הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת מערכת גידול תריפס צ'ילי (Scirtothrips dorsalis Hood) לבדיקת אלימות של פטריות אנטומופתוגניות

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68600

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

במאמר זה

סיכום

הוקם פרוטוקול בדיקה ביולוגית של עלים מנותקים לגידול המוני של תריפס צ'ילי בשיטת עלים מנותקים שונה במיכלי זכוכית המכילים אגר, מה שמבטיח הישרדות גבוהה והתפתחות מסונכרנת. מערכת זו מאפשרת סינון יעיל של אלימות פטריות אנטומופתוגניות כנגד זחלי כוכב 2 ומספקת אספקת תריפס אמינה להערכות מעבדה, חממה ושדה.

תקציר

תריפס הצ'ילי (Scirtothrips dorsalis Hood) הוא מזיק משמעותי מבחינה כלכלית של גידולי נוי ומזון בטייוואן. פטריות אנטומופתוגניות (EPF) פועלות כחומר הדברה ביולוגי ידידותי לסביבה לניהול תריפסים. חיוני לסנן את האלימות של מבודדי EPF כנגד תריפס צ'ילי בתנאי מעבדה לפני יישום בשטח. עם זאת, נתונים מוגבלים על שיטת הגידול של תריפס צ'ילי מציבים אתגרים לבדיקות מעבדה בקנה מידה גדול. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו שיטת גידול מעבדה מותאמת לייצור המוני של S. dorsalis.

השיטה משתמשת במערכת גידול עלים מנותקים באמצעות מיכל זכוכית המכיל אגר המתאים להערכת EPF כנגד תריפס צ'ילי. מערכת בדיקה ביולוגית עלים מנותקים אופטימלית זו מתאימה להערכת היעילות של EPF נגד תריפס צ'ילי. למערכת יש יכולת לייצר מספר רב של תריפסים באותו שלב התפתחותי לבדיקת אלימות. על פי הבדיקה, התוצאה הראתה כי מבודד קורדיספס קטניאנולטה (Cc-NCHU-213) הראה את האלימות הגבוהה ביותר (53.6%) כנגד זחלי כוכבשני של תריפס צ'ילי 7 ימים לאחר החיסון (d.p.i). יתר על כן, דיסקות העלים המשובצות באגר נשארו טריות במשך למעלה מ-7 ימים, מה שאפשר לתריפסים לשרוד (שיעור הישרדות של 90% בטיפול הביקורת) לאורך כל תקופת התצפית, מה שמעיד על יציבות מערכת הגידול. פרוטוקול זה מדגים מערכת גידול יציבה לייצור המוני ולהערכת האלימות של מבודדי EPF כנגד תריפס צ'ילי וזה עשוי להיות שימושי עבור תריפסים אחרים, ומאפשר סינון של מבודדי EPF פוטנציאליים לשליטה בתריפסים בשדה.

מבוא

תריפס הצ'ילי (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) הוא מזיק פוליפגוס הפוגע ביותר מ-100 מיני צמחים ב-40 משפחות צמחים שונות, כולל ירקות וגידולי נוי ופירות1. מקורו באסיה הטרופית והסובטרופית - דרום מזרח אסיה, הודו, יפן וטייוואן2. למיטב ידיעתנו, תריפס הצ'ילי הוא המזיק של גידולי חקלאות ונוי, כולל מנגו, תה, אוכמניות ולוטוס בטייוואן. במהלך שני העשורים האחרונים, תריפס הצ'ילי הפך למזיק כלכלי משמעותי במספר מדינות בגלל הגלובליזציה הגוברת והסחר החקלאי הפתוח. בנוסף, פוטנציאל הרבייה הגבוה ויכולת ההסתגלות לאזורים שפלשו לאחרונה תרמו להתפשטות מזיק זה 1,3.

תריפס הצ'ילי ניזון בעיקר מעלווה צעירה, נבטים, עלי כותרת של פרחים ופירות לא בשלים, מה שמוביל לנמק ולמוות של רקמות3. יתר על כן, הם משמשים כווקטור למחלות צמחים שונות, כולל וירוס נמק ניצני אגוזי אדמה (GBNV), וירוס כתמי מניפה כלורוטיים של אגוזי אדמה (GCFSV), וירוס כתמים צהובים (GYSV)4 ווירוס פס טבק (TSV)5. כתוצאה מכך, האכלה על ידי תריפס צ'ילי יכולה להפחית משמעותית את התשואה והערך של היבולים המושפעים. ניהול מוצלח של תריפס צ'ילי מסתמך על תוכנית הדברה משולבת המשתמשת באסטרטגיות הדברה תרבותיות, ביולוגיות וכימיות1. בטייוואן, חקלאים אורגניים משתמשים בדרך כלל בחומרים לא כימיים, כגון שמן צר טווח ושמן נים, או בשיטות הדברה ביולוגיות, כולל שימוש בקרדית טורפת וחרקים פיראטיים זעירים (על ידי תצפית אישית). עם זאת, על סמך משוב מהחקלאים, מריחת שמנים אלה בעונת הפריחה והפרי עלולה להפריע להאבקה ולפגוע באבקה, מה שמוביל לירידה ביבול ובערך הכלכלי. לכן, פיתוח אמצעי בקרה חלופיים יעילים לתריפס צ'ילי הוא חיוני עבור חקלאים אורגניים.

פטריות אנטומופתוגניות (EPF) הן קבוצה של פטריות הורגות חרקים שהוכחו כטכניקת הדברה יעילה ובת קיימא 6,7,8. מספר מחקרים הוכיחו את היעילות של EPF נגד תריפס צ'ילי. EPFs מסחריים, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES), ו-Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), הפגינו שליטה משמעותית בתריפס צ'ילי על צמחי ורדים 9,10. ניתן להפחית את אוכלוסיות תריפס הצ'ילי על צמחי פלפל גם על ידי Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11. EPFs אחרים, כגון Lecanicillium lecanii ו-Purpureocillium lilacinum, נבדקו נגד תריפס צ'ילי בגידולים שונים, כולל צמח צ'ילי ותה, והיו יעילים בהדברת מזיק זה12,13.

כמה מחקרים קודמים שבדקו את יעילותם של EPFs להדברת תריפסים בחממות או בשדה נערכו ללא סינון ראשוני של זנים/זני EPF היעילים ביותר, מה שהגביל את יעילותם. סינון קפדני של EPFs עשוי לשפר מאוד את ניהול המזיקים. מחקרים רבים גידלו תריפסים לבדיקות ביולוגיות על צמחים שלמים בתוך כלובים11,14. בעוד שמערכת גידול צמחים שלמה מציעה סביבה טבעית יותר לתריפסים, הם מציבים אתגרים בניהול שלבי התפתחות שונים, שכן תריפסים מציגים התנהגויות שונות בכל שלב. שונות זו עלולה לסבך את בחירת השלבים הממוקדים למטרות ניסוי ספציפיות. יתר על כן, תנאי הקרקע בתוך מערכת גידול הצמחים השלמה עשויים להשפיע על ההתגלמות והאקלוזציה של תריפס הצ'ילי, ובכך להפחית את מספר הפרטים הזמינים לבדיקות ביולוגיות עוקבות15, ולהגביל את המשאבים לבדיקות ביולוגיות נוספות. בנוסף, מערכות גידול צמחים שלמות דורשות יותר מקום וטיפול מתמשך בצמחים, מכיוון שצמחים לחוצים עשויים לשנות את התנהגות התריפסים ויכולים להיות גוזלים זמן רב יותר ועתירי משאבים. ישנם מעט דיווחים על מערכות גידול תריפסים המבוססות על חומר צמחי לא חי (למשל, רקמת צמחים מנותקת או תזונה מלאכותית) לניסויים ביולוגיים במעבדה, אך הפרטים של שיטות אלה היו לעתים קרובות לא ברורים או הושמטו12,16.

מחקר זה נועד לפתח מערכת גידול המוני פשוטה, חסכונית ובת קיימא של תריפס צ'ילי בתנאי מעבדה. בפרוטוקול זה, שיטת גידול דיסק עלים7 שונתה כדי להציע גישה יעילה ומבוקרת יותר לגידול המוני, המאפשרת בחירה מדויקת של שלבי התפתחות לבדיקות ביולוגיות באמצעות בקרה הדוקה על תנאי הסביבה. בנוסף, פותחה מערכת בדיקה ביולוגית יציבה וניתנת לשחזור כדי להעריך את האלימות של פטריות אנטומופתוגניות מבודדות (EPF) ב-50% זמן קטלני (LT50) ו-50% ריכוז קטלני חציוני (LC50), המתייחסים לזמן המשוער במינון ספציפי, וריכוז התרחיף הפטרייתי הנדרש כדי לגרום לתמותה של 50% מתריפס צ'ילי, בהתאמה. באמצעות יישום שיטה זו, ניתן לזהות נכון את התריפסים שנאספו בשטח, ולשמור על מושבות המעבדה היציבות של תריפסים כדי לבדוק את יעילותם של מבודדים פטרייתיים שונים במתודולוגיה קלה וניתנת לשחזור יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: תרשים הזרימה הניסיוני המלא מוצג באיור 1.

1. תריפס צ'ילי, איסוף שדה ותחזוקת מושבה

  1. אוסף תריפס צ'ילי
    1. בדוק ויזואלית את שני צידי העלים ובתוך הפרחים לאיתור התפשטות של תריפס צ'ילי על צמחי אוכמניות בחוות אוכמניות מושפעת.
    2. רשום את הפרטים של כל דגימה (למשל, חלק מהצמח וחומרת הנגיעות), ואשר את שיטות הייצור עם חקלאים, כגון חקלאות קונבנציונלית או חקלאות אורגנית, כולל מריחת שמן מינרלי ואויבים טבעיים.
    3. חותכים את העלים והפרחים הנגועים בתריפס צ'ילי ומעבירים אותם לשקית הרוכסן מפלסטיק (טבלת החומרים), ואז אוטמים את שקית הרוכסן עם קצת אוויר בפנים כדי לשמור על התריפסים בחיים. הביאו את הדגימה למעבדה תוך 3 שעות.
      הערה: הכניסו את הדגימה לצידנית כאשר זמן איסוף השטח הוא יותר מ-3 שעות.
    4. הכינו מיכל גידול זכוכית (35 מ"מ גובה, 45 מ"מ קוטר פנימי), הניחו שלוש שכבות של מגבת נייר עגולה (40 מ"מ קוטר) בתחתית מיכל גידול הזכוכית, ולאחר מכן הוסיפו 8-10 טיפות (400-500 מיקרוליטר) של מים מסוננים (איור 1 וטבלת החומרים).
    5. אספו עלה מנגו אדום צעיר משדות המנגו (איור 1). שטפו את העלה ובדקו במיקרוסקופ אופטי (טבלת חומרים) אם יש ביצי חרקים או זיהום חרקים אחר לפני הכנת מיכל גידול הזכוכית. חותכים את עלה המנגו בעזרת חותך עור (טבלת חומרים) לדיסק עגול (40 מ"מ) ומניחים אותו על מגבת הנייר הרטובה.
      הערה: עלי מנגו הם משאבים יציבים יותר להאכלת תריפסים מאשר עלי אוכמניות צעירים, הגדלים רק בעונה.
    6. התבוננו בתריפס הצ'ילי במיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 10, והעבירו 10 תריפסים בוגרים (חמישה זכרים וחמש נקבות) באמצעות מברשת צביעה עדינה (טבלת חומרים) לתוך מיכל גידול הזכוכית.
    7. אטמו כל מיכל גידול זכוכית בשתי שכבות של פרפילם (טבלת חומרים) וצרו כ-40 חורים קטנים באמצעות סיכת חרקים #00 לאוורור (טבלת חומרים).
    8. שמור את מיכל גידול הזכוכית בחממה בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס, ~70% לחות יחסית עם תקופת אור של אור: כהה (L:D) = 12 שעות: 12 שעות (טבלת חומרים).
    9. הסר את המבוגרים בעזרת מברשת צבע לאחר 48 שעות.
      הערה: בהתבסס על התצפית שלנו, התריפסים הנקבות יטילו ביצים ~ יומיים לאחר העברתן למיכל גידול הזכוכית.
    10. התבוננו ברקמות העלים עם הביצים תחת סטריאומיקרוסקופ כדי לאשר עוד יותר את ההטלה (איור 1 וטבלת החומרים). מניחים דיסק עלי מנגו טרי על העלה עם ביצים ומוסיפים 8-10 טיפות מים מסוננים על מגבת הנייר כדי לשמור על הלחות.
  2. שמירה על אוכלוסיית תריפס הצ'ילי
    הערה: הביצים בוקעות לזחלי כוכב ראשון לאחר ~5-7 ימים.
    1. העבירו ישירות את העלה המכיל זחליכוכב אחד למיכל גידול זכוכית חדש.
      הערה: בעזרת מברשת צבע, העבירו בעדינות זחלי כוכב ראשון למיכל גידול זכוכית חדש, הימנעו מזיהום מהגידול הפטרייתי הרקוב והבלתי צפוי על עלי המנגו. על סמך התצפית שלנו, נקבה בוגרת מטילה בממוצע 6 ביצים ביום.
    2. שימו לב לתריפס הצ'ילי מדי יום. הוסף 8-10 טיפות מים מסוננים כל 4 ימים ליד מגבת הנייר. הוסף דיסק עלי מנגו טרי בתוך המיכל כל 4 ימים, לפני שהעלה הישן מתייבש.
      הערה: זחלי כוכב ראשון מגיחים לבוגרים תוך ~7-10 ימים, תלוי בגורמים סביבתיים כגון טמפרטורה ולחות.
    3. התבונן באוכלוסיית תריפס הצ'ילי מדי יום עד שהתריפסים מתפתחים לבוגרים, וחזור על השלבים משלב 1.1.4 לתחזוקת אוכלוסייה לטווח ארוך.
  3. גידול המוני של תריפס צ'ילי
    1. אספו נקבות בוגרות מהאוכלוסייה המתוחזקת והכינו מיכל גידול זכוכית על פי השלבים לעיל.
    2. העבירו 10 נקבות בוגרות למיכל ובצעו את השלבים משלבים 1.1.4 עד 1.1.10 כדי לקבל עלה עם ביצים.
      הערה: נקבה בוגרת מטילה בממוצע 6 ביצים ביום.
    3. העבירו בעדינות ~120 זחלי כוכב אחד למיכל גידול זכוכית חדש באמצעות מברשת צבע.
    4. שימו לב לתריפס הצ'ילי מדי יום. הוסף 8-10 טיפות מים מסוננים על מגבת הנייר כל 4 ימים. הוסף דיסק עלי מנגו טרי למיכל כל 4 ימים לפני שהעלה הישן מתייבש.
    5. אסוף זחלי כוכב ראשון 5-7 ימים לאחר הטלת הביצים; לאסוף 2 זחלי כוכבלאחר 7-10 ימים; לאסוף בוגרים אחרי ~14 ימים עבור הבדיקה הביולוגית (איור 2).
      הערה: התבוננו במורפולוגיה כדי להבחין בשלבים שונים של תריפס צ'ילי לניסויים נוספים (איור 2).

2. זיהוי מולקולרי של תריפס צ'ילי

הערה: יש לזהות תריפסים שנאספו מהשדה לרמת המין על ידי זיהוי מולקולרי באמצעות שבר של הגן המיטוכונדריאלי ציטוכרום אוקסידאז I (COI), סמן נפוץ לתריפס צ'ילי17,18.

  1. מיצוי תריפס צ'ילי DNA גנומי
    1. אוספים תריפס צ'ילי בוגר אחד בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל (טבלת חומרים).
    2. הומוגניזציה של תריפס הצ'ילי באמצעות עלי גלולה, ולאחר מכן בודד DNA גנומי באמצעות הערכה המסחרית על פי פרוטוקול היצרן (טבלת חומרים).
  2. הגברת PCR וריצוף DNA
    1. הגבירו את שבר ה-DNA הצפוי של תריפס צ'ילי על ידי שימוש ב-PCR Master Mix (2x) עם זוג פריימר COI, פריימר קדימה LCO 1490 ופריימר הפוך HCO 2198, המגביר את הגן החלקי של COI המיטוכונדריאלי (טבלת חומרים).
      1. הכן תערובת PCR של 20 מיקרוליטר המכילה 2 מיקרוליטר של תבנית DNA גנומית של תריפ, 1 מיקרוליטר כל אחד של פריימרים קדימה ואחורה, 10 מיקרוליטר של 2x PCR Master Mix ו-6 מיקרוליטר של ddH2O (טבלת חומרים).
      2. בצע את ה-PCR עם Thermal Cycler עם תנאי הרכיבה הבאים: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן הארכה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (טבלת חומרים).
    2. בדוק את אמפליקון ה-PCR על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 1% כדי לאמת את תוצאת ההגברה (איור 3).
    3. כרתו את רצועת המטרה (גודל האמפליקון הצפוי היה 658 bp) וטהרו את אמפליקון ה-COI PCR של תריפס הצ'ילי באמצעות ערכת טיהור ג'ל/PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. שלח את המוצר המטוהר לריצוף באמצעות שירות ריצוף מסחרי. (טבלת חומרים).
  3. ניתוח רצף
    1. העריכו את איכות הרצף באמצעות התוכנה המוזכרת (טבלת החומרים).
    2. פתיחת קובץ ה-FASTA או TXT וחיתוך ידני של הבסיסים באיכות נמוכה הן ב-5' והן ב-3' מסתיימת על ידי מחיקת הרצפים הלא רצויים.
    3. בצע חיפוש BLAST במסד הנתונים של NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) באמצעות פרמטרי ברירת מחדל כדי לאשר את זהות המין.

3. הכנת פטריות אנטומופתוגניות

הערה: מבודדי ה-EPF ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.

  1. התאוששות של מבודדים פטרייתיים מספריית המשאבים הפטרייתיים
    1. הפשירו את ציר הקונידיה הפטרייתי המשומר (קונידיה תלויה ב-30% גליצרין) ממקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
    2. מעבירים כ-10 מיקרוליטר ממתלה הקוניידיה ומורחים באופן שווה על צלחת אגר דקסטרוז Sabouraud (SDA) בגודל 5.5 ס"מ 1/4 באמצעות מפזר תאים במכסה זרימה למינרית. את המדיום מכינים על ידי ערבוב של 0.75 גרם מרק דקסטרוז Sabouraud ו-1.5 גרם אגר ב-100 מ"ל מים מזוקקים כפולים (ddH2O) (טבלת חומרים).
    3. אוטמים את צלחת הפטרי עם פרפילם (טבלת חומרים) ומעבירים את הצלחת לחממת חושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10-14 ימים.
    4. תת-תרבית של התפטיר הפטרייתי הגדל באופן פעיל על ידי פסים על צלחת טרייה של 1/4 Sabouraud dextrose agar (SDA). דגרו פטריות לחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10-14 ימים כדי לאפשר התפתחות קונידיאלית לפני הקציר.
      הערה: השתמש בתרביות פטרייתיות בנות כ-10 ימים לבדיקות ביולוגיות עוקבות. תרביות בנות יותר מ-14 יום אינן מומלצות לבדיקת אלימות בשל הפחתה פוטנציאלית בכדאיות הקונידיאלית.
  2. הכנת תרחיף קונידיה
    1. הוסף 2-3 מ"ל של 0.03% טווין 80 לפני השטח של תרבית פטרייתית בת 10-14 יום על 1/4 SDA. מגרדים בעדינות את הקונידיה באמצעות לולאה סטרילית (טבלת חומרים).
    2. העבירו את התרחיף הפטרייתי לצינור צנטריפוגה נקי של 15 מ"ל.
    3. הומוגניזציה של המתלה על ידי מערבולת במהירות המרבית וסנן אותו דרך נייר סינון כדי להסיר פסולת היפאלית ולקבל מתלה קונידיה טהור.
    4. השתמש בהמוציטומטר (טבלת חומרים) כדי לבדוק את מספר הקונידיות תחת מיקרוסקופ אור ולדלל את התרחיף ל-108 קונידיה/מ"ל.
    5. העבר את התרחיף הקונידיאלי למיקרו-מרסס מעוקר באור UV ליישום ביו-בדיקה לאחר מכן.
      הערה: ודא שהמתלה הקונידיאלי מסובב היטב לפני כל העברה כדי למנוע שקיעה. לפני השימוש, יש לעקר את המיקרו-מרסס על ידי חשיפתו לקרינה אולטרה סגולה למשך 30 דקות בתוך מכסה זרימה למינרית.

4. הקרנת אלימות נגד תריפס צ'ילי

  1. הכנת זחלי כוכב 2
    1. אסוף את זחלי הכוכבהשני על ידי ביצוע השלבים 1.3.1-1.3.5 עבור הניסוי הבא.
      הערה: הבחינו בין זחלי הכוכבהשני לפי צבע הגוף הצהוב והבטן הרחבה שלהם בהשוואה לזחלי הכוכב הראשון (איור 2).
  2. הכנת מיכל חיסון
    הערה: בחר את מיני העלים על סמך יבול היעד של תריפס הצ'ילי. במחקר זה נאספו תריפס צ'ילי משדה עלי האוכמניות הנגועים 'בילוקסי' (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp). לכן, הבדיקה הביולוגית של EPF נגד תריפס צ'ילי תתבצע על עלי אוכמניות.
    1. אספו עלי אוכמניות צעירים מחוות אוכמניות ושטפו את עלי האוכמניות כדי להסיר אבק פני השטח וכל פרוקי רגליים אחרים אם קיימים.
    2. יבש את העלים באוויר או השתמש במגבות נייר כדי לנגב מים; לאחר מכן, בדוק את פני השטח של עלי האוכמניות לאיתור פרוקי רגליים או ביצים אחרים תחת סטריאומיקרוסקופ. הסר פרוקי רגליים אם קיימים.
    3. חותכים דיסק עלים בקוטר 2.8 ס"מ בעזרת חותך עור (טבלת חומרים), מחטאים את העלה באמצעות אקונומיקה 1% (תמיסת נתרן היפוכלוריט), ושוטפים פעמיים במים מעוקרים כדי להסיר שאריות אקונומיקה על העלים.
      הערה: הכן את דיסק העלים לפני התמצקות האגר כדי להבטיח שניתן להטמיע את דיסק העלים באגר המים כראוי.
    4. חיטוי תמיסת אגר מים 2.5% (2.5 גרם אגר לכל 100 מ"ל של ddH2O) לעיקור.
    5. יוצקים 3 מ"ל של אגר מים 2.5% למיכלי זכוכית קטנים (35 מ"מ גובה, 30 מ"מ קוטר פנימי) בתוך מכסה זרימה למינרי לפני שהאגר מתמצק. מניחים לאגר להתקרר לכ-40 מעלות צלזיוס עד שהוא מגיע למצב מוצק למחצה.
    6. הנח בעדינות את דיסק העלים (הצד האדאקסיאלי כלפי מעלה) על האגר, והטביע אותו מעט עם חשיפה מינימלית מעל פני האגר. לאחר שאגר המים מתמצק במלואו, מיכלי הזכוכית מוכנים לבדיקה הביולוגית.
  3. חיסון ותצפית EPF
    1. לפני היישום, מערבל היטב את המתלה הקונידיאלי. בעזרת מיקרו-מרסס, מרחו באופן שווה 0.1 מ"ל מהתרחיף (שהוכן בשלב 3.2.4) על פני כל דיסק עלה ממרחק של כ-10 ס"מ בתוך מיכל הזכוכית.
      הערה: בדוק את אזורי הריסוס לפני הניסוי. ודא שהריסוס מכסה באופן שווה את כל דיסק העלים בשכבה דקה. אם טיפות מצטברות למים עומדים על העלה, הפחיתו את נפח החיסון כדי למנוע הרטבת יתר.
    2. יבש באוויר את תרחיף הקוניידיה על העלה למשך 30 דקות בתנאים סטריליים (למשל, במכסה זרימה למינרית).
    3. העבירו 10 מתוך 2 זחלי כוכב לכל מיכל בעזרת מברשת צבע עדינה ואטמו כל מיכל גידול זכוכית בשתי שכבות של פרפילם.
    4. צור ~30 חורים קטנים על ידי שימוש בסיכת חרקים #00 (טבלת חומרים) לאוורור.
    5. חסנו את המיכל באינקובטור של 25 ± מעלות צלזיוס עם ~70% לחות יחסית ותקופת אור של L:D = 12 שעות: 12 שעות.
    6. התבונן ורשום את התמותה של תריפס צ'ילי תחת סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 מדי יום למשך 7 ימים.
    7. שמור את הזחלים המתים בתוך מיכל הזכוכית לתצפית על מיקוזיס כדי לאשר את זיהום ה-EPF.

5. בדיקה ביולוגית של מבודדי EPF נבחרים

הערה: ניתן לבחור את מבודד ה-EPF האלים ביותר או מספר מבודדים בעלי אלימות גבוהה לבדיקה ביולוגית תלוית מינון נגד תריפס צ'ילי. שלושה ריכוזים קונידיאליים שונים, הנעים בין 106 ל-108 קונידיה/מ"ל, שימשו להערכת הקשר בין מינון לפתוגניות.

  1. הכנת תרחיף קונידיה
    1. שחזר את מבודד ה-EPF שנבחר לפי שלב 3.1.
    2. הכן שלושה ריכוזים של תרחיפי קונידיה (106, 107 ו-108 קונידיה/מ"ל) כמתואר בשלב 3.2.
  2. הכנת זחלי כוכב 2
    1. אסוף את זחלי הכוכב השני על ידי ביצוע שלב 4.1 כדי להשיג בוגרים חדשים.
  3. הכנת מיכל חיסון
    1. בצע את שלב 4.2. להכין את מיכל החיסון המכיל דיסקיות עלי אוכמניות משובצות באגר מים.
  4. חיסון ותצפית EPF
    1. בצע את חיסון ה-EPF עם שלושה ריכוזים של תרחיף קונידיה, כמתואר בשלב 4.3.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. חישוב התמותה
    1. שנה את נתוני התמותה של כל זן פטרייתי על ידי טרנספורמציה של Arcsin לפני ביצוע ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) כדי להעריך את ההבדלים בין טיפולים פטרייתיים (רמת מובהקות מוגדרת כ-p < 0.05).
    2. בצע השוואות פוסט-הוק של אמצעי טיפול באמצעות מבחן ההבדל המשמעותי הכנה (HSD) של Tukey.
  2. חישוב זמן קטלני חציוני (LT50) וריכוז קטלני חציוני (LC50)
    1. חשב את ערכי הזמן הקטלני החציוני (LT50) והריכוז הקטלני החציוני (LC50) באמצעות ניתוח רגרסיה של Probit.
    2. צור ואכלס משתנים בשם "סה"כ", "תגובה" ו"משך" (עבור LT50) או "ריכוז" (עבור LC50) עם הנתונים הנצפים בממשק התוכנה.
      הערה: אם התמותה המצטברת אינה עולה על 50% במהלך תקופת התצפית, לא ניתן להעריך באופן אמין את ערכי LT50 ו/או LC50.
    3. ביצוע ניתוח פרוביט על ידי ניווט לניתוח | רגרסיה | פרוביט. הגדר את ה"סה"כ" כמספר הכולל של החרקים שנבדקו, "תגובה" כמספר החרקים המתים, ו"משך" או "ריכוז" כמשתנה המשנה. הגדר את רמת המובהקות עבור גורם ההטרוגניות ל-0.05 על ידי לחיצה על אפשרויות והגדרת רמת המובהקות לשימוש במקדם ההטרוגניות ל-0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים הזרימה הניסיוני שהוצג במחקר זה הראה כי ניתן לבסס את מערכת הגידול היציבה של תריפס הצ'ילי, החל מאיסוף השדה ועד לסינון האלימות של מבודדי EPF (איור 1). למרות שתצפית מורפולוגית יכולה להבחין בין תריפס צ'ילי לתריפסים אחרים של פרחים, השימוש ברצף COI החלקי כסמן מולקולרי, כולל גודל אמפליקון PCR וריצוף COI, יכול לאשר עוד יותר את הזיהוי של תריפסים שנאספו בשדה כתריפס צ'ילי (איור 3). מערכת גידול העלים המנותקים מספקת סביבת בקרה טובה יותר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תריפס צ'ילי הוא מזיק בעל חשיבות עולמית המשפיע על גידולים רבים בעלי חשיבות כלכלית כגון תירס, בוטנים, פלפל, פולי סויה, תות, בטטה ועגבנייה 1,11,19. אסטרטגיות הבקרה הנוכחיות מסתמכות על גישות משולבות הכוללות פרקטיקות תרבותיות, חומרי הדברה ביולוגיים וטיפולים כימיים, כולל שימוש באויבים טבעיים, נמטודות ו-EPFs 11,14,20,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים בעבודה זו.

תודות

אנו מודים במיוחד למר לין, Huanf-Jen מחוות האוכמניות Humi (Wufeng Dist., Taichung City), שסיפק את צמחי האוכמניות. מחקר זה נתמך על ידי 113-2313-B-005 -024 -MY3 מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (NSTC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#00 סיכת חרקיםאנטוסופינקס DMM0220תוצרת בריטניה
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לקורנינג התאגדהMCT-175-Cתוצרת ארה"ב
10 μ L לולאת חיסוןNEST מדעי718201תוצרת ארה"ב
סולם DNA 100 bp IIIג'נאידDL007תוצרת טייוואן.
2x SuperRed PCR מאסטר מיקסביו-כליםTE-SR01תוצרת טייוואן
צלחת פטרי 6 ס"מאלפא פלוס סיינטיפיק16021תוצרת טייוואן
אגרביומן סיינטיפיקAGR001.1כיתה מיקרוביולוגיה
אגרוזביומן סיינטיפיקPB1200תוצרת טייוואן
מאגר ג'ל DNA בטוח של BioGreenביומן סיינטיפיקSDB001Tתוצרת טייוואן
ערכת רקמות מיצוי DNA קלה במהירות גבוההפישר ביוטקET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (תוצרת אוסטרליה)
פריימר קדמי: LCO 1490גנומיקה PO-PR220919G6רצף: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
ערכת ג'ל/PCR של GenepHlowג'נאידDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
מיכל גידול זכוכית חברת סאנשיין לאב ציודגודל: 35 מ"מ גובה, 45 מ"מ קוטר פנימי. ניתן להחלפה בכל גודל דומה של פלסטיק או זכוכית.
המוציטומטרפול מרינפלד640030תוצרת גרמניה
חממההייפוינטF740תוצרת טייוואן
חותך עורסדנת עבודת יד אמיתיתhttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp תרמי Cyclerתרמו פישר סיינטיפיקא37834תוצרת ארה"ב
מיקרוסקופ אופטי ניקון  סי-לתוצרת יפן
מכחול ציורחברת מברשות טיאן צ'נג4716608400352ניתן להחליף במברשת צבעי מים עדינה, שוות ערך למברשת עגולה בגודל 0 או 1.
מגבת ניירמאי פורחBLS007-8תוצרת טייוואן
פרפילם מבמיסPM-996תוצרת ארה"ב
עלי גלולהביומן סיינטיפיקGT100Rתוצרת טייוואן
פריימר הפוך: HCO 2198גנומיקה PO-PR220919G6רצף: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
מרק דקסטרוז SabouraudהיימדיהMH033-500Gתוצרת הודו
סטריאומיקרוסקופסופטופשנז'ן71תוצרת טייוואן
מאגר TAE 50Xביומן סיינטיפיקTAE501000תוצרת טייוואן
טווין 80PanReac AppliChem142050.1661תוצרת טייוואן
תיק רוכסןחברת פלסטיק וונצ'ן1809000061גודל: רוחב 12 ס"מ ואורך 17 ס"מ. (תוצרת טייוואן)

מקורות

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
  2. Hoddle, M. Scirtothrips dorsalis (chilli thrips). CABI Compendium. , Wallingford, CT, USA. (2022).
  3. Liburd, O. E., Panthi, B. R., Phillips, D. A. Chilli thrips on blueberries in Florida: ENY2053/IN1298. EDIS. 2020 (6), (2020).
  4. Gopal, K., Krishna Reddy, M., Reddy, M., Muniyappa, V. Transmission of peanut yellow spot virus (PYSV) by thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in groundnut. Arch Phytopathol Plant Prot. 43 (5), 421-429 (2010).
  5. Prasada Rao, R., et al. The host range of tobacco streak virus in India and transmission by thrips. Ann Appl Biol. 142 (3), 365-368 (2003).
  6. Chang, J. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Front Sustain Food Syst. 5, 596316(2021).
  7. Yang, C. J., Nai, Y. S. Assessment of aphidicidal effect of entomopathogenic fungi against mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J Vis Exp. (197), e65312(2023).
  8. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. J Vis Exp. (175), e62882(2021).
  9. Aristizábal, L., Chen, Y., Cherry, R., Cave, R., Arthurs, S. Efficacy of biorational insecticides against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae), infesting roses under nursery conditions. J Appl Entomol. 141 (4), 274-284 (2017).
  10. Francis, J. R., Manchegowda, H. K. Molecular phylogenetic identification of Metarhizium and Beauveria and their bio-efficacy against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. Int J Trop Insect Sci. 43 (3), 909-918 (2023).
  11. Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).
  12. Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae). Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).
  13. Panyasiri, C., et al. Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant. Insects. 13 (8), 684(2022).
  14. Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis). Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).
  15. Han, D., et al. Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae). Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).
  16. Tatara, A. Effect of temperature and host plant on the development, fertility and longevity of Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae). Appl Entomol Zool. 29 (1), 31-37 (1994).
  17. Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification. Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).
  18. Silva, R., et al. Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region. Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).
  19. Venette, R., Davis, E. Chilli thrips/yellow thrips, Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae) mini pest risk assessment. , Univ Minnesota Tech Bull. (2004).
  20. Mandi, N., Senapati, A. Integration of chemical, botanical and microbial insecticides for control of thrips, Scirtothrips dorsalis Hood infesting chilli. J Plant Prot Sci. 1 (1), 92-95 (2009).
  21. Samota, R., Jat, B., Choudhary, M. D. Efficacy of newer insecticides and biopesticides against thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in chilli. J Pharmacogn Phytochem. 6 (4), 1458-1462 (2017).
  22. Panthi, B. R., Renkema, J. M., Lahiri, S., Liburd, O. E. The short-range movement of Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae) and rate of spread of feeding injury among strawberry plants. Environ Entomol. 50 (1), 12-18 (2021).
  23. Priyanka, T., et al. Biology and morphometrics of Thrips parvispinus (Karny) (Thysanoptera: Thripidae) on chilli, Capsicum annuum L. Pest Manag Hortic Ecosyst. 30 (1), 85-92 (2024).
  24. Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies. Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).
  25. Xu, X. M., Guerin, L., Robinson, J. Effects of temperature and relative humidity on conidial germination and viability, colonization and sporulation of Monilinia fructigena. Plant Pathol. 50 (5), 561-568 (2001).
  26. Lee, S. J., et al. Transcriptional response of bean bug (Riptortus pedestris) upon infection with entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana JEF-007. Pest Manag Sci. 75 (2), 333-345 (2019).
  27. Yang, Y. -T., et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae). Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).
  28. Qayyum, M. A., et al. Entomopathogenic fungi: prospects and challenges. Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הקמת מערכת גידול תריפס צ'ילי (Scirtothrips dorsalis Hood) לבדיקת אלימות של פטריות אנטומופתוגניות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.