מאמר שיטה

טכניקות מולטי-אומיקה לאפיון מעברי מצב כרומטין בכולנגיוציטים ראשוניים של עכברים בעלי קלט נמוך

DOI:

10.3791/68606

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מציג פרוטוקול מקיף ל-ChIP-seq עם קלט נמוך לפרופיל שינויים בהיסטון ו-ATAC-seq להערכת נגישות כרומטין בכמויות קטנות של כולנגיוציטים ראשוניים של עכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת כבד פוליציסטית (PLD) היא הפרעה תורשתית המאופיינת בהיווצרות ציסטות מלאות בנוזל שמקורן בכולנגיוציטים, מה שמוביל למחלה מתקדמת ולירידה משמעותית באיכות החיים של החולים. הטיפולים הנוכחיים ב-PLD אינם מספקים, ומדגישים את הצורך באסטרטגיות טיפוליות חדשות. תפקיד הוויסות האפיגנטי בהתקדמות PLD, במיוחד נגישות כרומטין ושינויים בהיסטון, נותר לא נחקר. טכניקות פרופיל אפיגנטיות מסורתיות, כגון ChIP-seq ו-DNase-seq, דורשות מספר רב של תאים, שקשה להשיג מכולנגיוציטים ראשוניים. כדי לטפל בכך, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולי ChIP-seq ו-ATAC-seq עם קלט נמוך עבור מספרים נמוכים של כולנגיוציטים ראשוניים. גישות אלו מאפשרות ניתוח של שינויים בהיסטון ונגישות לכרומטין עם קלט תאים מינימלי. ChIP-seq בעל קלט נמוך משתמש בנוקלאז מיקרוקוקלי (MNase) לפיצול DNA, בעוד ש-ATAC-seq משתמש בטרנספוזאז Tn5 כדי ללכוד אזורי כרומטין פתוחים. טכניקות מולטי-אומיקס אלה מספקות תובנות חשובות לגבי דינמיקת מצב הכרומטין במהלך מעברי גורל כולנגיוציטים ב-PLD ומחלות מרה אחרות. חשוב לציין, הפרוטוקולים המותאמים ישימים בביטחון לתאים ראשוניים אחרים בעלי קלט נמוך, ומאפשרים לחקור מנגנונים אפיגנטיים בהקשרים תאיים שונים. עבודה זו מציגה גישה שיטתית לחקר שינויים במצב כרומטין, התורמת לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות מבוססות אפיגנטיקה למחלת לב ומחלות קשורות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD היא הפרעה תורשתית המאופיינת בהתפתחות של ציסטות מרובות מלאות בנוזל שמקורן בכולנגיוציטים. ככל שהציסטות הללו מתרחבות בהדרגה, הן משפיעות קשות על איכות החיים של המטופלים 1,2. אסטרטגיות הטיפול הקיימות ב-PLD אינן מספקות, ומספקות יתרונות מוגבלים בלבד תוך שמובילות לעתים קרובות לשיעורי הישנות וסיבוכים גבוהים 3,4. לכן, יש צורך דחוף בגישות טיפוליות בטוחות ויעילות יותר כדי לעמוד באתגרים הקליניים הבלתי פתורים בטיפול ב-PLD.

בתנאים רגילים, כולנגיוציטים נשארים שקטים, ואילו ב-PLD הם מציגים התפשטות מוגזמת, גורם מרכזי להתקדמות המחלה 5,6. המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המעבר הציסטי הזה נותרו לא ברורים. בעוד שהוויסות האפיגנטי, כולל נגישות לכרומטין ושינויים בהיסטון, ממלא תפקיד חיוני במעברי גורל התא 7,8, תפקידו בהתקדמות PLD נותר לא נחקר. עם זאת, טכניקות פרופיל אפיגנטיות רבות דורשות מספר רב של תאים. ChIP-seq מסורתי, המסתמך על פיצול כרומטין על ידי סוניקציה, כמו גם מבחני נגישות כרומטין כגון DNase-seq ו-MNase-seq, דורשים בדרך כלל למעלה מ-106 תאים - הרבה מעבר למספר שניתן להשיג מכולנגיוציטים ראשוניים.

כתב יד זה מספק פרוטוקול מקיף עבור ChIP-seq 9,10,11 עם קלט נמוך לפרופיל שינויים בהיסטון ו-ATAC-seq 11,12,13 להערכת נגישות כרומטין במספרים נמוכים של כולנגיוציטים ראשוניים. ChIP-seq בעל קלט נמוך משתמש ב-MNase כדי לפצל DNA9, בעוד ש-ATAC-seq לוכד שברי DNA מאזורי כרומטין פתוחים באמצעות טרנספוזאז Tn512. ניתוח מולטי-אומיקס תוך שימוש בגישות אלה מציע תובנות חשובות לגבי דינמיקה של מצב כרומטין במהלך מעברי גורל כולנגיוציטים ב-PLD ומחלות מרה אחרות, ובכך מקל על פיתוח טיפולים ממוקדים אפיגנטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תמיסות וכולנגיוציטים ל-ATAC-seq

  1. לפחות יום אחד לפני ניסוי ATAC-seq, הכן את מאגר הליזיס של ATAC באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 1.
    הערה: ניתן לאחסן את מאגר הליזיס של ATAC בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך חודש לפחות.
  2. עבור כולנגיוציטים ראשוניים מבודדים טריים14, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר מיד לאחר הבידוד והמשיכו בניסוי ATAC-seq.
    הערה: כמה שיותר מוקדם כך עדיף למזער את ההשפעה על כדאיות התא. עם זאת, אם שומרים על קרח, המשך תוך שעתיים בדרך כלל אינו מהווה בעיה.

2. ATAC-seq

הערה: השתמש ב-100,000 כולנגיוציטים עבור ATAC-seq. שמור את הדגימות והתמיסות על קרח. עבור ניסוי ATAC-seq, ההליך כולו אורך כיומיים.

  1. צנטריפוגה בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה ATAC המכיל מעכב פרוטאז, פיפטה בעדינות לערבוב ודגרו על קרח למשך 20 דקות. במשך 10 הדקות הראשונות, פיפטה בעדינות לערבב.
  3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 1,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכן את מאגר תגובת הטרנספוזיציה (50 מיקרוליטר) על ידי ערבוב של 3 מיקרוליטר של תערובת אנזימים מערכת ההכנה של ספריית ה-DNA של ATAC, 10 מיקרוליטר של מאגר פי 5 מערכת ההכנה של ספריית ה-DNA של ATAC, ו-37 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. מערבבים היטב.
  5. השליכו בזהירות את הסופרנטנט, הניחו את הכדור הגרעיני שנאסף על הקרח, והוסיפו מיד 50 מיקרוליטר של מאגר תגובת טרנספוזיציה. יש להשעות בעדינות ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, תוך ערבוב תחתית הצינור כל 10 דקות.
    הערה: הכן את מאגר תגובת הטרנספוזיציה לפני השלכת הסופרנטנט כדי למנוע את התייבשות התאים.
  6. טיהור DNA באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: ניתן להסיר חרוזי חלבון G שיוריים מתהליך בידוד הכולנגיוציטים14 בשלב זה. ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.
  7. בצע בניית ספרייה באמצעות ערכת ההכנה של ספריית ה-DNA של ATAC בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: שמור את כל הדגימות והתמיסות על קרח אלא אם צוין אחרת. בעוד שהנהלים עשויים להיות שונים בין מותגי ערכות אחרים, כולם תואמים לפרוטוקול שלנו.
    1. העשרת PCR: הכן את תערובת העשרת ה-PCR (50 מיקרוליטר) בצינור PCR על ידי ערבוב הרכיבים הבאים בסדר שצוין: 10 מיקרוליטר של דגימת DNA (משלב 2.6), 14 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז, 10 מיקרוליטר של 5x TAB, 5 מיקרוליטר של PPM, 1 מיקרוליטר של TAE, 5 מיקרוליטר של פריימר P5 ו-5 מיקרוליטר של פריימר P7. פיפטה בעדינות לערבב.
    2. העבר את הצינור למכשיר PCR והפעל את התוכנית הבאה: (72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות) x מחזור אחד, (98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) x מחזור אחד, (98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות) x 15 מחזורים, ו-(72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) x מחזור אחד, והחזק ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. טיהור: הביאו את חרוזי ה-DNA Clean לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש, ולאחר מכן בצעו טיהור חרוזים מגנטיים דו-שלבי.
      1. סיבוב ראשון: הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזי DNA Clean למוצרי ה-PCR (משלב 2.7.2), פיפטה בעדינות לערבוב ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את צינור ה-PCR על מפריד מגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר (~5 דקות). העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש והשליכו את חרוזי ה-DNA Clean.
      2. סיבוב שני: הוסף 7.5 מיקרוליטר של חרוזי DNA Clean לסופרנטנט שנאסף (משלב 2.7.3.1), פיפטה בעדינות לערבוב ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את הצינור על מפריד מגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר (~5 דקות). השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    4. שמור את הצינור על המפריד המגנטי ושטוף את חרוזי ה-DNA Clean למשך 2 x 30 שניות עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי מוכן בטמפרטורת החדר. יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט לאחר כל שטיפה. כשהצינור עדיין על המפריד המגנטי, פתח את מכסה הצינור וייבש את החרוזים באוויר למשך 10 דקות. לבסוף, הוסיפו 22 מיקרוליטר של מים נטולי גרעין כדי לסלק את הדנ"א.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.
  8. רצף את הספריות באמצעות סיקוונסר סטנדרטי מהדור הבא.
    הערה: אנו ממליצים להשיג לפחות 50 מיליון קריאות בזוגות.

3. הכנת תמיסות וכולנגיוציטים עבור ChIP-seq עם קלט נמוך

  1. לפחות יום אחד לפני ניסוי ChIP-seq בעל קלט נמוך, הכן את מאגר הליזיס של ChIP, מאגר ChIP MNase, מאגר עצירת ChIP, מאגר ChIP 2x RIPA, מאגר ChIP RIPA ומאגר ChIP LiCl באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 2, טבלה 3, טבלה 4 וטבלה 5.
    הערה: ניתן לאחסן את הפתרונות לעיל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות.
  2. עבור כולנגיוציטים ראשוניים מבודדים טריים14, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר מיד לאחר הבידוד והמשיכו בניסוי ChIP-seq בעל קלט נמוך.
    הערה: כמה שיותר מוקדם כך עדיף למזער את ההשפעה על כדאיות התא. עם זאת, אם שומרים על קרח, המשך תוך שעתיים בדרך כלל אינו מהווה בעיה.

4. יום 1 של ChIP-seq עם קלט נמוך: ליזיס תאים, עיכול MNase ודגירת נוגדנים

הערה: עבור ניסוי ChIP-seq בעל קלט נמוך, ההליך כולו אורך כ-3 ימים.

  1. חלקו את הכולנגיוציטים לכמות של 100,000 תאים בכל שפופרת ושמרו את הדגימות והתמיסות על קרח.
    הערה: אם מבצעים ניסוי ChIP-seq עם קלט נמוך עבור שינויים מרובים בהיסטון, מקובל להגדיל את עוצמת הקול באופן פרופורציונלי לפני הוספת נוגדן שינוי ההיסטון. נפחי המגיב בשלבים הבאים מבוססים על צינור אחד המכיל 1 × 105 תאים.
  2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 19 מיקרוליטר של מאגר ליזה ChIP המכיל מעכב פרוטאז, פיפטה בעדינות לערבוב ודגרו על קרח למשך 10 דקות. הימנע מיצירת בועות.
  4. הוסף 19 מיקרוליטר של ChIP MNase Buffer ופיפטה בעדינות לערבוב.
  5. מוסיפים 2 מיקרוליטר MNase (0.01 U/μL) ופיפטה בעדינות לערבב. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    הערה: זמן הדגירה הוא קריטי. הריכוז הסופי של MNase הוא 0.0005 U/μL. ניתן לקבוע את הריכוז האופטימלי של MNase על סמך סוג התא ומספרו.
  6. הניחו מיד את הדגימה על קרח, הוסיפו 5 מיקרוליטר של ChIP STOP Buffer כדי להפסיק את העיכול, ופיפטה בעדינות לערבב.
  7. הוסף 45 מיקרוליטר של ChIP 2x RIPA Buffer המכיל מעכב פרוטאז, פיפטה בעדינות לערבוב ודגירה נוספת על קרח למשך 10 דקות.
  8. צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבירו לאט את הסופרנטנט לצינור חדש.
    הערה: ניתן להסיר חרוזי חלבון G שיוריים מתהליך בידוד הכולנגיוציטים14 בשלב זה.
  9. הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר ChIP RIPA.
  10. עבור דגימות משקעים חיסוניים (IP), הוסף 1 מיקרוגרם של נוגדן לדגימה ודגר את התרחיף על מסובב (20 סל"ד) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  11. עבור דוגמאות קלט, אל תוסיף נוגדן כלשהו ותדגור את המתלה על מסובב (20 סל"ד) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

5. יום 2 של ChIP-seq עם קלט נמוך: משקעים חיסוניים, שטיפה ופליטה

הערה: עבור דוגמאות IP, בצע את שלבים 5.1-5.7. עבור דוגמאות קלט, בצע את שלבים 5.8-5.12.

  1. שטיפה מוקדמת של חרוזי חלבון G עם 1 מ"ל של מאגר ChIP RIPA קר כקרח.
  2. הוסף 400 מיקרוגרם של חרוזי חלבון G לדגימות ודגירה בסיבוב (20 סל"ד) ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  3. שטפו את החרוזים למשך 5 x 5 דקות עם 150 מיקרוליטר של ChIP RIPA Buffer קר כקרח למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס על מסובב (20 סל"ד). הסר את הסופרנטנט באמצעות מפריד מגנטי.
  4. שטפו את החרוזים עם 150 מיקרוליטר של מאגר ChIP LiCl קר כקרח למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על מסובב (20 סל"ד). הסר את הסופרנטנט באמצעות מפריד מגנטי.
  5. הוסף 30 מיקרוליטר של ChIP Elution Buffer (29 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ו-1 מיקרוליטר של פרוטאינאז K) כדי להשעות מחדש את החרוזים ולנער ב-900 סל"ד ב-55 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. החלק בעדינות את הצינור מעת לעת כדי לשמור על החרוזים בתרחיף.
  6. אספו את הסופרנטנט באמצעות מפריד מגנטי והעבירו אותו לאט לאט לצינור חדש. יש לדגור בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לנטרל את Proteinase K.
  7. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות פלואורומטר.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.
  8. לדגימות קלט, הוסף 1 מיקרוליטר של Proteinase K ונער ב-900 סל"ד ב-55 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  9. טהר DNA באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם. הוסף 130 מיקרוליטר של מגיב מיצוי DNA ומערבולת במרץ עד שהתמיסה הופכת לוורודה. צנטריפוגה במשקל 20,000 × גרם למשך 5 דקות.
  10. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש, הוסיפו 130 מיקרוליטר איזופרופנול קר כקרח, ולאחר מכן הוסיפו 1 מיקרוליטר גליקוגן ו-6.5 מיקרוליטר 3M NaAc. צנטריפוגה במשקל 20,000 × גרם למשך 15 דקות.
  11. השליכו את הסופרנטנט, שטפו פעם אחת עם 1 מ"ל של 70% אתנול, וצנטריפוגה בחום של 20,000 × גרם למשך 15 דקות. יבש את הגלולה והשהה אותה מחדש ב-30 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז.
  12. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות פלואורומטר.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.

6. יום 3 של ChIP-seq עם קלט נמוך: בניית ספרייה ורצף

  1. בצע בניית ספרייה באמצעות ערכת הכנה לספריית DNA של ChIP בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: השלבים כוללים הכנה סופית, קשירת מתאם וספרייה Amplification. פיפטה 5 ng של דגימות ChIP (דגימות קלט ו-IP) לבניית ספרייה. שמור את כל הדגימות והתמיסות על קרח אלא אם צוין אחרת. בעוד שהנהלים עשויים להיות שונים בין מותגי ערכות אחרים, כולם תואמים לפרוטוקול שלנו.
  2. הכנה סופית: הכן את מאגר תגובת ההכנה הסופית (65 מיקרוליטר) בצינור PCR על ידי ערבוב של 5 ננוגרם של דגימת DNA (משלב 5.6 או שלב 5.11), 15 מיקרוליטר של תערובת הכנה סופית 4, 6.5 מיקרוליטר של Tris EDTA, ומים ללא נוקלאז לנפח סופי של 65 מיקרוליטר. העבר את הצינור למכשיר PCR והפעל את התוכנית הבאה: 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, והחזק ב-4 מעלות צלזיוס (מכסה חם: 105 מעלות צלזיוס).
  3. קשירת מתאם: דילול מתאם DNA S ביחס של 1:100. הכן את מאגר תגובת קשירת המתאם (100 מיקרוליטר) בצינור PCR על ידי ערבוב של 65 מיקרוליטר של מוצרי הכנה סופיים (משלב 6.2), 25 מיקרוליטר של מאגר קשירה מהירה 2, 5 מיקרוליטר של ליגאז DNA מהיר ו-5 מיקרוליטר של מתאם DNA מדולל S. פיפטה בעדינות לערבוב. העבר את הצינור למכשיר PCR והפעל את התוכנית הבאה: 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן החזקה ב-4 מעלות צלזיוס (מכסה חם: 105 מעלות צלזיוס).
  4. טיהור:
    1. הביאו את חרוזי ה-DNA Clean לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. הוסף 60 מיקרוליטר של חרוזי DNA Clean למוצרי קשירת המתאם (משלב 6.3). פיפטה בעדינות לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    2. הנח את צינור ה-PCR על מפריד מגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר (~5 דקות). השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    3. שמור את הצינור על המפריד המגנטי. שטפו את חרוזי ה-DNA Clean למשך 2 x 30 שניות עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי מוכן בטמפרטורת החדר. יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט לאחר כל שטיפה.
    4. כשהצינור עדיין על המפריד המגנטי, פתח את מכסה הצינור וייבש את החרוזים באוויר למשך 5 דקות. לבסוף, הוסף 22.5 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-HCL (PH 8.0) כדי לחסל את ה-DNA.
  5. הגברת ספרייה: הכן את מאגר תגובת ההגברה של הספרייה (50 מיקרוליטר) בשפופרת PCR על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר של מוצרי טיהור (משלב 6.4), 2.5 מיקרוליטר של פריימר i5 PCR, 2.5 מיקרוליטר של פריימר i7 PCR ו-25 מיקרוליטר של תערובת הגברה. פיפטה בעדינות לערבב. העבר את הצינור למכשיר PCR והפעל את התוכנית הבאה: (95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות) x מחזור אחד, (98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) x 18 מחזורים, (72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) x מחזור אחד, והחזק ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. טיהור: הביאו את חרוזי ה-DNA Clean לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש, ולאחר מכן בצעו טיהור חרוזים מגנטיים דו-שלבי.
    1. סיבוב ראשון: הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזי DNA Clean למוצרי ההגברה של הספרייה (משלב 6.5). פיפטה בעדינות לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את צינור ה-PCR על מפריד מגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר (~5 דקות). העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש והשליכו את חרוזי ה-DNA Clean.
    2. סיבוב שני: הוסף 7.5 מיקרוליטר של חרוזי DNA Clean לסופרנטנט שנאסף. פיפטה בעדינות לערבב ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הנח את הצינור על מפריד מגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר (~5 דקות). השליכו בזהירות את הסופרנטנט. שמור את הצינור על המפריד המגנטי. שטפו את חרוזי ה-DNA Clean למשך 2 x 30 שניות עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי מוכן בטמפרטורת החדר. יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט לאחר כל שטיפה. כשהצינור עדיין על המפריד המגנטי, פתח את מכסה הצינור וייבש את החרוזים באוויר למשך 10 דקות. לבסוף, הוסף 22.5 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-HCl (PH 8.0) כדי לחסל את ה-DNA.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור לטווח ארוך.
  7. רצף את הספריות בסיקוונסר סטנדרטי מהדור הבא.
    הערה: אנו ממליצים להשיג לפחות 10-20 מיליון קריאות בזוגות.

7. ניתוח נתונים של ATAC-seq ו-ChIP-seq עם קלט נמוך

  1. הכנת הסביבה הווירטואלית לניתוח (miniconda)
    1. הורד את Miniconda3 מהאתר באמצעות הפקודות הבאות ופעל לפי הוראות ההתקנה של Miniconda.
      WGET https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. צור סביבה וירטואלית עבור צינור ניתוח הן של ATAC-seq והן של ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda להפעיל את NGSpipeline
      קונדה להתקין ביוקונדה::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::IGV
    3. הורד את קובץ רצף הגנום הייחוס וצור אינדקס יישור ליישור פפיון 2.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. בצע בקרת איכות של קריאות ATAC-seq וקריאות ChIP-seq עם FastQC וסכם את דוח בקרת האיכות באמצעות MultiQC כדי להבטיח את הטיית ה-GC של תוצאות הריצוף ומורכבות ספרייה מספקת לניתוח במורד הזרם. השלך את ספריית הרצפים עם תוצאות בקרת איכות שונות משמעותיות.
    fastqc -o <ספריית פלט> ......
    multiqc     <ספריית פלט>
  3. חתוך מתאם רצף באמצעות קיצוץ בשפע.
    trim_galore -q 20 --phred33 --מחמירות 3 --אורך 25 -e 0.1 --מזווג -j <מספר חוט> -o <ספריית פלט> <קצה מזווג קורא 1> <קצה מזווג קורא 2>
  4. מפת קריאות חתוכות למכלול גנום הייחוס mm10 עם Bowtie2 באמצעות פרמטרי ברירת מחדל, ומעבירות פרמטרי חיבור (--very-רגיש -X 2000) ל-bowtie2 עבור ATAC-seq עקב התפלגות אורך רחבה של מקטע ATAC-seq.
    1. עבור ATAC-seq:
      bowtie2 -p <מספר חוט> --מאוד רגיש -X 2000 -x <אינדקס גנום משלב 7.1.3> -1 <נקה קובץ fastq מ-4.2 קרא 1> -2 <נקה קובץ fastq מ-4.2 קרא 2> | samtools view -S -O BAM -@ <מספר חוט> -O <פלט קובץ BAM>
    2. עבור ChIP-seq:
      Bowtie2 -P <מספר חוט> -X <אינדקס הגנום משלב 7.1.3> -1 <קובץ FastQ נקי מ-4.2 קרא 1> -2 <נקה קובץ FastQ מ-4.2 קרא 2> | SAMTOOLS VIEW -S -O BAM -@ <מספר חוט> -O <פלט קובץ BAM>
  5. הסר קריאות עם ציון יישור נמוך (q30) וקריאות מיושרות לגנום המיטוכונדריה ולכרומוזום לא סטנדרטי.
    תצוגה של samtools -bh -q 30 -f 2 <קלט קובץ BAM> | תצוגת samtools -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'אקראי' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <קובץ BAM מסונן>
  6. השתמש בפקודה Picard MarkDuplicates כדי להסיר קריאות PCR כפולות.
    picard MarkDuplicates I=<קובץ bam מסונן> O=<פלט להסיר קובץ bam שכפול> M=<הסר קובץ דוח שכפול> REMOVE_DUPLICATES=נכון
  7. שיא שיחה באמצעות פקודת MACS2 callpeak עם פרמטר -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t <הסר שכפול קובץ BAM > -g mm -n <קידומת פלט> -B -q 0.01
  8. צור קבצי BigWig באמצעות הפקודה Deeptools BamCoverage.
    אינדקס SamTools <הסר קובץ BAM כפול> -@ 4
    bamCoverage -b     <הסר קובץ bam כפול> -o <פלט קובץ BigWig> -bs 50 -p <מספר חוט> --effectiveGenomeSize2652783500--נורמליזבאמצעות RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. השתמש בדפדפן הגנום IGV כדי להציג את קובץ narrowPeak מקבצי macs2 ו-BigWig מ-Deeptools BamCoverage.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי ליצור את נוף הכרומטין של כולנגיוציטים ראשוניים, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולי ChIP-seq ו-ATAC-seq בעלי קלט נמוך למספרים נמוכים (~100,000) של כולנגיוציטים ראשוניים. תוצאות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עבור כולנגיוציטים ראשוניים הצביעו על כך שעבור 1 × 105 כולנגיוציטים ראשוניים, 0.02 U MNase ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות הביא לייצור מונונוקלאוזומים, שזוהה כריכוז האופטימלי (איור 1).

סקירה כללית של ATAC-seq ו-H3K9ac/H3K9me3 ניתוח ChIP-seq עם קלט נמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי למפות באופן שיטתי ומקיף את דינמיקת מצב הכרומטין העומדת בבסיס מעבר המצב של כולנגיוציטים ציסטיים, ביצענו אופטימיזציה מוצלחת של ChIP-seq ו-ATAC-seq עם קלט נמוך עבור מספר מוגבל של כולנגיוציטים ראשוניים. למרות שמחקר זה התמקד בכולנגיוציטים ראשוניים, אנו בטוחים שניתן ליישם את הפרוטוקול גם על תאים ראשוניים אחרים בעלי כדאיות גבוהה עם זמינות מוגבלת. באופן דומה, בעוד שמחקר זה מציג רק את תוצאות ניתוח ChIP-seq של H3K9ac ו-H3K9me3, הפרוטוקול ישים באותה מידה לשינויים אחרים בהיסטון, כולל סימני הפעלה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82402166 ל-R.J.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7.5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8.0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
ג'ל אגרוזBiosharpBS081
ATAC ספריית DNA ערכת הכנהVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M מלאי
ChIP DNA ספריית ערכת הכנהVazymeND607
DNA חרוזים נקייםVazymeN411
מגיב מיצוי DNASolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 מ"מ (pH = 8) מלאי
פלואורומטרInvitrogenQ33226
גליקוגןתרמו מדעיR0561
המוציטומטרQIUJINGXB. ק.25.
Igepal CA-630SigmaI889610% מלאי
מפריד מגנטיPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 מיליון מלאי
MNaseSigmaN37550.01 U/µ L מלאי
NaClSangon BiotechA6104765 M מלאי
NP40SolarbioN8030
מים ללא נוקלאזLife TechnologiesAM9937
PCR מכשירApplied Biosystems4484073
PCR ערכת טיהורQIAGEN28106
מעכב פרוטאזרוש
חרוזי חלבון GInvitrogen10004D
Proteinase KTransGenGE201-01
מסובבKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010% 
מלאי נתרן דאוקסיכולטSigmaS1827
Thermomixer ComfortEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
לקצץ בשפע0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
04693132001

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Low input ChIP seqATAC seq ProtocolChromatin AccessibilityHistone ModificationsPrimary CholangiocytesEpigenetic ProfilingMicrococcal NucleaseTn5 Transposase
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים