מאמר שיטה

מיקרוסקופ התרחבות: הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונבנציונלי

DOI:

10.3791/68595

⸱

19 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט המשלב שיטות מיקרוסקופ קריו-קיבוע והרחבה (Cryo-ExM), המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עם שימור מבני מותאם לדגימות ביולוגיות שונות. דגימות ביולוגיות מוקפאות, מוטמעות בפולימר מתנפח, מפורקות, מורחבות ומסומנות באימונו, מה שמאפשר הדמיה ברזולוציה על-גבוהה עם מיקרוסקופים רגילים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ התרחבות (ExM) היא טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנציה סופר-רזולוציה חדשנית שמרחיבה פיזית דגימות ביולוגיות, ומאפשרת הדמיה מעבר לגבול הדיפרקציה באמצעות מערכות קונבנציונליות כמו מיקרוסקופים קונפוקליים. על ידי הטמעת דגימות במטריצת הידרוג'ל מתנפחת, ExM מאפשר התרחבות איזוטרופית של הדגימה, ומגבירה את הרזולוציה המרחבית ללא צורך בציוד ננו-סקופיה ייעודי. וריאנטים מתקדמים, כגון מיקרוסקופיית הרחבת אולטרה-מבנה (U-ExM), שומרות על פרטים תאיים עדינים, כולל אברונים ומרכבות מקרומולקולריות.

התצפית על מבנים תאיים ספציפיים או אברונים תלויה במידה רבה בשיטת הקיבוע המיושמת על הדגימה, במיוחד באמצעות מקשרים כימיים מבוססי אלדהיד ומשקעים חלבונים עם מתנול קר. לאחרונה, שילוב קריו-קיבוע – טכניקת קיבוע תקנית זהב – עם שיטת U-ExM אפשר תצפיות בקנה מידה ננומטרי במגוון רחב של דגימות ביולוגיות, מתאי יונקים מתורבתים ועד אורגניזמים שלמים, במצבם הכמעט טבעי. מיקרוסקופ התרחבות הוא כלי עוצמתי לחקר מבנים ביולוגיים בקנה מידה שונים, מאברונים מבודדים ועד רקמות שלמות. בשילוב עם קיבוע קריו, הוא מספק תובנות חסרות תקדים על ארכיטקטורה תאית ותהליכים דינמיים תוך מזעור ארטיפקטים הקשורים לשיטות קיבוע מסורתיות. פיתוחים אלו מציבים את ExM כמסגרת רב-שימושית להדמיה ביולוגית ברזולוציה גבוהה וכמעט ילידית.

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט לקיבוע קריו-בשילוב עם מיקרוסקופיית התרחבות של דגימות ממקורות שונים. פרוטוקול זה מדגיש שלבים קריטיים, כולל קיבוע דגימה, יצירת פולימר, הרחבה, צביעת חיסון והדמיה, ומספק את ההנחיה הנדרשת ליישום שיטה זו בכל מעבדה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה ממלאת תפקיד קריטי במחקר הביולוגי, ומאפשרת לנו להמחיש את המבנה האולטרה-מבנה והארגון במערכות חיות בקנה מידה חסר תקדים, מאורגניזמים שלמים ועד מולקולות בודדות. שדה המיקרוסקופיה כולל שתי מערכות מובחנות: מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), חד-משמעי אך עם יכולת מוגבלת לתיוג ספציפי, ומיקרוסקופיה אור, המאפשרת הדמיה מדויקת ומדויקת של מבנה תת-תא אך ברזולוציה מוגבלת בשל מגבלת הדיפרקציה של האור. למרות שמיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה על-גבוהה (SRM) התפתח כשיטה עוצמתית לדימות פלואורסצנציה תת-דיפרקציה של תאים, המחשת הפרטים האולטרה-סטרוקטוריאליים של הרכבים מקרומולקולריים, כגון אורגניזמים שלמים, נותרה מאתגרת1. יתרה מזאת, טכניקות SRM, שמשיגות רזולוציות הנעות בין 10 ל-120 ננומטר, תלויות במיקרוסקופים מתקדמים ובאלגוריתמים לשחזור תמונה ודורשות מומחיות ומיקרוסקופים מיוחדים, מה שמגביל את הנגישות שלהן למעבדות ביולוגיה רבות. שיטת סופר-רזולוציה מתפתחת, מיקרוסקופיית הרחבה (ExM), התגברה על מגבלות אלו. פותחה במעבדתו של אדוארד ס. בוידן לפני עשור, ExM היא טכניקת מיקרוסקופיה פוטונית חדשנית הנחשבת כיום למיקרוסקופיה סופר-רזולוצוציה, המאפשרת הדמיה ללא צורך במיקרוסקופים ייעודיים2. במקום להסתמך על טכנולוגיות הדמיה מתקדמות, ExM כולל הטמעת דגימות ביולוגיות בפולימר מתנפח שמתרחב איזוטרופית. ההתרחבות הפיזיקלית הזו מגדילה את גודל הדגימה פי ארבעה או יותר, משפרת את הרזולוציה ומאפשרת תצפית באמצעות מיקרוסקופים רגילים של אור. פרוטוקולי ExM, שפותחו במקור בפרוסות מוח, התפתחו כדי לשפר את הרזולוציה ולפשט פרוצדורות. טכניקה זו הותאמה בהצלחה לדגימות ביולוגיות שונות, כולל תאים אאוקריוטיים, אורגניזמים חד-תאיים, טפילים, רקמות ואורגניזמים שלמים, ומדגימה את הרב-גוניות שלה ב-3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

נכון להיום, קיימות שתי קטגוריות עיקריות של פרוטוקולים: קדם-התרחבות 2,16 ופוסט-התרחבות17,18, המתייחסים לרגע של צביעת הדגימה הביולוגית, בין אם לפני או אחרי תהליך ההרחבה. מאמר זה יתמקד במיוחד בפרוטוקול שלאחר ההתרחבות, שבו מתבצעת תיוג חיסוני לאחר דה-דנטורה והתרחבות הדגימה.

בפרוטוקול זה, דגימות ביולוגיות מקובעות בקריו או כימית ומודגרות בסוכנים כימיים, מה שמאפשר עיגון חלבון לפולימר העתידי. הדגימות מוטמעות בפולימר מתנפח המורכב מאקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (הנפוץ בג'לים לאלקטרופורזה) ואקרילט נתרן (המאפשר התרחבות). הוספת מים מפעילה את התפשטות הג'ל, ומגדילה את המרחק בין החלבונים ביחס להתרחבות הג'ל. החלבונים הרלוונטיים מסומנים ישירות בתוך הג'ל באמצעות נוגדנים ספציפיים (איור 1).

כל טכניקות ההדמיה שהוזכרו לעיל, כולל מיקרוסקופ אלקטרוני, מיקרוסקופיה פוטונית, מיקרוסקופיה ברזולוציה על-אנושית ו-ExM, דורשות קיבוע ביולוגי לדגימה. קיבוע מבוסס אלדהיד יוצר קישור צולב בין חלבונים, ושומר על ארגון התאים במהלך הטיפולים הנדרשים למיקרוסקופיה פוטונית או אלקטרונית. עם זאת, קיבוע יכול גם להוביל לארטיפקטים ולשינויים מורפולוגיים בתא, שעשויים להיות עדינים במיקרוסקופ אור קלאסי אך הפכו לברורים יותר עם ההתקדמות וההתפתחות של SRM, מה שגרם למדענים לשקול מחדש את ההשלכות של שיטות קיבוע19. דרך אחת לעקוף ארטיפקטים הקשורים לקיבוע היא שימוש במיקרוסקופיה חיה, שמאפשרת המחשה דינמית של מבנים תאיים במצבם הכמעט טבעי. עם זאת, למיקרוסקופיה חיה יש מספר חסרונות, במיוחד הצורך בביטוי גנים טרנסג'נדריים, שעלול להשפיע על פיזיולוגיית התא ולשנות את התנהגות החלבונים בהשוואה למיקרוסקופיה האנדוגנית. בנוסף, מיקרוסקופיה חיה מציעה בדרך כלל רזולוציה נמוכה יותר ממיקרוסקופיה קבועה ויש לה אפשרויות תיוג מוגבלות, שכן תגי פלואורסצנט חייבים להיות לא רעילים ויציבים בתנאים חיים, מה שמגביל את הסמנים הזמינים. תחום המיקרוסקופיה האלקטרונית, בשל הרזולוציה הגבוהה שלו, תרם רבות לפיתוח שיטות אופטימליות לקביעת מבנים תת-תאיים או מקרומולקולריים תוך שמירה על מצבם הטבעי. לפני עשרות שנים, פותחה קריו-קיבוע על ידי מעבדות דובושה, פרנק והנדרסון, שכללה קיבוע מהיר של התא במים במצב זגוגית והוכחה שזהו הגישה היחידה לשימור האולטרסטרוגרם הטבעי20,21. בעוד שמולקולות מטוהרות ניתנות לצפייה ישירה בקרח זגוגי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני-קריו, יש להטמיע את התאים בשרף ולחתך אותם לפני התצפית. כדי לייצב את הדגימות במצב הטבעי המרבי, הדגימות עוברות החלפת הקפאה. בתהליך זה, כאשר מולקולות הקרח חוזרות למצב נוזלי, הן מוחלפות מיד באצטון, שיש לו מקדם דיפוזיה גבוה יותר ממים. במהלך הסרת מים, מולקולות מעניינות עלולות להצטבר ולקרוס, בדומה למה שקורה בקיבוע קישור משולב כימי. כדי להגביל את ההצטברות הזו, מתבצעת החלפת הקפאה בטמפרטורות נמוכות, מה שמפחית את ההצטברות על ידי הגדלת צמיגות תוך-תאית22. גישה מבוקרת זו מגבילה את היווצרות אגרגטים גדולים ושומרת על מבנה אולטרה-תאי קרוב יותר למצבו הטבעי.

בשנת 2022, ראיות הולכות וגוברות לכך שקיבוע כימי מביא חפצים, בשילוב עם התקדמות במיקרוסקופיית התפשטות, הובילו את מעבדת גישארד/המל לפתח שיטה המשלבת קיבוע קריו-עם מיקרוסקופ התרחבות, הידועה בשם 'Cryo-ExM'23'. גישה זו מנצלת את חוזקות שתי הטכניקות על ידי שימור מבנים ביולוגיים עם מינימום עיוות. הדגימות מוקפאות בקריו באמצעות הקפאה בלחץ גבוה או טבילה ידנית, שדורשת ציוד מיוחד הנפוץ במעבדות מיקרוסקופיה אלקטרונית או במתקנים מרכזיים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע קיבוע קריו-קיבוע ואחריו מיקרוסקופ התרחבות, ומציג תוצאות מייצגות משני מודלים ניסיוניים: תאים מתורבתים אנושיים וטפיל חד-תאי טריפנוזומה ברוסאי, הגורם למחלת השינה. נדגיש את השיפורים שמציעה קיבוע קריו-על פני שיטות קיבוע קונבנציונליות ונדגיש את המלכודות והארטיפקטים הנפוצים ביותר הקשורים לטכניקה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: החומרים המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. פרוטוקול זה מותאם, עם שינויים קלים, לתצפית על תהליכים תאיים שונים בדגימות ביולוגיות שונות (כולל שמרים24,25, טוקסופלזמה גונדי26, מיני בעלי חיים קרובים27, אצות ירוקות28,29, אאוקריוטים מיקרוביאליים30, וכן דגימות עכבר23 ובני אדם 23,31,32,33). שינויים בהתאמת הפרוטוקול לדגימות השונות הללו אינם מוזכרים במאמר זה, שכן ניתן לשלוף אותם מהפרסומים המקוריים. כאן, תאי RPE1 ו-Trypanosoma brucei משמשים כפרוקסי לתאים וטפילים של יונקים. פרוטוקול זה מדגיש את שלבי הקיבוע וההרחבה של הדגימות הביולוגיות; לכן, מידע על תרבות הדגימה אינו מוצג במאמר זה.

1. הכנת תמיסת ציר

  1. תמיסת פולי-ליזין
    1. השעתי מחדש פולי-L או פולי-די-ליזין הידרוברומיד (טבלת חומרים) במים כדי לקבל תמיסה מלאית של פולי-ליזין בעוצמה של 1 מ"ג/מ"ל. אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של מינוס 20°C ודילל אותו במים ב-0.2 מ"ג/מ"ל לציפוי הכיסוי (טבלה 1, טבלת חומרים).
  2. פתרון עיגון
    1. הכינו תמיסת אקרילאמיד/פורמלדהיד טרייה (מתחת למכסה הכימי) על ידי ערבוב 38 מיקרוליטר פורמלדהיד (36.5%-38%; טבלת החומרים) ו-50 מיקרוליטר אקרילאמיד (40%, טבלת החומרים) ב-912 מיקרוליטר PBS לקבלת 1 מ"ל תמיסה.
  3. תמיסת ג'לציה ללא APS (יוזם)
    1. הכינו תמיסה תערובת על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 38% נתרן אקרילט (19% סופי), 250 מיקרוליטר של 40% אקרילאמיד (10% סופי), 50 מיקרוליטר של 2% ביס-אקרילאמיד (0.1% סופי), 50 מיקרוליטר TEMED (0.5% סופי), ו-100 מיקרוליטר של 10x PBS (פעם אחת סופית). אליקווט בנפח מתאים למקסימום 2 ג'לים (80-90 מיקרוליטר) ואחסון בטמפרטורה של מינוס 20°C לפחות 12 שעות לפני השימוש (ראו טבלה 1 לשימור ארוך טווח).
      הערה: יש לשים לב כי הנפח המיוצג להכנת תערובת תמיסת הג'לציה מחושב כדי לקבל נפח סופי של 1 מ"ל, אך הנפח בפועל של התמיסה הוא 950 מיקרוליטר, שכן APS, שמייצג 1/20 מהנפח הכולל כל אחד, מתווסף באופן ספונטני. זמן האחסון המקורי של תמיסת הג'לציה17 הוארך לאחר שראינו שניתן לשמר אותה עד חודש אחד בטמפרטורה של מינוס 20°C מבלי לפגוע במוצקות הג'ל או ביעילות ההתפשטות.
  4. TEMED ו-APS
    1. APS 10% בליל וייט: מדלל אבקת APS במים, הקפיד ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. TEMED 10% v/v: מדלל TEMED במים, הקצב ואחסון בטמפרטורה של -20°C.
  5. נתרן אקרילט (SA) 38%
    1. הכינו 38% SA מ-SA מטוהר (AK scientific או Sigma; טבלת החומרים)
      1. החזירו 38 גרם נתרן אקרילט ל-100 מ"ל מים תחת ערבוב מתמיד (חשוב). שלב את ה-SA בהדרגה כדי להימנע מאגרגטים וערבב בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להבטיח השעיה מלאה מחדש. ודאו שהתמיסה שקופה וחסרת צבע או מעט צהובה. אליקווט ואחסן בטמפרטורה של 4°C עד שנה.
    2. הכינו 38% SA מחומצה אקרילית (Sigma; טבלת החומרים)
      1. הכינו 90 מ"ל של 38% נתרן אקרילט על ידי ניטרול חומצה אקרילית עם NaOH מתחת למכסה כימי.
      2. מערבבים 29 מ"ל מים עם 25 מ"ל חומצה אקרילית בזמן הערבוב.
        הערה: מהשלב הזה, יש לבצע את התגובה על קרח עם שליטה קבועה ב-pH ובטמפרטורה, שכן התגובה אקסותרמית.
      3. הוסף 10 N NaOH טיפה אחר טיפה באמצעות פיפט פסטר.
        הערה: ודאו שהטמפרטורה לא עולה על 25 מעלות צלזיוס (אם כן, הפסיקו להוסיף NaOH והמתינו שהטמפרטורה תתקרר).
      4. ממשיכים לנטרול עד שה-pH מגיע ל-7-8 וערבבו במשך שעה על הקרח.
        הערה: אם ה-pH קופץ פתאום ליותר מ-10, הוסיפו חומצה אקרילית עד שה-pH יורד ל-7-8.
      5. אחסן את התמיסה במיכל סגור ללילה. אם התמיסה שקעה, יש להשתמש בצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות. אסוף את הסופרנטנט, אליקווט, ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  6. פתרון דנאטורציה
    1. TrisBase 1 M: מדלל 121.14 גרם של TrisBase בליטר מים אחד, כוון את ה-pH עם HCl ל-9, ואחסן ב-RT.
    2. בופר דהנאטורציה: מערבבים 200 מ"מ סודיום דודציל סולפט (SDS), 200 מ"מ NaCl, 50 מ"מ טריס-בסיס במים. לתמיסה של 200 מ"ל, יש להוסיף 10 מ"ל של Tris-BASE 1 M (pH 9) ב-124.9 מ"ל ddH2O, להוסיף 57.1 מ"ל SDS (20%/700 mM) ו-8 מ"ל NaCl (5 מ"מ) בזמן ערבוב. חנות ב-RT (שולחן 1).

2. תהליך קיבוע קריו-קיבוע והרחבה

  1. הכנת דגימה וקיבוע קריו-קיבוע
    הערה: פרוטוקול זה מותאם לדגימות שגדלו/נטענו על כיסויי 12 מ"מ. אנא עדכן את כרך הפתרון לתמיכה נוספת.
    1. הכנת דוגמאות
      1. לגדל את הדגימה במצב המותאם לדגימה הביולוגית, או ישירות על כיסויי 12 מ"מ (תאי דבק יונקים) או בתלייה (T. brucei).
      2. דגימת העומס על הכיסוי (T. brucei) מצופה מראש בפולי-ליזין כך: בקצרה, דגרו כיסויי כיסוי בעובי 12 מ"מ בפולי-ליזין (0.2 מ"ג/מ"ל) למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס, שטפו במהירות וייבשו באוויר.
      3. צנטריפוגה את הטפילים ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השעיה מחודשת ב-PBS עם תוספת של 10% מהמדיום והעומס על כיסויי כיסוי 5-10 דקות לפני קיבוע קריו.
    2. הגדרת צלילה (איור 2A-C)
      אזהרה: עבד מתחת למכסה כימי עם כפפות ומעיל מעבדה בעת מניפולציה של אצטון. השתמש במעיל מעבדה ומשקפי מגן בכל פעם שאתה מניפולציה של חנקן נוזלי ואתאן נוזלי.
      1. מתחת למכסה כימלי, מלא צינורות של 5 מ"ל (1 כיסוי/צינור) ב-1 מ"ל אצטון יבש במיוחד באמצעות מזרק ומחט כדי למנוע זיהום אוויר.
        הערה: לשימור ביולוגי טוב יותר של הממברנה, יש צורך בהוספת פאראפורמלדהיד (PFA)/גלוטראלדהיד (GA) (0.1/0.02%) (0.1/0.02%). התאמו את הצינור בהתאם לקוטר הכיסוי (כיסוי > 12 מ"מ לא יתאימו לצינורות של 5 מ"ל).
      2. הקפיאו את הצינורות בחנקן נוזלי באמצעות מתקן פלסטיק או מתכת עמיד לטמפרטורות קרות כדי לשמור עליהם זקופים.
      3. מלאו חצי מקופסת פוליסטירן (30 ס"מ על 30 ס"מ / דפנות בעובי) בקרח יבש.
      4. מלא את הדיוור מסוג ויטרובוט בחנקן נוזלי עד שהוא מפסיק להתאדות, והמתין 10-15 דקות לייצוב הטמפרטורה. השימוש בעכביש נדרש כדי להקל על קירור המערכת (איור 2B, כוכבית). למלא שוב אם צריך.
      5. הסר את העכביש ומלא את תא הטבילה המתכתי באתאן נוזלי.
      6. המתינו 10 דקות עד שהאתאן יהיה מאוזן.
        הערה: מלא מחדש את מערכת הניקוז באתאן נוזלי במהלך הניסוי במידת הצורך (אין להשתמש יותר בעכביש בשלב זה). המעבר מאתאן גזי לנוזלי הוא קשה. שימוש בלחץ מתאים הוא קריטי ליצירת אתאן נוזלי. לחץ גבוה ימנע היווצרות נוזלים על ידי גלישת גז מתמדת בתוך תא המתכת, בעוד שלחץ נמוך ייצור אתאן מוצק בתוך התא המתכתי וצינור המילוי. הימנעות מהיווצרות קרח היא חיונית לניסוי. שמירה על קצה המילוי במחבר נוזל/אוויר מסייעת למנוע היווצרות אתאן מוצק.
    3. צלילה (איור 2A-C)
      זהירות: השתמש במעיל מעבדה ומשקפי מגן בכל פעם שאתה מניפולציה של חנקן נוזלי ואתאן נוזלי.
      1. קח כיסוי 12 מ"מ עם פינצטה דקה.
      2. השרה כל עודף מדיום עם נייר טישו.
      3. החזק את הכיסוי באמצע הדרך עם הפינצטה עם טבעת מהדקת מותאמת לפולנג'ר.
      4. הנח את המלקחיים שמחזיקים את הכיסוי במחזיק הבוכנה הקפואית. נמרח כל עודף של חומר מדיום בנייר ווטמן.
      5. הפעל את הקריו-פלנגר כדי להכניס את הכיסוי לתמיסת האתאן בתא המתכת.
      6. העבר במהירות את ה-coverslip לצינור המכיל אצטון קפוא (1 coverslip/tube).
        הערה: אין להשתמש באותן פינצטה לאיסוף דגימות ולשקיעה כדי למנוע זיהום במדיום התרבית. היה זהיר במיוחד כשאתה משתמש בכיסויי כיסוי > 12 מ"מ (כיסויי כיסוי בקוטר 15 או 18 מ"מ מתאימים לנשא אך עלולים להיות קשים יותר לטביעה). במהלך שלב זה, ניתן לטבול את הכיסוי בחנקן נוזלי לאחר השקיעה כדי להקל על ההעברה לאפנדורף תוך שמירה על הדגימה קפואה. כאשר האצטון קופא ב-96- מעלות צלזיוס, הנחת הכיסוי על אצטון קפוא היא הכרחית להחלפת ההקפאה.
    4. החלפת הקפאה והידרציה מחדש
      אזהרה: עבוד מתחת למכסה המנוע בעת מניפולציה של דגימות במהלך החלפת הקפאה. עליית הטמפרטורה יוצרת לחץ בתוך הצינור, מה שעלול לגרום לפיצוץ צינור.
      1. דגרו את הצינורות בקרח יבש בזווית הטיה (כ-45°).
      2. תערבב כל הלילה על שייקר אורביטלי. הנח את הקופסה הסגורה על שייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או RT כדי לאפשר לטמפרטורה לעלות מ-180 מעלות צלזיוס ל-80 מעלות צלזיוס.
      3. הסר את רוב הקרח היבש מהקופסה (רק שמור כמה בתחתית הקופסה), שחרר את הלחץ לצינורות על ידי פתיחה וסגירה מהירה שלהם, והמשך לערבב במשך 45 דקות על המנער האורביטלי כדי להמשיך לעלות את הטמפרטורה מ-80°C ל-20-°C.
      4. העבר את כיסויי הכיסוי לפלטת 12 בארות (או כל מיכל נוח) המכילה תמיסה של אתנול טהור מקורר מראש (100%). דגרו במשך 5 דקות והמשיכו בהדרגה בהדרגה בהדרגה כדלקמן: EtOH 100% (5 דקות) - EtOH 95% (3 דקות) - EtOH 95% (3 דקות) - EtOH 70% (3 דקות) - EtOH 50% (3 דקות) - EtOH 25% (3 דקות) - H2 O 100%.
      5. העבר את הכיסויים ב-PBS וכיוון אותם תחת מיקרוסקופ (מגרדים את המשטח עם קצה) כך שכולם יהיו פונים כלפי מעלה.
        הערה: EtOH של 100% ו-95% מאוחסנים ב-20°C-, EtOH 70% ו-EtOH 50% ב-4°C, ו-EtOH 25% ו-DDH2O ב-RT כדי להמשיך להעלות את הטמפרטורה עד ל-RT. לצורך סימון ממברנה, יש צורך בהוספת PFA/GA (0.1%/0.02%) בתמיסות אצטון והידרציה למעט ddH2O.
  2. הרחבה
    1. עיגון חלבון
      1. הכינו תמיסה טרייה של 1.4% פורמלדהיד/2% אקרילאמיד (FA/AA) ב-PBS פעם.
      2. הניחו את הכיסוי לתוך פלטת באר 4/12 מלאה ב-0.5/1 מ"ל AA/FA.
      3. דגרו במשך 3-5 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא ערבובות.
        הערה: הפורמלדהיד מקשר בין קבוצות אמינים חופשיות של חלבונים לאקרילאמיד. עודף האקרילאמיד מסייע להגביל את קישור החלבונים הנוצר בדרך כלל על ידי פורמלדהיד ומעגן את החלבונים לפולימר ההתרחבות העתידי. ייתכן שיהיה צורך בהארכת שלב עיגון חלבון ללילה בהתאם לדגימה הביולוגית. בכל מקרה, דגירה ארוכה יותר לא תשפיע על אף אחד מהשלבים הבאים. מלאו בארות חופשיות במים או הניחו אותן בתא לח כדי למנוע אידוי.
    2. ג'לציה
      1. הפשרה, APS (10%), ותמיסת ג'לציה (נתרן אקרילט 19%, אקרילאמיד 10%, ביס-אקרילאמיד 0.1%, TEMED 0.5% מדולל ב-10 פעמים PBS) על קרח 10 דקות לפני הג'ל.
      2. הכינו תא לח עם שכבה דקה של רקמה רטובה ופרה-פילם, ואז שמרו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
      3. שים את התא הלח על קרח.
      4. הוציאו את הכיסוי מתמיסת העיגון של החלבון והוציא את התמיסה העודפת עם נייר טישו (2 ברצף).
      5. הוסף APS (ריכוז סופי 0.5%) לתמיסת הג'לציה, מערבולת למשך 2-3 שניות, וטעין 2 טיפות של 35 מיקרוליטר על הפרפילם של תא הלח.
      6. כסו כל טיפה בכיסוי, התאים פונים לתמיסת הג'ליציה.
      7. דגרו על קרח במשך 5 דקות כדי לאפשר חדירת ג'ל.
      8. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
    3. דנאטורציה
      1. חורב את הג'ל עם כלי ניקוב ביופסיה (בקוטר 0.4 ס"מ, איור 2D) וערבב במשך 10-15 דקות לתוך לוח 6 בארות מלא ב-1 מ"ל של בופר דנאטורציה עד שהג'לים מתנתקים מהכיסוי.
      2. העבר את הג'ל לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל מלא בבופר דנאטורציה טרי.
      3. דגרו במשך שעה ו-30 בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס.
      4. העבר את הג'ל ל-ddH2O למשך 10 דקות, וחזור על זה 3 פעמים כדי לשטוף את בופר הדנאטורציה כראוי.
      5. מדוד את הג'ל עם נייר מילימטר או קליפר כדי להעריך את גורם התפשטות הג'ל.
      6. העבר את הג'ל ל-PBS לצביעת חיסונים.
      7. חלופה נוספת לאחסן את הג'לים ב-PBS-אזיד 0.02% בטמפרטורה של 4°C לתקופה קצרה (טבלה 1) או ב--20°C לאחסון ארוך יותר (טבלה 1). לאחסון ממושך, יש לדגור את הג'לים בכמה אמבטיות מים: תמיסת גליצרול 50% למשך 2-3 שעות תחת ערבוב והנחה בטמפרטורה של -20°C בנפח תמיסה מספק, שיש להתאים לגודל הג'ל.
        הערה: ניתן לשמור את הג'ל שלם אם מעדיפים (איור 2D, E) (שלב 2.2.3.1). עד 5 אגרופים (שווה ערך לג'ל שלם) ניתן לאסוף בצינור אחד (שלב 2.2.3.2). יש לכבד את טמפרטורת וזמן הדנאטורציה (שלב 2.2.3.3). חום גבוה עלול לגרום לפתיחת צינור, מה שמוביל לאידוי בופר הדנאטורציה ו/או להוציא את הג'ל. תוודא להשתמש בצינורות נעילה בטוחה או לכסות אותם. שטיפת הג'ל לאחר הדנאטורציה חייבת להיעשות במים מזוקקים, שכן PBS תגרום לשקיעת SDS, מה שישפיע על יעילות השטיפות. שלב זה יגרום להתרחבות קלה של הג'ל שאין לה השלכות על השלבים הבאים בפרוטוקול (שלב 2.2.3.4). ניתן לדלל את הגליצרול ב-PBS כדי לחסוך מקום במקרה של ג'לים גדולים. לניקוב של 0.4 מ"מ, הג'לים מאוחסנים באופן אידיאלי בצלחת של 12 בארות מלאה ב-3 מ"ל מים: גליצרול.

3. צביעת חיסון והתרחבות סופית

  1. להחליף את אמבטיית ה-PBS לעוד 15 דקות של דגירה.
  2. חתוך את כל הג'ל ל-4 חתיכות שוות.
  3. העבר את חלקי הג'ל/החורים לנשא מותאם (איור 2D, E) ודגר עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS-BSA 2% למשך 3 שעות ועד לילה עם ערבוב (ראו טבלה 2 וטבלה 3 לתנאים מפורטים).
  4. ג'לים לשטוף 3 פעמים עם PBS+Tween 0.1% למשך 10 דקות RT עם ערבוב.
  5. החדרו את הג'ל לנוגדנים משניים ול-Hoechst ב-PBS-BSA 2% למשך 3 שעות ועד לילה עם ערבוב (ראו טבלאות 2 וטבלה 3 לפרטים על מצבים).
  6. ג'ל שטיפה 3 פעמים עם PBS+Tween 0.1% למשך 10 דקות RT עם ערבובות.
  7. אופציונלי: לבצע סימון פאן-סימון של כל הפרוטאום על ידי דגירה של ג'ל עם NHS-אסטר (ראו טבלה 2 לפרטים נוספים) ב-PBS למשך שעה ו-30 ב-RT תחת ערבוב, ואז שטוף 3 פעמים ב-PBS+Tween 0.1% למשך 10 דקות.
  8. העבר את הג'ל לנושא מותאם והמשך בהרחבת הג'ל באמצעות דגירה במים מזוקקים (ddH2O).
    הערה: הריכוז והסוג של חומר ניקוי (טווין, טריטון-X100, ספונין) המשמש לשטיפות נוגדנים יכולים להיות מותאמים לדגימות ביולוגיות. החלפת המים מספר פעמים היא חיונית כדי להסיר שאריות מלחים, שמונעים התפשטות מלאה.

4. הרכבה והדמיה

  1. ציפוי כיסוי בפולי-ליזין (ראה סעיף 1.1) על ידי כיסוי כיסוי בכ-200 מיקרוליטר פולי-ליזין, דגירה של שעה אחת ב-RT, ושטיפה פי 3 ב-ddH2O להסרת עודף הפולי-ליזין. תן לכיסויי הכיסוי להתייבש ואחסן אותם בטמפרטורה של 4°C עד השימוש.
  2. הניחו ג'לים מורחבים על כיסויי כיסוי לא מצופים בתא ההדמיה כדי לבדוק את כיוון הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  3. לאחר הכיוון, ג'לים יבשים על נייר ללא סיבים כדי להסיר מים עודפים ולהתקין על כיסויי כיסוי מצופים פולי ליזין (ראו שלב 1.1 לפרוטוקול).
  4. צפו בדגימות עם מיקרוסקופ הפוך.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדגיש את התוצאות של שילוב קריו-קיבוע עם מיקרוסקופיית הרחבה על שני סוגי דגימות שונים: תאים יונקים מתורבתים וטפילי T. brucei . שתי הדגימות היו או מקובעות בקריו או כימית ב-4% PFA לפני ההרחבה והצביעה החיסונית. יש לשים לב שקיבועים כימיים אחרים עשויים להתאים יותר לאברונים ספציפיים (כמו מתנול או גלוטארלדהיד) ורק PFA, קיבוע כימי נפוץ, נבחר להשוואה לקיבוע קריו-קיבוע לשם הפשטות.

RPE1 (תאי אפיתל פיגמנט רשתי) בבני אדם צובעו עבור αβ-tubulin, ATP5a ו-Hoechst כדי להמחיש מיקרוטובולים, מיטוכונדריה וגרעינים, בהתאמה. בנוסף, ג'לים דוגרו עם אסטר פלואורסצנטי NHS לפני ההתרחבות, צבע שמגיב עם קבוצות האמין החופשי וכך צבע את כל הפרוטאום התאי. יכולנו להבחין במספר יתרונות של קיבוע קריו-קיבוע לעומת קיבוע כימיקלי, כפי שכבר הוכח23. המאפיין הבולט ביותר היה שקיבוע קריו-קיבוע שמרה בצורה מושלמת על רשת המיטוכונדריה, הן נראית באמצעות NHS-אסטר והן נוגדנים ספציפיים נגד תת-יחידת ATP סינתאז אלפא (ATP5a) (איור 3A,B). יתרה מזאת, מאחר ש-ATP5a ממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימית, ניתן לפרק את הקריסטה המיטוכונדריאלית באמצעות קיבוע קריו (איור 3B"). להפך, קיבוע ה-PFA לא אפשר לשמר את רשת המיטוכונדריה ולכן הקריסטות המטוכונדריאליות לא היו נראות במצב זה (איור 3C"). כמו כן, צבענו מיקרוטובולים בשני התנאים והדגמנו כי קיבוע קריו-שומר טוב יותר על מיקרוטובולים דינמיים כמו מיקרוטובולים ציטופלזמיים או אסטרליים (איור 3B-E). עם זאת, מיקרוטובולים יציבים כמו בצנטריאול ובריסים, אברונים לא-ממברניים המורכבים ממיקרוטובולים תשע-כפולים של שלישיות/זוגות, נשמרו באותה מידה, אם לא טוב יותר בתאים קבועים ב-PFA לעומת תאים מקובעים בקריו (איור 3B',C'). חשוב לציין כי קיבוע קריו, ששומר על אינטגרליות חלבוני התא, עשוי להיות פחות רלוונטי למבנים צפופים מאוד כמו צנטריולות/ריסים. תצפית זו נעשתה גם על מבנים קשיחים כמו נקבוביות גרעיניות, שבהם קיבוע כימי מפעיל שטיפה של חלבונים ציטופלזמיים, מה שמאפשר תצפית טובה יותר על מבני נקבוביות גרעיניות23,32. לבסוף, נוכל להראות כי קיבוע קריו-קיבוע גם עוקף את אפקט הקישור הצלב של קיבוע כימיקלים, שמשפיע לרעה על קיבולת ההתפשטות כפי שמוצג בצירים המיטוטיים, שהיו כמעט פי שניים יותר מורחבים במצב קיבוע קריו-קבוע לעומת PFA (איור 3D,E).

תאי Trypanosoma brucei צובעו עבור TDH34 (איור 4A-D) כדי להמחיש את המיטוכונדריה הייחודית ול-BiP35 (איור 4E,F) להדגשת הרשתית האנדופלזמית. בנוסף, ג'לים צובקו ב-NHS-ester פלואורסצנטי. כפי שנצפה בתאים אנושיים, קיבוע קריו בשילוב עם התרחבות שומר טוב יותר על הארכיטקטורה התאית הכוללת (איור 4B,E), במיוחד שני המבנים הקברניים הללו, בהשוואה לקיבוע PFA (איור 4C,D,F). שלד המיקרוטובול של T. brucei נוקשה ויציב יותר מזה של תאים אנושיים; כתוצאה מכך, לא נצפה הבדל משמעותי בין PFA לבין קיבוע קריו. יתרה מזאת, מגבלת הרזולוציה של טכניקת U-ExM מונעת מאיתנו להבחין בין מיקרוטובולים בודדים (לא מוצג).

בסך הכל, קיבוע קריו-מתמודד עם מגבלות של קיבוע כימי קלאסי, כגון שימור אברונים ממברניים (מיטוכונדריה, רשת אנדופלזמית) ויסודות דינמיים של שלד ציטוקלטוני (מיקרוטובולים ציטופלזמיים או אסטרליים). בנוסף, מכיוון שקיבוע קריו אינו יוצר קשר צולב בין חלבונים, הוא שומר במלואו על יכולת ההתפשטות, במיוחד במבנים קשיחים וצפופים.

שליטה באיכות הקיבוע וההתרחבות של קריו-קיבוע היא חיונית לשימור המבנה האולטרה-תאי של דגימות ביולוגיות. מספר טעויות עלולות לגרום לקיבוע לקוי וליצור ארטיפקטים בתוך הדגימות הביולוגיות. כאן, אנו מדגישים את החסרונות והתוצאות הנפוצים ביותר של קיבוע לקוי. החפץ הברור ביותר שנוצר על ידי קיבוע קריו-הוא הופעת סדקים בתוך הדגימה הביולוגית (איור 5A), שגם הוא נפוץ במיקרוסקופ אלקטרוני-קריו. למרות שסדקים אלו אינם משנים את המבנה האולטרה-פנימי של האברונים, כפי שמוצג באיור 5A (הטבה) עבור מיטוכונדריה ומיקרוטובולים, הם עלולים להוביל לפרשנות שגויה של הרלוונטיות הביולוגית של סדקים אלו ויש לשקולם בזהירות. אין קשר ספציפי בין בעיות מניפולציה לבין הופעת/שפע הסדקים האלה.

מאפיין ספציפי שמצביע על קיבוע לקוי הוא הופעת "מבנים דמויי בועה" בתוך הציטופלזמה של התא, מה שמעיד על נוכחות גבישי קרח. מבנים אלו בולטים במיוחד בצביעת אסטר של NHS (איור 5B). בדרך כלל הם מלווים בשימור מוגבל של יסודות שלד צית, כגון מיקרוטובולים גליים (איור 5B), ושימור גרוע מאוד של אברונים ממברניים (מיטוכונדריה באיור 5B). תכונות אלו מעידות על בעיות חשובות בקיבוע (i) נפח אתאן ו/או טמפרטורה לא מתאימים (שלבים 2.2.4-2.2.6 מהפרוטוקול), (ii) חימום לא הדרגתי של הדגימה הביולוגית (שלבים 2.3 ו-2.4 מהפרוטוקול), ו-(iii) נוכחות זיהומים בתמיסת החלפת ההקפאה (שלב 2.2.1 מהפרוטוקול). תמונות מייצגות של תמיסות נתרן אקרילט המדגישות את ההיבט הצפוי של 38% נתרן אקרילט שניתן להשתמש בו (חסר צבע ושקופ [1]) או צהוב מעט ושקופ [2]), או לא שמיש להתרחבות (צהוב/כתום ועכור [3]) מוצגות באיור 5C.

figure-results-1
איור 1 זרימת עבודה של Cryo-ExM. (א) תאים חיים (תאים אנושיים או T. brucei) מוקפצים בקריו על ידי טבילה באתאן נוזלי בטמפרטורה של -180°C ודגירה באצטון קפוא על קרח יבש. החלפת הקפאה מתבצעת על ידי עלייה קבועה ואיטית של הטמפרטורה מ-180 °C ל-80- °C באמצעות דגירה על קרח יבש, מה שמפעיל נוזל אצטון (-96 °C), ואז מ-80-°C ל-20-C באמצעות דגירה ללא קרח יבש. הידרציה מתבצעת על ידי אמבטיות עוקבות של אתנול מעורבבות בריכוז סהר של מים מזוקקים יחד עם עלייה מתמדת בטמפרטורה מ-20°C לטמפרטורת החדר. (B) דגימות מיובשות מחדש ממשיכות להתרחבות כך: דגימות מודגרות בתערובת של אקרילאמיד: פורמלדהיד (AA/FA) בטמפרטורה של 37 °C, מה שמאפשר עיגון החלבונים לפולימר המתנפח המורכב מאקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד ואקרילט נתרן (AA/BIS/SA), מה שמעניק את תכונת ההתרחבות לג'ל. הדגימות מודגרות ב-NaCl/SDS בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס לביצוע אינטראקציה, חוסר יציבות וחלבון עדין. שלב זה חיוני להתרחבות איזוטרופית. הדגימות עוברות צביעת חיסון באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים רגילים ולבסוף מורחבות במים מזוקקים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2. הקמת קריו-פלינגינג והרחבה. (א) בומפה קריו-במצב חמוש (לוח עליון) ובמצב למטה (הפאנל התחתון). החץ מציין את כפתור הלחיצה כדי להפעיל את ה-plunging. (ב) מערכת קריו-פולינג מוכנה לשקיעה, המציגה את רמת החנקן הנוזלי (N2) המתאימה לקיבוע קריו, המסומנת על ידי גובה הקצף שמקיף את הדוור (ראש חץ אדום). העכביש הנשלף מסומן בכוכביות. (ג) המחשה של השלבים המרכזיים של קריו-פלינגינג מהחזקת הכיסוי (בפינה השמאלית העליונה), מיקום הכיסוי באתאן דוור נוזלי (למטה משמאל), ושל צינור האיסוף להחלפת הקפאה (מימין). (ד) המחשה של שיטת 'ג'ל פאנקינג' לצביעת חיסון בדגימות אנושיות. ג'ל פולימריז על כיסויי כיסוי (1) נחתך באמצעות מחורר ביופסיה ייעודי (P), ויוצר חור ג'ל בקוטר 0.4 ס"מ (2), שניתן לצבוע אותו בלוח סיליקון (פאנלים ימניים) כדי להפחית את כמות הנוגדנים. (ה) המחשה של שיטת 'חיתוך ג'ל' לצביעת חיסון בדגימות אנושיות ושל T. brucei . ג'לים פולימריזטוריים ומנוטרים (1) נחתכים ל-4 חלקים שווים (2), מה שמאפשר את הדגירה שלהם בצלחת של 12 בארות עם נוגדנים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3. השוואה בין קיבוע קריו-קיבוע ל-PFA בתאים אנושיים. (א) תמונת דיסק מסתובב של תאי RPE1 מוקפדים ומורחבים שנצבעו עבור αβ-tubulins (ציאן), תת-יחידת ATP סינתאז 5a (ATP5a, צהוב) ו-NHS-אסטר (אדום/אפור) המדגימה שימור מצוין של אברונים מבוססי ממברנה ושל יסודות שלד ציטו, כולל צנטריאולים וריסלים (ראש חץ). פס קנה מידה: 10 מיקרון. (B, C) תמונת דיסק מסתובב של תא RPE1 קבוע בקריו (B) ו-PFA-קבוע (C) צובע עבור αβ-tubulins (ציאן), ATP5a מיטוכונדריאלי (צהוב) והוכסט (מג'נטה) עם דגש על ציליום ראשוני (חצים, B', C') ומיטוכונדריה (B", C"). אם קיבוע קריו ו-PFA שומרים באופן שווה על הצנטריאולים והריסים הראשוניים, קיבוע קריו עולה במידה רבה על PFA מבחינת שימור מבנה מיטוכונדריה (B", C"- ראשי חץ אדומים מצביעים על קריסטה מיטוכונדריאלית הנראית רק בתנאי קריו קבועים). פסי קנה מידה: 1, 1, ו-2.5 מיקרומטר בהתאמה. (D,E) תמונת דיסק מסתובב של תא RPE1 מיטוטי קבוע בקריו (D) ו-PFA קבוע (E) עם צביעת αβ-tubulins צהוב/אפור), ATP5a מיטוכונדריאלי (מג'נטה) והוכסט (כחול BOP), שמראה כי קיבוע קריו-מאפשר התרחבות טובה יותר של הציר המיטוטי (ראשי חץ אדומים) ושימור מיקרוטובולים מיטוטיים טובים יותר (חצים אדומים). מדידות אורך הציר המיטוטי: 12 מיקרון ו-7 מיקרון לקיבוע קריו-קיבוע ו-PFA, בהתאמה. פסי קנה מידה: 10 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

figure-results-4
איור 4. השוואה בין קיבוע קריו-קיבוע ל-PFA בטריפנוזומה ברוסיי. (א, ב) תמונות קונפוקליות של תאי T. brucei פרוציקליים מוקפדים ומורחבים שנצבעו עבור דהידרוגנאז תראונין מיטוכונדריאלי (TDH, צהוב) ו-NHS-אסטר (אדום/אפור), המראות את השימור המצוין של המיטוכונדריה הייחודית ואת הארכיטקטורה הכללית של התא. פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר (C, D) תמונה קונפוקלית של תאי T. brucei פרוציקליים קבועים ומורחבים ב-PFA, צבועים ל-TDH (צהוב) ו-NHS-אסטר (אדום/אפור). בהשוואה לשימור מבנה מיטוכונדריאלי לרשת, קיבוע קריו-פוקסציה עולה על קיבוע PFA. פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר (E, F) תמונות קונפוקליות של תאי פרוציקליים מוקפדים (E) ו-PFA-קבועים (F) ומורחבים של T. brucei צובעו עבור סמן הרשתית האנדופלזמית BiP ו-NHS-ester (אפור), המראות כי קיבוע קריו-מפעיל התרחבות ושימור טוב יותר של הרשתית האנדופלזמית. פסי קנה מידה: 5 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

figure-results-5
איור 5. בעיות קיבוע קריו. (א,ב) תמונות דיסק מסתובב של RPE1 המורחב ומקובע בקריו, צבועות ל-αβ-tubulins (ציאן), תת-יחידה של ATP סינתאז 5a (ATP5a, צהוב) ו-NHS-אסטר (אדום), המראות השפעות קלאסיות של קיבוע קריו: סדקים (A, חצים) ובועות (B, חץ). למרות שסדקים אינם משפיעים על אולטרה-מבנים של האברונים (A), נוכחות בועות בציטופלזמה (B) מעידה על קיבוע לקוי ומשנה משמעותית את שימור האברונים התת-תאיים (מיטוכונדריה ומיקרוטובולים, אינסטים). פסי סולם: 5 מיקרון ו-2 מיקרון (אינסטים). (C) תמונה המציגה תמיסות נתרן אקרילט שונות המדגישות את ההיבט הצפוי של 38% נתרן אקרילט שניתן להשתמש בו (חסר צבע ושקוף (1) או צהוב ושקוף מעט (2), או לא שמיש להתרחבות (צהוב/כתום ועכור (3)). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: תנאי אחסון פתרונות אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: רשימת נוגדנים אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3: מצבים חיסוניים אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט המשלב קריו-קיבוע עם מיקרוסקופיית התרחבות (Cryo-ExM), ומציע גישה איתנה להמחשת תאים תת-תאיים תוך הימנעות מפריטים הנפוצים לקביעת כימיקלים, כגון עיוות מבני ואובדן אנטיגן. על ידי שמירה על ארכיטקטורה תאית במצב כמעט טבעי, Cryo-ExM מבטל את הצורך באופטימיזציה מקיפה של קיבוע נרחב, ומאפשר מיקום חלבונים מדויק יותר.

למרות שהפרוטוקול בדרך כלל פשוט, מספר צעדים קריטיים דורשים תשומת לב מיוחדת כדי להבטיח תוצאות מוצלחות. שלב ההקפאה רגיש במיוחד, שכן הוא דורש גם חומרים ספציפיים (ראו טבלת חומרים) וגם רמת מיומנות, במיוחד בעת טיפול במילוי האתאן הנוזלי, מה שמייצג מכשול פוטנציאלי. ידע מוקדם בטכניקות קיבוע קריו הוא יתרון; אנו ממליצים להתייעץ עם מומחה קריו-EM או מנהל מתקן מיקרוסקופיה אלקטרונית בעת אימוץ השיטה הראשונה. במהלך שלב ההתרחבות, חיוני להקפיד על תנאי הדנאטורציה, שכן סטיות עלולות לפגוע הן בשימור הדגימה והן ביעילות ההרחבה. לבסוף, שמירה על תנאי אחסון מתאימים לכל החומרים (ראו טבלה 1) היא קריטית להבטחת שחזוריות ואיכות הדמיה עקבית לאורך זמן.

מאמר זה מדגיש מספר יתרונות מרכזיים של פרוטוקול Cryo-ExM. ראוי לציין כי קיבוע קריו מפחית את אובדן החלבונים הממסים, מגבלה נפוצה בשיטות קיבוע קונבנציונליות, ומשמר טוב יותר על שלמות הממברנה, ובכך משפר את הדיוק של ההדמיה התאית. חוזקה מרכזית של טכניקה זו טמונה בהתאמתה למיקרוסקופים רחבי שדה ומיקרוסקופים קונפוקליים סטנדרטיים. בניגוד לשיטות רזולוציה סופר-רבות אחרות שדורשות ציוד מיוחד ולעיתים יקר, ניתן ליישם את ExM באמצעות מיקרוסקופים פלואורסצנציים קונבנציונליים. יתרון משמעותי נוסף של ExM הוא הרב-גוניות שלו. הטכניקה יושמה בהצלחה על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות – מתאים בודדים ועד רקמות מורכבות – ומדגימה את היישום הרחב שלה בתחומי מחקר מגוונים. מאמר זה מדגיש במיוחד את התאימות של פרוטוקול זה לשתי מערכות מודל שונות מאוד: T. brucei ותאים אנושיים, אך יש לשים לב שמדגם גדול או מורכב יותר ידרוש קיבוע בלחץ גבוה, שכן טבילה ידנית אינה מספיקה לשימור כל הדגימה 24,25,30. מיקרוסקופ ההתרחבות חולל מהפכה ביכולת להמחיש מבנים תאיים בקנה מידה ננומטרי שבעבר היו קשים או בלתי אפשריים לפתרון, ואפשרה פריצות דרך בתחומים כמו ביולוגיה תאית, ביולוגיה התפתחותית ומדעי המוח36. במיוחד, השיטה הייתה טרנספורמטיבית בפרזיטולוגיה, תחום שבו מיקרוסקופיית אור קונבנציונלית לעיתים קרובות נכשלת. עבור טפילים רבים, מיקרוסקופיית הרחבת אולטרה-מבנה (U-ExM) הוכיחה את עצמה כשינוי משחק, ומאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של אברונים מורכבים כגון האפיקופלסט, הקונואיד והיסודות התא-שלדיים בבהירות חסרת תקדים 6,37,38. התקדמות זו מדגימה את כוחו של U-ExM לחשוף פרטים מבניים שבעבר לא היו נגישים, לפתוח דרכים חדשות לגילוי בביולוגיה תאית, מדעי המוח וביולוגיית הטפילים, ולסייע בחיפוש אחר מטרות טיפוליות פוטנציאליות. יתרה מזאת, ExM נשארת תואמת לנוגדנים אימונופלואורסצנציה נפוצים, מה שמקל על שילובו בתהליכי עבודה קיימים. ברוב המקרים, נוגדנים המשמשים באופן שגרתי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית או למיקרוסקופיה מערבית פועלים ביעילות על דגימות מורחבות, ומבטלים את הצורך בתגובות מיוחדות. הנגישות הזו הופכת את Cryo-ExM לאופציה אטרקטיבית עבור מעבדות מחקר ביולוגיות רבות, ומציעה הדמיה ברזולוציה גבוהה ללא העלות או המורכבות הרגילה של מערכות הדמיה מתקדמות.

למרות היתרונות שלה, ל-ExM יש מגבלות מסוימות. חיסרון מרכזי הוא הצריכה הגדולה של נוגדנים, שיכולים להיות יקרים או בעייתיים, במיוחד עבור נוגדנים ביתיים הזמינים בכמויות מוגבלות. הנה הסיבה לכך שאנו מציעים אסטרטגיית פרוטוקול זו להפחתת נפח הנוגדנים המשמשים לצביעת חיסון (איור 2D,E). תהליך ההרחבה גם מגדיל את עובי הדגימה, מה שיכול להשפיע על היכולת לדמיין מבנים עמוקים יותר בשל מגבלות מרחק העבודה של מטרות מיקרוסקופ סטנדרטיות. מגבלה זו עלולה להיות מאתגרת במיוחד כאשר חוקרים דגימות גדולות ועבות יותר, שבהן אזורים עמוקים יותר עשויים שלא להיות מדומים ביעילות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים. בנוסף, התפשטות רקמה עלולה לעיתים לגרום לעיוותים מכניים, המחייבים אימות ותיקון מדויקים כדי להבטיח ייצוגים מרחביים מדויקים. לבסוף, ExM הקלאסי תלוי באופן מוחלט בקיבוע דגימה, שעשוי להשתנות בין דגימות ביולוגיות או מבנה תת-תאי לתצפית. בעוד שצנטריאולים וריסים יציבים מספיק כדי להתרחב ללא קיבוע מוקדם, אברונים תאיים דורשים סוגים שונים של קיבוע כימי (PFA, מתנול, גלוטראלדהיד), מה שעלול ליצור ארטיפקטים ולמנוע תצפית של מספר מבנים תאיים יחד. לבסוף, מכיוון ש-ExM תואם למודאליות שונות של הדמיה ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM)39, מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED)40, מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)41 ולפני זמן קצר מיקרוסקופיית גיליון אור42, הגישה המתוארת במחקר זה מספקת כלי רב-שימושי לחקר מבנים תאיים בדיוק גבוה. מחקר עדכני שילב קריו-קיבוע עם מיקרוסקופ התרחבות איטרטיבית32, מה שדחף עוד יותר את גבולות הרזולוציה תוך שמירה על מצבו הטבעי של התא ככל האפשר בזכות קיבוע קריו.

על ידי מתן אפשרות לטכניקות הדמיה מתקדמות אלו ללכוד תאים במצבם הטבעי, Cryo-ExM סוללת את הדרך למחקרים עתידיים של תהליכים תאיים מורכבים בבהירות חסרת תקדים. גישה זו פותחת גם אפשרויות חדשות למיקרוסקופיית אור ואלקטרונים קורלטיבית (CLEM), ומגבירה עוד יותר את הפוטנציאל שלה להדמיה רב-מודלית.

לסיכום, ExM מהווה כלי עוצמתי להדמיה ברזולוציה על-גבוהה עם יישום רחב על דגימות ביולוגיות שונות. ההתאמה שלו למיקרוסקופים סטנדרטיים, הרב-גוניות בסוגי דגימות והיישום הפשוט יחסית הופכים אותו לבחירה אטרקטיבית עבור מעבדות רבות. עם ההתקדמות המתמשכת בטכניקה, אנו מצפים לשיפורים נוספים ברזולוציה, בשימוש בנוגדנים ובטיפול בדגימות, שישפרו את יכולותיה ויהפכו אותה לנגישה אף יותר למגוון רחב של יישומים ביולוגיים. Cryo-ExM, במיוחד, מהווה התקדמות מבטיחה, המספקת דרך לחקור מבני תאים בפירוט יוצא דופן תוך שמירה על שלמותם הטבעית, ובסופו של דבר דוחפת את גבולות המיקרוסקופיה המודרנית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ניפר ויילארד על העצות הביקורתיות והקריאה בכתב היד. אנו מכירים בתרומתו של SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL): CIQLE (חבר ב-LyMIC) לרכישת תמונות תאי RPE1. אנו מודים למוניקה פרננדס מונריאל מה-BIC על ההרשמה לגישה לפומנה ולאתאן, ולמרכז ההדמיה בורדו, יחידת שירות של CNRS-INSERM, ולאוניברסיטת בורדו, חברה בתשתית הלאומית France BioImaging, על רכישת תמונות T. brucei . עבודה זו נתמכה על ידי CNRS (T.brucei) ו-INSERM (תאים אנושיים) ומומנה על ידי המוסדות הבאים: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 to M.B), LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) ו-Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H נתמכה במימון ANR-OIL (ANR24-CE15-2171-01 ל-L.R), ו-L.K נתמכה על ידי ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 to B.D)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחזיק מתכת צינור 5 מ"לדומיניק דושרQB-E5שלב ההחלפה של הקפאה
620 קריו-פלנגר ידניRHOSThttps://rhost-em.com/שלב קיבוע הקריו
אצטון 99.8% אקרוסילאקרוס אורגניקסחתול. מס' 67-64-1 שלב ההחלפה של הקפאה
אקרילאמיד 40% (AA)סיגמא-אלדריץ'A4058תהליך הרחבה   (עוגן)
חומצה אקרילית  סיגמא-אלדריץ'8.00181 הליך התרחבות (פולימר)
פרסולפט אמוניום (APS)תרמו פישר17874הליך התרחבות (פולימר)
אגרוף ביופסיהדומיניק דושרPUK-40נדרש לחיתוך הג'ל לפני הדנאטורציה  
BSAסיגמא-אלדריץ'P1379צביעת חיסון 
תא תא אטופלוורInvitrogenA7816תא הדמיה מותאם לכיסויי 24 מ"מ להדמיה
תא תאשירות הגדלת חיים10900תא הדמיה מותאם לכיסויי 18 מ"מ להדמיה
כיסויי 12 מ"מ;דומיניק דושר100040תאים גדלים / חיבור T.brucei
כיסויי כיסוי 24 מ"מ;דומיניק דושר900547הדמיה 
כיסויי 18 מ"מVWR631-0153הדמיה 
אתאן גז לינדה גז88888DEנדרש לקיבוע קריו
פורמלדהיד 36.5– 38% (FA)סיגמא-אלדריץ'  F8775תהליך הרחבה   (עוגן)
גלוטארלדהיד 25% (GA)סיגמא-אלדריץ'  G5882שלב ההחלפה של הקפאה
גליצרול Euromedex EU3550אחסון ג'ל לטווח ארוך  
חנקן נוזלי לינדה גז2200975נדרש לקיבוע קריו (קירור המערכת)
מיקרוטיוב clear-lock 5 מ"ל דומיניק דושר390932Aנדרש להחלפת הקפאה
מחט 18Gדומיניק דושר050123Bנדרש לאסוף אצטון
N,N-מתילביסקרילאמיד 2% (BIS)סיגמא-אלדריץ'M1533, SIGMAהליך התרחבות (פולימר)
פאראפורמלדהיד 16% (PFA)EMSחתול. מס' 15710שלב ההחלפה של הקפאה
פולי-די-ליזיןסיגמא-אלדריץ'P1024כיסוי כיסוי לדגימה / הדמיה  
פולי-אל-ליזיןסיגמא-אלדריץ'P1274כיסוי כיסוי לדגימה / הדמיה  
מפעיל לחץ  לינדה גזCPLH0SJ-LIN224משדר לחץ המאפשר דיסטרובציה של אתאן (קיבוע קריו)
סרינגה טרומו 10 מ"לדומיניק דושר50132נדרש לאסוף אצטון
ערכת אלסטומר סיליקוןדאו4001834ערכה להכנת לוחות באר סיליון (צביעת חיסונים) 
נתרן אקרילט 97-99% (SA)סיגמא-אלדריץ'408220הליך התרחבות (פולימר)
AK ScientificR624הליך התרחבות (פולימר)
נתרן דודציל סולפטיורומדקסEU0660הליך התרחבות (דנאטורציה)
טטרמתילתילנדיאמין (TEMED)תרמו פישר17919הליך התרחבות (פולימר)
Tubings תרמו-סיינטיפיק8060-0060צינורות לדיסטרבציה אתנית (קיבוע קריו)
טווין-20יורומדקס1005-7צביעת חיסון 
פינצטות Dumont n° 5 FineScienceTools11255-20מניפולציה של הכיסוי 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacquemet, G., et al. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. J Cell Sci. 133 (11), jcs240713(2020).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Laporte, M. H., et al. Time-series reconstruction of the molecular architecture of human centriole assembly. Cell. 187 (9), 2158-2174 (2024).
  4. Steib, E., et al. WDR90 is a centriolar microtubule wall protein important for centriole architecture integrity. Elife. 9, e57205(2020).
  5. Le Borgne, P., et al. The evolutionary conserved proteins CEP90, FOPNL, and OFD1 recruit centriolar distal appendage proteins to initiate their assembly. PLoS Biol. 20 (9), e3001782(2022).
  6. Bertiaux, E., et al. Expansion microscopy provides new insights into the cytoskeleton of malaria parasites including the conservation of a conoid. PLoS Biol. 19 (3), e3001020(2021).
  7. Liffner, B., et al. Atlas of Plasmodium falciparum intraerythrocytic development using expansion microscopy. Elife. 12, RP88088(2023).
  8. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 134 (5), jcs254300(2021).
  9. Corrales, R. M., et al. Tubulin detyrosination shapes Leishmania cytoskeletal architecture and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (3), e2415296122(2025).
  10. Brunet, M., et al. Drosophila Alms1 proteins regulate centriolar cartwheel assembly by enabling Plk4-Ana2 amplification loop. EMBO J. 44 (8), 2396(2025).
  11. Langner, E., et al. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of mouse and human kidneys for analysis of subcellular structures. Cytoskeleton (Hoboken). 81 (11), 618-638 (2024).
  12. Mercey, O., et al. The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration. PLoS Biol. 20 (6), e3001649(2022).
  13. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Rep Methods. 2 (10), 100311(2022).
  14. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  15. Yu, C. J., Orozco Cosio, D. M., Boyden, E. S. ExCel: super-resolution imaging of C. elegans with expansion microscopy. Methods Mol Biol. 2468, 141-203 (2022).
  16. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  17. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  18. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 34 (9), 973-981 (2016).
  19. Schnell, U., et al. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  20. Dubochet, J. Cryo-EM-the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  21. Neuhaus, E. M., et al. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 121 (3), 326-342 (1998).
  22. Kellenberger, E. The potential of cryofixation and freeze substitution: observations and theoretical considerations. J Microsc. 161 (Pt 2), 183-203 (1991).
  23. Laporte, M. H., et al. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nat Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  24. Hinterndorfer, K., et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast. J Cell Sci. 135 (24), jcs260240(2022).
  25. Mikus, F., Dey, G. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol. 2862, 47-59 (2025).
  26. Ben Chaabene, R., et al. Toxoplasma gondii rhoptry discharge factor 3 is essential for invasion and microtubule-associated vesicle biogenesis. PLoS Biol. 22 (8), e3002745(2024).
  27. Shah, H., et al. Life-cycle-coupled evolution of mitosis in close relatives of animals. Nature. 630 (8015), 116-122 (2024).
  28. Klena, N., et al. An in-depth guide to the ultrastructural expansion microscopy (U-ExM) of Chlamydomonas reinhardtii. Bio Protoc. 13 (17), e4792(2023).
  29. van den Hoek, H., et al. In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains. Science. 377 (6605), 543-548 (2022).
  30. Mikus, F., et al. Charting the landscape of cytoskeletal diversity in microbial eukaryotes. bioRxiv. , (2024).
  31. Petrich, A., et al. Expanding insights: harnessing expansion microscopy for super-resolution analysis of HIV-1-cell interactions. Viruses. 16 (10), 1610(2024).
  32. Louvel, V., et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nat Commun. 14 (1), 7893(2023).
  33. Lemaître, F., et al. Unveiling the molecular architecture of T cells and immune synapses with cryo-expansion microscopy. bioRxiv. , (2025).
  34. Millierioux, Y., et al. De novo biosynthesis of sterols and fatty acids in the Trypanosoma brucei procyclic form: carbon source preferences and metabolic flux redistributions. PLoS Pathog. 14 (5), e1007116(2018).
  35. Bangs, J. D., et al. Molecular cloning and cellular localization of a BiP homologue in Trypanosoma brucei: divergent ER retention signals in a lower eukaryote. J Cell Sci. 105 (Pt 4), 1101-1113 (1993).
  36. Dolgin, E. 'Expansion microscopy' turns ten: how a tissue-swelling method brought super-resolution imaging to the masses. Nature. 637 (8046), 752-754 (2025).
  37. Tosetti, N., et al. Essential function of the alveolin network in the subpellicular microtubules and conoid assembly in Toxoplasma gondii. Elife. 9, e56635(2020).
  38. Gorilak, P., et al. Expansion microscopy facilitates quantitative super-resolution studies of cytoskeletal structures in kinetoplastid parasites. Open Biol. 11 (9), 210131(2021).
  39. Halpern, A. R., et al. Hybrid structured illumination expansion microscopy reveals microbial cytoskeleton organization. ACS Nano. 11 (12), 12677-12686 (2017).
  40. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  41. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  42. Daetwyler, S., Fiolka, R. P. Light-sheets and smart microscopy, an exciting future is dawning. Commun Biol. 6 (1), 502(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Super Resolution ImagingCryo FixationFluorescence MicroscopyHydrogel EmbeddingConfocal MicroscopyUltrastructure Expansion MicroscopySample FixationImmunostaining ProtocolCellular Architecture

מאמרים קשורים