שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד להגדיר ולבצע ביעילות ניתוחים אוטומטיים של נתוני הדמיה של תאים חיים המתקבלים ממעקב אחר ההובלה הנוקליאוציטופלזמית באמצעות כלים אופטוגנטיים.

תקציר

הובלה נוקלאוציטופלזמית (NCT) חיונית לשמירה על הומאוסטזיס תאי, ושיבושה מעורב במחלות שונות, כולל הפרעות ניווניות וטרשת אמיוטרופית לרוחב. זה מדגיש את הצורך בפיתוח כלים לניטור וכימות NCT. בין הכלים הללו, בדיקות האופטוגנטיקה המהירות וההפיכות, LEXY (מערכת ייצוא גרעינית הניתנת להשראת אור) ו-LINuS (אות לוקליזציה גרעינית המושרה באור), מאפשרות מדידה של דינמיקת NCT בתאים חיים.

הפרסומים המקוריים מתארים פילוח ידני וכימות של אות הבדיקה הפלואורסצנטית בגרעין ובציטוזול בעת טרנספקציה של מבני LEXY ו-LINuS בהדמיית תאים חיים. עם זאת, גם טרנספקציה וגם פילוח ידני מגבילים את מספר התאים שניתן לנתח ונתונים לחוסר דיוק עקב שגיאות פוטנציאליות תלויות משתמש. בעוד שהמהירות הגבוהה וההפיכות המסופקות על ידי אופטוגנטיקה אמורות, באופן עקרוני, לאפשר רגישות גבוהה בזיהוי שינויים בדינמיקת NCT, זה תלוי בפרמטרי הרכישה ובניתוח של מספר מספיק של תאים.

לכן הקמנו וקטורים לנטי-ויראליים המבטאים LEXY ו-LINuS כדי ליצור קווי תאים יציבים, בדקנו סמני הדמיה חיים ותנאי בקרה, ויישמנו צינור ניתוח תמונה חצי אוטומטי המאפשר ניתוח של מאות תאים. שיטת ניתוח זו משתמשת בתוכנת הגישה הפתוחה FIJI, נגישה למתחילים בביואינפורמטיקה, ואינה דורשת הגדרות מחשב מתקדמות. כאן אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב להגדרת LEXY כדוגמה לכלים אופטוגנטיים אלה לניטור ייצוא גרעיני, מהכנת הדגימות ועד לרכישת הדמיה של תאים חיים וניתוח אוטומטי, תוך הדגמה כיצד להתאים את הפרוטוקול לתנאים, בקרות או מודלים אחרים בכל מעבדה. כל הפלסמידים וקווי התאים המשמשים בפרוטוקול זה יהיו זמינים לקהילה המדעית, ובכך יגדילו עוד יותר את הנגישות של השיטה.

מבוא

החשיבות של הובלה נוקלאוציטופלזמית (NCT) לוויסות מסלולים תאיים מרכזיים ושמירה על הומאוסטזיס תאי נחקרה היטב במהלך השנים האחרונות¹. כתוצאה מכך, נוצרו מספר כלים לחקר הדינמיקה של ה-NCT ^2,3,4. בין הכלים הללו, בדיקות אופטוגנטיות LINuS⁵ ו-LEXY⁶, שפורסמו בהתאמה ב-2014 ו-2016, מספקות דרך רבת עוצמה לנטר NCT בתאים חיים. כלים אלה, שנועדו לעקוב אחר ייצוא השראה (LEXY) או ייבוא (LINuS) של מדווח פלואורסצנטי, ניתנים להשראה על ידי חשיפה לאור כחול והפיכים.

בקצרה, שתי הבדיקות הקטנות הללו משתמשות בתכונות של תחום LOV2 מהחלבון פוטוטרופין-1 של הצמח Avena sativa⁷. בהיעדר אור כחול, סליל Jα מתחום LOV2 מצולם ומוטמע בליבת החלבון. מכיוון שסליל Jα יכול להגיב לגירוי אור, הארה על ידי אור כחול גורמת לשינוי קונפורמציה ולניתוק העגינה של סליל Jα מתחום LOV2. המחברים של LEXY ו-LINuS השתמשו ברגישות אור זו כדי להתיך אות לוקליזציה גרעינית (NLS) או אות ייצוא גרעיני (NES) לסליל Jα, עבור LINuS ו-LEXY, בהתאמה (איור 1). הכלי המתקבל הוא בדיקה שעוברת לגרעין (LINuS) או לציטוזול (LEXY) עם תאורת אור כחול.

כדי לעקוב אחר הבדיקות עם הדמיה פלואורסצנטית, נוסף גם מדווח פלואורסצנטי mCherry למבנים. לבסוף, NES חלש (עבור LINuS) או NLS (עבור LEXY) נוסף למערכת כדי להבטיח שהבדיקות לא היו בלוקליזציה הסופית שלהן לפני תאורת האור הכחול, מה שימנע התבוננות בטרנסלוקציה של LEXY או LINuS בין הגרעין לציטוזול.

איור 1: ייצוג של בדיקות LEXY ו-LINuS. שתי הבדיקות מורכבות מחלבון mCherry המאוחה לתחום LOV2 הרגיש לאור. ההבדל בין שני הכלים טמון ברצף האיתות המוסתר על ידי סליל Jα: NES עבור LEXY ו-NLS עבור LINuS. לשתי הגשושיות יש גם רצף אותות חלש כדי לשלוט בלוקליזציה הראשונית שלהן: NLS חלש עבור LEXY ו-NES חלש עבור LINuS. הפעלת המערכות על ידי תאורת אור כחול גורמת אפוא לייצוא שלהן ל-LEXY או לייבוא שלהן ל-LINuS, מה שמאפשר למשתמשים לפקח על ייצוא או יבוא גרעיני. קיצורים: LEXY = מערכת ייצוא גרעינית הניתנת להשראה אור; LINuS = אות לוקליזציה גרעינית המושרה באור; NLS = אות לוקליזציה גרעינית; NES = אות ייצוא גרעיני. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הלוקליזציה של הקרינה mCherry מדווחת על העברת בדיקות LEXY ו-LINuS בין גרעינים לציטוזול, ולכן ניתן לעקוב אחריה בהדמיית תאים חיים, מה שמאפשר למשתמשים לנטר NCT. בנוסף לשימוש כבדיקות פשוטות, ניתן להנדס את LEXY ו-LINuS גם כדי לשלוט בלוקליזציה ולחקור חלבונים מעניינים, במבחנה 5,6,8,9 או in vivo ^10,11.

שיטת הכימות המוצעת בפרסומי LEXY ו-LINuS מראה את העוצמה הגרעינית היחסית של הגשושיות. הניתוח המוצע נעשה באופן ידני ומסתמך על מדידה של אזור עניין (ROI) בגרעין ובציטוזול. למרות ששיטה זו נותנת ייצוג טוב של אות הגשושית לאורך זמן, היא ארוכה ומייגעת מאוד, במיוחד כאשר ניסויים ותנאים חוזרים על עצמם. חשיבות, שיטה זו גם חסרה דיוק מכיוון שרק חלק קטן מהתא המעוצב מיוצג.

כאן אנו מציעים פרוטוקול חדש לכימות אותות פלואורסצנטיים של LEXY ו- LINuS. יישמנו טכניקות אוטומטיות, המאפשרות את הניתוחים ומספקות דיוק רב יותר. זה יקל על התהליך עבור משתמשים חדשים בכלים אלה ויעזור להגדיל את התפוקה. פרוטוקול הכימות שלנו משתמש בממשק אחד בלבד, תוסף הקוד הפתוח TrackMate¹² של FIJI. יש לציין כי כדי לשפר את אמינות הכמות, השתמשנו בסמן DNA אדום רחוק תואם הדמיה חיה כדי לבצע פילוח גרעין שלם עם StarDist¹³, רשת עצבית קונבולוציונית מאומנת, בשילוב עם מעקב ומדידה של האות הפלואורסצנטי של הגשושית עם TrackMate¹².

לאחר מכן ניתן לייצא בקלות את הנתונים המתקבלים לגיליון האלקטרוני המסופק והמוכן לשימוש (טבלה משלימה S1) כדי לקבל את העוצמה הגרעינית היחסית של כל גרעין שזוהה. פרוטוקול זה מסביר גם כיצד לאגד את הערכים המתקבלים בגרף על ידי התאמת עקומת מהלך הזמן המתקבלת למודל חד-מעריכי, כמו ב-Yoo ו-Mitchison¹⁴ וכיצד לחשב את קצב ההובלה עבור התנאים השונים שנבדקו. עם פרוטוקול זה והגיליון האלקטרוני המסופק לניתוח, המשתמשים יוכלו לכמת בקלות נתוני הדמיה של תאים חיים, אפילו עם כישורי ביואינפורמטיקה מוגבלים.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול הבא מתואר לניטור יצוא גרעיני עם הגשושית של LEXY. פרטים לגבי הגדרות להתאמה עבור LINuS מוצגים בסעיף 5.

1. תרבית תאים

הערה: יש לבצע את ההליך בסעיף זה במכסה מנוע בדרגת תרבית רקמות. השלבים המתוארים להלן עברו אופטימיזציה עבור קו התאים של NIH/3T3 פיברובלסטים¹⁵ , תוך שימוש ב-DMEM (או DMEM נטול פנול אדום כאשר מצוין), בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין כמדיום (ראה טבלת החומרים). עם זאת, משתמשים יכולים להתאים את ההליך לסוגי תאים אחרים. הפרוטוקול מתאים לתאים שעברו טרנספטציה או לקווי תאים יציבים. עם זאת, אנו ממליצים ליצור שורות תאים יציבות, כפי שהוזכר בסעיף הדיון.

1. הכן את תמיסת הציפוי עם 23 מיקרוגרם/מ"ל קולגן ו-2 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין ב-PBS סטרילי 1x. הוסף 800 מיקרוליטר מתמיסת הציפוי לכל צלחת הדמיה חיה (ראה טבלת חומרים) ושמור בחממה למשך 90 דקות.
2. שטפו את תערובת הציפוי עם PBS סטרילי 1x וזרע 60,000 תאים על צלחות ההדמיה החיה במדיה, לרכישה למחרת.
3. במידת הצורך, העבירו את התאים עם הפלסמיד LEXY על פי שיטת הטרנספקציה המתאימה ביותר לסוג התא בו נעשה שימוש. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, בצע טרנספקציה משותפת של הגשושית עם וקטור ריק כדי להגביר את היעילות, ביחס של 1:5 עבור LEXY:וקטור ריק. הגן על התאים מפני אור בקופסה חשוכה או בעזרת נייר אלומיניום ותן להם לצמוח למשך יום.
4. לפני הרכישה, צבעו את התאים בסמן DNA אדום רחוק התואם להדמיית תאים חיים, בתווך נטול פנול אדום, וודאו שהם מוגנים לחלוטין מאור עד לרכישה.
   הערה: במקרה שלנו, אנו משתמשים ב-SiR-DNA¹⁶ ב-1 מיקרומטר, מודגר לפחות שעה אחת לפני הרכישות.
5. כדי לשלוט בייצוא, השתמש במעכב הייצוא הגרעיני Leptomycin B¹⁷ ב-0.5 ננומטר (עיכוב יצוא קל) ו-1 ננומטר (עיכוב יצוא חזק), המופעל על התאים שעה אחת לפני הרכישה.

2. הדמיה

הערה: ניתן לבצע רכישות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תואם הדמיה חיה, בעל יכולת ליצור דפוס של רכישות נבחרות ותאורת לייזר פועמת של 458 ננומטר. ההדמיה שלנו בוצעה בחושך בתא של 37 מעלות צלזיוס (עם 5% CO₂) של מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקה תהודה. ההגדרה מותאמת למטרה של פי 20, ולכן מאפשרת הדמיה בו זמנית של מספר תאים באותו שדה ראייה. רצף ההדמיה מורכב משלושה שלבים, כמו באיור 2.

1. שלב יציב
   1. בצע רכישה אחת של אותות mCherry (LEXY, לייזר 561 ננומטר) ואדום רחוק (SiR-DNA, לייזר 633 ננומטר) כל 15 שניות, וחזור עליו פי 10, למשך זמן כולל של 150 שניות. ודא שלא נצפתה הלבנה או העברה של LEXY לציטוזול בשלב זה.
      זהירות: הארת המערכת באור כחול בשלב זה תפעיל את LEXY, מה שיגרום מיד לייצוא שלו לציטוזול.
2. שלב הארה
   הערה: שלב זה מורכב משלושה שלבים, החוזרים על עצמם פי 15.
   1. בצע תאורה פועמת עם אור כחול (לייזר 458 ננומטר), עם פולסים של 36 אלפיות השנייה החוזרים על עצמם פי 150, למשך זמן כולל של ~5 שניות.
   2. בצע רכישה אחת של אותות פלואורסצנטיים mCherry (LEXY, לייזר 561 ננומטר) ואדום רחוק (SiR-DNA, לייזר 633 ננומטר).
   3. הפסקה למשך 15 שניות.
3. שלב ההתאוששות
   1. בצע רכישה אחת של אותות mCherry (LEXY, לייזר 561 ננומטר) ואדום רחוק (SiR-DNA, לייזר 633 ננומטר) כל 15 שניות, חזור על 25x, למשך זמן כולל של 375 שניות.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי וניתן להסירו אם המשתמשים רוצים רק לצפות בייצוא של הגשושית ולא בשחזור.

איור 2: תצורה של שלושת השלבים של LEXY. כדי לפקח על ייצוא גרעיני עם LEXY, יש להגדיר שלושה שלבים בתוכנת המיקרוסקופ. החלק העליון מציין את התצורה לשימוש עבור רכישות הדמיית תאים חיים של LEXY. תצורה זו מורכבת משלב יציב, כדי להבטיח שהאות יציב בגרעין, שלב תאורה, כדי לגרום לטרנסלוקציה של LEXY מהגרעין לציטוזול, ושלב התאוששות, כדי לצפות ב-LEXY חוזר לגרעין. החלק התחתון של האיור מציין את התוצאות הצפויות עם הדמיית תאים חיים. באדום, ה-mCherry מציין את הלוקליזציה של LEXY. באפור, ה-SiR-DNA מכתים את גרעין התאים. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח עבור LEXY

הערה: כל ניתוח הפילוח והמעקב נעשה באמצעות פיג'י, עם TrackMate¹², תוסף פיג'י בקוד פתוח (הגרסה הנדרשת המפורטת בטבלת החומרים).

1. התקן את FIJI ולאחר מכן הורד את התוספים StarDist¹³ ו-TrackMate. כדי להתקין את התוספים, עבור אל עזרה | עדכון ... | נהל אתרי עדכונים וסמן את CSBDeep, StarDist ו-Trackmate-StarDist, ולאחר מכן לחץ על החל שינויים. הפעל מחדש את פיג'י.
2. בעוד שמיקרוסקופים מסוימים יכולים לקחת כל שלב רכישה (Stable-Illumination-Recovery) יחד, אחרים (למשל, המיקרוסקופ הקונפוקלי המוזכר) שומרים אותם בנפרד. לכן, שלב נוסף, אם משתמשים בתצורה זו, הוא לשרשר את השלבים יחד: פתח את התמונות של שלושת הרצפים, הפעל את פונקציית השרשור כדי להרכיב את שלושת שלבי ה-Time-lapse בקובץ יחיד: לחץ על Image | ערימות | כלים | שרשר ....
3. בחר את השלב היציב כ-Image1, את שלב התאורה כ-Image2 ואת שלב השחזור כ-Image3. התמונה המתקבלת היא תמונה בודדת עבור זמן-lapse של שלושת השלבים, כאשר ערוצי mCherry (ערוץ 1) ו-SiR-DNA (ערוץ 2) ממוזגים.
4. שמור את התמונה שהתקבלה לשלב הפילוח המאוחר יותר ושמור אותה: עבור אל קובץ | שמירה בשם | טיף....
5. פיצול ערוץ mCherry לבד עבור הניתוחים הבאים: עבור לתמונה | צבע | פיצול ערוצים ושמירתם: מעבר אל קובץ | שמירה בשם | טיף....
6. כדי לבדוק אם יש הלבנה בסופו של דבר במהלך הרכישה, הפעל את הפקודה פרופיל ציר Z בערוץ mCherry: עבור אל תמונה | ערימות | תרשים פרופיל ציר Z. בטבלה שנוצרה, לחץ על נתונים | העתק את מערך הנתונים הראשון והדבק אותו בגיליון האלקטרוני המוכן לשימוש המצורף לפרוטוקול זה (טבלה משלימה S1), מתחת לתא הפרופיל של ציר Z.
7. צייר אזור עניין מעגלי (ROI) בגודל הממוצע של גרעין ושמור אותו: עבור אל ניתוח | כלים | מנהל החזר ROI.... הוסף את ההחזר על ההשקעה ושמור אותו: עבור אל עוד | שמר...
   הערה: יש להשתמש באותו החזר ROI כדי למדוד את הרקע עבור כל התנאים שנותחו.
8. מקם את ההחזר על ההשקעה שנשמר באזור ללא תאים במהלך כל ה-Time-lapse ומדוד את העוצמה הממוצעת בתוך החזר ROI זה באמצעות פונקציית ממשק ה-ROI. ראשית, ודא שהערך האפור הממוצע מסומן על ידי לחיצה על נתח | הגדר מידות. לאחר מכן, לחץ על עוד | רב מדידה. סמן מדוד את כל 50 הפרוסות וגולמי אחד לכל פרוסה, ולחץ על אישור.
9. העתק-הדבק את כל הערכים המוצגים בגיליון האלקטרוני המצורף (טבלה משלימה S1), מתחת לתא "רקע החזר ROI".
10. בפיג'י, סגור את התמונה רק בערוץ mCherry ובחר את התמונה שנשמרה קודם לכן עם ערוצי mCherry ו-SiR-DNA הממוזגים.
11. פתח את התוסף TrackMate: עבור אל תוספים | מעקב | TrackMate.
12. בדוק שמספר נקודות הזמן נכון (0 עד 49 אם בוצעו השלבים המוצעים) ולחץ על הבא.
13. בחר את גלאי StarDist ולחץ על הבא.
14. בחר ערוץ 2 (SiR-DNA) כדי לפלח את הגרעינים ולחץ על הבא. המתן מספר שניות לסיום תהליך הפילוח. בדוק ויזואלית שהסגמנטציה שהתקבלה תואמת את גבול הגרעינים ולחץ על הבא (איור 3). במקרה של פילוח לא מדויק, שים לב למזהה הגרעין המתאים (SpotID) כדי לא לכלול אותו בניתוח נוסף בשלב 3.26.
15. השאר את פרמטרי ברירת המחדל ולחץ על הבא בחלון הגדרת הסף הראשוני. חלון זה נותן את מספר הכתמים המפולחים (גרעינים) בין 50 נקודות הזמן.
16. הגדר מסננים על ספוטים: צור והגדר מסננים:
    1. צור שני מסננים עם עוצמה ממוצעת ch1 כפרמטר להסרת גרעינים עם אות חזק מדי או חלש מדי, מה שעלול להטות את הניתוחים: מסנן אחד לבחירת ערכים מעל הסף המוגדר והשני לבחירת הערכים מתחת לסף. הגדר את הערך להסרת האות הנמוך מאוד או הרווי בלבד.
       הערה: ייתכן שלא יהיה צורך במסננים אלה אם נעשה שימוש בקווי תאים יציבים. שים לב לערכים אלה מכיוון שיש להחיל אותם מחדש עבור כל התנאים.
    2. צור שני מסננים אזור להסרת אובייקטים לא רצויים (פסולת, תאים גוססים או מתחלקים) מניתוחים: מסנן אחד לבחירת ערכים מעל הסף המוגדר והשני לבחירת הערכים מתחת לסף. לחץ על הבא.
       הערה: החל מחדש ערכים אלה עבור כל התנאים.
17. בחר גשש: בחר גשש LAP פשוט ולחץ על הבא.
18. בחר את הפרמטרים עבור המעקב. התאם את המרחק המקסימלי של קישור (כאן, 30 מיקרומטר) - המרחק המקסימלי שיורשה לקשר לאובייקטים בין מסגרות. השתמש במרחק המקסימלי של סגירת הפער (כאן, 15 מיקרומטר) ובמרווח המסגרת המקסימלי של סגירת הפער (כאן, 3) כדי להגדיר כמה נקודות של רצועה בודדת ניתן להשמיט מבלי להוציא את אותה רצועה. לחץ על הבא (איור 3).
    הערה: פרמטרים מוצעים אלה עברו אופטימיזציה עבור ההגדרה והמודל הסלולרי שלנו באמצעות גישת ניסוי וטעייה וייתכן שיהיה צורך להתאים אותם בניסוי.
    יש להתאים את המרחק המקסימלי כדי למנוע מעקב שגוי מגרעין אחד למשנהו, במיוחד אם התאים זזים הרבה.
19. לאחר החישובים, לחץ על הבא והגדר מסננים על רצועות. כדי לבחור רק גרעינים שהיו במעקב במהלך כל מסלול הזמן (50 נקודות זמן עם הרצף המוצע), בחר את המספר הגבוה ביותר של נקודות במסלול (מקם את הסמן על מעל 49 עבור הרצף המוצע). לחץ על הבא.
    הערה: זה יקל על הניתוח אך אפשרי רק אם עקבו אחר מספיק גרעינים במשך כל מהלך הזמן, אם לא: ראה דיון.
20. אפשרויות תצוגה: סמן הצג שמות נקודות כדי שתוכל לשחזר כל גרעין בניתוחים נוספים. התאם אישית את התכונות המוצגות בהתאם להעדפות המשתמש.
21. בתחתית העמוד, לחץ על מסלולים | ייצא ל- CSV כדי לשמור את הטבלה עם כל המידות. סגור את הטבלה ולחץ על הבא.
22. לחלופין, שרטט את תכונות המסלול עם T (זמן) כציר X והעוצמה הממוצעת של ch1 עבור ציר Y. לחץ על תכונות עלילה. סגור את הגרף ולחץ על הבא.
    הערה: זה ייתן למשתמשים מושג על הנטייה הכללית של הייצוא. בשלב זה, הוא אינו מנורמל לרקע ולעוצמה הראשונית.
23. לחץ על לכידת שכבת-על כפעולה ובצע | בסדר. התמונה שתיווצר תשמש לזיהוי הגרעינים המכומתים. שמירה: מעבר אל קובץ | שמירה בשם | טיף....
24. בקובץ גיליון אלקטרוני, ייבא את קובץ ה- CSV שהושג באמצעות TrackMate: בכרטיסיה נתונים, בקבוצה קבל והמר נתונים, לחץ על מטקסט/CSV וייבא.
25. בחר את כל ארבע העמודות הבאות על ידי לחיצה על האות המתאימה להן והעתק והדבק אותן בחלק העליון של הגיליון האלקטרוני המצורף (טבלה משלימה S1), עמודות A עד D, עם הרקע: מזהה ספוט (B), מזהה מסלול (C), מסגרת (I), עוצמה ממוצעת ch1 (M).
    הערה: ודא שתחילת המידות המודבקות מתחילה בשורה 6 של טבלה משלימה S1. אם זה לא המקרה, המדידות עלולות להיות מוסטות מתא אחד או יותר ולכן להיות שגויות. עיין בגיליון האלקטרוני של טבלה משלימה S2 כדי לקבל דוגמה לנטייה הצפויה.
26. מיין את התוצאות בסדר אלפביתי תחילה לפי TrackID (גרעין בודד) על ידי לחיצה על החץ בתא B5 ומסגרת (נקודת זמן) על ידי לחיצה על החץ בתא C5.
27. כדי להסיר רעשי רקע, הפחיתו את הערכים שהתקבלו בשלב 3.8 מכל ערך שהתקבל בעוצמה ממוצעת ch1 (מחושב מראש בגיליון האלקטרוני המצורף, ראה טבלה משלימה S1).
28. כדי לנרמל את האות של LEXY, חשב את העוצמה הממוצעת של האות הפלואורסצנטי mCherry בשלב היציב (מסגרות 0 עד 9). לאחר מכן, חלקו את כל התוצאות שהתקבלו בעוצמה הממוצעת ch1 בעוצמה הממוצעת של השלב היציב (מחושב מראש בגיליון האלקטרוני המצורף, ראה טבלה משלימה S1).
    הערה: המספר המתקבל הוא עוצמת הפלואורסצנט הגרעינית הממוצעת של LEXY. כל המידות כבר מוצגות על ידי גרעינים מעמודה L וניתן לשרטט אותן בגרף.

איור 3: ניתוח TrackMate באמצעות FIJI. למעלה, ייצוג סכמטי של ניתוחי TrackMate, בתחתית, תמונות שהתקבלו מניתוחי פיג'י. הייצוג הראשון משמאל מראה את צביעת ה-SiR-DNA הלא מקוטע, סמן של הגרעין, באפור. הפאנל השני מייצג את הפילוח האוטומטי שבוצע עם ערוץ SiR-DNA על ידי Stardist. הגרעינים צבועים בהתאם לעוצמת תעלת ה- mCherry כדי להקל על ההדמיה והשלב הסופי. הפאנל השלישי מציג את המסלולים המתקבלים על ידי מעקב אחר צביעת SiR-DNA בנקודות הזמן של כל רצף הדמיית התאים החיים. הפאנל האחרון מימין מציג את האות הפלואורסצנטי של LEXY, באדום, באזור המוגדר על ידי הפילוח, שיימדד עבור כל נקודת זמן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. קצב הובלה, סטטיסטיקות ומספרים

1. שרטט את גרף העוצמה הגרעינית היחסית.
   1. פתח את GraphPadPrism וצור גיליון: לחץ על Enter או ייבא נתונים לטבלה חדשה, ובאפשרויות, בחר את הזמנים שחלפו עבור X ואת המספר המרבי של גרעינים מפולחים עבור ערכי השכפול בעמודות משנה זה לצד זה עבור Y. לחץ על צור והדבק את הנתונים שהתקבלו בטבלה.
   2. עבור ערכי X (זמן), אם הפרמטרים של רכישות נשמרו כפי שהוצע, העתק והדבק את העמודה תחת 'זמן' בגיליון האלקטרוני המצורף. אחרת, התאם את הערכים בהתאם לפרמטרים המשמשים.
   3. כדי ליצור את הגרף של עוצמת הגרעין היחסית, עבור לסעיף גרפים. בחר XY כמשפחת הגרפים ונקודות וקו חיבור עם קווי שגיאה כסוג הגרף.
   4. בקטע עלילה , בחר ממוצע, שגיאה ו- SEM ולחץ על אישור כדי לראות את הגרפים. שנה את המאזניים והוויזואליה בהתאם לפרמטרים שנבחרו.
2. התאם את העוצמה הגרעינית היחסית למודל חד-מעריכי.
   1. במקטע טבלת נתונים , לחץ על טבלת נתונים חדשה.
      1. בחר הזן ערכי X כ- X ו - Enter והתווה ערך Y יחיד עבור כל נקודה כ- Y, ולחץ על צור.
      2. בעמודה X , דווח על הזמנים בעשרוניים רק עבור השלבים היציבים וההארה; אם הפרמטרים המוצעים לרכישות נשמרו, העתק והדבק את העמודה תחת 'זמן עשרוני' בגיליון האלקטרוני המצורף, טבלה משלימה S1.
      3. הדבק את הערכים המתקבלים כעוצמה גרעינית יחסית בטבלה, רק עבור השלבים היציבים וההארה.
      4. במקטע תוצאות , בחר את הניתוח הבא: ניתוחי XY | אקספוננציאלי | רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) ולחץ על אישור.
      5. בפרמטרים, בחר רמה ואחריה דעיכת פאזה אחת כמודל, ובפרמטרים המגבלים, בחר קבוע השווה ל-2.25 כ-X0 (זמן ההתחלה של ההארה), קבוע השווה ל-1 כ-Y0 (עוצמה גרעינית יחסית בתחילת ההארה), קבוע השווה ל-0 עבור הרמה (הערכים שאליהם צריכה להישען העוצמה הגרעינית היחסית), ולציין ש-K (קצב הייצוא), צריך להיות גדול מ-0. השאר את הפרמטרים האחרים כברירת מחדל. לחץ על אישור.
      6. במקטע תוצאות , השורה K מציינת את כל שיעורי הייצוא עבור הגרעינים של המצב שנבדק.
      7. חזור על שלבים 4.2.1 עד 4.2.1.5 עבור התנאים האחרים במידת הצורך.
3. צור את גרף קצב הייצוא.
   1. צור טבלה חדשה: בחר הזן ערכי X כ-X ו-Enter והתווה ערך Y יחיד עבור כל נקודה כ-Y, ולחץ על צור.
   2. עבור כל תנאי (בעמודות), הדבק ובצע חילוף של ערכי K שהתקבלו בשלב הקודם.
   3. כדי ליצור את הגרף של קצב הייצוא, עבור לקטע גרפים, בחר עמודה כמשפחת גרפים, ובקטע תיבה וכינור, בחר עלילת כינור כסוג גרף, עם עלילת כינור. הצג את כל הנקודות כהתוויה. לחץ על אישור כדי לראות את הגרף. התאם אישית את אופן ייצוג הנתונים במידת הצורך.
   4. כדי להריץ בדיקה סטטיסטית לשיעור הייצוא, בצע מבחן t דו-צדדי של וולש, כמתואר ב-Yoo ו-Mitchison¹⁴, על ידי ביצוע השלבים הבאים:
      1. בטבלה המכילה את שיעורי הייצוא של כל התנאים, לחץ על ניתוח | השוואה בין קבוצות | T-Test (ובדיקות לא פרמטריות), בחר את התנאים לבדיקה ולחץ על אישור. סמן לא מזווג, כן השתמש במבחן פרמטרי, ומבחן t לא מזווג עם התיקון של וולש. אל תניח SDs שווים, ולחץ על אישור.
   5. צפה בתוצאות הניתוח בטבלה של סעיף התוצאות ודווח על גרף שיעור היצוא במידת הצורך.

5. התאמות ל-LINuS

הערה: ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול המתואר לעיל לניטור יבוא גרעיני עם LINuS על ידי החלת השינויים הבאים.

1. תרבית תאים
   1. במקום לפטומיצין B בשלב 1.5, השתמש ב-importazole¹⁸ כמעכב גרעיני, בריכוז של 10 מיקרומטר למשך שעה אחת לפני הרכישה.
2. דימות
   1. כדי לקבל יבוא אופטימלי של המערכת, החלף את 150 החזרות של פולסי תאורה של 36 אלפיות השנייה בלייזר 458 ננומטר בשלב 2.2.1 ב-250 חזרות למשך זמן כולל של ~9 שניות.
      הערה: תזמון הרצף יכול להיות תלוי בסוג התא, והפרמטרים עבור שני הבדיקות עשויים להזדקק להתאמה כדי להיות אופטימליים, מכיוון שהמערכות תלויות בזיהוי של NLS ו-NES, שהם ספציפיים לסוג התא^19,20.
3. קצב הובלה, סטטיסטיקות ומספרים
   1. במקום להתאים עקומה לרמה ואחריה דעיכה פאזה אחת בשלב 4.2.1.5, בחר את הרמה ואחריה ניתוח אסוציאציה פאזית אחת .
   2. הגבל את X0 ל-2.25, Y0 כ-1 ו-K (קצב הייבוא במקרה של LINuS) גדול מ-0.
      הערה: הניתוחים של LINuS עם TrackMate זהים לאלה של LEXY. העוצמה הגרעינית היחסית היא עדיין הערך שנמדד ונותח, אך במקום לצפות בירידה עקב ייצוא הגשושית, יש להבחין בהעשרה של האות הפלואורסצנטי בגרעין לאחר תאורת אור כחול.

תוצאות

הפרוטוקול הנ"ל אמור לאפשר למשתמשים לדמיין את הלוקליזציה והטרנסלוקציה של הגשושית במהלך הרכישה בהדמיית תאים חיים. דוגמה לתמונות הצפויות שנרכשו כדי להמחיש את הייצוא הגרעיני עם LEXY מוצגת באיור 4. יש להבחין בירידה מהירה של האות מהגרעין והעשרה בציטוזול לאחר כמה סיבובים של תאורת אור כחול. התאוששות הדרגתית של אות הגשושית יכולה להיות גלויה לאחר עצירת מחזורי התאורה. כדי לשלוט במערכת, Leptomycin B, מעכב ייצוא, מעיד שניתן להמחיש שינוי בייצוא באמצעות הניתוחים, מכיוון שהוא מונע ייצוא של LEXY על תאורת אור כחול (איור 4).

איור 4: ויזואליזציה של האות של LEXY לאורך זמן. לכידת נקודות זמן מייצגות של שלבי היציבות, ההארה וההתאוששות, שנרכשו באמצעות הדמיית תאים חיים. מצב המתנול מייצג את מצב הבקרה. עם תאורת אור כחול פועם, באדום, האות הפלואורסצנטי mCherry המדווח על מיקומו של LEXY, מועבר מהגרעין לציטוזול. לאחר הפסקת התאורה, האות מתאושש בגרעין. טיפול במעכב הייצוא Leptomycin B ב-1 ננומטר או 0.5 ננומטר מראה את היעדר או ירידה בייצוא של LEXY כאשר הייצוא נחסם. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לגבי הניתוחים, בעוד שערכי עקומת העוצמה הגרעינית היחסית במהלך הפאזה היציבה צריכים להיות בסביבות 1, לאחר הפעלת האור הכחול, הם צריכים להציג ירידה איטית עד הגעה לרמה בסוף שלב ההארה (איור 5A). אם הירידה מהירה מדי או איטית מדי, ניתן לייעל את פרמטרי הרכישה (ראה דיון). טיפול בלפטומיצין B בריכוזים מספיקים יכול גם לאשר שהניתוחים והטכניקה רגישים מספיק כדי להראות שהיצוא הגרעיני חסום לחלוטין, עם ערכי עוצמה גרעינית יחסית יציבים סביב 1 לכל הניסוי. עם זאת, ריכוזי לפטומיצין B בינוניים אמורים להראות יצוא גרעיני מתון (איור 5A). יש לאשר תצפיות חזותיות אלה באופן כמותי עם התאמת קצב הייצוא (איור 5B).

איור 5: העוצמה הגרעינית היחסית הצפויה של LEXY וקצב ההובלה. (A) הגרף מייצג את העוצמה הגרעינית היחסית של האות הפלואורסצנטי של LEXY לאורך זמן, מנורמל לעוצמה הממוצעת של mCherry של הפאזה היציבה. העוצמה הגרעינית היחסית של מצב המתנול (בקרה, אדום) יורדת בחצי לאחר ההארה, בניגוד לתאים שטופלו במעכב הייצוא לפטומיצין B, בריכוז של 0.5 ננומטר (כחול בהיר) או 1 ננומטר (כחול כהה). פסי שגיאה: SEM. (B) קצב הייצוא של תנאי הבקרה ולפטומיצין B, המתקבלים על ידי התאמת העקומה למודל חד-מעריכי. הערכים המתקבלים כאשר הייצוא נחסם על-ידי Leptomycin B נמוכים משמעותית ממצב הבקרה. N = 18 תאים למתנול (אדום), 19 תאים ללפטומיצין B 0.5 ננומטר (כחול בהיר) ו-15 תאים ללפטומיצין B 1 ננומטר (כחול כהה). ערכי P חושבו על ידי מבחן t דו-צדדי של וולש. P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵.: אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: גיליון אלקטרוני עם חישובים מוגדרים מראש. גיליון אלקטרוני זה מסופק כדי להקל על הניתוח. ניתן להעתיק ולהדביק ישירות את ערכי העוצמה המתקבלים עם TrackMate בגיליון האלקטרוני כדי לקבל את ערכי העוצמה הגרעינית היחסית המנורמלים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה S2: דוגמה לתוצאות הצפויות עבור מצב בקרה של ניתוח LEXY. הגיליון האלקטרוני מייצג דוגמה לערכים שהתקבלו עבור מצב בקרה של קו התאים היציב של LEXY. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

כפי שהוזכר בפרוטוקול, יצירת קווי תאים יציבים משפרת מאוד את איכות הניתוחים. ראשית, העובדה ש-100% מהתאים מבטאים את הגשושיות מגדילה את מספר הגרעינים המנותחים, מה שמחזק את החוסן של הניתוחים. שנית, זה מפחית את מוות התאים הנגרם על ידי ביטוי יתר של הבדיקות ואת הרעילות של ריאגנטים לטרנספקציה המשמשים. ולבסוף, זה מפחית את ההטרוגניות החזקה של אותות פלואורסצנטיים בין התאים. לפרמטר זה יש חשיבות מכיוון שאות רווי לא יאפשר זיהוי נכון של שינוי העוצמה לאחר ההארה. אותה מסקנה נכונה לגבי אותות חלשים, שעלולים להלבין או לא לאפשר כימות של הבדלים. לכן, אנו ממליצים תחילה לבדוק את הבדיקות על ידי טרנספקציה כדי לוודא שהן פועלות כראוי, להגדיר את פרמטרי הרכישה ולאחר מכן ליצור במהירות קווי תאים יציבים. יצרנו וקטורים של לנטי-וירוס עבור בדיקות LEXY ו-LINuS, הזמינים לשיתוף לפי בקשה, כמו גם את הקווים היציבים NIH/3T3 LEXY או LINuS שנוצרו עם וירוסים אלה.

אם הגשושיות עוברות טרנספטציה או אם התאים דלילים, הפרמטרים המוצעים ככל הנראה יפחיתו את מספר המסלולים שזוהו, והניתוחים יהיו פחות חזקים. אם זה המקרה, המשתמשים יכולים להיות מתירניים יותר עם הכתמים שהושמטו במעקב על ידי הפחתת המסנן מספר הנקודות במסלולים (אנו ממליצים לשמור לפחות 45 מתוך 50 נקודות). התראה: אם מסנן זה מוקטן, יש להתאים באופן ידני את קובץ ה-Excel שסופק (טבלה משלימה S1): אכן, הערכים שהודבקו מה-CSV המיובא לא ייקחו בחשבון את הפערים. המשתמש צריך למצוא היכן הנקודות החסרות עם מספר ה-TrackID ולתאם אותן עם מספר הגרעין, מה שבדרך כלל לוקח כמה סבבי העתק-הדבק.

פרמטר קריטי להבטחת הצלחת הניסוי הוא לשמור על התאים בחושך. כאשר הגשושיות מגיבות לאור כחול, על המשתמשים להבטיח את הובלת התאים בחושך לפחות 30 דקות לפני הרכישה. מספיקה קופסה סגורה קטנה או שימוש באלומיניום לכיסוי המנה. באופן דומה, יש להקפיד מאוד להשתמש רק באור mCherry כדי לחפש את התאים במיקרוסקופ, מכיוון שתאורה באור כחול מפעילה את התאים. אם מתרחשת הארה בסופו של דבר מתחת למיקרוסקופ, חפש שדה מרוחק אחר לרכישה. התוויית פרופיל ציר ה-Z בשלב 3.6 תעזור לדעת אם התאים הושפעו מתאורה, אם העקומה יורדת במקום להיות רמה.

רצף ההדמיה מוגדר להיות מורכב משלושה שלבים. ראשית, השלב היציב, כדי להעריך את ההלבנה הפוטנציאלית אך גם כדי להבטיח שהלוקליזציה של LEXY יציבה ללא הפעלה (1). שנית, שלב ההפעלה, המורכב מסבבים של תאורת אור כחול פועם, כדי לגרום לטרנסלוקציה של LEXY מהגרעין לציטוזול (2). לבסוף, שלב ההתאוששות האופציונלי, שבו האות חוזר בהדרגה למיקומו הראשוני בגרעין (3).

הרצף המתואר לרכישות יכול להיות ספציפי לסוג התא^19,20. בניסוי הראשון, על המשתמש לבדוק ולשנות את עוצמת הלייזר ואת התזמונים כדי לראות את המערכת עוברת בהדרגה בין הגרעין לציטוזול. חשיבות, עוצמת לייזר חזקה מדי, שכן הפסקה קצרה מדי, עלולה למנוע ראיית טרנסלוקציה פרוגרסיבית, אלא ירידה/העשרה אכזרית (תלוי בבדיקה המשמשת) של עוצמת ה-mCherry לאחר ההארה.

אם האופטימיזציה של הרצף לא פותרת את הבעיה, סביר להניח שה-NES ו/או ה-NLS אינם מתאימים לסוג התא בו נעשה שימוש. משתמשים יכולים לעיין בסעיף⁸ של שיטת LINuS כדי להנדס ולשנות את הבדיקות. משתמשים יכולים גם לעיין במאמר זה להדמיית LINuS עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

פילוח הגרעינים הוא שלב קריטי בניתוח. יש להשתמש בסמן גרעיני חזק ואמין להדמיית תאים חיים של הבדיקות. מכיוון שתאורה באור כחול מפעילה את הטרנסלוקציה של הגשושית, ומכיוון שהבדיקות מנוטרות באמצעות חלבון פלואורסצנטי mCherry, סמן זה חייב להיות גלוי בספקטרום האדום הרחוק או קרוב. במקרה שלנו, אנו משתמשים ב-SiR-DNA שמכתים את התאים במהלך 1 עד ~24 שעות של דגירה, אך שימוש ב-SPY-DNA 650 הוא גם אופציה (ראה טבלת חומרים להפניות).

לבסוף, אם הפילוח עם StarDist בשילוב עם המעקב המסונן של TrackMate מוכיח את יעילותו, חשוב לציין שהמשתמש צריך תמיד לבדוק חזותית את תוצאות הפילוח והכימות. תא מתחלק או גוסס עשוי להיכלל בכמות, בעוד שלא. כדי להפחית את הסיכונים לניתוח אירועים כאלה, גיליון האקסל המצורף מייחס קוד צבע לעוצמה הגרעינית היחסית (כחול = ערכים נמוכים, אדום = ערכים גבוהים). על ידי בדיקת הצבעים לפני התוויית הערכים ב-GraphPad Prism, המשתמש אמור להיות מסוגל להבחין בערכים חריגים. לדוגמה, העוצמות הגרעיניות היחסיות של LEXY צריכות להשתנות מגבוה (אדום, כמויות חזקות של הגשושית בגרעינים) במהלך השלב היציב לנמוך (כחול, כמויות מופחתות של הגשושית בגרעין) בסוף שלב ההארה, לפני שחוזרים לערכים גבוהים (אדום), בשלב ההתאוששות (כפי שמוצג בטבלה המשלימה S2).

פרוטוקול זה מציג יתרונות שונים על פני שיטות שהוצעו בעבר ^5,6. הצינור החצי אוטומטי מקל על ניתוח ההובלה הנוקליאוציטופלזמית של LEXY ו-LINuS, ומספק דיוק רב יותר מאשר כימות ידני שהוצע בעבר ^5,6. השימוש בפרוטוקול שלנו יאפשר למתחילים בתחום לבצע אנליזות יעילות, אך גם יספק כלי חדש למשתמשים מנוסים, שיזדקקו לממשק גישה פתוח אחד בלבד כדי לבצע אנליזות חצי אוטומטיות של ההובלה הנוקליאוציטופלזמית.

ניתן להשתמש בשיטה זו ליישומים נוספים מאשר חקר קצב ההובלה הנוקליאוציטופלזמי העולמי בשורות תאים NIH3T3. ואכן, עם כמה שלבי אופטימיזציה, ניתן להתאים אותו לחקר קצב ההובלה של הגשושית בסוגי תאים שונים או בבעלי חיים⁸. יתר על כן, על ידי מיזוג חלבון מעניין ל-LEXY או ל-LINuS, ניתן גם לחקור את קצב ההובלה שלו או את ההשפעות במורד הזרם של טרנסלוקציה המושרה על ידי אור בתוך הגרעין או מחוצה לו. לדוגמא, ניתן לבודד חלבון בציטופלזמה באמצעות LEXY, או לכפות את לוקליזציה שלו לגרעין באמצעות LINuS 5,6,21,22,23. לבסוף, ניתן להרחיב את הניתוחים המתוארים גם ליישומים רבים יותר מאשר LEXY ו-LINuS, כדי לעקוב אחר כל אות שעובר בין תאים תת-תאיים שניתן לפלח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קולגן	סיגמא-אולדריץ'	08-115
מיקרוסקופ קונפוקלי	לייקה	SP8
DMEM	ג'יבקו	31966021
הצטיין	מיקרוסופט
FBS	סיגמא-אולדריץ'	F7524
פיברונקטין	סיגמא-אולדריץ'	F1141
תוכנת פיג'י	פיג׳י		ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
פלואורוכלים	דוצ'ר	FD3510-100	חלופה: תא אטופלואור (Invitrogen #A7816)
פריזמה GraphPad 10.4.1	תוכנת GraphPad, בע"מ
Importazole	סיגמא-אולדריץ'	SML0341
לפטומיצין B	סיגמא-אולדריץ'	L2913
פלסמיד LEXY	אדג'ן	72655	pDN122
פלסמיד LINuS	אדג'ן	61347	pDN77
עפרון-סטרפטומיצין	ג'יבקו	15140-122
DMEM ללא פנול אדום	ג'יבקו	21063-029
SiR-DNA	ספירוכרום	SC007	אלטרנטיבה: SPY-DNA650 (ספירוכרום #SC501)
תוסף Stardist 2D	סטארדיסט		StarDist_0.3.0
תוסף TrackMate	טראק מייט		TrackMate-7.14.0