מאמר שיטה

תפקיד פוטנציאלי של ציר האיתות PGE 2-EP4-Ca2+ בדלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית

DOI:

10.3791/68602

⸱

22 באוגוסט 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Regenerative Medicine in Sports Science, School of Physical Education and Sports Science, South China Normal University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Refractory Chronic Diseases, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine), 3Bone and Joint Research Team of Degeneration and Injury, Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר באופן שיטתי את שיטות ההקמה וההערכה של מודלים של חולדות דלקת מפרקים ניוונית, באמצעות השוואה, המספק ראיות מדעיות לפתוגנזה השונה בין דלקת מפרקים ניוונית הנגרמת על ידי פגיעה מכנית חריפה לבין דלקת מפרקים ניוונית הנגרמת על ידי גורמים מטבוליים/סביבתיים כרוניים. מודל ACLT הוא המוקד העיקרי, תוך שימת דגש על שינויים במסלול האיתות של EP4-Ca2+-חוסר תפקוד מיטוכונדריאלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת מפרקים ניוונית פוסט טראומטית (PTOA) היא מחלת מפרקים ניוונית הנגרמת על ידי טראומה או מתח מכני עז, מה שמוביל לניוון סחוס המפרקים ולפגיעה תפקודית. פרוסטגלנדין E2 (PGE2) תורם באופן משמעותי לפירוק הסחוס לאחר פגיעה מכנית על ידי הפעלת הקולטן שלו, קולטן פרוסטגלנדין E 4 (EP4), על ממברנות כונדרוציטים. ההומאוסטזיס של הסחוס המפרקי מסתמך בעיקר על האיזון הדינמי בין פירוק הסחוס לתיקון, תהליך המווסת היטב על ידי כונדרוציטים. מסלול האיתות של חלבון קינאז II (CAMKII) תלוי Ca2+/קלמודולין הוכח כממלא תפקיד קריטי בתיווך שחזור תפקוד הכונדרוציטים. במחקר זה, ראינו ביטוי מוגבר של EP4, קולטן אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט (IP3R) ו-CaMKII זרחני בכונדרוציטים מגורים אינטרלוקין-1 בטא (IL-1β), מה שמרמז על קשר אפשרי בין איתות EP4 לחוסר ויסות סידן. עם זאת, עדויות ישירות המאשרות את המעורבות של ציר EP4-Ca2+/CaMKII ב-PTOA עדיין חסרות. יש צורך בחקירות נוספות באמצעות התערבויות גנטיות או תרופתיות כדי להבהיר את המנגנון הפוטנציאלי הזה. ממצאים אלה מספקים בסיס ראשוני לחקר הומאוסטזיס סידן ואיתות EP4 כמטרות לטיפול ב-PTOA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שפעילות גופנית מקודמת באופן נרחב בשל היתרונות הבריאותיים שלה, היא נותרה גורם עיקרי לפציעות שרירים ושלד בגפיים התחתונות, שעלולות להוביל לתוצאות שליליות שונות1. בין אלה, PTOA הפך לנטל הולך וגובר עבור מתבגרים ומבוגרים צעירים שחווים פציעות מפרקים בגילצעיר 2. באופן מדאיג, כ-48-52% מהאנשים הסובלים מפציעות מפרקים הקשורות לספורט מפתחים PTOA תוך 11-17 שנים 3,4. מפרק הברך, אחד המפרקים הפצועים ביותר בספורט נוער ופעילויות פנאי, פגיע במיוחד בהתקדמות מפציעה במפרק ל-PTOA. מחקר פרוספקטיבי דיווח כי לאנשים עם פציעות ברכיים יש סיכון גבוה פי 10 לפתח דלקת מפרקים ניוונית בברך מאושרת רדיוגרפית 12-20 שנים לאחר הפציעה בהשוואה לאנשים שלא נפגעו5. יתר על כן, בקרב מבוגרים צעירים, הערכות רדיוגרפיות הראו כי לשחקניות כדורגל עם פציעות רצועה צולבת קדמית (ACLT) יש סיכון של 51% לפתח PTOA תוך 12 שנים, בעוד שלשחקנים גברים יש סיכון של 41% תוך 14 שנים5. ממצאים אלה מדגישים את ההשפעה השלילית ארוכת הטווח של פציעות מפרקים הקשורות לספורט על בריאות השרירים והשלד. לכן, הבנת המנגנונים הפתולוגיים הבלתי הפיכים העומדים בבסיס התפתחות PTOA היא חיונית לזיהוי אסטרטגיות התערבות מתאימות שמטרתן להפחית את התקדמות המחלה.

חוסר ויסות מוקדם של הומאוסטזיס Ca2+ הוא אחד האינדיקטורים המרכזיים להתחלת PTOA6. Ca2+ נקשר לקלמודולין (CaM) ליצירת קומפלקס Ca2+/CaM שיכול לקיים אינטראקציה עם CaMKII, להקל על הקונפורמציה האוטו-אינהיביטורית שלו ולווסת את פעילות הקינאז7. הן באדם והן בעכברים, הביטוי של CaMKII זרחני (הצורה המופעלת של CaMKII) מוגבר, בעוד שהשימוש במעכבי CaMKII חוסם את העלייה הזו ברמות הזרחון, מה שמוביל להרס סחוס מפרקי8, מה שמדגים את התפקיד הרגולטורי החשוב של Ca2+/CaMKII בתיווך הומאוסטזיס סחוס OA. בדרך כלל, שינויים אלה מושפעים באופן מכריע מהפעלת מנגנונים דלקתיים בהתפתחות PTOA. רמות גבוהות של PGE2, כמתווך כאב פרו-דלקתי מרכזי, משפיעות על התקדמות דלקת מפרקים ניוונית על ידי הפעלת קולטן EP4. באופן ספציפי, נוקאאוט מותנה של EP4 בסחוס מפרקי משפר את היווצרות הסחוס ואת חילוף החומרים האנאבולי, תוך עיכוב היפרטרופיה וקטבוליזם של כונדרוציטים, ובכך מקדם התחדשות של סחוס מפרקי יציב ובוגר במקום סחוס פיברולוגי ומקל על כאבי מפרקים9. בהתחשב בתפקיד המכריע של מסלול האיתות Ca2+/CaMKII בפיזיולוגיה של כונדרוציטים והמעורבות המוכרת של קולטן EP4 בהתקדמות דלקת מפרקים ניוונית, מחקר זה נועד לחקור האם הפעלת EP4 קשורה לשינויים באיתות סידן ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה במהלך התפתחות PTOA. למרות שהקשר הסיבתי בין EP4 לחוסר ויסות Ca²⁺ עדיין לא נקבע, הנתונים כאן מצביעים על קשר מכניסטי אפשרי המצדיק חקירה נוספת.

מחקר זה מתמקד במנגנונים הפוטנציאליים המקשרים בין הפעלת קולטן EP4 לבין איתות Ca²⁺ ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה במהלך התפתחות PTOA. בהשוואה לשיטות אבחון מסורתיות, כגון טכניקות הדמיה המזהות התקדמות PTOA, וגישות טיפוליות עכשוויות, כגון תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) להקלה על תסמינים, הגישה שלנו שואפת לחשוף הפרעות איתות תוך תאיות מוקדמות בפתוגנזה של PTOA. תובנה מכניסטית זו מספקת הבנה מדויקת יותר של הופעת המחלה והתקדמותה, ומציעה דרכים חדשות לאבחון מוקדם והתערבויות ממוקדות. לכן, מחקר זה ביסס מודל חולדות PTOA המושרה על ידי חתך רצועה צולבת קדמית (ACLT) כדי לחקות פציעות מכניות הנפוצות אצל ספורטאים עם שליטה מוטורית לקויה במהלך פעילות גופנית חריפה או כרונית. מודל זה משמש כייצוג אופטימלי של נזק מכני למפרקים פוסט-טראומטיים, ומציע פלטפורמה ניתנת לשחזור לחקירת שינויים היסטופתולוגיים ומנגנונים מולקולריים בסיסיים. קבוצת תזונה עתירת שומן בתוספת חשיפה לסביבה לחה (FD) משמשת כבקרה חיובית, שמטרתה לדמות גורמי סיכון מטבוליים וסביבתיים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית כרונית. הראשון מדגמן פגיעה חריפה הנגרמת על ידי טראומה מכנית, ואילו השני מייצג מודל מחלה טבעי הנגרם על ידי הפרעה מטבולית וגורמים סביבתיים, אם כי הפתוגנזה הסופית בקבוצה זו עשויה שלא לעקוב אחר ציר EP4-Ca²-מיטוכונדריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי הניסוי הכוללים בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים המחוזי לרפואה סינית גואנגדונג (מספר אישור אתי: 2024014-2). המחקר נערך בהתאם לתקנות השימוש האתי בחיות מעבדה שנקבעו על ידי מועצת המדינה של הרפובליקה העממית של סין.

1. בעלי חיים

  1. השתמש בחולדות SPF של Sprague-Dawley (SD) כדי להפחית את ההשפעות המבלבלות הפוטנציאליות הקשורות למחזור הייחום. בחרו בסך הכל תשעה זכרים של חולדות SD, בגילאי 4 שבועות ובמשקל שבין 90 גרם ל-100 גרם, לניסוי זה.
    הערה: חולדות אלה הגיעו מספק חיות מעבדה מורשה בסין (מספר תעודה: 20240410Aazz0619000774).
  2. שמור על כל בעלי החיים בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים (SPF). שמור על סביבה מבוקרת בטמפרטורה של 24 ± 2 מעלות צלזיוס עם לחות ממוצעת של 60 ± 1% ומחזור אור/חושך של 12 שעות.
  3. ודא שלחולדות יש גישה חופשית למים מחומצים ודיאטת צ'או מכרסמים סטנדרטית.

2. בנייה והתערבות של מודלים של בעלי חיים

  1. התאקלמו את החולדות לתקופה של שבועיים במרכז האכלה. חלקו את החולדות באופן אקראי לשלוש קבוצות בגיל 6 שבועות: קבוצת ביקורת, קבוצת PTOA וקבוצת FD, עם שלוש חולדות בכל קבוצה.
  2. שמור על קבוצת הבקרה בתנאים סטנדרטיים.
  3. להרדים את קבוצת ה-PTOA עם איזופלורן (4% לאינדוקציה ו-1%-2% לתחזוקה).
  4. לחשוף בניתוח את מפרקי הברך הדו-צדדיים באמצעות חתך עור אורכי בגישה פרה-פטלרית מדיאלית.
  5. בצע ACLT באמצעות אזמל, ואשר חתך מלא על ידי ביצוע בדיקת מגירה קדמית חיובית.
    הערה: חתך ACL דו-צדדי בוצע כדי להבטיח עקביות במודל ולהפחית את השונות האינדיבידואלית. נתונים משתי הברכיים הוערכו בממוצע כדי לקבל ערך אחד לכל בעל חיים לניתוח.
  6. העבר מעת לעת חולדות בקבוצות ה-FD לתא מבוקר אקלים, הממוקם באותו מתקן. הכניסו את החולדות הללו לתזונה עתירת שומן.
    הערה: התזונה עתירת השומן הכילה 20% סוכרוז, 15% שומן חזיר, 1.2% כולסטרול, 0.2% נתרן כולאט, 10% קזאין, 0.6% סידן מימן פוספט, 0.4% אבקת אבן גיר, 0.4% פרמיקס ו-52.2% מזון בסיסי. הפרופיל התזונתי של הזנת הביקורת היה כדלקמן: 19% חלבון, 31% שומן ו-50% פחמימות, עם יחס קלורי של 17% חלבון, 37% שומן ו-46% פחמימות.
  7. שמור על תנאי הסביבה בתא האקלים בטמפרטורה של 24 ± 2 מעלות צלזיוס, רמת לחות של 90 ± 4%, ומחזור אור יומי של 12 שעות.
    הערה: בשל הסיכון המוגבר לצמיחת חיידקים בסביבה כה גבוהה ולחות גבוהה, יש לעקר מי שתייה ומזון ולחדש אותם מדי יום כדי למזער את הזיהום. משך ההתערבות הניסיונית הכולל היה 12 שבועות.

3. ניתוח הליכה (טביעות רגל)

  1. בצע ניתוח טביעת רגל 12 שבועות לאחר תחילת הטיפול בחולדות המודל, בשיטה שתוארה קודם לכן10.
  2. מצפים את משטחי הגחון של כפות הרגליים האחוריות של החולדות בדיו אדום, והם הורשו ללכת בשביל באורך 100 ס"מ ורוחב 8 ס"מ, שהיה מכוסה בנייר לבן.
  3. כדי לעודד את החולדות לנוע, מקמו תא חשוך בקצה השביל כדי לעודד תנועה קדימה.
  4. בצע שלוש מדידות עוקבות כדי לקבל ערכים ממוצעים עבור כל פרמטר, כולל אורך צעד ואורך צעד, ששימשו להערכת אי סדרים.
  5. קבע את אורך הצעד (ס"מ) על ידי מדידת המרחק שעברה אותה כפה אחורית בין שני צעדים רצופים.
  6. הגדר את אורך הצעד (ס"מ) כמרחק האופקי בין הכפות האחוריות השמאלית והימנית.
  7. מדוד את זווית הכפה (°) כזווית בין הבוהן השנייה לקלקנאוס ביחס לקו אופקי11.
  8. מדוד את אורך הצעד, אורך הצעד וזווית הכפות ישירות על תמונות טביעת הרגל הסרוקות באמצעות תוכנת Image-Pro Plus (גרסה 6.0), תוך שימוש בכלי מדידת המרחק והזווית המובנים שלה.
    הערה: פרמטרי הליכה אלה חיוניים לזיהוי ליקויים תפקודיים עדינים בשלבים המוקדמים של דלקת מפרקים ניוונית. חולים עשויים להפגין צעד ואורך צעד מופחתים כדי להגן על מפרקים כואבים, בעוד שזווית אצבע מוגברת ואסימטריה בהליכה מתרחשות לעתים קרובות כתגובות מפצות לחוסר יציבות מפרקים הנגרמת על ידי כאב.

4. מדידת קוטר המפרק

  1. מדוד את קוטר המפרק באמצעות מיקרומטר ספירלי מכויל (מ"מ) לאחר דוגמנות בכל קבוצה.
    הערה: ככל שדלקת מפרקים ניוונית מתקדמת, חולים בדרך כלל מפגינים נפיחות וכאבים במפרקים. דרגה גבוהה יותר של נפיחות עשויה להצביע על שלב חמור יותר של המחלה.

5. מדידת חוזק אחיזה

  1. מדוד את חוזק אחיזת הגפיים האחוריות באמצעות מד חוזק אחיזה דיגיטלי המצויד ברשת מתיחה, מד חוזק המצויד ברשת משיכה (90 מ"מ × 90 מ"מ).
    1. החזיקו בעדינות את החולדה בזנב ואת העור בחלק האחורי של הצוואר.
    2. הורד את החיה עד שהגפיים האחוריות שלה אוחזות בחוזקה ברשת, ואז משוך את החיה בהתמדה אופקית לאורך ציר חיישן הכוח עד שהיא משחררת את אחיזתה.
    3. חזור על הבדיקה שלוש פעמים לכל בעל חיים. רשום את הערך הגבוה ביותר כחוזק האחיזה המרבי.
      הערה: במהלך בדיקת חוזק אחיזת הגפיים האחוריות, שתק את הגפיים הקדמיות על ידי הדבקתן למשטח קרטון כדי למנוע מעורבות מקרית של הגפיים הקדמיות ברשת המתיחה. ירידה בכוח האחיזה מעידה על ירידה בתפקוד השרירים וליקויים מוטוריים פוטנציאליים הקשורים לכאב הקשורים להתקדמות אוסטאוארתריטיס.

6. בידוד ותרבות כונדרוציטים ראשוניים

  1. בודד כונדרוציטים ראשוניים מחולדות ספראג-דולי זכרות בנות 6 שבועות.
  2. נתח את ראשי הירך ומישורי השוק כדי לאסוף כ-100-150 מ"ג רקמת סחוס.
  3. שטפו את הטישו פעמיים עם PBS המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  4. עכל את הסחוס ב -5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ב -3 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. חותכים את הסחוס ל-1-2 מ"מ3 חתיכות ומעכלים עוד יותר ב-10 מ"ל של 0.2% קולגנאז II ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות על שייקר בטמפרטורה קבועה.
  6. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות, והשליך את הסופרנטנט.
  7. השעו מחדש את גלולת התא במדיום DMEM/F12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  8. דגרו על התאים בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO2.

7. טיפול בתאים

  1. ספרו את הכונדרוציטים המבודדים באמצעות המוציטומטר.
  2. זרעו את הכונדרוציטים לצלחות של 6 בארות בצפיפות של 2 × 105 תאים לבאר ב-0.1 מ"ל של מדיום תרבית שלם (DMEM/F12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
  3. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂ למשך 24 שעות כדי לאפשר הידבקות.
  4. כדי לבסס מודל PTOA דלקתי במבחנה , טפל בכונדרוציטים דביקים עם IL-1β (10 ננוגרם/מ"ל) למשך 48 שעות ברגע שמפגש התאים מגיע לכ-80%.
  5. לבקרת FD חיובית, ממיסים חומצה פלמיטית (PA, CAS מס' 57-11-4) בכלורופורם בדילול של 1:1000 להכנת תמיסת מלאי של 500 מיקרומטר.
    1. כאשר מפגש התאים הגיע לכ-80%, הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PA לכל 1 מ"ל של מדיום תרבית כדי להגיע לריכוז PA סופי של 500 ננומטר. טפל בכונדרוציטים בתמיסה זו למשך 48 שעות.
  6. הוסף 1 מיקרוליטר של כלורופורם (בקרת רכב) לכל 1 מ"ל של מדיום תרבית כדי לשלוט בתאים ללא PA.

8. איסוף דגימות, הסרת אבדן והכנת הטמעה

  1. המתת חסד של בעלי חיים 12 שבועות לאחר ההתערבות על ידי שאיפת מנת יתר של איזופלורן (≥5%) בתא אטום למשך 5 דקות לפחות, ואישור הפסקה מוחלטת של הנשימה ופעימות הלב.
    הערה: שיטה זו אושרה על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים ועמדה בהנחיות הלאומיות להמתת חסד הומאנית של חיות מעבדה.
  2. אסוף את שני מפרקי הברכיים משלוש חולדות לקבוצה (n = 3, סה"כ = 6 ברכיים) להערכה היסטולוגית.
  3. תקן דגימות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ביחס נפח רקמה לקיבוע גדול מ-1:20 למשך למעלה מ-48 שעות על שייקר במעלות-צלזיוס.
  4. יש לשטוף את הטישו מתחת למי ברז זורמים למשך 1-2 שעות כדי להסיר שאריות של קיבוע.
  5. להסיר אבדן רקמות בתמיסת EDTA של 0.5 M (pH 7.4, ~15%) ביחס רקמה לתמיסה של 1:20 למשך 21 יום ב-3 מעלות צלזיוס, ולהחליף בתמיסה טרייה כל 3 ימים.
  6. העריכו את השלמת הסרת האבדן על ידי בדיקת העצם בעזרת מחט לריכוך.
  7. שטפו טישו נטולי אבדן מתחת למי ברז זורמים למשך שעתיים והניחו אותם בקלטות הטבעה.
  8. ייבוש דגימות באמצעות סדרת אתנול מדורגת: 75% אתנול למשך שעתיים (או לילה), 80% אתנול למשך שעתיים, 95% אתנול למשך 0.5 שעות ואתנול מוחלט פעמיים למשך 60 דקות. לאחר מכן טבלו בקסילן:אתנול 1:1 למשך 20 דקות.
  9. נקה רקמות בקסילן פעמיים (10 דקות ו-60 דקות).
  10. הסתננו לרקמות עם פרפין בסדר הבא: קסילן: פרפין (1:1) למשך 15 דקות, פרפין רך ב-52-5 מעלות צלזיוס למשך שעה (פעמיים), ואז פרפין קשה ב-56-5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  11. הטמיעו רקמות באמצעות מערכת הטמעת פרפין (למשל, Leica, מוגדרת ל-6 מעלות צלזיוס), והעבירו בלוקים לצלחת קרה של -2 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  12. חתך פרפין חוסם סגיטלי בעובי מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
  13. צפו סרטים באמבט מים של 4 מעלות צלזיוס והרכיבו על מגלשות זכוכית נקיות.
  14. מייבשים באוויר חלקים מותקנים ואופים אותם בתנור של 60 מעלות למשך שעתיים כדי להסיר שאריות פרפין.
  15. דה-פרפיניזציה של חלקים על ידי טבילה ברצף בקסילן (10 דקות), קסילן טרי (10 דקות), אתנול מוחלט (5 דקות), אתנול מוחלט טרי (5 דקות), 90% אתנול (5 דקות) ו-75% אתנול (5 דקות), ולאחר מכן שטפו במי ברז לפני הצביעה.

9. צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE)

  1. קטעי רקמה טבולים והתייבשו היטבלו בתמיסת צביעת המטוקסילין 0.5% למשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT; ~2 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן שטיפה יסודית תחת מי ברז זורמים.
  2. יש לטפל בקצרה בקטעים עם תמיסת התמיינות המטוקסילין למשך 2-5 שניות, ולשטוף תחת מי ברז זורמים.
  3. בצע הכחולה על ידי טבילת חלקים בתמיסת הכחול המטוקסילין למשך 2-5 שניות, ולאחר מכן שטיפה.
  4. יש לייבש חלקים ב-85% ו-95% אתנול למשך 5 דקות כל אחד, ואז לצבוע ב-0.05% אאוזין Y (אלכוהולי) למשך 5 דקות.
  5. יש לייבש פעמיים באתנול מוחלט (5 דקות כל אחד), ואז לנקות בקסילן (5 דקות), ולאחר מכן קסילן טרי (5 דקות).
  6. הרכיבו חלקים עם בלזם ניטרלי וכסו בכיסוי.
    הערה: בסחוס שהשתמר היטב, המטוקסילין מכתים גרעינים כחולים ואאוזין מכתים מטריצה בוורוד. סחוס פגום מראה אובדן כונדרוציטים, פרפור ומטריצה לא מאורגנת.

10. ספרנין O - צביעה ירוקה מהירה (SOFG)

  1. יש להכתים חלקים בתמיסה של 2% Fast Green למשך 1-5 דקות ב-RT. יש לשטוף תחת מי ברז זורמים עד שהסחוס הופך לחסר צבע.
  2. הבדיל בקצרה חלקים בחומצה הידרוכלורית 1% למשך 10-15 שניות, ואז שטוף היטב במים זורמים.
  3. קטעי כתמים עם תמיסת ספרנין O של 0.2% למשך 5-10 שניות, ואז מתייבשים במהירות באמצעות ארבעה שינויים של אתנול מוחלט (3-5 שניות כל אחד).
  4. חלקים ברורים בקסילן (5 דקות), ואחריהם קסילן טרי (5 דקות).
  5. הרכיבו מגלשות עם בלסם ניטרלי וכסו בכיסוי.
    הערה: Safranin O מכתים את הסחוס פרוטאוגליקנים באדום, בעוד שירוק מהיר מכתים רקמות עצם/סיביות בירוק. אובדן אדום מעיד על דלדול וניוון פרוטאוגליקן.
  6. להעריך שינויים היסטולוגיים באמצעות מערכת הניקוד של האגודה הבינלאומית לחקר דלקת מפרקים ניוונית (OARSI). מדוד את רוחב חלל המפרק ועובי הסחוס כדי להעריך ניוון מבני. צלם תמונות במיקרוסקופ אור (למשל, ECLIPSE Ti2-E) ב-4× (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) ו-20x (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר).
    הערה: השתמש בתוכנת ההדמיה של המערכת ללכידת תמונות וב-ImageJ (v1.48v) לניתוח. כיול תמונות באמצעות ניתוח > הגדר קנה מידה עם מיקרומטר. עבור כל מפרק, כמת חמישה שדות אקראיים משלושה מקטעים סגיטליים באמצעות ניתוח עיוור על ידי שלושה צופים בלתי תלויים.

11. מיקרו-μ CT

  1. נתח את מפרקי הברכיים של חולדה 12 שבועות לאחר ההתערבות וקבע אותם מיד ב-4% פרפורמלדהיד ב-RT למשך 24 שעות כדי לשמר את המורפולוגיה של הרקמות.
  2. שטפו את הדגימות הקבועות עם PBS ואחסנו אותן באתנול 70% עד לסריקה.
  3. הרכיב כל דגימת מפרק ברך על מחזיק דגימה ייעודי לפני הסריקה. יישר את המפרק לאורך צירו הארוך כדי למזער את חפצי התנועה.
  4. בצע סריקת מיקרו-מיקרו-מיקרו-CT באמצעות מערכת מיקרו-מיקרו-מיקרו-CT עם פרמטרי הסריקה הבאים: כרך רנטגןtage 70 קילו וולט, זרם 100 μA והספק 7 וואט.
  5. רכוש ארבע פריימים לכל הקרנה וערם אותן כדי לשפר את איכות התמונה, עם גודל צעד סיבובי של 0.72°, והשלם סיבוב מלא של 360°.
  6. הגדר את גודל הווקסל המתקבל (עובי פרוסה) ל-15 מיקרומטר, ומספק תמונות ברזולוציה גבוהה המתאימות לניתוח עצם טרבקולרית.
  7. הגדר את אזור העניין (ROI) בין לוחית הצמיחה הטיביאלית הפרוקסימלית למישור השוקה, תוך התמקדות בעצם התת-כונדרלית של עצם הירך והשוקה.
  8. שחזר את נתוני הסריקה הגולמיים לתמונות חתך באמצעות תוכנת שחזור.
  9. ייבא את ערימות התמונות המשוחזרות לתוכנה מתאימה לניתוח מורפומטרי כמותי.
  10. להעריך פרמטרים מרכזיים כולל חלק נפח העצם (BV/TV, %), צפיפות מינרלים בעצם (BMD, g/cm³) והפרדה טרבקולרית (Tb.Sp, mm).
  11. להדמיה איכותית ותלת מימדית, השתמש בתוכנת הדמיה תלת מימדית כדי ליצור עיבודים נפחיים של מיקרו-ארכיטקטורת עצם.
  12. לבצע הערכה חזותית לאישור שלמות מבנית ושינויים מורפולוגיים שנצפו בנתונים הכמותיים.
    הערה: כל עיבוד התמונה והניתוח נערכו על ידי מפעילים עיוורים כדי להבטיח תוצאות ללא משוא פנים.

12. אליסה

  1. להרדים את החולדות 12 שבועות לאחר ההתערבות. חשוף ונתח בזהירות את אבי העורקים הבטני כדי לאסוף דגימות דם.
  2. אפשר לדם שנאסף להיקרש ב-RT למשך 30 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב-755 × גרם (שווה ערך ל-3000 סל"ד, באמצעות צנטריפוגה ברדיוס רוטור של 7.5 ס"מ) במעלות-צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. יש להפריד ולאחסן את הסרום למדידה עוקבת של רמות PGE₂ באמצעות ערכת ELISA הזמינה מסחרית.
  4. במקביל, זרעו כונדרוציטים ראשוניים ותרבו אותם במשך 24 שעות, ולאחר מכן טיפול ב-IL-1β ו-PA במשך 48 שעות, על פי פרוטוקול הטיפול התאי שנקבע. לאחר ההתערבות, אספו ונתחו את חומרי העל של תרבית לריכוז PGE₂ באמצעות אותה ערכת ELISA.

13. RT-PCR כמותי

  1. חלץ את סך ה-RNA מדגימות תאים באמצעות ריאגנט מיצוי RNA מסחרי (TRIzol).
  2. סנתז cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוך (עם מסיר gDNA), ואחסן את ה-cDNA המתקבל ב-8 מעלות צלזיוס לניתוח שלאחר מכן.
  3. לבצע PCR כמותי באמצעות SYBR Green, ולחשב את רמות הביטוי היחסיות בשיטת 2−ΔΔCt.
    הערה: רצפי הפריימר ששימשו היו כדלקמן: β-אקטין קדימה: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-אקטין הפוך: CTGACCCATACCACCACCATCAC; פורוורד EP4: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; פורוורד EP4: GGCTGTAGAAGTAGGGTGG; חלוץ COX-2: GATGACGAGCGACTGTTCCA; גב COX-2: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. ניתוח כתמים מערביים

  1. לייז את התאים עם מאגר RIPA על קרח למשך 30 דקות.
  2. הפרד את דגימות החלבון על ידי SDS-PAGE למשך 90 דקות, ולאחר מכן העבר אותן לממברנות ניטרוצלולוזה למשך שעתיים.
  3. חסום את הממברנות עם 5% BSA ושטוף אותן בתמיסה חוצצת פוספט.
  4. בצע אימונובלוטינג באמצעות נוגדנים ספציפיים.
    הערה: הנוגדנים והדילולים שלהם היו כדלקמן: אנטי-MMP9 (1:1000), אנטי-קולגן II (1:1000), אנטי-COX2 (1:1000), אנטי-CaMKII (1:1000), אנטי-p-CaMKII (1:1000), אנטי-IP3R (1:1000), אנטי-Cyt-C (1:1000) ואנטי-β-אקטין (1:2000).
  5. לאחר דגירה של לילה עם נוגדנים ראשוניים, יש לשטוף את הממברנות עם TBST ולדגור במשך שעה עם נוגדנים משניים: עכבר-HRP (1:2000) או ארנב-HRP (1:2000) בחושך.
  6. לאחר שטיפה נוספת עם TBST, בצע זיהוי חלבון באמצעות ערכת כימילומינסנציה משופרת.
  7. נתח את הנתונים עם תוכנת ImageJ (גרסה 1.48v).

15. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. תרבית כונדרוציטים על תלושי כיסוי בצלחות של 12 בארות עד שהגיעו למפגש של 80%.
  2. לאחר טיפול ב-IL-1β ו-PA במשך 48 שעות, או ללא טיפול כביקורת, יש לתקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות ב-RT.
  3. לחדור לתאים עם PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 למשך 15 דקות.
  4. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS (5 דקות כל אחד), ולאחר מכן דגרו אותם עם נוגדנים ראשוניים (אנטי-IP3R, דילול 1:200) במאגר דילול נוגדנים במעלות-צלזיוס למשך הלילה.
  5. חשוף את התאים לדילול של 1:500 של נוגדן IgG משני נגד ארנב עז עם תווית פלואורסצאין איזותיוציאנט למשך שעה אחת.
  6. צבעו את התאים בתמיסת DAPI של 5 מיקרוגרם/מ"ל למשך 10 דקות.
    הערה: תמונות פלואורסצנטיות נרכשו באמצעות עדשת אובייקטיביות פי 40 (סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר). כל התמונות עובדו עם תוכנת ZEN וכומתו עם ImageJ (גרסה 1.48v), בהתאם להליכי כיול עקביים.

16. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות GraphPad Prism (גרסה 8.0.2).
  2. לפני החלת מבחנים פרמטריים, יש להעריך את הנתונים עבור התפלגות נורמלית באמצעות מבחן שפירו-וילק ואת השונות ההומוגנית באמצעות מבחני בראון-פורסיית' ובארטלט.
  3. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני ואחריו במבחן הפוסט-הוק של טוקי להשוואות בין מספר קבוצות, והחל מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג עבור השוואות בין שתי קבוצות.
  4. קחו בחשבון את ערך P הקטן מ-0.05 כמובהקות סטטיסטית.
  5. הצג את כל הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PTOA המושרה על ידי ACLT מציג הרס סחוס מוקדם וליקויים התנהגותיים ביחס ל-KOA כרוני המושרה על ידי FD (איור 2 ואיור 3)
היצרות מרחב המפרקים וניוון הסחוס הם התוצאות העיקריות של דלקת מפרקים ניוונית. מחקרים קודמים זיהו עודף משקל וגורמים סביבתיים (למשל, אקלים לח) כתורמים פוטנציאליים להופעת דלקת מפרקים ניוונית12,13, שעשויים להיות קשורים ישירות להזדקנות ולהוביל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהשוואה לדלקת מפרקים כרונית הנגרמת על ידי גורמים סביבתיים ותזונתיים, טראומת מפרקים הנגרמת על ידי ACLT מובילה להתקדמות מהירה יותר של המחלה. התוצאות שלנו, המבוססות על הערכות התנהגותיות כולל נפיחות במפרקים, חוזק אחיזת הגפיים האחוריות וניתוח הליכה, חשפו הבדלים משמעותיים בין קבוצת הביקורת, קבוצת ה-PTOA וקבוצת הביקורת החיובית שנגרמו על ידי גורמים סביבתיים ותזונתיים. לאחר 12 שבועות של התערבות, נצפתה נפיחות מוגזמת במפרקים, מלווה בירידה משמעותית בחוזק האחיזה בגפיים האחוריות והליכה לא יציבה, בקבוצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82205147; מס' 62472046); פרויקט מחקר מדעי של לשכת הספורט של גואנגדונג (GDSS2024N038); ופרויקט הקרן המשותפת של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית (GZYFT2024G08).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2% קולגנאז IISigma-Aldrich, ארצות הבריתמס' CAS: 9001-12-1בידוד ותרבות כונדרוציטים ראשוניים
0.2% טריטון X-100Beyotime, סיןST795אימונופלואורסצנציה
0.25% טריפסין-EDTAווהאן בוסטר טכנולוגיה ביולוגית ושות', בע"מAR1071הסרת אבנית
0.25% טריפסין-EDTAGibco, ארצות הברית25200072בידוד ותרבות כונדרוציטים ראשוניים
4% תמיסת קיבוע פרפורמלדהידBiyuntian, סיןP0099-3Lקיבוע רקמות
נוגדן נגד CaMKIIHuabio, סיןET1608-47כתם מערבי (1:1000)
נוגדן אנטי-קולגן IIאבקם, בריטניהאילן אלכסנדרכתם מערבי (1:1000)
נוגדן נגד COX2אבקם, בריטניהab179800כתם מערבי (1:1000)
נוגדן נגד Cyt-CSelleck, סיןF2534כתם מערבי (1:1000)
נוגדן נגד IP3R (B-2)Santa Cruz, ארצות הבריתSC-377518כתם מערבי (1:1000)
נוגדן נגד MMP9אבקם, בריטניהאב76003כתם מערבי (1:1000)
נוגדן נגד p-CaMKIISelleck, סיןF0342כתם מערבי (1:1000)
נוגדן אנטי-בטא;-אקטיןטכנולוגיית איתות תאים (CST), ארה"ב8H10D10כתם מערבי (1:2000)
פתרון חסימת BSAסיגמא אולדריץ', ארצות הבריתלא ישים5% BSA עבור חסימת כתמים מערביים
צנטריפוגה (5424 R)Eppendorf, גרמניהלא ישים755 ופעמים; מהירות צנטריפוגה G
כלורופורםסיגמא אולדריץ', ארצות הבריתלא ישיםממס לרשות הפלסטינית
תא מבוקר אקלים (RXZ-158A)יצרן מקומי, סיןלא ישיםמודל סביבה לחה
ערכת תמלול הפוך בצבעInvitrogen, Suzhou, סיןלא ישיםסינתזת cDNA
תוכנת CTAn ברוקרגרסאות 1.9 ו-4.1לניתוח מורפומטרי כמותי
תוכנת CTVol ברוקרגרסה 2.0להדמיה איכותית ותלת מימדית
תמיסת מכתים DAPIBeyotime, סיןלא ישיםצביעה גרעינית (5 ומיקרו; גרם/מ"ל)
מד חוזק אחיזה דיגיטלימכשיר פוקסיןלא ישיםמדידת חוזק אחיזת הגפיים האחוריות
DMEM/F12 בינוניCorning, ארצות הבריתלא ישיםמדיום תרבית תאים
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)אלאדיןלא ישיםהסרת אבנית של רקמות עצם
ערכת ELISA עבור PGE2Elabscience , ווהאן, סיןPGE2E-EL-0034זיהוי ELISA
ערכת כימילומינסנציה משופרתMillipore, ארצות הבריתWBKLS0500זיהוי כתמים מערביים
אתנולגואנגדונג גואנגשי ריאגנט טכנולוגיה ושות', בע"מCAS: 64-17-5התייבשות רקמות
סרום בקר עוברי (FBS)Corning, ארצות הבריתלא ישיםריכוז של 10% לתרבית
IgG נגד ארנב עיזים עם תווית FITCBeyotime, סיןערכת P0179אימונופלואורסצנציה (1:500)
פריזמה של GraphPadתוכנת GraphPad, ארה"בגירסה 8.0.2ניתוח נתונים
המטוקסילין ואאוזין (H& ה) ערכת צביעהServicebio , ווהאןG1005היסטולוגיה
IL-1 ובטא;PeproTech, ארצות הברית400-01ב10 ננוגרם/מ"ל עבור מודל תאי PTOA
תמונהJNIH, ארצות הבריתגירסה 1.48vניתוח תמונה
תוכנת Image-Pro Plusקיברנטיקה תקשורתיתגירסה 6.0ניתוח הליכה כמותי מטביעות רגל סרוקות
איזופלורןשנחאי יאג'י ביולוגיYS1412Cהרדמה לכירורגיה בבעלי חיים
מרכז ההטמעה של לייקהלייקה מיקרוסיסטמסEG1160הטמעת פרפין
Leica Microtomeלייקה מיקרוסיסטמס₪2235חיתוך רקמות משובצות פרפין
אמבט מים Leicaלייקה מיקרוסיסטמסHI1210קטעי פרפין צפים
מיקרוסקופ אור (ECLIPSE Ti2-E)Nikon, יפןלא ישיםתצפית היסטולוגית
סורק מיקרו-CT (ZKKS-MCT-Sharp)יצרן מקומי, סיןלא ישיםהדמיית עצמות
נוגדן משני עכבר-HRPטכנולוגיית איתות תאים (CST), ארה"ב70761:2000 דילול
תוכנת הדמיה NIS-Elementsניקוןלא ישיםצילום וניתוח תמונות מיקרוסקופ
תוכנת NReconBruker, גרמניהגירסה 1.6שחזור CT
חומצה פלמיטית (PA)סיגמא אולדריץ', ארצות הבריתעמ' 0500500 ומיקרו; מלאי M לדגם תא FD
שעוות פרפין לחתך, כיתה פתולוגיה, נקודת התכה 52-54 ודג; Cגואנגדונג גואנגשי ריאגנט טכנולוגיה ושות', בע"מY258797-500 גרםמשמש להטמעת פרפין במהלך עיבוד רקמות
שעוות פרפין לחתך, כיתה פתולוגיה, נקודת התכה 56-58 ודג; Cגואנגדונג גואנגשי ריאגנט טכנולוגיה ושות', בע"מY258799-500 גרםמשמש להטמעת שעווה קשה סופית בחיתוך רקמות
PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט)ג'יבקו / תרמו פישרC10010500BTשטיפת תאים ושטיפת רקמות
פניצילין-סטרפטומיציןCorning, ארצות הבריתלא ישים1% לתרבית תאים
ממברנת PVDF (0.45 ומיקרו; m)Millipore, ארצות הבריתIPVH00010קרום כתם מערבי
נוגדן משני Rabbit-HRPטכנולוגיית איתות תאים (CST), ארה"ב70741:2000 דילול
דיו אדומהגיבורגיבור 204מעקב אחר טביעת רגל בניתוח הליכה
מאגר ליזה RIPAKeygen, סיןלא ישיםמיצוי חלבון
ספרנין O– ערכת צביעה ירוקה מהירהServicebio , ווהאןG1053צביעה היסטולוגית
מיקרומטר ספירלי (קליפר ורניה)Huangshan, סיןלא ישיםמדידת רוחב מפרק
תוכנה לניתוח עצמות תת-כונדרליות (CTAn)Bruker, גרמניהגרסאות 1.9 ו-4.1ניתוח מורפומטרי
SYBR ירוק PCR מאסטר מיקסAG Scientific, סיןלא ישיםניתוח qPCR
ריאגנטים של כתמים מערביים (מאגר RIPA, רכיבי ג'ל SDS-PAGE, מאגר טעינה, TBST וכו')ביוטיים ביוטכנולוגיה (סין)לא ישים (משמש כערך קבוצה)כל הריאגנטים השגרתיים המשמשים להליכי כתמים מערביים
קסילןגואנגדונג גואנגשי ריאגנט טכנולוגיה ושות', בע"מCAS: 1330-20-7ניקוי רקמות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whittaker, J. L., Roos, E. M. A pragmatic approach to prevent post-traumatic osteoarthritis after sport or exercise-related joint injury. Best PractRes Clin Rheumatol. 33 (1), 158-171 (2019).
  2. Maia, C. R., et al. Post-traumatic osteoarthritis: The worst associated injuries and differences in patients' profile when compared with primary osteoarthritis. BMC Musculoskel Dis. 24 (1), 568(2023).
  3. Luc, B., Gribble, P. A., Pietrosimone, B. G. Osteoarthritis prevalence following anterior cruciate ligament reconstruction: A systematic review and numbers-needed-to-treat analysis. J Athl Train. 49 (6), 806-819 (2014).
  4. Chen, T., et al. Radiographic osteoarthritis prevalence over ten years after anterior cruciate ligament reconstruction. Int J Sports Med. 40 (11), 683-695 (2019).
  5. Roos, E. M. Joint injury causes knee osteoarthritis in young adults. Curr Opin Rheumatol. 17 (2), 195-200 (2005).
  6. Chery, D. R., et al. Early changes in cartilage pericellular matrix micromechanobiology portend the onset of post-traumatic osteoarthritis. Acta Biomater. 111, 267-278 (2020).
  7. Nguyen, B. V., et al. A domain-swapped camkii conformation facilitates linker-mediated allosteric regulation. bioRxiv. , (2024).
  8. Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Sci Rep. 11 (1), 5682(2021).
  9. Jiang, W., et al. PGE2 activates EP4 in subchondral bone osteoclasts to regulate osteoarthritis. Bone Res. 10 (1), 27(2022).
  10. Nasiri, N., Hosseini, S., Reihani-Sabet, F., Baghaban Eslaminejad, M. Targeted mesenchymal stem cell therapy equipped with a cell-tissue nanomatchmaker attenuates osteoarthritis progression. Sci Rep. 12 (1), 4015(2022).
  11. Esmaeili, A., et al. Co-aggregation of MSC/chondrocyte in a dynamic 3D culture elevates the therapeutic effect of secreted extracellular vesicles on osteoarthritis in a rat model. Sci Rep. 12 (1), 19827(2022).
  12. Wang, L., Xu, Q., Chen, Y., Zhu, Z., Cao, Y. Associations between weather conditions and osteoarthritis pain: A systematic review and meta-analysis. Ann Med. 55 (1), 2196439(2023).
  13. Datta, P., et al. High-fat diet-induced acceleration of osteoarthritis is associated with a distinct and sustained plasma metabolite signature. Sci Rep. 7 (1), 8205(2017).
  14. Sun, Q., et al. Inhibition of PGE2 in subchondral bone attenuates osteoarthritis. Cells. 11 (17), 2760(2022).
  15. Wang, G., et al. Opposing effects of IL-1Β/COX-2/PGE2 pathway loop on islets in type 2 diabetes mellitus. Endocr J. 66 (8), 691-699 (2019).
  16. Curtis, E., et al. Safety of cyclooxygenase-2 inhibitors in osteoarthritis: Outcomes of a systematic review and meta-analysis. Drugs Aging. 36 (Suppl 1), 25-44 (2019).
  17. Jin, Y., et al. A novel prostaglandin E receptor 4 (EP4) small molecule antagonist induces articular cartilage regeneration. Cell Discov. 8 (1), 24(2022).
  18. Dupont, G., Goldbeter, A. Cam kinase ii as frequency decoder of Ca2+ oscillations. Bioessays. 20 (8), 607-610 (1998).
  19. Pritchard, S., Guilak, F. Effects of interleukin-1 on calcium signaling and the increase of filamentous actin in isolated and in situ articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 54 (7), 2164-2174 (2006).
  20. Bartok, A., et al. IP3 receptor isoforms differently regulate ER-mitochondrial contacts and local calcium transfer. Nat Commun. 10 (1), 3726(2019).
  21. Katona, M., et al. Capture at the ER-mitochondrial contacts licenses IP3 receptors to stimulate local Ca2+ transfer and oxidative metabolism. Nat Commun. 13 (1), 6779(2022).
  22. Lin, F., et al. Positioning regulation of organelle network via Chinese microneedle. Sci Adv. 10 (16), eadl3063(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PGE2 EP4CaMKIIEP4IP3R1
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים