מאמר שיטה

לקטילומה מבוססת ספקטרומטריית מסה ואישור חלבונים לקטיליטים

255 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68597

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת בקווי תאי קרצינומה של תאי קשקש הוושט כדוגמה לניתוח לקטילציה של חלבונים. התהליך כולל ניתוח לקטילציה של חלבונים מתרבות תאים ועד לאישור מועמדים, כולל ניתוח ספקטרומטריית מסה מבוסס לקטילציה ואישור באמצעות אימונופרציפיטציה.

תקציר

הלקטילציה, שזוהתה לראשונה ב-2019, שינוי פוסט-תרגומי חדש (PTM) על שאריות ליזין, הוכחה מאז כמעניינת בפתולוגיות ובהקשרים פיזיולוגיים שונים. היא מכילה שני איזומרים (L- ו-L-לקטילציה) וידועה בשינוי היווצרות מורכבים, מיקום תאים או יציבות של חלבוני מטרה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח לקטילציה מתרבות תאים ועד לאישור מטרות פוטנציאליות ללקטילות, תוך שימוש בקו התאים קרצינומה של תאי הקשקש הוושט TE11 כדוגמה. הפרוטוקול הבא יספק פרטים על זיהוי חלבונים עם לקטיליציה באמצעות אימונופרציפיטציה (IP) ספציפית ל-L-lactyllysine (KL-LA) של פפטידים לניתוח ספקטרומטריית מסה (MS): (1) הפקת חלבונים, (2) הפחתת חלבונים, אלקילציה ועיכול, (3) טיהור חלבונים וריכוז פפטידים, (4) IP באמצעות חרוזי KL-LA ו-(5) ריכוז של פפטידי KL-LA . לאחר שלבים אלו, יבוצעו ניתוחים של נתוני ה-MS הגולמיים לזיהוי אתרים עם לקטילות, ויתואר אישור של חלבונים משוערים אלה על ידי IP. באמצעות שיטה זו ניתן לזהות טווח של 100 עד 500 פפטידים, ולאשר חלבונים עם לקטילציה רלוונטיים. לסיכום, חקר חלבונים עם לקטיליציה עשוי להעשיר את הבנתנו לגבי איתות תאים מונע PTM במצבים תקינים ומחלתיים כאחד.

מבוא

לקטילציה היא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) על שאריות ליזין באמצעות מטבוליטים שמקורם בגליקוליזה. L-לקטיל-CoA ולקטואיגלוטתיון הם תת-רכיבים של L-לקטילציה (KL-LA) ו-D-לקטילציה (KD-LA), בהתאמה 1,2. L-לקטילציה היא תהליך אנזימטי הכולל אנזימים כמו אצטילטרנספראז 3,4. לעומת זאת, D-לקטילציה היא תהליך לא אנזימטי על ידי החלפה נוקלאופילית בין לקטוילגלוטתיון לשארית ליזין5. כתהליך דינמי, דאצטילזים כמו HDAC1-3 הוכרו כמחקים של לקטילציה6. מאז גילויו ב-2019, הוכח כי הוא מעניין בפתולוגיות ובהקשרים פיזיולוגיים מרובים2. PTM זה זוהה לראשונה על היסטונים על ידי תצפית על הסטת מסה של 72.021 Da באמצעות ניתוח MS/MS (כרומטוגרפיה נוזלית נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)-Tandem Mass Spectrometry3. מאז, לקטילציה זוהתה גם בחלבונים אחרים מלבד היסטונים והוכח כי היא משפיעה על הגיוון התפקודי, המיקום או היציבות של החלבונים המותאמים בהתאם להקשר 7,8,9,10.

בהתחשב בכך ש-PTMs נמצאים לעיתים קרובות בשפע נמוך11 והם חלק מתהליך דינמי וחולף12, נדרשת העשרה של ה-PTM הנחקר באמצעות אימונופרציפיטציה (IP). לאחר מכן, MS משמש לעיתים קרובות לתיאור פרוטאום המקושר ל-PTM על פפטידים מעוכלים, כגון פוספופרוטאום או פרופיל יוביקוויטינציה11. כמו במקרה של PTMs אחרים, לקטילומה או פפטידים מועשרים-לקטיליים, פרוטאומיקה מבוססת MS היא השיטה הסטנדרטית לזיהוי אתרי לקטילציה חדשים.

פרוטוקול זה מתאר זיהוי פפטידים מועשרים ב-KL-LA באמצעות פרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה, ולאחר מכן אישור חלבונים מלקטיליציה באמצעות אימונופרציפיטציה. באמצעות קווי תאים של קרצינומה של תאי קשקש הוושט (ESCC) כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול להורדת חלבונים עם לקטילציה לזיהוי מבוססי טרשת נפוצה של מטרות עם לקטילציה ואישורם באמצעות IP.

פרוטוקול

מכיוון ש-PTMs הם תהליך דינמי וחולף, חשוב לקבוע מראש את המפגש שבו רמת הלקטילציה הכוללת אופטימלית באמצעות ציטומטריית זרימה או ווסטרן בלוטינג עם נוגדןאנטי-K L-LA . לדוגמה, חיבור של 70%-80% מועדף בקווי תאים ESCC לניסויי לקטילומה ו-IP, שכן רמת הלקטילציה הכוללת היא בשיאה. הריאגנטים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים

  1. גדלו תאים בצלחות פטרי בגודל 100 מ"מ עד שמגיעים למפגש הנדרש, כפי שנאמר קודם.
    הערה: גידל מספיק תאים כדי לקבל בין 0.5 ל-1 מ״ג חלבונים ללקטילומים או יותר מ-2 מ״ג ל-IP.
  2. שטוף תאים ב-5 מ"ל של מי מלח מקוררים מראש 1x עם פוספאט (PBS).
  3. הוסף 500 מיקרוליטר של PBS מקורר מראש וקצור תאים באמצעות מגרד תאים. העבר למיקרוצינור במשקל 1 מ"ל עם קישור נמוך.
  4. תאי צנטריפוגה בעוצמה של 2,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ומשליכים את הסופרנטנט השקוף. כדורי תאים יכולים להיאחסן בטמפרטורה של -80°C.

2. לקטילומה

הערה: תמיד עבוד עם כפפות כדי למנוע זיהום דגימה. תמיד השתמש בקצוות מסוננים, מיקרופונוריות עם חיבור נמוך ומים בדרגת MS.
הערה: יש לבצע תמיד שכפולים ביולוגיים (3-5 לפי ניסינו) כדי לוודא שהשינויים שזוהו ניתנים לשחזור.

  1. הפקת חלבון
    הערה: לעבוד על הקרח.
    1. הכינו את בופר הלקטילומה (טבלה 1) ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הוסיפו מעכבי פרוטאז ממש לפני השימוש.
    2. חלבו את החלבונים באמצעות נפח מתאים של בופר ליזיס.
    3. סוניקייט על קרח 12 מחזורים של 5 שניות פולס + 5 שניות הפסקה בעוצמה של 20%-25%.
    4. צנטריפוגה בעוצמה של 16,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט השקוף המכיל את החלבונים למיקרוצינור חדש עם קישור נמוך.
    5. כמת חלבונים באמצעות ערכת חומצה ביצינכונינית (BCA) בהתאם להמלצת היצרן.
      הערה: ערכת BCA תואמת למקסימום של 3 מיליון אוריאה. לכן, יש לדלל דגימות בהתאם.
    6. העבר 500 מיקרוגרם ל-1 מ״ג חלבונים למיקרוצינורות חדשים בעלי קישור נמוך. השתמש באותה כמות חלבון לכל דגימה. השלים את נפח כל הדגימות עם בופר לאקטילומה לאותו נפח סופי.
  2. הפחתה, אלקילציה ועיכול אנזימטי
    1. הוסיפו דיתיותרייטול לריכוז סופי של 5 מ"מ. דגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    2. תדגר ל-30 דקות ב-RT.
    3. הוסיפו כלורואצטמיד לריכוז סופי של 7.5 מ"מ. דגרו ב-RT למשך 20 דקות בחושך.
    4. מוסיפים פי 3 את נפח הדגימה (מהשלב 2.1.6) של 1 M (NH4)2CO3 כדי להפחית את האוריאה מ-8 M ל-2 M.
      הערה: אם הנפח הכולל עולה על קיבולת המיקרוצינורות, חלק אותו לשני מיקרוצינורות.
    5. הוסף 1 מיקרוגרם של טריפסין בדרגת MS לכל 100 מיקרוגרם חלבונים. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. המשך בטיהור הדגימה.
  3. טיהור וריכוז פפטידים
    הערה: עבודה ב-RT.
    1. חומצים את הדגימה על ידי הוספת חומצה טריפלואורואצטית (TFA) לריכוז סופי של 0.2%.
    2. הכינו את התמיסות הבאות במים בדרגת MS טריים: 0.1% TFA, 1% חומצה פורמית (FA), ו-1% FA/50% אצטוניטריל.
    3. השתמש בעמודות C18 של 100 מ"ג כדי להמשיך בטיהור.
      הערה: כדי להשתמש בעמודה זו, השתמשו בשני קצות פיפטה: העמיסו את העמודה באחד וחתכו את קצה השני כדי להוציא את הנוזל מהעמודה. ודאו שהעמודה נשארת רטובה באופן עקבי. השתמשו בעמודה אחת לכל דגימה.
    4. טעינו את העמודה ב-1 מ״ל של 100% אצטוניטריל, תמיסת הרטבה, והוצאו את הדרך. חזרו פעמיים.
    5. איזון את העמודה על ידי טעינת 1 מ"ל של 0.1% TFA ופוצא. חזור פעמיים.
    6. טעינו את העמודה ב-1 מ"ל של הדגימה המוקצת. המשיכו ב-10 מחזורי מטען/פליטה של הדגימה. חזרו על הפעולה אם נשאר דגימה מסוימת.
    7. שטוף את העמודה על ידי טעינת 1 מ"ל של 0.1% TFA ופוצא. חזור פעמיים.
    8. לצורך שחרור, יש לבצע 10 מחזורי טעינה/פליטה באמצעות 750 מיקרוליטר של 1% FA/50% אצטוניטריל. לאסוף מיקרוצינור חדש עם קישור נמוך. חזור על התהליך עם תוספת של 750 מיקרוליטר של 1%/50% אצטוניטריל לסך כולל של 1.5 מ"ל פפטידים מטוהרים.
      הערה: זהה את המיקרוצינור בצד ולא על המכסה כדי להימנע מזיהום דגימות תוך כדי ניקוב חורים במכסה.
    9. נקב 1 עד 3 חורים במכסה המיקרו עם מחט לאידוי.
    10. באמצעות מרכז ואקום, ריכזו את הדגימות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך כל הזמן הנדרש (לדגימות בנפח סופי של 1.5 מ"ל, זה יכול לקחת לפחות 4 שעות). לאחר מכן, המשיכו באימונופרציפיטציה של הפפטידים.
  4. אימונופרציפיטציה באמצעותחרוזי K L-LA
    1. הכינו את בופר השטיפה ואת מאגר ה-IP של הלקטילומה (טבלה 2).
    2. על קרח, יש להוסיף 200 מיקרוליטר של בופר IP לפפטידים המרוכזים, תוך ערבוב יסודי למעלה ולמטה עד למומס. חלק מהמשקעים עדיין נראים לעין.
    3. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר משקעים.
      הערה: לאחר הצנטריפוגה, ניתן למינון את הדגימה כשלב בקרה, למשל באמצעות ספקטרופוטומטר לכימות ריכוז הפפטיד ב-205 ננומטר.
    4. שטוף חרוזים מצומדים באגרוז של KL-LA שלוש פעמים עם 200 מיקרול של 1x PBS קר על ידי צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והסרת הסופרנטנט השקופ לאחר כל שטיפה.
      הערה: עבור 1 מ״ג חלבון בתחילת הפרוטוקול הזה, יש להשתמש ב-20 מיקרוליטר של חרוזים מצומדים באגרוז KL-LA , שהיו מוכנים בעבר במופנורות בעלות חיבור נמוך של 0.5 מ"ל לשימוש נוח.
    5. העבר את הסופרנטנט השקוף המכיל את הפפטידים התלויים מחדש אל צינור המיקרו בקוטר 0.5 מ"ל המכיל את החרוזים השטופים מראש. אטום את הצינורות עם שכבת פרפין כדי למנוע דליפה.
    6. דגרו במהלך הלילה עם סיבוב עדין מקצה לקצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלבים 2.4.7-2.4.12 מבוצעים כולם בטמפרטורה של 4°C.
    7. גרגור את החרוזים בצנטריפוגציה בעוצמה של 2,000 x g למשך דקה אחת. השליך את הסופרנטנט השקוף.
    8. הוסף 200 מיקרוליטר של בופר IP לקטילומה ושוטף במשך 15 שניות על ידי הפיכת הצינור. צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות וזרוק את הסופרנטנט השקוף.
    9. חזור על שלב 2.4.8 פעם אחת.
    10. הוסיפו 200 מיקרוליטר של בופר שטיפה ושוטפים במשך 15 שניות על ידי הפיכת הצינור. צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות וזרוק את הסופרנטנט השקוף.
    11. חזור על שלב 2.4.10 פעמיים.
    12. הוסיפו 200 מיקרו ליטר מים בדרגת MS ושוטפים במשך 30 שניות על ידי הפיכת הצינור. צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת וזרוק את הסופרנטנט השקוף.
      הערה: השלבים הנותרים של פרוטוקול הלקטילומה מתבצעים ב-RT.
    13. שחרר את הפפטידים הקשורים עם 100 מיקרוליטר של בופר שחרור (0.1% TFA טרי) למשך דקה אחת עם סיבוב עדין מקצה לקצה ב-RT. צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 2 דקות.
    14. חזור על שלב 2.4.13 פעמיים נוספות ומשלב את האלוטים. המשך בטיהור הדגימות.
  5. ריכוז וטיהור של פפטידי KL-LA
    1. הכינו את התמיסות הבאות במים מתוקים בדרגת MS: 0.1% TFA, 1% FA, ו-1% FA/50% אצטוניטריל.
      הערה: מיד לפני תחילת הטיהור, יש להכין את כמות התמיסה הנכונה במיקרוצינורות בגודל 1.5 מ"ל (שלב 2.5.3: 300 מיקרוליטר של 100% אצטוניטריל, שלב 2.5.4: 300 מיקרוליטר של 0.1% TFA, שלב 2.5.6: 300 מיקרוליטר של 0.1% TFA ושלב 2.5.7: 300 מיקרוליטר של 1% FA/50%).
    2. השתמש בקצוות של 100 מיקרוליטר C18 כדי להמשיך בטיהור.
      הערה: קצות C18 בנפח 100 מיקרולטר משמשים באותו אופן כמו קצות פיפטות מסורתיות. שמרו על האגודל מחובר ואל תשחררו את הבוכנה בין השלבים כדי לשמור על העמוד רטוב ולמנוע כניסת אוויר.
    3. שאפו 100 מיקרוליטר של 100% אצטוניטריל, את תמיסת ההרטבה, ופרקו בזהירות מבלי להוציא את כל הנוזל. חזרו פעמיים.
    4. איזון את העמודה על ידי שאיפת 100 מיקרוליטר של 0.1% TFA וחלק בזהירות. חזור פעמיים.
    5. טעינו את העמודה ב-100 מיקרוליטר של דגימת פפטידי KL-LA . המשיכו ב-10 מחזורי מטען/פליטה במיקרוצינור חדש עם קישור נמוך. חזרו על הפעולה אם נשאר דגימה.
    6. שטוף את העמודה על ידי שאיפת 100 מיקרוליטר של 0.1% TFA ומשחרר אותו. חזור פעמיים.
    7. המשיכו עם 10 מחזורי טעינה/הוצאה לשחרור באמצעות 100 מיקרוליטר של 1% FA/50% אצטוניטריל במיקרוצינור חדש עם קישור נמוך. חזרו פעמיים ומשלבים את האלואטים.
      הערה: הפפטידים שנקשרים לקצה ה-C18 עשויים למנוע מהקצה לשאוב 100 מיקרוליטר בכל פעם. חזור על שלב זה עד שלא יישאר נוזל במיקרוצינור (300 מיקרוליטר) בשלב 2.5.7.
    8. נקב 1 עד 3 חורים במכסה המיקרו עם מחט לאידוי.
      הערה: זהה את המיקרוצינורות בצד הצינור ולא על המכסה כדי למנוע זיהום דגימות בזמן ניקוב החורים.
    9. באמצעות מרכז ואקום, יש לרכז את הדגימות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך כל הזמן הנדרש להתאדות הנוזל (בנפח כולל של 300 מיקרוליטר, זה יכול לקחת לפחות שעתיים).
    10. החזירו את הפפטידים המרוכזים ל-30 מיקרוליטר של 1% FA.
    11. בהתאם להנחיות פלטפורמת ספקטרומטריית המסה שלך, כמת את הפפטידים באמצעות ספקטרופוטומטר ב-205 ננומטר כדי לקבוע את ריכוזם.
    12. העבר לבקבוקון זכוכית ושמור על 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח ה-MS.

3. ניתוח MS וביואינפורמטיקה

הערה: הדגימות נותחו במתקן הליבה של הפרוטאומיקה של אוניברסיטת שרברוק באמצעות ספקטרומטר מסה (MS) (שהופעל במצב רכישת נתונים תלויה בנתונים עם צבירת פרגמנטציה סיריאלית מקבילה (DDA-PASEF).

  1. ספקטרומטריית מסה
    1. לכל דגימה, יש להזריק 375 ng של פפטידים למערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).
    2. טעינת פפטידים על עמוד מלכודת בקצב זרימה קבוע של 4 מיקרוליטר/דקה.
    3. הפרדו את הפפטידים בעמודת C18 אנליטית באמצעות גרדיאנט של 2 שעות של 5%-37% אצטוניטריל ב-0.1% FA בקצב זרימה של 400 ננוליטר לדקה.
    4. בצע יינון אלקטרוספריי עם ההגדרות הבאות: מתח קפילרי: 1500 וולט, גז יבש: 3.0 ליטר לדקה, טמפרטורה יבשה: 180 מעלות צלזיוס, לחץ TIMS-in: 2.6 mBar.
    5. רכוש את ספקטרום המסה בטווח של 100-1700 מ'/z באמצעות מצב DDA אוטומטי-MS/MS.
      הערה: המכשיר מוגדר לזהות מצבי מטען מ-0 עד 5+. תצורת ספקטרומטריית ניידות יונים כפולה (TIMS) משמשת עם זמן רמפה של 100 מילישניות ו-10 סריקות מצטברות-סדרתיות מקבילות (PASEF) בכל מחזור רכישה, מה שמוביל למחזור עבודה של 1.17 שניות. החרגה דינמית מוגדרת ל-0.4 דקות.
    6. לבצע פירוק באמצעות אנרגיית דיסוציאציה מושרה התנגשות (CID) שמוגברת ליניארית מ-20-59 eV בטווח ניידות יונים של 0.6-1.6 Vs/cm².
      הערה: עוצמת היעד מוגדרת על 20,000, עם סף עוצמה של 2,500. מצולע מסנן סטנדרטי מיושם כדי לתעדוף קודמים לאורך קו הסריקה האלכסוני עבור פפטידים טעונים +2, +3 ו-+4 במישור הניידות של יוני m/z.
  2. קדם-עיבוד נתונים: ניתוח MaxQuant
    הערה: השלבים הבאים מתבצעים באמצעות תוכנת MaxQuant v.2.6.713 לזיהוי הפפטידים הלקטיליים.
    1. בחלק העליון מימין, לחצו על לשונית התצורה ווודאו ש-Lactylation נוספה כשינוי.
    2. אם לא, השתמשו במסד הנתונים Unimod.org14. התחברו כאורח וחפשו לקטילציה (accession #2114).
    3. לחץ על כפתור ההוסף . בשם, כתוב Lactylation (K), הזן את הקומפוזיציה כפי שנכתב ב-Unimod על ידי לחיצה על כפתור השינוי .
    4. אמת את המסה המונואיזוטופית שהושגה. לחץ על אישור.
    5. בפינה השמאלית העליונה של המסך, בכחול, לחצו על כפתור שמירת שינויים .
    6. בחלק העליון-שמאלי לוחץ על נתונים גולמיים. טען קבצי נתונים גולמיים ושמות אותם אוטומטית באמצעות כפתור No fractions .
    7. הגדר את מספר התהליכים בפינה השמאלית התחתונה לפי מספר הליבות הזמינות במחשב.
    8. בלשונית הקבוצה הספציפית , לחצו על שינויים בכחול.
    9. הוסיפו Lactylation לשינויים משתנים על ידי לחיצה על כפתור החץ כדי להוסיף לריבוע מימין.
    10. לחץ על כימות ללא תווית. הזן את LFQ ושנה את סוג הנרמול ל-none.
    11. לחצו על העיכול. ודאו ש-Trypsin/P נוסף לריבוע מימין.
    12. הגדילו את מספר החפירות המקסימליות ל-4 כי לקטילציה עלולה להשפיע על עיכול הטריפסין.
    13. לחץ על המכשיר. שנו את סבילות הפפטידים בחיפוש הראשי ל-20, בהתחשב בכך שלקטילציה אינה PTM נפוצה.
    14. בחלק העליון-שמאל, לחץ על פרמטרים גלובליים. הוסף קובץ Fasta, שהורד קודם מ-Uniprot או Ensembl, עבור המין המתאים.
    15. לחץ על כלל מזהה ובדיקה כדי לוודא שקובץ ה-Fasta נקרא נכון.
    16. לחצו על כימות חלבון בכחול. הוסיפו לקטילציה לריבוע מימין.
    17. לחץ על זיהוי בכחול. שנה את FDR ל-0.05. ודא ש-2 של פפטידים והתאמה בין ריצות נבדקו.
    18. לחצו על כימות ללא תווית בכחול. בדקו את ה-iBAQ ו-Top3 בו.
    19. בחלק העליון מימין, לחצו על ביצועים.
    20. בחלק התחתון, לחץ על Start בכחול.
  3. זיהוי חלבונים עם לקטיליציה
    הערה: בסוף הרצת MaxQuant, יתקבלו מספר קבצי פלט, כגון:
    • לקטילציה (K)אתרים: קובץ ראשי מעניין - מכיל מידע ספציפי לאתר על שאריות ליזין מלקטיליציות ברצף פפטידי מדויק (חלבון מזוהה, מיקום לקטילציה ברצף, עוצמות, רמת אמון).
    • פרמטרי לקטילציה: מכילים את כל המידע על הגדרות וספים בניתוח MaxQuant.
    • פפטידים לקטילציה: פפטידים זוהו ששונו ולא עברו שינוי.
    • קבוצות חלבון לקטילציה: קבוצות חלבון מזוהות והקשר שלהן ללקטילציה מזוהה.
    השימוש בקבצים הללו תלוי בשאלה המחקרית. השלב הבא מתאר כיצד לזהות אתר עם לקטיל.
    1. פתח את קובץ Lactylation (K)Sites באקסל.
    2. שכפל את הלשונית בתחתית Lactylation (K)Sites כדי לשמור על הנתונים המקוריים.
    3. מיין מ-A ל-Z את עמודות ההפוכה ועמודות מזהם פוטנציאלי . אם יש ערך בשורות מסוימות, מחק את השורות האלה.
    4. בלשונית החדשה הזו, שמרו רק את העמודות הנדרשות, כגון: (1) חלבון: UniProt14 מספר גישה ראשוני, (2) מיקומים בתוך חלבונים: מיקום חזוי של לקטילציה, חשוב לאשר כפי שיתואר בהמשך, (3) שמות חלבונים, (4) שמות גנים, (5) מספר הלקטילציה (K זוהה על הפפטיד המתאים), (6) הסתברויות לקטילציה (K) (הסתברות של 1 במיקום הלקטילציה), (7) עוצמה (סכום כל העוצמות הבודדות השייכות לפפטיד המתאים).
    5. השלים ערכים חסרים כמו שמות חלבונים או שמות גנים.
    6. שמור רק את מספר הגישה הראשון בעמודת ''חלבונים''. הטבלה המתקבלת מייצגת את כל הפפטידים הלקטיליטיביים שזוהו יחד עם החלבון הסביר ביותר שבו נמצא פפטיד זה.
      הערה: מאחר שלקטילציה אינה PTM נפוצה, צפוי לזהות בין 100 ל-500 פפטידים כלקטיליטים. מכיוון שהפפטידים שזוהו משתנים משכפול אחד לאחר, ניתן לקבוע סף של לפחות זיהוי בשני שכפולים ביולוגיים.
    7. כדי לאשר את מיקום השארית המותאמת, השתמשו בכלי רשת יישור כמו BLAST מ-NIH15 או Align מ-UniProt16 עם רצף הפפטידים בעמודה ''הסתברויות Lactylation (K)'' (מחקו כל הסתברות) ורצף החלבונים ממאגר UniProt17.
      הערה: מכיוון שניתן לזהות מספר אתרי לקטילציה ברצף חלבון אחד, ניתן ליישר את האתרים הללו בו-זמנית. זה גם יסייע לזהות אתרים כפולים שעשויים להיות על פפטידים שונים אך באותו מיקום ברצף החלבון.
    8. ניתוח הנתונים תלוי בשאלת המחקר, אך יש לשקול שלבי נרמל, מרכזיות, קנה מידה וטרנספורמציה בלוגריתמים לפני ביצוע ניתוח נתונים סטטיסטי18.
    9. כדי לאשר את החלבונים הלקטיליטיביים שזוהו בניתוח טרשת נפוצה, יש להמשיך בפרוטוקול האימונופרציפיטציה.

4. אימונופרציפיטציה (IP)

  1. הפקת חלבון
    הערה: לעבוד על הקרח.
    1. הכינו את ה-IP-ליזיס/בופר השטיפה (טבלה 3) ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הוסיפו את מעכבי הפרוטאז ממש לפני השימוש.
      הערה: להכנת הדגימה, ניתן להשתמש בכדור תא שנשמר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אם עובדים עם תאים טריים, עקבו אחר השלבים 4.1.2 ו-4.1.3. אחרת, יש להחזיר את כדור התא לאותו נפח של פוליסה/שטיפה של IP כפי שמצוין בשלב 4.1.2 והמשך עם שלב 4.1.4.
    2. הוסיפו 1 מ״ל של ליזיס/בופר שטיפה ודגרו תאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. קציר תאים באמצעות מגרד תאים והעבר את הליזה למיקרוצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    4. דגרו בסיבוב עדין מקצה לקצה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. העבר את הסופרנטנט השקוף למיקרוצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    7. כמת חלבון עם ערכת BCA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. ניקוי מוקדם של החרוזים ודגירה של נוגדנים KL-LA
    הערה: עבוד על קרח. לכל מצב ניסוי, יש להכין צינור בקרה (IgG מאותו מין כמו נוגדן KL-LA ) וצינור ל-KL-LA IP.
    1. העבר 1 מ״ג חלבונים למיקרוצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל. השלים את כל הדגימות לאותו נפח סופי באמצעות ניתוק IP/בופר שטיפה.
      הערה: פרוטוקול זה יכול להתבצע באמצעות חרוזים מגנטיים או חרוזי אגרוז. בשלבים הבאים נעשה שימוש בחרוזים מגנטיים.
    2. העבר את נפח החרוזים הנדרש למיקרוצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    3. כדי לשטוף מראש את החרוזים, מגנטיזם את החרוזים למשך 30 שניות או עד שהתמיסה שקופה. השליך את הסופרנטנט השקוף. שטוף את החרוזים 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר של ליזיס/בופר שטיפה של IP. השליך את הסופרנטנט השקוף לאחר כל שטיפה. הוסף את אותו נפח של מאגר IP כמו נפח החרוזים שנלקחו בתחילה.
    4. דגרו את דגימות החלבון עם 10-15 מיקרוליטר של החרוזים שטופו מראש עם סיבוב עדין מקצה לקצה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: עבור 1 מ"ג חלבון, יש להשתמש ב-10-15 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים. שלב זה ממזער את הקשירה הלא-ספציפית של חלבונים לחרוזים במהלך פרוטוקול האימונופרציפיטציה.
    5. מגנטיזם את החרוזים למשך 30 שניות או עד שהתמיסה נקייה. העבר את הסופרנטנט השקוף למיקרוצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    6. הוסף 1.5 מיקרוליטר של נוגדןאנטי-K L-LAבצינור אחד ואת כמות ה-IgG המתאימה בצינור אחר.
      הערה: עבור 1 מ״ג חלבון בתחילת הפרוטוקול, יש להשתמש ב-1.5 מיקרוגרם נוגדנים.
    7. דגרו את הדגימות בסיבוב עדין מקצה לקצה במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  3. אימונופרסיפיטציה של ק.ל-ל.
    הערה: לעבוד על הקרח.
    1. הכינו את ה-IP-ליזיס/בופר השטיפה (טבלה 3) ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הוסיפו את מעכבי הפרוטאז ממש לפני השימוש.
    2. שטוף מראש את החרוזים כפי שמתואר בשלב 4.2.3.
      הערה: עבור 1 מ״ג חלבון בתחילת הפרוטוקול, יש להשתמש ב-40 מיקרוליטר של חרוזי מגנטיות.
    3. דגרו את הדגימות ב-40 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שנשטפו מראש עם סיבוב עדין מקצה לקצה למשך 4 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. מגנטיזם את החרוזים למשך 30 שניות או עד שהתמיסה נקייה. אסוף את הסופרנטנט השקוף הראשון. שטוף את החרוזים 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר של ליזיס/בופר שטיפה של IP. הסר את הסופרנטנט השקוף אחרי כל שטיפה.
      הערה: ניתן לכמת את הסופרנטנט הראשון ולהשתמש בו ב-Western bloting (WB). חשוב להעריך את יעילות האימונופרציפיטציה.
    5. החזירו את החרוזים עם 20 מיקרוליטר של 2x Laemmli ו-5% בופר מרקפטואתנול β.
    6. דגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הטעינה על ג'ל SDS-PAGE. חלופה נוספת היא שניתן לאחסן דגימות מעובדות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  4. זיהוי WB
    1. הנח את צינורות ה-IP על המעמד המגנטי למשך 30 שניות לפני איסוף הדגימה וטעינה על ג'ל SDS-PAGE.
    2. בצע WB באמצעות נוגדן נגד החלבון הרלוונטי ו/או נוגדןL-La נגד K כדי לאשר את המשיכה כלפי מטה של חלבונים עם לקטיליציה באלבמין בסרום בקר (BSA) 5%. נוגדנים משניים דוללו ב-1:5000 ב-5% BSA.
    3. לזהות את הרצועות באמצעות זיהוי כימילומינציה מבוסס HRP.

תוצאות

לדוגמה, קו התאים TE11 של קרצינומה של תאי הקשקש הוושט תורתח עד שהגיע ל-80% התנגשות. בהתאם לזרימת העבודה המוצג באיור 1 ובניתוח MaxQuant כפי שמתואר בפרוטוקול זה, נקבע הלקטילום. בתאים אלה, זוהו 137 פפטידים כפוטנציאליים ללקטילטים, המייצגים 82 חלבונים ייחודיים, כאשר זוהו מספר אתרים על אותו חלבון (איור 2A). יש לשים לב שזה אינו מתחשב בפפטידים ייחודיים. מספר בין 100 ל-500 פפטידים מזוהים צפוי בניסויים אלה בקווי תאי קרצינומה קשקשית של הוושט.

חלבונים לקטיליטיביים שזוהו קשורים למספר תהליכים ביולוגיים, כגון עיצוב מחדש של כרומטין או הרכבת כרומטין, שכבר תוארו בספרות כמועשרים בחלבונים מלקטיליטים (איור 2B). חלק מהחלבונים הראשונים שזוהו עם לקטילציה היו היסטונים, שניתן למצוא גם בנתונים אלו, כמו היסטון H1.2 (טבלה 4). ניתן היה לזהות לקטילציה על מספר שאריות ליזין שונות מאותו חלבון. לדוגמה, זוהו שני אתרי לקטילציה בהיסטון H1.2: ליזינים (K) 168 (כנראה) ו-191. בפפטיד הראשון (טבלה 4, שורה 2), נצפה כי שארית K168 סבירה גבוהה יותר להיות זו שמוצגת ב-0.733 על 1, בעוד של-K169 יש הסתברות של 0.267 בלבד. HNRNPA1 דוגמה טובה לפפטיד שצריך ליישר אותו כדי לקבוע את השארית המותאמת.

כדי לאמת את הלקטילציה של HNRNPA1 בהתבסס על תוצאות הלקטילומה (טבלה 4), בוצעה בדיקת IP שמטרתה את השינוי הפוסט-תרגומי הזה. ראשית, כדי לקבוע איזה סוג חרוז מציג אינטראקציה אופטימלית עם נוגדןה-ANTI-K L-LA,הושוו חרוזי G וחרוזי A/G. לאחר ביצוע IP עם נוגדן KL-LA ואחריו WB נגד KL-LA, נצפתה העשרה נראית לעין של חלבוניK L-LA , בהשוואה לקלט, כצפוי, בשני סוגי החרוזים (איור 3). תוצאות אלו מראות את היעילות והעמידות של הפרוטוקול בהעשרת חלבונים עם לקטיליטה. לא נצפה הבדל משמעותי בין שני סוגי החרוזים שנבדקו. כדי לאמת את המטרות שזוהו על ידי MS, ניתן לאשר IPs ספציפיים. לדוגמה, הלקטילציה של HNRNPA1, שזוהתה על ידי MS (טבלה 4), כויללה. תחום ספציפי המתאים ל-HNRNPA1 זוהה לאחר KL-LA IP ו-HNRNPA1 WB, מה שמעיד כי HNRNPA1 משתנה על ידי לקטילציה (איור 4). בעוד ששתי חרוזי G ו-A/G הצליחו לבצע אימונופרציפיטציה של חלבון היעד, נצפה אות HNRNPA1 חזק יותר עם חרוזי A/G, מה שמרמז על זיקה או התאוששות מוגברת.

figure-results-1
איור 1: סקירה של תהליך העבודה בניתוח הלקטילום. קיצורים: IP = אימונופרציפיטציה; KL-LA = L-לקטיליזין; LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תוצאות מייצגות עבור חלק מהחלבונים שהושגו עבור הלקטילום של תאי TE11. (א) מספר כולל של חלבונים ופפטידים שזוהו. ניתן לזהות מספר אתרי לקטילציה על אותו חלבון. (B) חמשת התהליכים הביולוגיים המובילים המועשרים לחלבונים עם לקטילציה בתאי TE11 שהושגו באמצעות מאגר הנתונים STRING. ערך P תוקן לבדיקות מרובות באמצעות Benjamini-Hochberg. המספר בכל בר מייצג את מספר החלבונים ברשת שזוהו כלקטיליטים מתוך סך החלבונים באונטולוגיית גנים (GO). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אימונופרציפיטציה של KL-LA באמצעות חרוזי G או A/G וזיהוי WB של Pan-KL-LA בתאי TE11. זיהוי Pan-KL-LA משמש כבקרה קריטית לאישור היעילות והספציפיות של האימונופרציפיטציה של PTM זה. ניסוי זה מבטיח שה-IP מעשיר בהצלחה חלבונים המכילים את שינוי ה-KL-LA . (*) מציין את השרשראות הכבדות והקלות של הנוגדן, כפי שנצפה בבירור בנתיבי IP: IgG (בקרת IP) (N = 3). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אימונופרסיפיטציה של KL-LA באמצעות חרוזי G או A/G וזיהוי HNRNPA1 על ידי WB. זיהוי HNRNPA1 על ידי WB באימונופרציפיטציות ספציפיותל-K L-LA באמצעות חרוזי G או A/G מאשר את הלקטילציה שלו בתאי TE11 (N = 3). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

פתרוןריכוז סופי
אוריאה8 מ'
ביקרבונט אמוניום1 מ'
HEPES20 מ"מ

טבלה 1: בופר ליזיס לקטילום. הכנה במים בדרגת MS והתאמת ה-pH ל-8.

פתרון - בופר שטיפת לקטילומהריכוז סופי
NaCl100 מ"מ
EDTA1 mM
טריס-HCl20 מ"מ
Add for Lactylome IP bufferריכוז סופי
NP-400.5%

טבלה 2: בופר שטיפת לקטילומה ובופ IP. הכנה במים בדרגת MS והתאמת ה-pH ל-8 עבור שתי התמינות.

פתרוןריכוז סופי
כלוריד נתרן100 מ"מ
פלואוריד נתרן50 מ"מ
טריס-HCl (pH 7.5)50 מ"מ
β-גליצרופוספט40 מ"מ
EDTA (pH 8)5 מ"מ
גליצרול5%
טריטון X-1001%
הוסף טרי:
קוקטייל מעכב פרוטאז 100X1X
PMSF1 mM
אורתובנאדטה0.2 מ"מ

טבלה 3: ליזיס/בופר שטיפה של IP. הוא חייב להיות נקי מדנטורנטים, שכן הם עלולים לייצב את נוכחות ה-PTM על חלבונים.

מיקומים בתוך חלבוניםחלבוןשמות חלבוניםשמות גניםמספר הלקטילציה (K)הסתברויות לקטילציה (K)עוצמה
168P16403היסטון H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403היסטון H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0חלבון דמוי אלפא-2-מקירוקלובולין 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0הומולוג חלבון כרומובוקס 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0הומולוג חלבון כרומובוקס 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2חלבון JTBJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651ריבונוקלאופרוטאין גרעיני הטרוגני A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

טבלה 4: תוצאות מייצגות עבור פפטידים עם לקטילציה שהושגו עבור קו התאים קרצינומה של תא קשקשי הוושט TE11. טבלה זו מתקבלת לאחר ניתוח MaxQuant.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש באימונופרציפיטציה של חלבונים שעברו עיבוד KL-LA בטרשת נפוצה לגילוי חלבונים חדשים עם לקטילציה ואתרי הלקטילציה שלהם. פרוטוקול לקטילומה זה מתבצע באמצעות חרוזים מצומדים, אך ניתן להשיג אותו באמצעות נוגדן KL-LA או אפילו נוגדן KD-LA לפי שאלת המחקר. אם משתמשים בנוגדן במקום חרוזים מצומדים, בחירת נוגדן פוליקלונלי מקלה על יצירת קומפלקסים הדוקים יותר, שכן הוא יכול להיקשר לאפיטופים מרובים; עם זאת, גישה זו עלולה להכניס שונות. יתרון אחד בשימוש בחרוזים מצומדים הוא שהם מונעים מהנוגדן לדלוף - לשחרור מהתמיכה המוצקה - שעלולים לזהם את דגימות ה-MS. זה גם יעיל יותר בזמן מאשר שימוש בנוגדן לא מצורף.

יתרה מזאת, חשוב לציין כי כמות הפפטידים המזוהים בניתוח מסוג זה יכולה להיות מושפעת ממספר גורמים1. ראשית, ספציפיות הנוגדנים משחקת תפקיד מרכזי בהבטחת לכידת החלבון הנכון. הוספת שלב של ניקוי מוקדם עם חרוזי אגרוז יכולה להיות דרך להסיר אינטראקציות לא ספציפיות. מצד שני, לא ידוע אם לקטילציה יכולה להשפיע על עיכול הטריפסין, שכן היא חותכת פפטידים בצד הסופי של שארית הארגינין, אך החשוב מכל, שארית ליזין. אם זה המצב, היא עלולה להוביל לירידה בכיסוי הפפטידים. לכן, ניתן לשקול אפשרויות נוספות לפרוטאזות. בפרוטוקול זה, הפרמטר "מקסימום החפצות" מוגדל כדי להתחשב במגבלה זו. לבסוף, יש לשקול גם הכנת דגימה וטיפול, כגון שימוש בכפפות למניעת זיהום דגימות בקרטינים מהעור, לדוגמה, או שינוי יציבות, שכן תהליך PTM הוא תהליך דינמי ולעיתים מהיר6.

בניגוד לגישה הרחבה יותר של טרשת נפוצה שהובילה לגילוי נמוך של PTM בעל שפע נמוך, כגון לקטילציה, זיהוי פפטידיםמועשרים-K L-LA באמצעות פרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה מאפשר ניתוח אתרי PTM מפורט, כגון זיהוי אתרים חדשים של לקטילציה וחלבונים מלקטיליציה19. ווסטרן בלוט יכול לספק מידע על דפוס הלקטילציה הכללי הקיים בתאים, אך אינו יכול ליידע על לקטילציה ספציפית לחלבון. לכן, IP היא הגישה הנפוצה לאישור PTM20 שזוהה בטרשת נפוצה. בדיקת קשירת קרבה (PLA) היא טכניקה נוספת שניתן להשתמש בה לאישור לקטילציה של מטרות פוטנציאליות שזוהו על ידי פרוטאומיקס21. טכניקה זו יכולה גם להצביע על מיקום החלבונים המותאמים, אך בעלת ספציפיות נמוכה יותר. שימוש בגישה IP ספציפית ללקטילציה מתאים לסקר PTM רחב, אך יכול להיות מעניין לבצע IP ספציפי לחלבון בהתאם לשאלת המחקר.

בעת כימות החלק של חלבון לקטיליציה ספציפי בתמצית חלבון כוללת, ביצוע IP בלבד אינו מספיק. בעוד ש-IP באמצעותחרוזי K L-LA מאפשר לכידת חלבונים מלקטיליציה, הוא אינו מכמת במדויק את שיעור הלקטילציה, שכן הוא מוגבל להעשרת חלבוני מטרה. לכן, נדרש ספקטרומטריית מסה, המספקת ניתוח מפורט יותר המאפשר מדידה כמותית מדויקת של הלקטילציה. לכן, ביצוע IP של חלבון פוטנציאלי ללקטילציה באמצעות נוגדן נגד אותו חלבון, ואחריו ניתוח ספקטרומטריית מסה, יכול לקבוע את אחוז החלבונים הלקטיליטיביים בדגימת חלבון כוללת, בעוד שביצוע IP הוא גישה יעילה לאישור הלקטילציה של החלבונים שזוהו כלקטילציה על ידי טרשת נפוצה.

ב-IP המשתמש בנוגדנים לא מצומדים, אופטימיזציה של יחס החרוז-לנוגדנים חיונית כדי להבטיח לכידה מיטבית של חלבונים מלקטיליציליים. למעשה, האיזון בין שני הרכיבים הללו משפיע ישירות על הספציפיות והיעילות של ה-IP. עודף נוגדנים עלול להוביל לקשירה לא ספציפית, שמגבירה רעש רקע ומפחית את דיוק הגילוי הכולל. לעומת זאת, ההפך עלול להוביל להעשרת חלבוני מטרה לא יעילה, מה שמוביל לאותות חלשים יותר ולירידה ברגישות. שיקולים טכניים אלו קריטיים להשגת תוצאות אמינות ומדויקות בחקר חלבונים עם לקטילות.

לסיכום, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה למעקב אחר שינויים בפרופילי הלקטילציה בעקבות די ויסות הומאוסטזיס, כגון סרטן 8,10, שעשויים להשפיע על תגובה הקשורה לתרופות. ניתן אף להשיג זיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות שיטה זו. היישום על קווי תאים מרובים, סוגי רקמות ואפילו ביופסיות של מטופלים, טכניקה זו מחזיקה פוטנציאל להעמיק את ההבנה של איתות תאים מונע PTM במחלות או במצבים נורמליים.

גילויים

אין ניגוד עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים מכל הלב לכל חברי מעבדת ג'ירו על הדיונים המדעיים. אנו מודים לפלטפורמת פרוטאומית וספקטרומטריית מסה מהפקולטה לרפואה ומדעי הבריאות - אוניברסיטת שרברוק על השירותים וההכוונה. VG נתמכת על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RJPIN-2019-06185) והמכונים הקנדיים למחקר בריאות (178171). VG מחזיק בכיסא המחקר הקנדי Tier 2 בביולוגיה של תאי גזע במערכת העיכול. MH הוא מקבל מלגות ממרכז מחקר לדלקת ואונקולוגיה עיכול של אוניברסיטת שרברוק, אוניברסיטת שרברוק-קרן של סב, CRCHUS, TRaIning דור חדש של חוקרים בגסטרואנטרולוגיה וחיים (TRIANGLE), ותוכנית FRQ. FMB הוא חוקר מצטיין של FRQS (366044). VG ו-FMB הם חברים ב"מרכז מחקר CHUS" הממומן על ידי FRQS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קצה רוכסן 100 מיקרו"ר C18 פירס87784
Acclaim PepMap100 C18תאגיד דיונקס164946זיהוי 0.3 מ"מ x 5 מ"מ
אצטוניטריל (דרגת MS)פישרA955-4
ביקרבונט אמוניוםסיגמא-אלדריץ'A6141-500
נוגדן מונוקלונלי אנטי-HNRNPA1Novus Biologicals NB100-672
נוגדן מונוקלונלי אנטי-L-לקטיליזין (KL-La)PTM-ביוגרפיהPTM1401RM
IgG אנטי-עכבר, נוגדן המקושר ל-HRPCST7076S
אנטי-ארנב IgG, נוגדן הקשור ל-HRPCST7074S
Azure 280מערכות ביולוגיותAZI280-01
ערכת BCAתרמו פישר סיינטיפיקP123227
בובין סרום אלבומין (BSA)Wisent800-095-EG
מקור ננוESI בספריי כלואברוקר דלטוניקס
כלורואצטמידסיגמא-אלדריץ'C0267
מצע Clarity Max Western ECLביו-ראד1705062
דיתיותרייטול (DTT)תרמו פישר סיינטיפיקR0861
חרוזי Dynabeads Protein G לאימונופרציפיטציהתרמו פישר סיינטיפיק10004D
EDTAסיגמא-אלדריץ'E9884
חומצה פורמית (FA; דרגת MS)תרמו פישר סיינטיפיקA117-50
גליצרולפישר סיינטיפיקBP229-1
HEPES (1M)Wisent330-050-EL
עמודת Hypersep C18 100 מ"גפישר60108-302
חרוזי אגרוז מצומדים ב-KL-LAPTM-ביוגרפיהPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, ברומופנול)ויזנט, ג'יי.טי. בייקר800-100-CG, D293-01
מיקרוצינור עם חיבור נמוך 0.5 מ"לסארסטדט72.704.600
מיקרוצינור עם חיבור נמוך 1.5 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקP190410
מיקרוטיוב 1.7 מ"לאקסיגןMCT-175-C
מערכת HPLC של NanoEluteברוקר דלטוניקסגודל חלקיקים 1.9 מ"מ, זיהוי 75 מ"מ x 25 ס"מ
נוגדן פוליקלונלי IgG Rabbit תקיןמיליפור סיגמא12-370
פפספברוקר דלטוניקס1811112
סליין ממוגן בפוספט (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFתרמו פישר סיינטיפיק36978
קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC)סיגמא-אלדריץ'P8340-5
חלקיקי מגנטיים של חלבון A/G של Sera-Mag SpeedBeadsתרמו פישר סיינטיפיק09-981-920
כלוריד נתרןסיגמא-אלדריץ'S9888-500
פלואוריד נתרןסיגמא-אלדריץ'S1504
נתרן אורתובנאדטסיגמא-אלדריץ'S6508
TimsTOF pro ספקטרומטר מסה  ברוקר דלטוניקס
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)תרמו פישר סיינטיפיקA116-50
טריס-HClWisent600-125-IK
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'X100
טריפסין (דרגת MS)פירס90058
אוריאהתרמו פישר סיינטיפיקU15-500
Vaccufuge plusאפנדורף22820168
מים (דרגת MS)VWR10803-890A
β-גליצרופוספטסיגמא-אלדריץ'G5422
β-מרקפטואנולסיגמא-אלדריץ'M3148

מקורות

  1. Li, H., Sun, L., Gao, P., Hu, H. Lactylation in cancer: Current understanding and challenges. Cancer Cell. 42 (11), 1803-1807 (2024).
  2. Lu, Z., et al. Lactylation: The emerging frontier in post-translational modification. Front Genet. 15, 1423213(2024).
  3. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  4. Niu, Z., et al. HBO1 catalyzes lysine lactylation and mediates histone H3K9la to regulate gene transcription. Nat. Commun. 15 (1), 3561(2024).
  5. Zhao, Q., et al. Non-enzymatic lysine D-lactylation induced by glyoxalase II substrate SLG dampens inflammatory immune responses. Cell Res. 35 (2), 97-116 (2025).
  6. Moreno-Yruela, C., et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 8 (3), eabi6696(2022).
  7. Yang, W., et al. Hypoxic in vitro culture reduces histone lactylation and impairs pre-implantation embryonic development in mice. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 57(2021).
  8. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat. Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  9. Zhang, N., et al. Protein lactylation critically regulates energy metabolism in the protozoan parasite Trypanosoma brucei. Front Cell Dev Biol. 9, 719720(2021).
  10. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  11. Kim, M. -S., Zhong, J., Pandley, A. Common errors in mass spectrometry-based analysis of post-translational modifications. Proteomics. 16 (5), 700-714 (2016).
  12. Conradi, C., Shiu, A. Dynamics of post-translational modification systems: Recent progress and future directions. Biophys J. 114 (3), 507-515 (2018).
  13. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  14. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  15. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  16. Zaru, R., Orchard, S. UniProt Consortium. UniProt Tools: BLAST, Align, Peptide Search, and ID Mapping. Curr Protoc. 3 (3), e697(2023).
  17. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  18. Sun, J., Xia, Y. Pretreating and normalizing metabolomics data for statistical analysis. Genes Dis. 11 (3), 100979(2023).
  19. Yang, Y., Qiao, L. Data-independent acquisition proteomics methods for analyzing post-translational modifications. Proteomics. 23 (7-8), e2200046(2023).
  20. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein post-translational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  21. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. J Vis Exp. (185), e64294(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים