/30 שניות; 72 מעלות צלזיוס/30 שניות; עקומת התכה: 65-95 מעלות צלזיוס (+0.5 מעלות צלזיוס/5 שניות).
    3. לנתח את ביטוי הגנים בשיטת 2-ΔΔct. רצפי הפריימר מוצגים בטבלה משלימה S2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקבוצה כללה שתי נקבות ושני זכרים, בטווח גילאים של 46 עד 73 שנים (גיל ממוצע: 64.0 שנים). מדידות לחץ הדם הבסיסיות הראו לחץ דם סיסטולי שנע בין 109 ל-168 מ"מ כספית ולחץ דיאסטולי בין 68 ל-115 מ"מ כספית. לכל חולי HF הייתה היסטוריה תרופתית מתועדת, כולל חומרים נפוצים להגנה על הלב כגון חוסמי בטא, סטטינים ותרופות נוגדות טסיות, עם וריאציות אינדיבידואליות במעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין ומשתנים. לביקורת, גייסנו ארבעה נבדקים ללא כל מחלת לב או תסמינים או סימנים הקשורים ל-HF, כפי שאושר על ידי התייעצות עם רופא, בדיקה גופנית ובדיקות מעבדה.<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר שנערך לאחרונה ב-CRS זיהה תכנות מחדש מטבולי כמנגנון פתולוגי מרכזי, כאשר מטבוליטים מווסתים הומאוסטזיס של כלי הדם בכליות 7,8,9. בעוד ש-VSMCs ממלאים תפקיד קריטי בוויסות טונוס כלי הדם ותאימות ב-CRS, המחקר שלנו מספק ראיות ישירות לכך שמטבוליטים הקשורים לפגיעות לב פוגעים בהתכווצות השריר החלק בכלי הדם ובשלמות המבנית. באופן ספציפי, הממצאים שלנו מראים כי מטבוליטים שמקורם בפלזמה ובמעיים בחולי אי ספיקת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח של סין (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 ל-Y.Z., 2021YFF0501404 ל-Y.L.), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82325004 ו-92168114 ל-Y.Z., 82300286 ל-J.Z., 92168113 ל-E.D., 82170422 ל-Y.L.), מעבדת Haihe של קרן החדשנות של המערכת האקולוגית התאית (No. HH22KYZX0047 ל-E.D), קרן הפוסט-דוקטורט למדע בסין (BX20220023, 2022M720288 עד J.Z.), קרן מדעי הטבע של בייג'ינג (7252157 עד J.Z.). הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (7232096 ל-Y.L.), פרויקט מחקר של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין במעבדת המפתח הממלכתית להומאוסטזיס ושיפוץ כלי דם (אוניברסיטת פקין; 2024-VHR-SY-07 עד Y.Z.). איור 1 נוצר עם Biorender.com עם רישיונות מאושרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM גלוקוז גבוהג'יבקוקט# 06-1055-57-1-ACS
PBSסולארביוחתול# P1010
פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין Bתרמו פישר סיינטיפיקCat# 15240062
פנילפריןMCEחתול#HY-B0769
מערכת שעתוק הפוךפרומגהחתול# A5001
מערכת סטריאומיקרוסקופיתלייקהM80
מיקס מאסטר ירוק SYBRתרמו פישר סיינטיפיקCat# 4309155
מערכת מדידת מתח כלי דםDMT620 מיליון

מקורות

  1. Cases and observations illustrative of renal disease, accompanied with the secretion of albuminous urine. Med Chir Rev. 25 (49), 23-35 (1836).
  2. Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
  3. KDIGO 2020 clinical practice guideline for diabetes management in chronic kidney disease. Kidney Int. 98 (4S), S1-S115 (2020).
  4. Amatruda, J. G., et al. Reninangiotensinaldosterone system activation and diuretic response in ambulatory patients with heart failure. Kidney Med. 4 (6), 100465(2022).
  5. Valente, M. A., et al. Diuretic response in acute heart failure: clinical characteristics and prognostic significance. Eur Heart J. 35 (19), 1284-1293 (2014).
  6. Damman, K., et al. Renal effects and associated outcomes during angiotensinneprilysin inhibition in heart failure. JACC Heart Fail. 6 (6), 489-498 (2018).
  7. Curaj, A., et al. Cardiovascular consequences of uremic metabolites: an overview of the involved signaling pathways. Circ Res. 134 (5), 592-613 (2024).
  8. Wang, J., et al. New insights into the pathophysiological mechanisms underlying cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 12 (12), 12422-12431 (2020).
  9. Zou, D., Li, Y., Sun, G. Attenuation of circulating trimethylamine Noxide prevents the progression of cardiac and renal dysfunction in a rat model of chronic cardiorenal syndrome. Front Pharmacol. 12, 751380(2021).
  10. Zhang, S., et al. Sensing ceramides by CYSLTR2 and P2RY6 to aggravate atherosclerosis. Nature. 641 (8062), 476-485 (2025).
  11. Zhang, J., Bottiglieri, T., McCullough, P. A. The central role of endothelial dysfunction in cardiorenal syndrome. Cardiorenal Med. 7 (2), 104-117 (2017).
  12. Guo, J., et al. Vasculopathy in the setting of cardiorenal syndrome: roles of proteinbound uremic toxins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 313 (1), H1-H13 (2017).
  13. Khandait, H., Sodhi, S. S., Khandekar, N., Bhattad, V. B. Cardiorenal syndrome in heart failure with preserved ejection fraction: insights into pathophysiology and recent advances. Cardiorenal Med. 15 (1), 41-60 (2025).
  14. Gabbin, B., et al. Toward human models of cardiorenal syndrome in vitro. Front Cardiovasc Med. 9, 889553(2022).
  15. Gabbin, B., et al. Heart and kidney organoids maintain organspecific function in a microfluidic system. Materials Today Bio. 23, 100818(2023).
  16. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  17. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and realtime recording of dynamic tension changes along vessel diameter. J Vis Exp. (184), e64121(2022).
  18. Lai, Y., et al. Gut microbiotaderived metabolites: potential targets for cardiorenal syndrome. Pharmacol Res. 214, 107672(2025).
  19. Brunt, V. E., et al. TrimethylamineNoxide promotes agerelated vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in mice and healthy humans. Hypertension. 76 (1), 101-112 (2020).
  20. Wang, B., Qiu, J., Lian, J., Yang, X., Zhou, J. Gut metabolite trimethylamineNoxide in atherosclerosis: from mechanism to therapy. Front Cardiovasc Med. 8, 723886(2021).
  21. Seldin, M. M., et al. Trimethylamine Noxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogenactivated protein kinase and nuclear factorκB. J Am Heart Assoc. 5 (2), 002767(2016).
  22. Watanabe, H., et al. pCresyl sulfate, a uremic toxin, causes vascular endothelial and smooth muscle cell damages by inducing oxidative stress. Pharmacol Res Perspect. 3 (1), e00092(2015).
  23. Muteliefu, G., et al. Indoxyl sulfate promotes vascular smooth muscle cell senescence with upregulation of p53, p21, and prelamin A through oxidative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (2), C126-C134 (2012).
  24. Kotlyarov, S., et al. Immunology of atherosclerosis: problems and prospects of immunotherapy. Vessel Plus. , (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.